CN112662584B

CN112662584B - 一种稳定不析出的胆硫乳琼脂培养基平板

Info

Publication number: CN112662584B
Application number: CN202011638498.6A
Authority: CN
Inventors: 徐环; 卢勉飞; 蔡芷荷; 何志毅; 张�杰; 吴清平; 李远强
Original assignee: Guangdong Huankai Microbial Sci and Tech Co Ltd
Current assignee: Guangdong Huankai Microbial Sci and Tech Co Ltd
Priority date: 2020-12-31
Filing date: 2020-12-31
Publication date: 2022-05-24
Anticipated expiration: 2040-12-31
Also published as: CN112662584A

Abstract

本发明公开了一种稳定不析出的胆硫乳琼脂培养基平板。发明人研究发现，通过在胆硫乳琼脂培养基平板内添加乳酸钠、十二烷基苯磺酸钠、甘氨酸和聚乙烯吡咯烷酮中的至少2种作为稳定剂，可以有效提高胆硫乳琼脂培养基平板的稳定性。一些实例在6个月的储存期内不会出现点状或针状盐晶，且平板的保水性能好，生物学性能依旧可以达标。解决了胆硫乳琼脂培养基平板储存过程中容易析出盐晶，影响平板的外观及使用的问题。

Description

一种稳定不析出的胆硫乳琼脂培养基平板

技术领域

本发明涉及一种微生物鉴定用平板，特别涉及一种稳定不析出的胆硫乳琼脂培养基平板。

背景技术

沙门氏菌是一类广泛存在于肉制品、蛋类，水产品，奶制品等常见食物中的革兰氏阴性杆菌，主要通过食物和饮水经口感染，引起急性胃肠炎、剧烈头痛、呕吐、腹泻等临床症状。志贺氏菌是一类革兰氏阴性杆菌，是人类细菌性痢疾最为常见的病原菌。在我国每年由沙门氏菌、志贺氏菌感染引起的食物中毒占细菌性食物中毒的首位, 因此在日常食物以及进出口食物中，沙门氏菌、志贺氏菌的检测是非常重要的检测项目。

我国微生物检验标准GB/T4789.4-2003、SN/T2206.3-2009等均推荐胆硫乳琼脂作为分离沙门氏菌、志贺氏菌的选择性培养基。SN/T2206.3-2009使用的胆硫乳琼脂（DHL）组成为：蛋白胨20.0g、牛肉膏粉3.0g、乳糖10.0g、蔗糖10.0g、牛胆盐1.0g、硫代硫酸钠2.2g、柠檬酸钠1.0g、柠檬酸铁铵1.0g、中性红0.03g或5g/L 水溶液6mL、琼脂18.0g～20.0g、蒸馏水1000mL，pH7.3。GB/T4789.28-2003规定的DHL琼脂成分为蛋白胨20.0g、牛肉膏粉3.0g、乳糖10.0g、蔗糖10.0g、去氧胆酸钠1.0g、硫代硫酸钠2.3g、柠檬酸钠1.0g、柠檬酸铁铵1.0g、中性红0.03g、琼脂18.0g～20.0g、蒸馏水1000mL，pH7.3。

即用型琼脂平板是一种预制的琼脂平板，不需要经过配制过程、直接现取现用，方便、快捷、节省人力物力财力等各种优势，是微生物检验产品发展的趋势。胆硫乳琼脂中含有蛋白胨、牛肉浸粉、乳糖、蔗糖、胆盐、硫代硫酸钠、柠檬酸钠、柠檬酸铁铵、中性红、琼脂等多种成分。由于该配方中糖、胆盐、硫代硫酸钠等种类较多，配制的平板在储存过程中容易在平板表面析出盐晶，影响平板的外观及使用。目前国内生产的胆硫乳琼脂培养基平板均只有3个月保质期，且在保质期内平板表面出现盐晶，无法满足长期储存的需求。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种稳定的胆硫乳琼脂培养基平板。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供：

