ES2911341T3 - Composiciones antifitopatogénicas - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende quinolinacarboxaldehído 1 mM e hidroximetil-2-furaldehído que tienen la actividad de eliminar un fitopatógeno o reducir el crecimiento del mismo.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones antifitopatogénicas

Campo de la invención

La presente invención, en algunas modalidades de la misma, se refiere a las composiciones antifitopatogénicas. Antecedentes de la invención

El género bacteriano Ca. fitoplasma consiste de bacterias relativamente pequeñas, todas las cuales son patógenos de plantas limitados por el floema, no helicoidales y sin paredes. A diferencia de los virus, los fitoplasmas tienen un metabolismo propio muy reducido, aunque algunas de las moléculas esenciales para su supervivencia se adquieren del huésped. Representan un clado monofilético dentro de la clase Mollicutes, que actualmente se divide en al menos 15 subgrupos sobre la base de análisis de las secuencias de varios genes conservados.

El amarillo de la vid (GY), un complejo de enfermedades que originalmente se pensó que era causado por virus, ahora se sabe que tiene una etiología de fitoplasma. Los síntomas casi idénticos del síndrome GY son causados por diferentes fitoplasmas y aparecen en hojas, brotes y racimos de vides (Vitis vinifera). Los síntomas típicos incluyen decoloración y necrosis de las nervaduras y láminas de las hojas, enrollamiento de las hojas hacia abajo, ausencia o lignificación incompleta de los brotes, atrofia y necrosis de los brotes, aborto de las inflorescencias y marchitamiento de las bayas. Esos síntomas están relacionados con la deposición de callos en las placas cribosas y la subsecuente degeneración del floema. Aunque hasta el momento no se conocen cultivares resistentes de V. vinifera o portainjertos, las diversas variedades de uva difieren considerablemente en lo que se refiere a la gravedad de los síntomas. Va desde un rápido declive y muerte en cultivares altamente susceptibles hasta portainjertos tolerantes como portadores asintomáticos del patógeno.

Aproximadamente el 70 % de la producción mundial de uva se destina a la elaboración de vino, que es el producto agroalimentario de mayor valor adicionado del mundo. El principal factor que influye en la calidad del vino es la condición en la que se cultivan las uvas. Las enfermedades, las plagas y las prácticas vitivinícolas tienen un gran impacto en la consistencia de la producción y la calidad de la uva. La mayoría de las veces, las enfermedades y plagas se controlan con pesticidas, ya sea de manera preventiva o de respuesta.

El control de patógenos, que incluye, entre otros, los patógenos restringidos al floema (por ejemplo, fitoplasma) necesita nuevas estrategias dado que la aplicación convencional demostró ser ineficiente.

Cho Jang-Hee y otros (2005, Antimicrobial activity of quinolone derivatives isolated from Ruta chalepensis toward human intestinal bacteria, Journal of Microbiology and Biotechnology, vol. 15, núm. 3, páginas 646-651) describe el efecto de los materiales derivados de la hoja de Ruta chalepensis, que incluye la quinolina-4-carboxaldehído, en las bacterias intestinales humanas.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a una composición que comprende 1 mM de quinolinacarboxaldehído e hidroximetil-2-furaldehído que tienen la actividad de eliminar un fitopatógeno o reducir el crecimiento del mismo. La presente invención también se refiere a un método para tratar o reducir los síntomas de un fitopatógeno, el método comprende la etapa de poner en contacto dicho fitopatógeno con la composición de la invención, para de esta manera tratar o reducir los síntomas del fitopatógeno, dicho fitopatógeno se selecciona de Xanthomonas campestris, Candidatus Liberibacter, Spiroplasma melliferum y fitoplasma.

De acuerdo con un ejemplo descrito en la presente descripción, se describe una bacteria aislada que comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 98 % de identidad de secuencia con la: SEQ ID NO: 1 y al menos una secuencia de ácido nucleico adicional que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 2-14.

De acuerdo con algunos ejemplos, la bacteria aislada comprende las secuencias de ácido nucleico como se establecen en las SEQ ID NO: 2 - 14. De acuerdo con algunos ejemplos, la bacteria aislada comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 10 % de variedad de secuencias para: Dyella ginsengisoli.

De acuerdo con otro ejemplo descrito en la presente descripción, existe una composición que comprende la bacteria aislada de los ejemplos y cualquier uno de un emulsionante, un sustrato de crecimiento o su combinación.

De acuerdo con algunos ejemplos, la composición comprende un emulsionante que comprende un material seleccionado del grupo que consiste en: tensioactivo no iónico, tensioactivo aniónico, tensioactivo catiónico o un tensioactivo anfifílico. De acuerdo con algunos ejemplos, el emulsionante es un tensioactivo no iónico. En una modalidad, dicho tensioactivo no iónico comprende monolaurato de sorbitán polioxietilenado (20).

De acuerdo con algunos ejemplos, la composición comprende un sustrato de crecimiento, dicho sustrato de crecimiento comprende un medio de crecimiento bacteriano selectivo. De acuerdo con algunas modalidades, dicho medio de crecimiento bacteriano selectivo comprende uno o más materiales seleccionados del grupo que consiste en un azúcar y un aminoácido. De acuerdo con algunas modalidades, dicho azúcar se selecciona del grupo que consiste en: arabinosa, manosa, sacarosa, melibiosa, galactosa, inositol, glucósido y cualquier combinación o derivado de los mismos. De acuerdo con algunas modalidades, dicho aminoácido se selecciona del grupo que consiste en: prolina nitroanilida, Y-L-glutamil p-nitroanilida, fenilalanina, glicina, arginina y cualquier combinación de los mismos.

De acuerdo con algunas modalidades, la composición de la invención comprende además un material seleccionado del grupo que consiste en: un fertilizante, un herbicida, un pesticida o cualquier combinación de los mismos.

De acuerdo con otro aspecto, se proporciona un método para tratar o reducir los síntomas de un fitopatógeno, el método que comprende la etapa de poner en contacto dicho fitopatógeno con la composición de la invención, lo que trata o reduce los síntomas del patógeno.

De acuerdo con algunas modalidades, el fitopatógeno se selecciona de Xanthomonas campestris, Candidatus Liberibacter y fitoplasma. De acuerdo con algunas modalidades, el fitopatógeno es fitoplasma. En otra modalidad ilustrativa, el patógeno es Ca. Liberibacter. En otra modalidad ilustrativa, el patógeno es Xanthomonas campestris. De acuerdo con algunas modalidades, el patógeno es Spiroplasma melliferum.

De acuerdo con algunos ejemplos descritos en la presente descripción, existe una composición que comprende una semilla de planta y una cápsula que encapsula dicha semilla de planta, en donde dicha cápsula comprende:

i. la bacteria o composición descrita en la presente descripción y

ii. un material biocompatible.

De acuerdo con algunos ejemplos, el material biocompatible comprende un material adhesivo. De acuerdo con algunos ejemplos, dicho material adhesivo se selecciona del grupo que consiste en: guar, guar derivatizado, poliacrilamida, poli(ácido metacrílico), poli(ácido acrílico), poliacrilato, poli(etilenglicol), polímeros rematados con fosfonato, polietilenóxido, poli(alcohol vinílico), poliglicerol, politetrahidrofurano, poliamida, almidón, almidón derivado, maíz ceroso, sorgo, sargo ceroso, sagú, dextrina, quitina, quitosano, composiciones de alginato, goma, pectina, celulosa o cualquier combinación o derivado de los mismos.

De acuerdo con algunos ejemplos, dicho material biocompatible es o comprende un mineral. De acuerdo con algunos ejemplos, la composición comprende además un aglutinante. De acuerdo con algunos ejemplos, el aglutinante se selecciona del grupo que consiste en: gelatina, acetato de polivinilo, polivinilpirrolidonas, dextrina, maltodextrina, polisacáridos, grasas, aceites, proteínas, gomas lacas, cloruro de vinilideno, copolímeros de cloruro de vinilideno, lignosulfonatos de calcio, copolímero acrílico, acrilato de polivinilo, zeína, quitosano, óxido de polietileno, polímero de acrilimida, acrilato de polihidroxietilo, un monómero de metilacrilimida, alginato, policloropreno, jarabe o cualquier combinación de los mismos.

Otras modalidades y el alcance completo de la aplicabilidad de la presente invención se harán evidentes a partir de la descripción detallada que se proporciona a continuación.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 ilustra la inhibición del filtrado de bacterias tipo Dyella (representado como "D") en el desarrollo in vitro de Spiroplasma melliferum en comparación con la inhibición de 0,5 pg/ml de oxitetraciclina (representada como "Oxi").

La figura 2 ilustra el efecto del extracto de la fracción sobre el crecimiento de espiroplasma de (de izquierda a derecha) hexano, MBTE, cloroformo, acetona y MEOH. El medio brillante indica crecimiento de espiroplasma mientras que el medio más oscuro (marcado por "*") indica inhibición de espiroplasma.

La figura 3 demuestra el análisis por cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) en el extracto de la fracción de metanol y acetona obtenido del medio con y sin DLB.

Las figuras 4A-D presentan el análisis FISH de la ubicación de DLB en las secciones de pecíolos de plantas de vid mediante el uso de diferentes sondas: figura 4A: bacterias generales - mostradas como secciones grises; figura 4B: específico de DLB; figura 4C: luz visible; figura 4D: todas las imágenes combinadas.

Las figuras 5A-E demuestran la influencia de DLB en plántulas de vid ocho semanas después de la inoculación. Figura 5A: saludable; figura 5B: saludable inoculada con DLB; figura 5C: infectada por fitoplasma; figura 5D: infectada por fitoplasma inoculada con Dyella. La figura 5E representa la influencia de DLB en plántulas de vid ocho semanas después de la inoculación de plantas saludables ("H") e infectadas con fitoplasma ("Fito") con ("+D") y sin DLB.

Las figuras 6A-E representan la influencia de DLB en plántulas de bígaro ocho semanas después de la inoculación. Figura 6A: saludable; figura 6B: saludable inoculada con DLB; figura 6C: infectada por fitoplasma; figura 6D: infectada por fitoplasma inoculada con DLB. La figura 6E demuestra la influencia de DLB en plántulas de bígaro ocho semanas después de la inoculación de plantas saludables ("H") e infectadas con fitoplasma ("Fito") con ("+D") y sin DLB (panel izquierdo: longitud del brote, panel derecho: peso en seco).

Las figuras 7A-D presentan gráficos de barras que muestran la influencia de la aplicación de DLB en las vides. Las figuras 8A-D presentan gráficos de barras que muestran la influencia de la aplicación de DLB en las vides. La figura 9 presenta un gráfico que muestra la curva estándar de antibióticos de referencia - oxitetraciclina. La figura 10 presenta un gráfico que muestra el efecto de diferentes sustancias en diferentes concentraciones sobre el crecimiento de espiroplasma, medido por prueba de microplaca.

La figura 11 es un gráfico de barras que muestra las diferentes concentraciones de quinolinacarboxaldehído con hidroximetilo y su efecto sobre varias especies bacterianas, según se midió mediante la prueba de microplaca. En cada triplete de barras, la columna de la izquierda representa S. aureus, la columna del medio representa E. coli y la columna de la derecha representa B. cereus.

La figura 12 representa el efecto de la bacteria descrita en la presente descripción bajo un ensayo de patogénesis de Xanthomonas.

Descripción detallada de la invención

La presente invención, en algunas modalidades de la misma, se refiere a una composición que comprende 1 mM de quinolinacarboxaldehído e hidroximetil-2-furaldehído que tiene la actividad de eliminar un fitopatógeno o reducir el crecimiento del mismo. La invención se refiere además a los métodos de uso de los mismos, tales como para tratar o prevenir enfermedades de los cultivos, que incluye, pero que no se limita a, enfermedades de los cultivos causadas por fitoplasma.

En la presente descripción se describe por primera vez una nueva bacteria, denominada en la presente descripción "bacteria tipo Dyella " o "DLB", con un efecto inhibidor específico sobre los síntomas de patógenos restringidos al floema tal como el fitoplasma. Además, esta bacteria es ventajosamente capaz de penetrar en las plantas tratadas, tanto a través de las raíces como de las semillas y las hojas de las plantas. La utilidad de la bacteria descrita en la presente descripción se demostró además en un ensayo de patogénesis de Xanthomonas, lo que indica que la bacteria también reduce el daño de las bacterias patógenas que no se limita únicamente al floema.

De acuerdo con algunos ejemplos, en la presente descripción se describe una bacteria aislada que comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 98 % de identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico como se establece en la SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, por "que tiene al menos un 98 % de identidad con la secuencia de ácido nucleico como se establece en la SEQ ID NO: 1" se entiende además que se refiere a al menos 98,5 %, al menos 99 %, al menos 99,1 %, al menos 99,5 %, o al menos 99,9 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico como se establece en la SEQ ID NO: 1, que incluye cualquier valor o intervalo entre ellos.

En algunos ejemplos, la bacteria aislada comprende además una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 2 - 14. En algunas modalidades, la bacteria aislada comprende además una pluralidad de secuencias de ácido nucleico que tienen al menos un 85 % de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 2 - 14. Una "pluralidad" tal como se usa en la presente descripción, se refiere a al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13 secuencias de polinucleótidos como se establece en la SEQ ID NO: 2-14.

En algunos ejemplos, la bacteria aislada comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 99 % de identidad de secuencia con cualquiera de la SEQ ID NO: 2. En algunos ejemplos, la bacteria aislada comprende una secuencia de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 2. En algunos ejemplos, la bacteria aislada comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 99 % de identidad de secuencia con cualquiera de la SEQ ID NO: 3. En algunos ejemplos, la bacteria aislada comprende una secuencia de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 3.

En algunos ejemplos, la bacteria aislada comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 99 % de identidad de secuencia con cualquiera de la SEQ ID NO: 4. En algunos ejemplos, la bacteria aislada comprende una secuencia de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 4. En algunos ejemplos, la bacteria aislada comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 99 % de identidad de secuencia con cualquiera de la SEQ ID NO: 5. En algunos ejemplos, la bacteria aislada comprende una secuencia de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 5. En algunos ejemplos, la bacteria aislada comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 99 % de identidad de secuencia con cualquiera de la SEQ ID NO: 6. En algunos ejemplos, la bacteria aislada comprende una secuencia de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 6. En algunos ejemplos, la bacteria aislada comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 99 % de identidad de secuencia con cualquiera de la SEQ ID NO: 7. En algunos ejemplos, la bacteria aislada comprende una secuencia de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 7. En algunos ejemplos, la bacteria aislada comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 99 % de identidad de secuencia con cualquiera de la SEQ ID NO: 8. En algunos ejemplos, la bacteria aislada comprende una secuencia de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 8. En algunos ejemplos, la bacteria aislada comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 99 % de identidad de secuencia con cualquiera de la SEQ ID NO: 9. En algunos ejemplos, la bacteria aislada comprende una secuencia de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 9. En algunos ejemplos, la bacteria aislada comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 99 % de identidad de secuencia con cualquiera de la SEQ ID NO: 10. En algunos ejemplos, la bacteria aislada comprende una secuencia de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 10.

En algunos ejemplos, la bacteria aislada comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 99 % de identidad de secuencia con cualquiera de la SEQ ID NO: 11. En algunos ejemplos, la bacteria aislada comprende una secuencia de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 11.

En algunos ejemplos, la bacteria aislada comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 99 % de identidad de secuencia con cualquiera de la SEQ ID NO: 12. En algunos ejemplos, la bacteria aislada comprende una secuencia de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 12.

En algunos ejemplos, la bacteria aislada comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 99 % de identidad de secuencia con cualquiera de la SEQ ID NO: 13. En algunos ejemplos, la bacteria aislada comprende una secuencia de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 13.

En algunos ejemplos, la bacteria aislada comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 99 % de identidad de secuencia con cualquiera de la SEQ ID NO: 14. En algunos ejemplos, la bacteria aislada comprende una secuencia de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 14.

En algunos ejemplos, la bacteria aislada comprende además una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 10 %, al menos 15 %, al menos 20 % de variedad de secuencias con: Dyella ginsengisoli. En algunos ejemplos, la bacteria aislada comprende además una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 10 %, al menos 15 %, al menos 20 % de variedad de secuencias con: Frateuria aurantia.

Se aprecia que un experto en la técnica sepa determinar la secuencia de polinucleótidos de Dyella ginsengisoli o Frateuria aurantia (véase,Jung y otros. Int J Syst Evol Microbiol. 2009; 460-5 y Li y otros. J Environ Sci, 2009; 21(2): 211-7) y determinando así la variedad de secuencia de la bacteria descrita en la presente descripción en contraposición a la bacteria Dyella ginsengisoli o Frateuria aurantia. En ejemplos específicos, el gen ARNr 16S de la bacteria descrita en la presente descripción tiene una identidad de secuencia del 97 % con el gen de ARNr 16S de Dyella ginsengisoli (número de acceso EF191353; SEQ ID NO: 15).

En ejemplos específicos, la secuencia ITS de la bacteria descrita en la presente descripción tiene una identidad de secuencia de aproximadamente el 84 % con la secuencia ITS de Frateuria aurantia (número de acceso CP003350). En algunos ejemplos, "que tiene al menos un 85 % de identidad" con una secuencia de ácido nucleico referenciada se refiere además a al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 % o al menos 94 % %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o al menos 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico de referencia, que incluye cualquier valor o intervalo entre ellos.

Como se describe a continuación, la SEQ ID NO: 1 puede detectarse mediante el uso del par de cebadores que tiene la secuencia de ácido nucleico como se establece en las SEQ ID NO: 16-17 o la secuencia de sonda que tiene la secuencia de ácido nucleico como se establece en las SEQ ID NO: 18 -19. Como se describe más adelante en la presente descripción, la SEQ ID NO: 2 puede detectarse mediante el uso del par de cebadores que tiene la secuencia de ácido nucleico como se establece en las SEQ ID NO: 16-17. Un experto en la técnica apreciará que los cebadores y las sondas se proporcionan en la presente descripción como un ejemplo no limitativo para detectar el ARNr 16S (SEQ ID NO: 1) y la secuencia del espaciador transcrito interno (ITS) (SEQ ID NO: 2), respectivamente, de la bacteria descrita en la presente descripción.

En ejemplos particulares, la bacteria descrita en la presente descripción está en forma de cultivo biológicamente puro. Como se usa en la presente descripción, la frase "cultivo biológicamente puro" se refiere a un cultivo de la bacteria, en donde al menos 80 % (por ejemplo, al menos el 85%, 90 %, 95 % o incluso 100 %) de los microorganismos en el cultivo y/o en la composición son de estas bacterias.

En algunos ejemplos, un cultivo biológicamente puro también se denomina "un aislado". El término "aislado" pretende referirse específicamente a un organismo que se extrae de su fuente original y se purifica de los componentes adicionales con los que se asoció originalmente y, por lo tanto, es alterado por la mano del hombre de su entorno natural. Cabe señalar que la composición puede incluir células bacterianas completas, partes de las mismas y extractos de las mismas. Una bacteria aislada se refiere a una bacteria que, por ejemplo, es cultivada, purificada y/o cultivada por separado del entorno en el que se encuentra de forma natural. El material aislado comprende además bacterias aisladas y cultivadas por separado del entorno en el que se encontraban, donde estos aislados están presentes en composiciones purificadas que no contienen ninguna cantidad significativa de otros microorganismos tales como otras cepas bacterianas. Una "bacteria aislada" como se usa en la presente descripción no incluye la bacteria tal como existe en su entorno natural antes del aislamiento y/o la purificación sustancial.

En algunos ejemplos, dichas bacterias aisladas se aíslan del entorno natural, tal como por ejemplo del saltamontes Hyalesthes obsoletus (Hemiptera: Cixiidae), mediante etapas conocidas en la técnica. Como se demuestra más abajo en la presente descripción, la bacteria descrita en la presente descripción es una bacteria Gram negativa, aeróbica, con forma de bastón que pertenece a la familia Xanthomonadaceae (en la que no se ha informado de ninguna especie formadora de esporas).

Como se usa en la presente descripción, el término "genoma" se refiere a la información genética total o al material hereditario que posee un organismo, por ejemplo, el complemento genético completo de una bacteria. Un genoma puede comprender ARN o ADN. Típicamente, un genoma bacteriano es circular.

Como se usa en la presente descripción, el término "ácido nucleico" es bien conocido en la técnica. Un "ácido nucleico", tal como se usa en la presente descripción, se referirá generalmente a una molécula (por ejemplo, una hebra) de ADN, ARN o un derivado o análogo del mismo, que comprende una nucleobase. Una nucleobase incluye, por ejemplo, una base de purina o pirimidina natural que se encuentra en el ADN (por ejemplo, una adenina "A", una guanina "G", una timina "T" o una citosina "C") o ARN (por ejemplo, una A, una G, un uracilo "U" o una C).

Como se usa en la presente descripción, las expresiones "secuencia de nucleótidos", "secuencia de ácidos nucleicos", "secuencia de polinucleótidos" y frases equivalentes o similares se refieren al orden de los monómeros de nucleótidos en el polímero de nucleótidos. Por convención, una secuencia de nucleótidos normalmente se escribe en la dirección 5' a 3'. Un polinucleótido puede ser un polímero de ARN o ADN de cadena simple o doble, que opcionalmente contiene las bases de nucleótidos sintéticas, no naturales o alteradas. A menos que se indique lo contrario, una secuencia de polinucleótidos particular de los ejemplos incluye opcionalmente las secuencias complementarias, además de la secuencia explícitamente indicada. Como se usa en la presente descripción, no se pretende que el término "polinucleótido" se limite a las estructuras de polinucleótidos naturales, secuencias de nucleótidos naturales, cadenas principales naturales o enlaces internucleotídicos naturales. Un experto en la técnica conoce bien la amplia variedad de análogos de polinucleótidos, nucleótidos no naturales, enlaces fosfodiéster no naturales y análogos de internucleótidos que encuentran uso en los ejemplos.

Los ejemplos descritos en la presente descripción proporcionan además las variantes y análogos de la bacteria descrita. El término "variante" de una bacteria de referencia designa una bacteria que tiene variaciones en la secuencia genómica y/o polipéptidos codificados en comparación con la bacteria de referencia, mientras conserva la misma característica fenotípica que la bacteria de referencia. Las variantes también abarcan bacterias que tienen variaciones en la secuencia genómica y/o polipéptidos codificados en comparación con la bacteria de referencia, al tiempo que mejoran la característica fenotípica como la bacteria de referencia. En algunos ejemplos, las variantes son variantes modificadas genéticamente (por ejemplo, resultado de mutaciones modificadas genéticamente en la secuencia de ácido nucleico de la bacteria de referencia).

Las variantes pueden comprender, por ejemplo, mutaciones silenciosas, mutaciones conservativas, deleciones menores y/o replicaciones menores de material genético y conservar las características fenotípicas de la bacteria de referencia. En algunos ejemplos, las variantes conservan cualquier característica o propiedad observable que dependa del genoma de la bacteria de los ejemplos, tal como las características fenotípicas de la bacteria y/o la actividad inhibidora contra el fitoplasma.

El término "característica fenotípica" designa la morfología y/o el intervalo de huéspedes de una bacteria. Los métodos para el fenotipado bacteriano son bien conocidos en la técnica.

De acuerdo con algunos ejemplos, también se describen en la presente descripción las variantes que tienen un genoma que comprende al menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con las secuencias de ácido nucleico como se establece en las SEQ ID NO: 2-14. Cada posibilidad representa un ejemplo separado. De acuerdo con algunos ejemplos, en la presente descripción se describen las variantes que tienen un genoma que comprende al menos 1, al menos 2, al menos 4, al menos 5 o al menos 10 mutaciones relativas a las secuencias de ácido nucleico como se establece en las SEQ ID NO: 2-14.

En algunos ejemplos, las mutaciones incluyen deleciones, inserciones, sustituciones o cualquier combinación de las mismas. En algunos ejemplos, las deleciones, inserciones, sustituciones pueden encontrarse en una región no codificante tal como operón y regiones promotoras. En algunos ejemplos, las deleciones, inserciones, sustituciones pueden encontrarse en una región codificante de la bacteria. En algunos ejemplos, las deleciones, inserciones, sustituciones son mutaciones silenciosas que no dan como resultado cambios en la secuencia de aminoácidos codificada.