组合物在制备胆硫乳琼脂培养基平板稳定剂中的应用，所述组合物选自乳酸钠、十二烷基苯磺酸钠、甘氨酸和聚乙烯吡咯烷酮中的至少2种。

在一些实例中，所述组合物为乳酸钠和十二烷基苯磺酸钠。

在一些实例中，乳酸钠和十二烷基苯磺酸钠的质量比为(10～30)：(2～6)。

在一些实例中，乳酸钠和十二烷基苯磺酸钠的质量比为20：5。

在一些实例中，所述组合物为甘氨酸和十二烷基苯磺酸钠。

在一些实例中，甘氨酸和十二烷基苯磺酸钠的质量比为(15～30)：(1～3)。

在一些实例中，甘氨酸和十二烷基苯磺酸钠的质量比为20：1。

本发明的第二个方面，提供：

一种稳定的胆硫乳琼脂培养基平板，其添加有本发明第一个方面所述的组合物。

在一些实例中，每1000ml培养基中添加有乳酸钠0.1～0.3g，十二烷基苯磺酸钠0.02～0.06 g。

在一些实例中，每1000ml培养基中添加有乳酸钠 0.2g，十二烷基苯磺酸钠0.05g。

在一些实例中，每1000ml培养基中添加有甘氨酸0.75～1.5g，十二烷基苯磺酸钠0.02～0.06 g。

在一些实例中，每1000ml培养基中添加有甘氨酸1g，十二烷基苯磺酸钠0.05g。

在一些实例中，每1000ml培养基中含有蛋白胨10.0g、牛肉膏粉3g、酵母粉3g、氯化钠5g、乳糖10.0g、蔗糖10.0g、胆盐3.0g、硫代硫酸钠2.0g、柠檬酸钠2g、柠檬酸铁铵1g、中性红0.03g、琼脂14g。

在一些实例中，每1000ml培养基中含有蛋白胨20.0g、牛肉膏粉3.0g、乳糖10.0g、蔗糖10.0g、牛胆盐1.0g、硫代硫酸钠2.2g、柠檬酸钠1.0g、柠檬酸铁铵1.0g、中性红0.03g，琼脂18.0g～20.0g，余量为水。

在一些实例中，每1000ml培养基中含有蛋白胨20.0g、牛肉膏粉3.0g、乳糖10.0g、蔗糖10.0g、去氧胆酸钠1.0g、硫代硫酸钠2.3g、柠檬酸钠1.0g、柠檬酸铁铵1.0g、中性红0.03g、琼脂18.0g～20.0g，余量为水。

本发明的有益效果是：

本发明的一些实例，配置出的平板，在储存期内不会出现点状或针状盐晶，且平板的保水性能好，储存6个月后，生物学性能依旧可以达标。解决了胆硫乳琼脂培养基平板储存过程中容易析出盐晶，影响平板的外观及使用的问题。

本发明的一些实例，通过对胆硫乳琼脂培养基平板的配方进行优化，可以得到稳定性更好的胆硫乳琼脂培养基平板。

具体实施方式

下面结合实例，进一步说明本发明的技术方案。

对比例1：

SN/T2206.3-2009使用的胆硫乳琼脂（DHL），组成为：蛋白胨20.0g、牛肉膏粉3.0g、乳糖10.0g、蔗糖10.0g、牛胆盐1.0g、硫代硫酸钠2.2g、柠檬酸钠1.0g、柠檬酸铁铵1.0g、中性红0.03g，琼脂18.0gg、蒸馏水1000mL，pH7.3。

对比例2：

GB/T4789.28-2003规定的DHL琼脂，成分为：蛋白胨20.0g、牛肉膏粉3.0g、乳糖10.0g、蔗糖10.0g、去氧胆酸钠1.0g、硫代硫酸钠2.3g、柠檬酸钠1.0g、柠檬酸铁铵1.0g、中性红0.03g、琼脂18.0g、蒸馏水1000mL，pH7.3。

对比例3：

一种稳定不析出的胆硫乳琼脂培养基平板，每1000ml培养基中含有蛋白胨10.0g、牛肉膏粉3g、酵母粉3g，氯化钠5g，乳糖10.0g、蔗糖10.0g、胆盐3.0g、硫代硫酸钠2.0g，柠檬酸钠2g, 柠檬酸铁铵1g, 中性红0.03g, 琼脂14g，pH7.3。