El término "% de identidad" en relación con las secuencias de ácidos nucleicos designa el nivel de identidad u homología entre las secuencias y puede determinarse mediante técnicas conocidas en la técnica. El término "% de variedad" en relación con las secuencias de ácidos nucleicos designa el nivel de variedad entre las secuencias y puede determinarse mediante técnicas conocidas en la técnica.

El porcentaje de identidad de secuencia puede determinarse, por ejemplo, mediante Fitch y otros, versión del algoritmo (Fitch y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 1382-1386 (1983)) descrito por Needleman y otros, (Needleman y otros, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970)), después de alinear las secuencias para proporcionar la máxima homología. Alternativamente, la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias puede lograrse mediante el uso del algoritmo matemático de Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Tal algoritmo está incorporado en el programa BLASTP de Altschul y otros. (1990) J. Mol. Biol. 215, 403-410. Para obtener las alineaciones con espacios con fines comparativos, Gapped BLAST se utiliza como se describe enAltschul y otros (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se usan los parámetros predeterminados de los respectivos programas (por ejemplo, XBLAST).

Las variantes pueden prepararse para bacteriófagos específicos mediante métodos químicos, radiológicos u otros bien conocidos por los expertos en la técnica. Las variantes también pueden prepararse mediante métodos de recombinación homóloga bien conocidos por los expertos en la técnica. Las variantes que tienen una secuencia mutada pueden comprender deleciones, inserciones, adiciones o sustituciones, todas las cuales pueden construirse mediante técnicas rutinarias.

Composiciones de las bacterias

En algunos ejemplos, en la presente descripción se describe una composición (denominada en la presente descripción como: "composición bacteriana") que comprende la bacteria de los ejemplos, es decir, la bacteria tipo Dyella.

(i) Emulsionantes

En algunos ejemplos, la composición de las bacterias comprende además un emulsionante. El término "emulsionante", como se usa en la presente descripción, se refiere a una sustancia que promueve la formación y estabilización de una emulsión. De acuerdo con algunos ejemplos, el emulsionante se selecciona del grupo que consiste en dodecilsulfato de sodio, un fosfolípido, un glicolípido, un triglicérido, lecitina, jabón, estearato de sodio, estearato de potasio, estearato de amonio, oleato de sodio, oleato de potasio, oleato de amonio, palmitato, palmitato de potasio y palmitato de amonio.

En un ejemplo, el emulsionante es un tensioactivo. El término "tensioactivo" (también conocido como agente surfactante) incluye cualquier agente que disminuya la tensión superficial (o tensión interfacial) entre dos líquidos o entre un líquido y un sólido o entre un gas y un líquido. Los tensioactivos pueden actuar como detergentes, agentes humectantes, emulsionantes, agentes espumantes y/o dispersantes.

Típicamente, el tensioactivo incluye cualquier tensioactivo aceptable no iónico, aniónico, catiónico, zwitteriónico y anfótero. En algunos ejemplos, el emulsionante es un tensioactivo no iónico. En algunos ejemplos, el emulsionante es un tensioactivo aniónico. En algunos ejemplos, el emulsionante es un tensioactivo catiónico. En algunos ejemplos, el emulsionante es un tensioactivo anfifílico. De acuerdo con algunos ejemplos, el emulsionante se selecciona del grupo que consiste en un emulsionante catiónico, un emulsionante aniónico, un emulsionante no iónico y combinaciones de los mismos.

Los tensioactivos no iónicos incluyen, pero no se limitan a, ésteres de ácidos grasos de sorbitán, ésteres de ácidos grasos de polioxisorbitán, éteres de alcoholes superiores de polioxialquileno y ésteres de alcoholes superiores de polioxialquileno. Los ejemplos no limitantes de tensioactivos no iónicos incluyen ésteres de sorbitol de polioxietileno tales como polisorbato 80 (TWEEN® 80), polisorbato 60 (TWEEN® 60) y polisorbato 20 (TWEEN® 20), Tyloxapol; éteres de polioxietilenisooctilfenilo tales como Triton X-100, éteres de polioxietilennonilfenilo tales como NP-40, éteres de polioxietilendodecilo tales como Brij 58, octilglucósido y alquilmaltósido tal como n-dodecil-beta-D-maltósido; poloxámero 4070; poloxámero 188; y estearato de polioxilo 40. Cada posibilidad es un ejemplo separado. Los tensioactivos no iónicos también pueden incluir, pero no se limitan a, etoxilatos de alcoholes grasos (alquilpolietilenglicoles); polietilenglicoles de alquilfenol; polietilenglicoles de alquilmercaptano; etoxilatos de aminas grasas (alquilaminopolietilenglicoles); etoxilatos de ácidos grasos (acilpolietilenglicoles); etoxilatos de polipropilenglicol (Pluronics™; por ejemplo, Pluronic F-68); alquilolamidas de ácidos grasos (polietilenglicoles de amidas de ácidos grasos); N-alquil-, N-alcoxipoli-hidroxi-amida de ácido graso, ésteres de sacarosa; ésteres de sorbitol y éteres de poliglicol, aceite de ricino hidrogenado con polioxietileno, alcanolamida de ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos de sacarosa, mono, di y trioctanoato de glicerol. Cada posibilidad es un ejemplo separado.

Los tensioactivos aniónicos incluyen, pero no se limitan a, sulfatos de alquilo, sulfatos de olefina, sulfatos de éter, sulfatos de monoglicérido, sulfonatos de alquilo, sulfonatos de arilo, sulfonatos de olefina, sulfosuccinatos de alquilo, sulfosuccinatos de arilo, que incluye el dodecilsulfato de sodio (SDS), sulfosuccinato de dioctilo y sodio, sulfonato de sodio Cada posibilidad representa un ejemplo separado.

Los tensioactivos catiónicos incluyen, pero no se limitan a, sales de benzalconio, polioxialquilenalquilaminas, alquilaminas, ésteres de ácidos grasos de alcanolamina, ésteres de ácidos grasos de amonio cuaternario, sales de dialquil amonio, sales de alquil piridinio que incluyen estearilamina, oleato de trietanolamina, cloruro de bencetonio. Cada posibilidad es un ejemplo separado.

Los tensioactivos anfóteros incluyen, por ejemplo, tensioactivos anfóteros a base de imidazolina (tal como una sal de 2-cocoil-2-imidazolinio hidróxido-1-carboxietiloxi-2-sódico), tensioactivos a base de betaína (tal como alquil betaína, amida betaína y sulfo betaína) y acilmetil taurina. Cada posibilidad es un ejemplo separado.

El tensioactivo está presente en la composición de los ejemplos en una cantidad de aproximadamente 0,001 % a aproximadamente 10 % en peso del peso total de la composición, alternativamente en una cantidad de aproximadamente 0,001 % a aproximadamente 0,5 % en peso, o en una cantidad de aproximadamente 0,001 % a aproximadamente 0,2 % en peso, o en una cantidad de aproximadamente 0,001 % a aproximadamente 0,05 % en peso del peso total de la composición.

La emulsión, en algunos ejemplos, se obtiene preparando y mezclando dos soluciones, una fase acuosa (fase acuosa) y otra fase orgánica (fase oleosa), para dispersar una fase en la otra.

(ii) Sustrato de crecimiento

En algunos ejemplos, la composición de los ejemplos comprende la bacteria descrita en la presente descripción y un sustrato de crecimiento. En algunos ejemplos, los términos "sustrato de crecimiento" o "medio de crecimiento", que se usan en la presente descripción de manera intercambiable, pretenden significar un medio usado para el crecimiento de bacterias en un cultivo que comprende los componentes necesarios para el crecimiento de las bacterias, tales como, sin limitación, una fuente de carbono/energía.

Normalmente, la composición de estos ejemplos puede producirse al cultivar la cepa descrita en un medio líquido o en placas de agar. El medio líquido puede ser cualquier medio nutritivo adecuado que comprenda fuentes de carbono y nitrógeno y sales inorgánicas. Los medios adecuados están disponibles o pueden estar disponibles de fuentes comerciales. Dichos medios pueden estar en forma líquida o en forma sólida.

En algunos ejemplos, el sustrato de crecimiento es un medio de crecimiento selectivo. En algunos ejemplos, el medio de crecimiento selectivo está diseñado para suprimir el crecimiento de algunos microorganismos mientras permite el crecimiento de otros (por ejemplo, el microorganismo descrito).

En algunos ejemplos, el medio de cultivo selectivo comprende un azúcar y/o un aminoácido, o un derivado del mismo.

Se entiende que el término "aminoácido" (o "aminoácidos", también denominados "tipos de aminoácidos") incluye, sin limitarse a ellos, los veinte aminoácidos naturales, como se conoce en la técnica. Además, a menos que se indique lo contrario, el término "aminoácido" puede referirse tanto a D- como a L-aminoácidos. En algunos ejemplos también son concebibles aminoácidos no convencionales o modificados (por ejemplo, sintéticos).

En algunos ejemplos, el medio de crecimiento selectivo comprende uno o más aminoácidos seleccionados de, pero que no se limitan a, nitroanilida de prolina, Y-L-glutamil p-nitroanilida, fenilalanina, glicina, arginina y cualquier combinación de los mismos.

El término azúcar pretende incluir cualquier mono, di o trisacárido y cualquiera de sus formas reducidas u oxidadas que todavía poseen grupos hidroxilo. Los ejemplos no limitantes de sacáridos incluyen, por ejemplo, fructosa, glucosa, sacarosa, ramnosa, galactosa, lactosa, arabinosa, ácido glucurónico, maltosa y rafinosa.

Un derivado ilustrativo de azúcar es el glucósido. Otro derivado ilustrativo de azúcar es un alcohol de azúcar. El término "glucósido" es genérico y la presencia de un residuo de azúcar en particular se indica mediante el término apropiado, como glucósido, galactósido, fructósido, etc. Puede considerarse que el glucósido se deriva de un monosacárido, un disacárido, un trisacárido o incluso un oligosacárido que contiene hasta, por ejemplo, 9 unidades de azúcar.

En algunos ejemplos, el medio de cultivo selectivo comprende uno o más azúcares o derivados de azúcares seleccionados de, pero que no se limitan a, arabinosa, manosa, sacarosa, melibiosa, galactosa, inositol, glucósido y cualquier combinación de los mismos.

En algunos ejemplos, el glucósido se selecciona de, sin limitación, de p-nitrofenil-(p-glucósido (p-n-p-p-Glc), p-n-p-aglucósido y p-n-p-a-p-glucósido. En modalidades ilustrativas, el medio de crecimiento comprende p-n-p-a-pglucósido.

En algunos ejemplos, el medio de crecimiento selectivo comprende uno o más materiales seleccionados de, sin limitarse a ellos, p-n-p-xilósido, esculina y urea.

En algunos ejemplos, el medio de crecimiento selectivo comprende nitrofuración, ciprofloxacina, cefalotina, meropenem, norfloxacina, ácido nalidíxico, sulfato de colistina, imipenem, cefeprima, aztreonam y cefuroxima.

(iii) portadores

Las composiciones de la invención también pueden incluir uno o más portadores, preferentemente uno o más portadores aceptables en la agricultura. En una modalidad, el portador, como un portador aceptable en la agricultura, puede ser sólido o líquido. Los portadores útiles en la presente descripción incluyen cualquier sustancia típicamente usada para formular una composición agrícola.

En una modalidad, el portador aceptable en la agricultura puede seleccionarse del grupo que comprende rellenos, solventes, excipientes, tensioactivos, agentes de suspensión, esparcidores/pegatinas (adhesivos), agentes antiespumantes, dispersantes, agentes humectantes, agentes reductores de la deriva, auxiliares, adyuvantes o una mezcla de los mismos.

Las composiciones de la invención pueden formularse como, por ejemplo, concentrados, soluciones, aerosoles, baños de inmersión, baños, emulsiones, polvos humectables, polvos solubles, concentrados en suspensión, polvos, gránulos, gránulos dispersables en agua, microcápsulas, pastas, geles y otros tipos de formulaciones mediante procedimientos bien establecidos. Estos procedimientos incluyen la mezcla y/o molienda de los ingredientes activos con sustancias portadoras aceptables en la agricultura, tal como rellenos, solventes, excipientes, tensioactivos, agentes de suspensión, esparcidores/pegatinas (adhesivos), agentes antiespumantes, dispersantes, agentes humectantes, agentes reductores de deriva, auxiliares y adyuvantes.

En una modalidad, los portadores sólidos incluyen, pero no se limitan a, tierras minerales tales como ácidos silícicos, geles de sílice, silicatos, talco, caolín, arcilla attapulgus, piedra caliza, cal, creta, tronco, loess, arcilla, dolomita, tierra de diatomeas, alúminas, sulfato de calcio, sulfato de magnesio, óxido de magnesio, plásticos triturados, fertilizantes tales como sulfato de amonio, fosfato de amonio, nitrato de amonio y ureas, y productos vegetales tales como harinas de cereales, harina de corteza, harina de madera y harina de cáscara de nuez, polvos celulósicos y similares. Como portadores sólidos para gránulos son adecuados los siguientes: rocas naturales trituradas o fraccionadas tales como calcita, mármol, piedra pómez, sepiolita y dolomita; gránulos sintéticos de harinas inorgánicas u orgánicas; gránulos de materia orgánica tales como aserrín, cáscaras de coco, mazorcas de maíz, cáscaras de maíz o tallos de tabaco; tierra de diatomeas, fosfato tricálcico, polvo de corcho o negro de humo absorbente; polímeros solubles en agua, resinas, ceras; o fertilizantes sólidos. Tales composiciones sólidas pueden, si se desea, contener uno o más agentes humectantes, dispersantes, emulsionantes o colorantes compatibles que, cuando son sólidos, también pueden servir como diluyentes.

En una modalidad, el portador también puede ser líquido, por ejemplo, agua; alcoholes, en particular butanol o glicol, así como también sus éteres o ésteres, en particular acetato de metilglicol; cetonas, particularmente acetona, ciclohexanona, metiletilcetona, metilisobutilcetona o isoforona; fracciones de petróleo tales como hidrocarburos parafínicos o aromáticos, particularmente xilenos o alquilnaftalenos; aceites minerales o vegetales; hidrocarburos alifáticos clorados, particularmente tricloroetano o cloruro de metileno; hidrocarburos clorados aromáticos, particularmente clorobencenos; solventes solubles en agua o fuertemente polares tales como dimetilformamida, dimetilsulfóxido o N-metilpirrolidona; gases licuados; o similares o una mezcla de los mismos.

Los esparcidores/pegatinas promueven la capacidad de las composiciones de la invención para adherirse a las superficies de las plantas. Los ejemplos de tensioactivos, esparcidores/adhesivos incluyen, pero no se limitan a, Tween y Tritón (Rhom and Hass Company), Fortune®, Pulse, C. Daxoil®, Codacide oil®, D-C. Tate®, Supamet Oil, Bond®, Penetrant, Glowelt® y Freeway, Citowett®, Fortune Plus™, Fortune Plus Lite, Fruimec, Fruimec lite, sales de metales alcalinos, metales alcalinotérreos y sales de amonio de ácidos sulfónicos aromáticos, por ejemplo, ácido ligninsulfónico, ácido fenolsulfónico, ácido naftalenosulfónico y ácido dibutilnaftalenosulfónico, y de ácidos grasos, sulfonatos de alquilo y alquilarilo, y sulfatos de alquil, lauril éter y alcohol graso, y sales de hexadecanoles, heptadecanoles y octadecanoles sulfatados, sales de éteres de glicol de alcohol graso, productos de condensación de naftaleno sulfonado y derivados de naftaleno con formaldehído, productos de condensación de naftaleno o ácidos naftalenosulfónicos con fenol y formaldehído, éteres de polioxietilenoctilfenol, isooctilfenol etoxilado, octilfenol etoxilado y nonilfenol etoxilado, alquilfenol poliglicol éteres, tributilfenil poliglicol éteres, alquilaril poliéter alcoholes, alcohol isotridecílico, grasas alcohol óxido de etileno condensado es, aceite de ricino etoxilado, éteres alquílicos de polioxietileno, polioxipropileno etoxilado, éter acetal de poliglicol de alcohol laurílico, ésteres de sorbitol, licores residuales de sulfito de lignina y metilcelulosa. Cuando se seleccionan para su inclusión, uno o más tensioactivos agrícolas, tales como Tween, se incluyen deseablemente en la composición de acuerdo con protocolos conocidos.

Los agentes humectantes reducen la tensión superficial del agua en la composición y, por lo tanto, aumentan el área superficial sobre la que puede aplicarse una cantidad dada de la composición. Los ejemplos de agentes humectantes incluyen, pero no se limitan a, sales de ácidos poliacrílicos, sales de ácidos lignosulfónicos, sales de ácidos fenolsulfónicos o naftalenosulfónicos, policondensados de óxido de etileno con alcoholes grasos o ácidos grasos o ésteres grasos o aminas grasas, fenoles sustituidos (particularmente alquilfenoles o arilfenoles), sales de ésteres de ácido sulfosuccínico, derivados de la taurina (particularmente alquiltauratos), ésteres fosfóricos de alcoholes o de policondensados de óxido de etileno con fenoles, ésteres de ácidos grasos con polioles, o derivados funcionales sulfato, sulfonato o fosfato de los compuestos anteriores.

Como se describió anteriormente, las composiciones de la presente invención pueden usarse solas o en combinación con uno o más agentes agrícolas, que incluyen pesticidas, insecticidas, acaracidas, fungicidas adicionales, bactericidas, herbicidas, antibióticos, antimicrobianos, nemacidas, rodenticidas, entomopatógenos, feromonas, atrayentes, reguladores del crecimiento vegetal, hormonas vegetales, reguladores del crecimiento de insectos, quimioesterilizantes, agentes microbianos de control de plagas, repelentes, virus, fagoestimulantes, nutrientes vegetales, fertilizantes vegetales y controles biológicos. Cuando se usa en combinación con otros agentes agrícolas, la administración de los dos agentes puede ser separada, simultánea o secuencial. Los expertos en la técnica conocen ejemplos específicos de estos agentes agrícolas, y muchos están fácilmente disponibles comercialmente.

Los ejemplos de fungicidas incluyen, pero no se limitan a, las siguientes clases de fungicidas: carboxamidas, bencimidazoles, triazoles, hidroxipiridinas, dicarboxamidas, fenilamidas, tiadiazoles, carbamatos, cianooximas, derivados del ácido cinámico, morfolinas, imidazoles, beta-metoxiacrilatos y piridinas/pirimidinas. Otros ejemplos de fungicidas incluyen, pero no se limitan a, fungicidas naturales, fungicidas orgánicos, fungicidas a base de azufre, fungicidas de cobre/calcio e inductores de las defensas del huésped vegetal. Los ejemplos de fungicidas naturales incluyen, pero no se limitan a, leche entera, suero, ácidos grasos o ácidos grasos esterificados. Los ejemplos de fungicidas orgánicos incluyen, pero no se limitan a, cualquier fungicida que pase un estándar de certificación orgánica, tal como agentes de biocontrol, productos naturales, elicitores (algunos de los cuales también pueden clasificarse como productos naturales) y fungicidas de azufre y cobre (limitados a uso restringido). En algunas modalidades, pueden emplearse fungicidas no orgánicos.

Los ejemplos de pesticidas incluyen, pero no se limitan a, azoxistrobina, bitertanol, carboxina, Cu2O, cimoxanil, cyproconazole, cyprodinil, dichlofluamid, difenoconazole, diniconazole, epoxiconazole, fenpiclonil, fludioxonil, fluquiconazole, flusilazole, flutriafol, furalaxyl, guazatin, hexaconazole, hymexazol, imazalil, imibenconazol, ipconazol, kresoxim-metil, mancozeb, metalaxil, R-metalaxil, metconazol, oxadixil, pefurazoato, penconazol, pencycuron, procloraz, propiconazol, piroquilona, SSF-109, espiroxamina, tebuconazol, tiabendazol, tolifluamida, triazóxido, triadimefón, triadimenol, triflumizol, triticonazol y uniconazol.

Es importante que cualquier aditivo usado esté presente en cantidades que no interfieran con la eficacia de los agentes de control biológico.

La composición puede comprender además un estabilizador. Como se usa en la presente descripción, el término "estabilizador" se refiere a un excipiente que mantiene la estructura química y/o la actividad biológica de la bacteria de los ejemplos. En algunas modalidades, el estabilizador se selecciona del grupo que consiste en Tween, Tritón, tiloxapol, pluronics, Brijcs, Spans, poloxámeros y cmulphors. En algunas modalidades, el estabilizador es polivinilpirrolidona (PVP). En algunas modalidades, el estabilizador es polisorbato. En algunas modalidades, el estabilizador se selecciona del grupo que consiste en polisorbato, dodecilbencenosulfato de sodio (SDBS), poli(etilenglicol)-bloque-poli(propilenglicol)-bloque-poli(etilenglicol) y monolaurato de sorbitán de polietilenglicol. (Tween 20).

La composición puede comprender además un agente tamponador. El "agente tamponador" significa un agente o agentes que se adicionan a la composición para ajustar el valor del pH en una preparación en solución o en una preparación liofilizada cuando se reconstituye. La determinación de este pH óptimo puede lograrse mediante el uso de métodos generalmente disponibles en la técnica. Los agentes tamponadores representativos que pueden incluirse en las composiciones de la presente invención son, por ejemplo, tampón fosfato, tampón acetato, tampón Tris y tampón citrato. Cada posibilidad es una modalidad separada de la invención. El agente tamponador ajusta el valor de pH de la solución para que se mantenga la estabilidad de la bacteria o los compuestos que contiene. El valor de pH de la presente composición está, en algunas modalidades, en el intervalo de aproximadamente 5 a aproximadamente 8.

Las composiciones pueden prepararse en varias formas. Una preparación comprende una forma en polvo de una composición de la invención. En otra forma, la composición se mezcla con un diluyente tal como agua para formar un spray, espuma, gel o baño y se aplica apropiadamente mediante el uso de los protocolos conocidos.

También pueden usarse las composiciones formuladas para otros métodos de aplicación tales como inyección, frotamiento o cepillado, al igual que cualquier método conocido en la técnica. También se contemplan las aplicaciones indirectas de la composición al entorno de la planta o al entorno tal como el suelo, el agua o como recubrimientos de semillas.

La concentración a la que se van a aplicar las composiciones de la invención para que sean agentes de control biológico efectivos puede variar en dependencia del uso final, condición fisiológica de la planta; tipo (que incluyen las especies bacterianas), concentración y grado de infección por patógenos; temperatura, estación, humedad, etapa de la estación de crecimiento y edad de la planta; número y tipo de plaguicidas convencionales u otros tratamientos (incluidos fungicidas) que se están aplicando; y tratamientos de plantas (tales como deshojar y podar).

Se contemplan las aplicaciones repetidas en el mismo o en diferentes momentos en un ciclo de cultivo. Las composiciones de la invención pueden aplicarse antes o después de la temporada. Esto puede ocurrir durante la floración o durante la fructificación, la emergencia del tubérculo y similares. Las composiciones de la invención también pueden aplicarse inmediatamente antes de la cosecha o después de la cosecha.

Las composiciones expuestas anteriormente pueden formularse de cualquier manera. Los ejemplos de formulación no limitantes incluyen, pero no se limitan a, granos secos tal como concentrados emulsionables (EC), polvos humectables (WP), líquidos solubles (SL), aerosoles, soluciones concentradas de volumen ultra bajo (ULV), polvos solubles (SP), microencapsulación, gránulos dispersos en agua (WDG), materiales fluidos (FL), microemulsiones (ME), nanoemulsiones (NE), etc, dentro de un intervalo de 0,01 % a 99,99 %.

Las composiciones pueden estar en forma de líquido, gel, sólido o biofumigante. Puede prepararse una composición sólida sumergiendo un portador sólido en una solución de ingredientes activos y secando la suspensión en condiciones suaves, tales como evaporación a temperatura ambiente o evaporación al vacío a 65 °C, o más bajo. Una composición sólida también puede ser granos secos cultivados con la cepa. La composición puede comprender adicionalmente un tensioactivo para usarse con el propósito de emulsificación, dispersión, humectación, esparcimiento, integración, control de la desintegración, estabilización de los ingredientes activos y mejora de la fluidez o inhibición de la oxidación.