对比例4

同对比例3，不同之处在于还添加了稳定剂，稳定剂为聚乙烯吡咯烷酮和聚乙二醇，1000 mL培养基的添加量为聚乙烯吡咯烷酮0.5g，聚乙二醇0.01g，余量为水。

对比例5

同对比例3，不同之处在于还添加了稳定剂，稳定剂为聚乙二醇和甘氨酸，1000 mL培养基的添加量为聚乙二醇0.02g，甘氨酸0.5g。

实施例1

同对比例3，不同之处在于还添加了稳定剂，稳定剂为乳酸钠和十二烷基苯磺酸钠，1000 mL培养基的添加量为乳酸钠 0.2g，十二烷基苯磺酸钠0.05g。

实施例2

同对比例3，不同之处在于还添加了稳定剂，稳定剂为甘氨酸和十二烷基苯磺酸钠，1000 mL培养基的添加量为甘氨酸1g，十二烷基苯磺酸钠0.05g。

实施例3

同对比例3，不同之处在于还添加了稳定剂，稳定剂为聚乙烯吡咯烷酮和甘氨酸，1000 mL培养基的添加量为聚乙烯吡咯烷酮0.5g，甘氨酸0.5g。

实施例4

同实施例1，不同之处在于乳酸钠和十二烷基苯磺酸钠的添加量分别为0.1g和0.06g。

实施例5

同实施例1，不同之处在于乳酸钠和十二烷基苯磺酸钠的添加量分别为0.15g和0.04g。

实施例6

同实施例1，不同之处在于乳酸钠和十二烷基苯磺酸钠的添加量分别为0.3g和0.02g。

实施例7

同对比例1，不同之处在于还添加了稳定剂，稳定剂为乳酸钠和十二烷基苯磺酸钠，其添加量(每1000 mL培养基)为乳酸钠 0.3g、十二烷基苯磺酸钠0.03g。

实施例8

同对比例2，不同之处在于还添加了稳定剂，稳定剂为乳酸钠和十二烷基苯磺酸钠，其添加量为乳酸钠 0.1g、十二烷基苯磺酸钠0.04g。

下面结合实验，进一步说明本发明一些实例的胆硫乳琼脂培养基平板性能。

平板性能测试：

1材料

1.1菌株

鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhimurium)ATCC14028，福氏志贺氏菌（Shigella falfella）CMCC(B)51572，粪肠球菌（Enterococcus faecalis）ATCC29212，由本实验室保存的商品化菌株。这些菌株可以使用其他公知的菌株替换。

1.2培养基及试剂

胰酪胨大豆培养基琼脂平板(简称TSA平板)由广东环凯微生物科技有限公司提供。

方法

2.1平板外观性能评价

2.1.1胆硫乳琼脂培养基平板制备：按实施例中配方以及标准配方按比例进行称量，调整pH值，煮沸溶解，冷却至50℃倾注平板，备用。

2.1.2将制备好的胆硫乳琼脂培养基平板进行包装，各平板均置于同一冷库，2～8℃中储存，分别在0d、15d、30d、60d、120d、180d取样，观察平板表面析出情况。

2.2培养基生物学性能评价

生长率试验：

采用定量方法进行。将鼠伤寒沙门氏菌、志贺氏菌2株菌的新鲜斜面培养物制成约10 ³cfu/ml的菌悬液。分别取上述各菌液0.1ml用全自动螺旋接种仪分别接种于待测平板，鼠伤寒沙门氏菌、志贺氏菌的菌液同时接种参比培养基TSA平板，37±1℃培养18-24小时。每种平板进行3个重复。观察各株菌在培养基上的生长情况，并对其进行菌落计数。按下列公式计算生长率P_R。

P_R＝N_S/N₀，

N_S：待测培养基平板上得到的平均菌落数；N₀：参比培养基平板上获得的平均菌落数。

选择性测试：

将粪肠球菌制成10⁸cfu/mL～10⁹cfu/mL浓度菌悬液，用1μl接种环取菌悬液1环，在待测平板及参照培养基平板表面划六条平行直线，37±1℃培养18-24小时；培养后按以下方法对培养基计算生长指数G：