Compuestos derivados de las bacterias tipo Dyella y análogos de los mismos

De acuerdo con alguna modalidad, la composición comprende una pluralidad de compuestos (por ejemplo, compuestos orgánicos volátiles (VOC)) que se producen a partir de un cultivo biológicamente puro de la bacteria descrita. De acuerdo con alguna modalidad, la composición comprende una pluralidad de compuestos sintéticos idénticos, análogos o derivados de dichos compuestos.

De acuerdo con la presente invención, la composición comprende quinolinacarboxaldehído e hidroximetil-2-furaldehído. También se describen en la presente descripción en algunos ejemplos, dicha pluralidad de compuestos que se seleccionan de quinolinacarboxaldehído, hidroximetil-2-furaldehído o cualquier derivado de los mismos. En algunos ejemplos, la composición comprende quinolinacarboxaldehído o hidroximetil-2-furaldehído o cualquier derivado de los mismos. En algunas modalidades, los ejemplos comprenden quinolinacarboxaldehído e hidroximetil-2-furaldehído, cualquier derivado de los mismos.

En algunas modalidades, la composición comprende quinolinacarboxaldehído e hidroximetil-2-furaldehído, en una proporción de 1:10 a 10:1. En algunas modalidades, la composición comprende quinolinacarboxaldehído e hidroximetil-2-furaldehído, en una proporción de 1:5 a 5:1. En algunas modalidades, la composición comprende quinolinacarboxaldehído e hidroximetil-2-furaldehído, en una proporción de 1:4 a 4:1. En algunas modalidades, la composición comprende quinolinacarboxaldehído e hidroximetil-2-furaldehído, en una proporción de 1:3 a 3:1. En algunas modalidades, la composición comprende quinolinacarboxaldehído e hidroximetil-2-furaldehído, en una proporción de 1:2 a 2:1.

En algunos ejemplos, el quinolinacarboxaldehído o un derivado del mismo tiene una estructura representada por la fórmula I:

en donde cada uno de Ri a R5 representa un sustituyente, y en donde uno a cuatro sustituyentes de R1 a R7, en cada caso, comprenden o se seleccionan del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, arilo, heteroalicíclico, heteroarilo, alcoxi, hidroxi, tiohidroxi, tioalcoxi, ariloxi, tioariloxi, amino, nitro, halo, trihalometilo, ciano, amida, carboxi, sulfonilo, sulfoxi, sulfinilo, sulfonamida, o es un anillo condensado, y al menos uno de R1 a R5 está independientemente en la forma representada por la fórmula 12:

En algunas modalidades, el quinolinacarboxaldehído tiene la estructura de fórmula II (también denominada 4-quinolinacarboxaldehído):

En algunos ejemplos, un derivado de 5-(hidroximetil)-2-furfural se selecciona de, pero no se limita a: 5-metilfurfural, 2-furilalquilcetona, 2,5-furandicarboxaldehído, furfural, alcohol furfurílico, 5-alquil-furfural, ácido 2,5-furandicarboxílico. En la presente descripción, "alquilo" puede referirse a alquilo C1-C5, por ejemplo, metilo.

Como se demuestra en la sección de ejemplos que sigue, los presentes inventores han demostrado que la combinación de quinolinacarboxaldehído e hidroximetil-2-furaldehído presenta un efecto antimicrobiano sinérgico. En algunas modalidades, el término sinergismo, o cualquier derivado gramatical del mismo, se define como la acción simultánea de dos o más compuestos en los que la respuesta total de un organismo a la combinación es mayor que la suma de los componentes individuales. Aunque se han estudiado muchas combinaciones de compuestos antimicrobianos, rara vez se revela un efecto sinérgico y el uso global de combinaciones antimicrobianas con actividad mejorada sinérgicamente es bastante limitado.

Métodos de extracción

En algunas modalidades, los compuestos descritos en la presente descripción se extraen de un medio o un sobrenadante que comprende las bacterias descritas.

Como se usa en la presente descripción, el término "extracto", o cualquier derivado gramatical del mismo, incluye pero no se limita a productos (por ejemplo, concretos, oleorresinas, destilados, extractos de polvo seco, extractos fluidos y residuos) obtenidos de una fuente tal como una planta o animal a través de un proceso de extracción tal como la destilación, la extracción orgánica, la extracción alcohólica, la extracción acuosa y la extracción con solventes.

Los ejemplos no limitantes de solventes usados para la extracción incluyen metanol, acetona, terc-butil éter (MTBE), cloroformo y hexano. En modalidades ilustrativas, los solventes se seleccionan de metanol y acetona.

La destilación fraccionada y/o la cromatografía de absorción también son ejemplos no limitantes de métodos para extraer el producto deseado producido por los aislados bacterianos de los ejemplos descritos en la presente descripción. La destilación fraccionada se conoce en la técnica como la separación de una mezcla en sus componentes, o fracciones, tal como en la separación de compuestos químicos por su punto de ebullición calentándolos a una temperatura a la que se evaporarán varias fracciones del compuesto. La cromatografía de absorción es un método de separación física en el que los componentes de una mezcla se separan por diferencias en su distribución entre dos fases, una de las cuales es estacionaria (fase estacionaria) mientras que la otra (fase móvil) se mueve a través de ella en una dirección definida. Las sustancias deben interactuar con la fase estacionaria para ser retenidas y separadas por ella.

La cromatografía de gases es una técnica bien conocida para fraccionar y determinar las cantidades relativas de varios componentes en una muestra que contiene una mezcla de compuestos de diferentes volatilidades. Por ejemplo, la muestra se vaporiza y toda la cantidad resultante de gases se pasa a través de una columna de cromatografía analítica. Los procesos cromatográficos, tal como la cromatografía de gases, pueden determinar rápidamente el contenido de volátiles de una muestra de múltiples componentes, tal como la que producirían los aislados fúngicos de la presente invención.

Actividad antibacteriana

En algunas modalidades, la invención proporciona una composición antibacteriana. En algunas modalidades, la invención proporciona una composición antifitopatogénica.

En algunas modalidades, los compuestos de la invención y las composiciones que los comprenden se caracterizan por tener actividad antibacteriana, por ejemplo, actividad lítica contra una bacteria diana.

En algunas modalidades, se proporciona un método para tratar o prevenir la infección de plantas, por ejemplo, infección de plantas por fitoplasma. En algunas modalidades, el método comprende la etapa de tratar la planta con una de las composiciones descritas, reduciendo así los síntomas o previniendo la infección de la planta por fitoplasma.

Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona un método para matar un fitopatógeno o reducir sus síntomas, el método que comprende exponer el fitopatógeno a una cantidad efectiva de una composición que comprende 1 mM de quinolinacarboxaldehído e hidroximetil-2-furaldehído que es capaz de matar el fitopatógeno o reducir el daño o los síntomas del mismo.

También se describe en la presente descripción un método para reducir el daño general a una planta o parte de una planta causado por un fitopatógeno, el método que comprende exponer la planta o parte de la planta a una cantidad efectiva de cualquiera de las composiciones descritas (por ejemplo, la composición bacteriana en cualquier ejemplo de la misma) o al menos un compuesto producido por el cultivo biológico y capaz de matar el fitopatógeno o reducir los síntomas del mismo, reduciendo de esta manera el daño general a la planta o parte de la planta.

Las frases "actividad antifitopatogénica" y "eficacia antifitopatogénica" se usan en la presente descripción de manera intercambiable y se refieren a la capacidad de ciertos agentes, tales como ciertos microorganismos, para antagonizar uno o más fitopatógenos. El término "antibacteriano" significa una capacidad para antagonizar una o más bacterias, particularmente una o más bacterias fitopatógenas. De acuerdo con un agente antibacteriano, tal como una cepa bacteriana antifúngica, es un agente que es un antagonista de uno o más hongos, preferentemente de uno o más hongos fitopatógenos. Tal agente se considera en la presente descripción que tiene eficacia antifúngica.

El término "agente de control biológico" (BCA), tal como se usa en la presente descripción, se refiere a un agente biológico que actúa como antagonista de uno o más patógenos, tal como insectos fitopatógenos, bacterias fitopatógenas o protozoos fitopatógenos, o es capaz de controlar uno o más fitopatógenos. El antagonismo puede tomar varias formas. En una forma, el agente de control biológico puede actuar simplemente como repelente. De otra forma, el agente de control biológico puede hacer que el medio ambiente sea desfavorable para el fitopatógeno. En otra forma preferida, el agente de control biológico puede parasitar, incapacitar, volver estéril, impedir el crecimiento y/o matar al fitopatógeno. Los mecanismos antagónicos incluyen, pero no se limitan a, antibiosis, parasitismo, infertilidad y toxicidad. Por lo tanto, puede decirse que los agentes que actúan como antagonistas de uno o más fitopatógenos tienen eficacia antifitopatogénica. Por ejemplo, puede decirse que un agente que es un antagonista de insectos fitopatógenos tiene eficacia micopatógena.

Como se usa en la presente descripción, una "composición de control biológico" es una composición que comprende o incluye al menos un agente de control biológico que es un antagonista de uno o más patógenos (por ejemplo, fitopatógenos). Dichos agentes de control incluyen, pero no se limitan a, agentes que actúan como repelentes, agentes que hacen que el entorno sea desfavorable para el patógeno y agentes que incapacitan, vuelven estéril y/o matan al patógeno. Por consiguiente, se considera que tal composición en la presente descripción tiene eficacia antifitopatogénica.

Por consiguiente, tal como se usa en la presente descripción, una "composición antifitopatogénica" es una composición que comprende o incluye al menos un agente que es un antagonista de uno o más fitopatógenos. Tal composición se considera en la presente descripción que tiene eficacia antifitopatogénica.

Como se usa en la presente descripción, el término "método" se refiere a maneras, medios, técnicas y procedimientos para llevar a cabo una tarea dada, que incluyen, pero no se limitan a aquellas maneras, medios, técnicas y procedimientos ya sea que se conocen, o se desarrollan fácilmente a partir de maneras, medios, técnicas y procedimientos conocidos por los practicantes de las técnicas química, farmacológica, biológica, bioquímica y médica.

Como se usa en la presente descripción, el término "tratar" incluye anular, inhibir sustancialmente, ralentizar o revertir la progresión de una condición, mejorar sustancialmente los síntomas clínicos o estéticos de una condición o prevenir sustancialmente la aparición de síntomas clínicos o estéticos de una condición.

El término "control" o "controlar", tal como se usa en la presente descripción, generalmente comprende prevenir, reducir o erradicar la infección por patógenos o inhibir la velocidad y el alcance de dicha infección, o reducir la población de patógenos en o sobre una planta o sus alrededores, en donde dicha prevención o la reducción en las infecciones o poblaciones es estadísticamente significativa con respecto a las infecciones o poblaciones no tratadas. También se contempla el tratamiento curativo. Preferentemente, dicho control se logra mediante una mayor mortalidad entre la población de patógenos.

Como se usa en la presente descripción, el término "reducir" se refiere a al menos 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % 90 % o más, reducción del crecimiento o incluso 100 % detención del crecimiento en un determinado tiempo en comparación con el crecimiento en ese tiempo dado del patógeno que no está expuesto al tratamiento como se describe en la presente descripción.

Como se usa en la presente descripción, el término "prevención" en el contexto de antimicrobiano indica que la velocidad de crecimiento de las células del microorganismo se anula esencialmente o se reduce en al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, incluido cualquier valor intermedio, de la aparición del microorganismo en una situación comparable sin la presencia de las bacterias descritas. Alternativamente, prevenir significa una reducción de al menos 15 %, 10 % o 5 % de la apariencia de las células del microorganismo en una situación comparable que carece de la presencia del descrito o de una composición que contiene el mismo. Los métodos para determinar el nivel de apariencia de las células de un microorganismo son conocidos en la técnica.

El efecto de las composiciones de la invención también puede describirse como pesticida o pestistática.

Como se usa en la presente descripción, el término "endofito" se refiere a un organismo capaz de vivir dentro de una planta o está asociado de cualquier otra manera con ella, y no causa enfermedad ni daña la planta de cualquier otra manera (es decir, es capaz de vivir simbióticamente con la planta). Los endófitos pueden ocupar los espacios intracelulares o extracelulares de los tejidos vegetales, que incluyen las hojas, tallos, flores, frutos, semillas o raíces. Un endófito puede ser, por ejemplo, un microorganismo bacteriano o fúngico.

El término "planta" como se usa en la presente descripción abarca no solo plantas enteras, sino que se extiende a partes de plantas, esquejes y productos vegetales que incluyen raíces, hojas, flores, semillas, tallos, callos, nueces y frutas, bulbos, tubérculos, cormos, granos, esquejes, portainjertos o vástagos, e incluye cualquier material vegetal, ya sea antes de la siembra, durante el crecimiento y durante o después de la cosecha. Las plantas que pueden beneficiarse de la aplicación de la presente invención cubren una amplia gama de cultivos agrícolas y hortícolas. Como se usa en la presente descripción, el término "fitopatógeno" se refiere a un organismo que es patógeno para las plantas. El organismo fitopatógeno típicamente se refiere a un organismo unicelular, por ejemplo, que incluye bacterias, así como también hongos, oomicetos, quitridios, algas y nematodos. El patógeno puede estar en cualquier etapa de desarrollo.

De acuerdo con una modalidad específica, el fitopatógeno es un microorganismo (por ejemplo, una bacteria). Las bacterias fitopatógenas incluyen típicamente, pero no se limitan a los géneros Agrobacterium (por ejemplo, A. tumefaciens); Erwinia, Pantoea, Pectobacterium, Serratia, Acidovorax, Pseudomonas, Ralstonia, Rhizobacter, Rhizomonas, Xanthomonas, Xylophilus, Rhizobium, Bacillus, Clostridium, Arthrobacter, Clavibacter, Curtobacterium, Leifsonia, Rhodococcus, Streptomyces y Xanthomonas (X. axonopodis, X. oryzae pv. oryzae, X. vesicatoria).

En una modalidad particular, la bacteria fitopatógena se selecciona del grupo que consiste en Clavibacter, Xanthomonas, Pseudomonas (por ejemplo, P. syringae) y Pectobacterium (por ejemplo, P. carotovorum).

En algunas modalidades, los patógenos son patógenos que residen típicamente en los sistemas vasculares de las plantas (por ejemplo, xilema o floema). En algunas modalidades, los patógenos se seleccionan de patógenos restringidos al floema. En algunas modalidades, los patógenos restringidos al floema se seleccionan de espiroplasmas y fitoplasmas, micoplasmas y libaribacter. En modalidades ilustrativas, el patógeno restringido al floema se selecciona de Spiroplasma melliferum y Phytoplasma solani.

Los fitoplasmas pueden detectarse mediante el uso de los medios conocidos en la técnica que incluyen microscopía electrónica y técnicas moleculares que incluyen sondas de ADN, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).

En un ejemplo, las células bacterianas se almacenan de manera que sean efectivas para matar el fitopatógeno o reducir el crecimiento del mismo. Por ejemplo, las células pueden secarse (por ejemplo, liofilizarse) o congelarse. En otro ejemplo, las células están en un cultivo. Los medios para propagar las células pueden seleccionarse del grupo que consiste en: suelo, aparato hidropónico y/o medio de crecimiento artificial.

Las composiciones pueden comprender cultivos en caldo completo, cultivos líquidos o sólidos, o suspensiones de las células bacterianas descritas, que tengan al menos una de las características identificativas de las cepas descritas, así como también sobrenadante, filtrado y/o extracto o uno o más y más particularmente una pluralidad de (i) metabolitos, (ii) compuestos aislados (iii) volátiles derivados de las bacterias descritas en la presente descripción o (iv) compuestos sintéticos (por ejemplo, comprende quinolinacarboxaldehído o hidroximetil-2-furaldehído) o derivados de los mismos que tienen la actividad de matar el fitopatógeno o reducir el crecimiento del mismo.

La composición puede combinarse o usarse con otro microorganismo y/o pesticida (por ejemplo, nematicida, bactericida, fungicida, insecticida). En algunos ejemplos, la composición bacteriana comprende además un material seleccionado de un fertilizante, un pesticida o cualquier combinación de los mismos.

El término "fertilizante", como se usa en la presente descripción, se refiere a cualquier sustancia que, cuando se aplica a un sustrato, por ejemplo, suelo, hojas, solución hidropónica, etc., enriquece o fertiliza ese sustrato al proporcionar nutrientes para el organismo, por ejemplo, la planta, funciones biológicamente necesarias, por ejemplo, crecimiento, floración, etc.

De acuerdo con características adicionales en algunas modalidades de la invención que se describen más abajo, el pesticida se selecciona del grupo que consiste en acaricidas, miticidas, algicidas, antialimentarios, avicidas, bactericidas, repelentes de aves, quimioesterilizantes, fungicidas, protectores de herbicidas, herbicidas, atrayentes de insectos, insecticidas repelentes, insecticidas, repelentes de mamíferos, disruptores de apareamiento, molusquicidas, nematicidas, activadores de plantas, reguladores del crecimiento de plantas, rodenticidas, sinergistas y virucidas, y cualquier combinación de los mismos.

De acuerdo con características adicionales en algunas modalidades de la invención que se describen más abajo, el herbicida se selecciona del grupo que consiste en herbicidas de clorotriazina, herbicidas de cloroacetanilida y herbicidas alifáticos halogenados.

Además, el pesticida puede ser un agente antifúngico de sitio único que puede incluir, pero que no se limita a, benzimidazol, un inhibidor de la desmetilación (DMI) (por ejemplo, imidazol, piperazina, pirimidina, triazol), morfolina, hidroxipirimidina, anilinopirimidina, fosforotiolato, inhibidor externo de la quinona, quinolina, dicarboximida, carboximida, fenilamida, anilinopirimidina, fenilpirrol, hidrocarburo aromático, ácido cinámico, hidroxianilida, antibiótico, polioxina, acilamina, ftalimida, bencenoide (xililalanina), un inhibidor de la desmetilación seleccionado del grupo que consiste en imidazol, piperazina, pirimidina y triazol (por ejemplo, bitertanol, miclobutanilo, penconazol, propiconazol, triadimefón, bromuconazol, ciproconazol, diniconazol, fenbuconazol, hexaconazol, tebuconazol, tetraconazol), miclobutanilo y un inhibidor externo de la quinona (por ejemplo, estrobilurina). La estrobilurina puede incluir, pero no se limita a, azoxistrobina, kresoxim-metoil o trifloxistrobina. En otra modalidad particular más, el agente antifúngico es una quinona, por ejemplo, quinoxifeno (5,7-dicloro-4-quinolil 4-fluorofeniléter). El agente antifúngico también puede derivarse de un extracto de Reynoutria.

El fungicida también puede ser un fungicida químico no inorgánico multisitio seleccionado del grupo que consiste en cloronitrilo, quinoxalina, sulfamida, fosfonato, fosfito, ditiocarbamato, cloralquilhios, fenilpiridinamina y cianoacetamida oxima.

Como se indicó anteriormente, la composición puede comprender además un nematicida. Este nematicida puede incluir, pero no se limita a, productos químicos tales como organofosforados, carbamatos y fumigantes, y productos microbianos tales como avermectina, Myrothecium spp., Biome (Bacillus firmus), Pasteuria spp., Paecilomyces spp. y productos orgánicos tales como saponinas y aceites vegetales.

En el caso de que la composición se aplique a una semilla, puede hacerse como una o más capas antes de plantar la semilla mediante el uso de uno o más agentes de recubrimiento de semillas que incluyen, pero no se limitan a, etilenglicol, polietilenglicol, quitosano, carboximetil quitosano, musgo de turba, resinas y ceras o fungicidas o bactericidas químicos con un modo de acción de sitio único, multisitio o desconocido mediante el uso de los métodos conocidos en la técnica.

Como se indicó anteriormente, las composiciones expuestas anteriormente pueden aplicarse mediante el uso de los métodos conocidos en la técnica. Específicamente, estas composiciones pueden aplicarse a y alrededor de plantas o partes de plantas. En el presente contexto, debe entenderse que las plantas significan todas las plantas y poblaciones de plantas tales como plantas silvestres deseadas y no deseadas o plantas de cultivo (que incluyen las plantas de cultivo de origen natural). Las plantas de cultivo pueden ser plantas que pueden obtenerse mediante métodos convencionales de fitomejoramiento y optimización o mediante métodos biotecnológicos y de ingeniería genética o mediante combinaciones de estos métodos, que incluyen las plantas transgénicas y los cultivares de plantas protegibles o no mediante derechos de obtentor. Por partes de plantas debe entenderse todas las partes y órganos de plantas por encima y por debajo del suelo, tales como brotes, hojas, flores y raíces, por ejemplo, hojas, acículas, tallos, tallos, flores, cuerpos fructíferos, frutos, semillas, raíces, tubérculos y rizomas. Las partes de la planta también incluyen, pero no se limitan a, material cosechado y material de propagación vegetativa y generativa, por ejemplo, esquejes, tubérculos, rizomas, vástagos y semillas.

En algunas modalidades, las plantas son plantas vasculares. La planta vascular comprende tejido vascular, por ejemplo, floema. El floema es el tejido vegetal que traslada los productos de la fotosíntesis de las hojas maduras a las áreas de crecimiento y almacenamiento.

En algunas modalidades, las vides pueden modificarse para el tratamiento mediante el uso de las composiciones de la invención. Se seleccionan vides ilustrativas de, sin limitarse a ellas, Chardonnay, Cabernet Sauvignon, Pinot noir, Riesling, Sauvignon blanc y Sémillon, Sangiovese y Garganega.

En modalidades ilustrativas, la planta es vid. En otra modalidad ilustrativa, la planta es bígaro. En otra modalidad ilustrativa, la planta es una zanahoria.

Como se mencionó, la planta, parte de la misma o los fitopatógenos están expuestos a una cantidad efectiva de la composición. Exposición como se usa en la presente descripción significa que una cantidad suficiente de los compuestos de la invención efectúa la destrucción del fitopatógeno o reduce el crecimiento del mismo.

La exposición de la planta, parte de la misma o el fitopatógeno a las composiciones expuestas anteriormente puede llevar a cabo directamente o permitiendo que las composiciones descritas actúen en su entorno, hábitat o espacio de almacenamiento, por ejemplo, mediante inmersión, recubrimiento, inmersión, pulverización, evaporación, empañamiento, dispersión, pintura o inyección.

Las composiciones también pueden aplicar al suelo mediante el uso de los métodos conocidos en la técnica. Estos incluyen pero no se limitan a (a) riego por goteo o quimigación; (b) incorporación al suelo; c) tratamiento de semillas. Las composiciones pueden usarse como pesticidas y, en particular, pueden usarse como insecticidas, nematicidas, fungicidas y bactericidas, solos o en combinación con una o más sustancias pesticidas expuestas anteriormente y aplicadas a plantas, partes de plantas, sustrato para el cultivo de plantas o semillas.

Las composiciones pueden combinarse con otros compuestos potenciadores de las composiciones tales como, pero que no se limitan a, aminoácidos, quitosano, quitina, almidón, hormonas, minerales, microbios sinérgicos para aumentar la eficacia y promover los beneficios para las plantas.

Recubrimientos de las semillas

De acuerdo con algunos ejemplos descritos en la presente descripción, existe una composición que comprende una semilla de planta y una cápsula que encapsula la semilla de la planta, en donde la cápsula comprende (a) la bacteria descrita en la presente descripción y (b) un material biocompatible.

En algunos ejemplos, el término "biocompatible" se define como la capacidad de un material para funcionar con una respuesta adecuada del huésped en una aplicación específica.

En el contexto de las aplicaciones de biomateriales, la biocompatibilidad se refiere a la capacidad de funcionar como una matriz de apoyo para una actividad adecuada, sin provocar efectos indeseables o inducir respuestas locales o sistémicas indeseables en el huésped.

En el contexto de los ejemplos descritos en la presente descripción, un "material biocompatible" describe un material (por ejemplo, un polímero natural o sintético) o matriz (por ejemplo, hidrogel o andamiaje) que no interfiere y, preferentemente, proporciona un entorno adecuado para la actividad biológica.