1)每条有比较稠密菌落生长的划线则G为1，每个培养皿上最多为6分；

2)如果仅一半的线有菌落生长，则G为0.5；

3)如果划线上没有菌落生长或生长量少于划线的一半，则G为0。

记录每个平板的得分总和便得到G值。

结果

3.1平板外观性能评价

测试方法，目测，少量盐晶指平板表面≤10%的面积有肉眼可见的盐晶；大量盐晶指平板表面≥80%面积有肉眼可见的盐晶；介于二者之间的，计为部分盐晶。实验结果见下表。

注：“N”表示无析出；“+”表示析出少量盐晶；“++”表示析出部分盐晶；“+++”表示析出大量盐晶。

结果表明：

1)乳酸钠、十二烷基苯磺酸钠、甘氨酸、聚乙烯吡咯烷酮中的两种，特别是乳酸钠和十二烷基苯磺酸钠组合、甘氨酸和十二烷基苯磺酸钠组合、甘氨酸和聚乙烯吡咯烷酮组合使用，均有提高胆硫乳琼脂培养基平板作用，其中乳酸钠和十二烷基苯磺酸钠组合的效果最佳，甘氨酸和十二烷基苯磺酸钠组合次之，甘氨酸和聚乙烯吡咯烷酮组合的效果较弱；

2)聚乙烯吡咯烷酮和聚乙二醇组合、聚乙二醇和甘氨酸组合，未显示出提高胆硫乳琼脂稳定性的效果；

3)乳酸钠和十二烷基苯磺酸钠作为稳定剂添加在胆硫乳琼脂培养基平板内，可以显著提高现有胆硫乳琼脂培养基平板的稳定性；

4)通过对胆硫乳琼脂培养基平板的配方进行进一步优化，可以获得稳定性更佳的胆硫乳琼脂培养基平板。

3.2生物学

将实施例1所述平板，与新配制的胆硫乳琼脂培养基平板(对比例3)进行比较，结果如下：

综上所述：仅有实施案例1所述的胆硫乳琼脂培养基平板的保质期最长，6个月后其外观未发生变化，平板表面未见杂质或盐晶，且6个月后生物学效果与新配制的平板相当，培养基的性能良好，为延长即用型成品培养基的保质期提供了新途径。

Claims

1.组合物在制备胆硫乳琼脂培养基平板稳定剂中的应用，所述组合物为乳酸钠和十二烷基苯磺酸钠，每1000ml培养基中添加有：乳酸钠 0.2g，十二烷基苯磺酸钠 0.05g。

2.一种稳定的胆硫乳琼脂培养基平板，其特征在于：每1000ml培养基中添加有：乳酸钠0.2g，十二烷基苯磺酸钠 0.05g。

3.根据权利要求2所述的胆硫乳琼脂培养基平板，其特征在于：每1000ml培养基中含有蛋白胨10.0g、牛肉膏粉3g、酵母粉3g、氯化钠5g、乳糖10.0g、蔗糖10.0g、胆盐3.0g、硫代硫酸钠2.0g、柠檬酸钠2g、柠檬酸铁铵1g、中性红0.03g、琼脂14g。

4.根据权利要求2所述的胆硫乳琼脂培养基平板，其特征在于：每1000ml培养基中含有蛋白胨20.0g、牛肉膏粉3.0g、乳糖10.0g、蔗糖10.0g、牛胆盐1.0g、硫代硫酸钠2.2g、柠檬酸钠1.0g、柠檬酸铁铵1.0g、中性红0.03g，琼脂18.0g～20.0g，余量为水。

5.根据权利要求2所述的胆硫乳琼脂培养基平板，其特征在于：每1000ml培养基中含有蛋白胨20.0g、牛肉膏粉3.0g、乳糖10.0g、蔗糖10.0g、去氧胆酸钠1.0g、硫代硫酸钠2.3g、柠檬酸钠1.0g、柠檬酸铁铵1.0g、中性红0.03g、琼脂18.0g～20.0g，余量为水。