En algunos ejemplos, la cápsula tiene forma de núcleo-envoltura. En algunos ejemplos, el núcleo es o comprende una o más semillas. En algunos ejemplos, la cubierta es o comprende un material biocompatible y la bacteria descrita en la presente descripción.

El término "estructura de núcleo-cubierta" generalmente se refiere a un material sólido, en donde el material sólido es un material particulado, y en donde las partículas individuales se caracterizan por contener al menos dos tipos diferentes de materiales que pueden distinguirse entre sí por su composición y/o por su estructura y/o por su ubicación dentro de la partícula, en donde uno o más materiales de cierto tipo están contenidos en la parte interior del compuesto.

La porción exterior de la cápsula que comprende la superficie se designa con los términos "cubierta" o "capa de recubrimiento".

En algunos ejemplos, la estructura de núcleo-cubierta es una estructura cerrada. El término "cerrado" como se usa en la presente descripción, es un término relativo con respecto al tamaño, la forma y la partícula o composición de dos entidades, a saber, una entidad que define un recinto (la entidad envolvente) y la entidad que está siendo al menos parcialmente encerrada en el mismo. En general, el término "cerrado" se refiere a un estado morfológico de un objeto que tiene superficies discretas interior (por ejemplo, la semilla) y exterior que están sustancialmente desconectadas, en el que la superficie interior constituye el límite del área cerrada.

En algunos ejemplos, las semillas pueden recubrirse mediante el uso de cualquier proceso conocido en la técnica. Por ejemplo, las semillas pueden recubrirse con un aglutinante y luego volcarse en el polvo polimérico. En algunas modalidades, la semilla se voltea en un polvo polimérico sin aglutinante, para provocar que el polvo se adhiera a las semillas.

Pueden incluirse componentes adicionales en el recubrimiento. Dichos componentes pueden ser uno o más de los siguientes, en cualquier combinación:

un componente que tiene el efecto de estabilizar química y/o mecánicamente y/o conservar las semillas: por ejemplo, para aumentar su vida útil en almacenamiento, reducir su susceptibilidad a los contaminantes ambientales o reducir la probabilidad de que se rompan durante la siembra/sembrado;

un componente que tiene el efecto de potenciar el efecto fertilizante del recubrimiento: por ejemplo, acelerando o retardando la descomposición del recubrimiento en el campo;

un componente que tiene el efecto de proteger o mejorar el crecimiento de los cultivos por medios distintos de la fertilización: por ejemplo, un herbicida, fungicida, insecticida, rodenticida, hormona, estimulante de plantas o hongo o espora micorriza;

una composición fertilizante: por ejemplo, una fuente de nitrógeno y/o fósforo y/o cualquier otro ingrediente biológicamente activo tal como boro, cobalto para promover el crecimiento de la semilla de la planta o de los organismos asociados;

un pigmento;

un aglutinante;

un componente que tiene el efecto de alterar el pH del suelo: por ejemplo cal, azufre o un sulfato; y

podría adicionarse una matriz porosa inerte para permitir un mejor paso de agua, aire o nutrientes a la semilla. Tal componente puede adicionarse en varias etapas del proceso, por ejemplo, puede combinarse con el polvo de recubrimiento antes o después de la formación de una suspensión como se describió anteriormente, o con el aglutinante antes de la etapa de mezcla como se describió anteriormente, o puede rociarse o recubrirse de otro modo sobre las semillas antes o después del secado. El componente puede rociarse o recubrirse de otro modo sobre la semilla antes de que la semilla se cubra con la suspensión, por ejemplo, pueden aplicarse uno o más componentes a la semilla antes de que las semillas se recubran con la suspensión.

En algunos ejemplos, los recubrimientos exteriores de las semillas están formados por una o más capas y uno o más de los componentes adicionales descritos anteriormente pueden estar presentes en al menos una de esas capas. En la práctica, el grosor medio del recubrimiento podría estar en el intervalo de 0,1 a 1,0 mm, el grosor medio del recubrimiento también puede estar en el intervalo de 0,1 a 2,0 mm, pero el intervalo puede elegirse para adaptarse a la semilla en cuestión y la masa deseada de recubrimiento por semilla.

En algunos ejemplos, el recubrimiento está por ejemplo por encima del 0,5 %, 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o por encima del 95 % en peso.

La masa de recubrimiento con la que se cubre cada semilla puede controlarse mediante la elección del aglutinante o las proporciones relativas de aglutinante y material de recubrimiento.

En algunos ejemplos, el material biocompatible comprende un material adhesivo.

En algunos ejemplos, el material adhesivo se selecciona de, pero no se limita a, guar, guar derivatizado, poliacrilamida, poli(ácido metacrílico), poli(ácido acrílico), poliacrilato, poli(etilenglicol), polímeros rematados con fosfonato en los extremos, óxido de polietileno, poli(alcohol vinílico), poliglicerol, politetrahidrofurano, poliamida, almidón, almidón derivado, maíz ceroso, sorgo, sargo ceroso, sagú, dextrina, quitina, quitosano, composiciones de alginato, goma, pectina, celulosa o cualquier combinación o derivado de los mismos.

En algunos ejemplos, el material biocompatible comprende un mineral.

En algunos ejemplos, el término "mineral" se refiere a uno o más minerales evaporados adheridos al exterior de la semilla. El recubrimiento puede comprender una matriz de aglutinante en la que se incrustan partículas de uno o más minerales evaporados. El recubrimiento puede encerrar total o parcialmente la semilla.

En algunos ejemplos, el aglutinante puede ser susceptible de degradación por exposición a la humedad. El aglutinante puede ser tal que libere al menos el 50 % de las partículas minerales.

En algunos ejemplos, el aglutinante se selecciona, pero no se limita a, gelatina, acetato de polivinilo, polivinilpirrolidonas, dextrina, maltodextrinas, polisacáridos, grasas, aceites, proteínas, lacas, cloruro de vinilideno, copolímeros de cloruro de vinilideno, lignosulfonatos de calcio, copolímero acrílico, acrilato de polivinilo, zeína, quitosano, óxido de polietileno, polímero de acrilimida, acrilato de polihidroxietilo, un monómero de metilacrilimida, alginato, policloropreno, jarabe o cualquier combinación de los mismos.

Definiciones químicas

Como se usa en la presente descripción, el término "alquilo" describe un hidrocarburo alifático que incluye los grupos de cadena lineal y de cadena ramificada. Preferentemente, el grupo alquilo tiene de 21 a 100 átomos de carbono y con mayor preferencia de 21 a 50 átomos de carbono. Siempre que un intervalo numérico; por ejemplo, "21-100", se indica en la presente descripción, implica que el grupo, en este caso el grupo alquilo, puede contener 21 átomos de carbono, 22 átomos de carbono, 23 átomos de carbono, etc., hasta 100 átomos de carbono inclusive. En el contexto de la presente invención, un "alquilo largo" es un alquilo que tiene al menos 20 átomos de carbono en su cadena principal (la ruta más larga de átomos unidos covalentemente continuos). Por lo tanto, un alquilo corto tiene 20 o menos carbonos en la cadena principal. El alquilo puede estar sustituido o no sustituido, como se define en la presente descripción.

El término "alquilo", como se usa en la presente descripción, también abarca hidrocarburos saturados o insaturados, por lo tanto, este término abarca además alquenilo y alquinilo. El término "alquenilo" describe un alquilo insaturado, como se define en la presente descripción, que tiene al menos dos átomos de carbono y al menos un doble enlace carbono-carbono. El alquenilo puede estar sustituido o sin sustituir con uno o más sustituyentes, como se ha descrito anteriormente. El término "alquinilo", como se define en la presente descripción, es un alquilo insaturado que tiene al menos dos átomos de carbono y al menos un triple enlace carbono-carbono. El alquinilo puede estar sustituido o sin sustituir con uno o más sustituyentes, como se ha descrito anteriormente. El término "cicloalquilo" describe un grupo de anillo condensado o monocíclico totalmente de carbono (es decir, anillos que comparten un par de átomos de carbono adyacentes) donde uno o más de los anillos no tienen un sistema de electrones pi completamente conjugado. El grupo cicloalquilo puede estar sustituido o no sustituido, como se indica en la presente descripción. El término "arilo" describe un grupo monocíclico o policíclico de anillos condensados (es decir, anillos que comparten pares adyacentes de átomos de carbono) totalmente de carbono que tiene un sistema de electrones pi completamente conjugado. El grupo arilo puede estar sustituido o sin sustituir, como se indica en la presente descripción. El término "alcoxi" describe tanto un grupo -O-alquilo como -O-cicloalquilo, como se define en la presente descripción. El término "ariloxi" describe un -O-arilo, como se define en la presente descripción. Cada uno de los grupos alquilo, cicloalquilo y arilo en las fórmulas generales de la presente descripción puede estar sustituido con uno o más sustituyentes, por lo que cada grupo sustituyente puede ser independientemente, por ejemplo, haluro, alquilo, alcoxi, cicloalquilo, alcoxi, nitro, amina, hidroxilo, tiol, tioalcoxi, tiohidroxi, carboxi, amida, arilo y ariloxi, en dependencia del grupo sustituido y su posición en la molécula. También se contemplan los sustituyentes adicionales.

El término "haluro", "halógeno" o "halo" describe flúor, cloro, bromo o yodo. El término "haloalquilo" describe un grupo alquilo como se define en la presente descripción, además sustituido por uno o más haluros. El término "haloalcoxi" describe un grupo alcoxi como se define aquí, además sustituido por uno o más haluros.

El término "hidroxilo" o "hidroxi" describe un grupo -OH. El término "tiohidroxi" o "tiol" describe un grupo -SH. El término "tioalcoxi" describe tanto un grupo -S-alquilo como un grupo -S-cicloalquilo, como se define en la presente descripción. El término "tioariloxi" describe tanto un grupo -S-arilo como un grupo -S-heteroarilo, como se define en la presente descripción.

El término "amina" describe un grupo -NR'R", con R' y R" como se describe en la presente descripción.

El término "heteroalicídico" o "heterocidilo" describe un grupo de anillo monocíclico o condensado que tiene en el anillo uno o más átomos, como nitrógeno, oxígeno y azufre. Los anillos también pueden tener uno o más dobles enlaces. Sin embargo, los anillos no tienen un sistema de electrones pi completamente conjugado. Los ejemplos representativos son piperidina, piperazina, tetrahidrofurano, tetrahidropirano, morfolino y similares.

El término "carboxi" o "carboxilato" describe un grupo -C(=O)-OR', donde R' es hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, alquenilo, arilo, heteroarilo (unido a través de un anillo de carbono) o heteroalicíclico (unido a través de un carbono anular) como se define en la presente descripción.

El término "carbonilo" describe un grupo -C(=O)-R', donde R' es como se ha definido anteriormente.

Los términos anteriores también abarcan tioderivados de los mismos (tiocarboxi y tiocarbonilo). El término "tiocarbonilo" describe un grupo -C(=S)-R', donde R' es como se ha definido anteriormente. Un grupo "tiocarboxi" describe un grupo -C(=S)-OR', donde R' es como se define en la presente descripción.

Un grupo "sulfinilo" describe un grupo -S(=O)-R', donde R' es como se define en la presente descripción. Un grupo "sulfonilo" o "sulfonato" describe un grupo -S(=O)² -R', donde Rx es como se define en la presente descripción. Un grupo "carbamilo" o "carbamato" describe un grupo -OC(=O)-NR'R", donde R' es como se define en la presente descripción y R" es como se define para R'. Un grupo "nitro" se refiere a un grupo -NO². Un grupo "ciano" o "nitrilo" se refiere a un grupo -C=N. Como se usa en la presente descripción, el término "azida" se refiere a un grupo -N3. El término "sulfonamida" se refiere a un grupo -S(=O)²-NR'R", con R' y R" tal como se definen en la presente descripción.

El término "fosfonilo" o "fosfonato" describe un grupo -OP(=O)(OR')², con R' como se define anteriormente en la presente descripción. El término "fosfinilo" describe un grupo -PR'R", con R' y R" como se define anteriormente en la presente descripción.

El término "alcarilo" describe un alquilo, como se define en la presente descripción, que se sustituye por un arilo, como se describe en la presente descripción. Un alcarilo ilustrativo es bencilo.

El término "heteroarilo" describe un grupo de anillo monocíclico o fusionado (es decir, anillos que comparten un par de átomos adyacentes) que tiene en el anillo uno o más átomos, tal como, por ejemplo, nitrógeno, oxígeno y azufre y, en además, que tiene un sistema de electrones pi completamente conjugado. Los ejemplos, sin limitación, de grupos heteroarilo incluyen pirrol, furano, tiofeno, imidazol, oxazol, tiazol, pirazol, piridina, pirimidina, quinolina, isoquinolina y purina. El grupo heteroarilo puede estar sustituido o no sustituido por uno o más sustituyentes, como se ha descrito anteriormente. Los ejemplos representativos son tiadiazol, piridina, pirrol, oxazol, indol, purina y similares.

Tal como se usan en la presente descripción, los términos "halo" y "haluro", a los que se hace referencia en el presente descripción de forma intercambiable, describen un átomo de un halógeno, es decir, flúor, cloro, bromo o yodo, también denominados en la presente descripción como fluoruro, cloruro, bromuro y yoduro.

El término "haloalquilo" describe un grupo alquilo como se define anteriormente, además sustituido por uno o más haluros.

Como se usa en la presente descripción, el término "aproximadamente" se refiere a ± 10 %.

Los términos "comprende", "que comprende", "incluye", "que incluye", "que tiene" y sus conjugados significan "que incluye pero no se limita a". El término "que consiste en" significa "que incluye y se limita a". El término "que consiste esencialmente en" significa que la composición, el método o la estructura pueden incluir ingredientes, etapas y/o partes adicionales, pero solo si los ingredientes, etapas y/o partes adicionales no alteran materialmente las características básicas y novedosas de la composición, el método o la estructura reivindicados.

Como se usa en la presente descripción, la forma singular "un", "una" y "el/la/los/las" incluyen referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, el término "un compuesto" o "al menos un compuesto" puede incluir una pluralidad de compuestos, que incluye sus mezclas.

A lo largo de esta solicitud, pueden presentarse varias modalidades de esta invención en un formato de intervalo. Debe entenderse que la descripción en formato de intervalo es simplemente por conveniencia y brevedad y no debe interpretarse como una limitación inflexible del alcance de la invención. En consecuencia, debe considerarse que la descripción de un intervalo ha revelado específicamente todos los subintervalos posibles, así como también los valores numéricos individuales dentro de ese intervalo. Por ejemplo, debe considerarse que la descripción de un intervalo tal como del 1 al 6 tiene subintervalos descritos específicamente tal como del 1 al 3, del 1 al 4, del 1 al 5, del 2 al 4, del 2 al 6, del 3 a 6, etc., así como también números individuales dentro de ese intervalo, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 y 6. Esto se aplica independientemente de la amplitud del intervalo.

Cuando se hace referencia a listados de secuencias particulares, debe entenderse que dicha referencia también abarca secuencias que corresponden sustancialmente a su secuencia complementaria, que incluyen las variaciones menores de secuencia, resultantes, por ejemplo, de errores de secuenciación, errores de clonación u otras alteraciones que resultan en la sustitución de bases, eliminación de bases o adición de bases, siempre que la frecuencia de tales variaciones sea inferior a 1 en 50 nucleótidos, alternativamente, inferior a 1 en 100 nucleótidos, alternativamente, inferior a 1 en 200 nucleótidos, alternativamente, inferior a 1 en 500 nucleótidos, alternativamente, menos de 1 en 1000 nucleótidos, alternativamente, menos de 1 en 5000 nucleótidos, alternativamente, menos de 1 en 10000 nucleótidos.

Se aprecia que determinadas características de la invención, las cuales por claridad, se describen en el contexto de modalidades separadas, también pueden proporcionarse en combinación en una sola modalidad. A la inversa, diversas características de la invención, las cuales por brevedad, se describen en el contexto de una sola modalidad, también pueden proporcionarse separadamente o en cualquier subcombinación adecuada o como sea adecuado en cualquier otra modalidad que se describe de la invención. Determinadas características que se describen en el contexto de diversas modalidades no deben considerarse características esenciales de esas modalidades, a menos que la modalidad no sea operativa sin esos elementos.

Las diversas modalidades y aspectos de la presente invención como se definen en la presente descripción anteriormente y como se reivindican en la sección de reivindicaciones más adelante encuentra apoyo experimental en los siguientes ejemplos.

Ejemplos

Ahora se hace referencia a los siguientes ejemplos, los cuales junto con las descripciones anteriores ilustran la invención de una manera no limitante.

Generalmente, la nomenclatura usada usa en la presente descripción y los procedimientos de laboratorio que se usan en la presente invención incluyen técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas y de ADN recombinante. Dichas técnicas se explican a fondo en la literatura. Véase, por ejemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook y otros, (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volúmenes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel y otros, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson y otros, "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren y otros. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vol. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1998); las metodologías establecitas en las patentes de los Estados Unidos núm. 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 y 5,272,057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", volúmenes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites y otros. (ed), "Basic and Clinical Immunology" (8va edición), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell y Shiigi (ed), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman y Co., Nueva York (1980); los inmunoensayos disponibles se describen ampliamente en la literatura científica y de patentes, véanse, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos núm. 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 y 5,281,521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., y Higgins S. J., ed. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., y Higgins S. J., Ed. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) y "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak y otros, "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996). A lo largo de este documento se proporcionan otras referencias generales. Se cree que los procedimientos allí descritos son bien conocidos en la técnica y se proporcionan para comodidad del lector.

Materiales y métodos

Insectos y plantas: diez saltamontes Hyalesthes obsoletus (Cixiidae), un vector del fitoplasma de la vid, se recolectaron en los Altos del Golán, Israel, en octubre de 2011 y se colocaron directamente en etanol al 97 % o se usaron vivos para el aislamiento de microorganismos.

Se establecieron plántulas de la vid Vitis vinifera de la variedad 'Chardonnay' y bígaro (Vinca spp.) mediante esquejes de 2-3 cm de tallo con yema y sembrando en un tubo de vidrio de 30 ml que contenía medios de crecimiento (sacarosa 30 g/l, tiamina 0,4 mg/l, VPM 2,35g/l (Duchefa), carbón activado 2,5g/l y mioinositol 100mg/l). Las plántulas se cultivaron en condiciones controladas bajo un régimen de 24 °C, 16: 8 L:D. Las plántulas de ambos géneros tenían entre 6-8 semanas de edad en el momento en que comenzaron los experimentos.

Aislamiento e identificación de las bacterias: para identificar posibles bacterias cultivables de H. obsoletus, se esterilizaron en la superficie 10 insectos individuales, sumergiendo los insectos en una mezcla de ampicilina y tetraciclina durante 5 minutos, seguido de tres series de lavados con solución salina estéril (2 minutos cada uno). A continuación, las muestras se colocaron en un tubo Eppendorf que contenía 300 pl de solución salina estéril (9 % de NaCl), se molieron con un mortero y se diluyeron en una serie de 10 veces. A continuación, se esparcieron alícuotas de 150 |jl de la dilución 102-107 en agar cristal violeta (CV) (66 g/l de sacarosa, 10 g/l de sorbitol, 2 g/l de caldo Luria, 0,1 % de cristal violeta y 15 g/l de agar). Las placas se mantuvieron a 28 °C en la oscuridad y las colonias cultivadas se identificaron mediante la secuencia de ADN del gen 16S de ARNr y el dominio espaciador transcrito interno (ITS) amplificado por PCR (Tabla 1).

Crecimiento bacteriano: solo se aisló una bacteria siguiendo el procedimiento descrito anteriormente. Si bien está estrechamente relacionado con el género Dyella, lo más probable es que sea un género no descrito. Para producir grandes cantidades de inóculo bacteriano, las bacterias se cultivaron transfiriendo dos bucles del cultivo en placas CV a 250 ml de medio líquido (6 g/l de caldo Luria, 2 g/l de K²HPO⁴ y 0,5 g/l de KH²PO⁴ pH 7) en un matraz Erlenmeyer de 500 ml e incubarlos a 28 °C a 150 rpm durante 48 h. Las bacterias se recolectaron por centrifugación (3500 g; 15 min) y se lavaron dos veces con tampón salino fosfato (PBS) (8 g/l NaCl, 0,2 KCl, 1,44 de Na²HPO⁴ y 0,24 g/l de KH²PO⁴ pH 7,5). Mediante el uso de un espectrofotómetro (600 nm), la concentración de bacterias se ajustó a OD=0,6 (~106 CFU/ml) con PBS. La concentración se confirmó mediante recuento de UFC en placa CV.

Análisis filogenético bacteriano: para resolver aún más la ubicación filogenética de las bacterias aisladas, el gen de ARN ribosómico 16S casi completo de esta bacteria fue amplificado por el conjunto de cebadores 27F 1513R que amplifica la mayoría de las bacterias conocidas. El producto obtenido se secuenció y alineó con otras proteobacterias Gamma y Beta que se recuperaron de la base de datos de genes de ARN ribosómico SILVA mediante el uso de MAFFT. El modelo de sustitución de nucleótidos más apropiado se determinó mediante el uso de jModelTest 2 bajo el criterio de información bayesiano y resultó ser TIM3+I+G. El filograma de máxima verosimilitud se construyó mediante el uso de PhyML v3.1 implementado por SeaView v4.5.4. Los valores de soporte de Bootstrapping se calcularon a partir de 1000 muestras.

Análisis del genoma bacteriano: el ADN genómico de la bacteria se aisló mediante el uso del minikit QlAamp ADN de acuerdo con el protocolo del fabricante. La calidad del ADN se examinó mediante el uso del espectrofotómetro NanoDrop. La secuenciación del genoma se realizó en el Centro de Servicios de ADN (Chicago, Illinois); se generó una biblioteca de pares de parejas con el kit de preparación de muestras de pares de parejas de Nextera, seguido de la secuenciación del genoma en Illumina MiSeq, mediante el uso de 2x100 lecturas. El ensamblaje de novo se realizó con el paquete de software CLC Genomics Workbench (v7.0), después del recorte de calidad de los datos de secuencia sin procesar (Q20), que produjo 6 709 847 lecturas de 333 contig con una cobertura de pliegues de aproximadamente el 86,7 %. La medida de calidad N50 de los contig fue de 42,2 kb, con un tamaño de contig promedio de 12,5 kb, y el contig ensamblado más grande fue de aproximadamente 191,2 kb. El análisis de predicción de genes y las anotaciones funcionales se realizaron dentro de la plataforma Integrated Microbial Genomes Expert Review (IMG ER) (http://img.jgi.doe.gov) desarrollada por el JGI, mediante el uso del canal de anotación del genoma microbiano DOE-JGI. Se predijeron 3832 genes, que incluyen 3757 predicciones de CDS con Prodigal V2,50, 49 genes de ARNt con tARNscan-SE 13.1 y 5 genes de ARNr con HMMER 3,0. Las secuencias de codificación predichas se tradujeron y se usaron para buscar en las bases de datos TIGRFam, Pfam, KEGG, COG e InterPro. Se asignaron 1945 genes codificadores de proteínas a 1381 categorías KO.

La superposición metabólica efectiva entre fitoplasmas se calculó mediante el uso de la herramienta NetCmpt. El software toma como entrada el contenido de EC de las especies bacterianas, traduce el contenido enzimático en redes topológicas específicas de especies, aplica un algoritmo basado en topología para la predicción de recursos metabólicos específicos de especies (NetSeed) y simula el crecimiento tras la exclusión de recursos comunes. Las anotaciones de EC para el genoma de la bacteria se recuperaron de la plataforma Integrated Microbial Genomes Expert Review (IMG ER) (http://img.jgi.doe.gov) desarrollada por el JGI, mediante el uso del canal de anotación del genoma microbiano DOE-JGI. Las anotaciones de EC para el genoma del fitoplasma se recuperaron de la base de datos KEGG. Los antibióticos y los metabolitos secundarios se predijeron mediante el uso de la herramienta antiSMASH.

Prueba antagónica del sobrenadante de la bacteria: para examinar la capacidad de los compuestos excretados por la bacteria para inhibir Spiroplasma melliferum (una bacteria modelo que simula la infección por fitoplasma), la bacteria se cultivó en un caldo de espiroplasma modificado durante 10 días. Se adicionaron las células de espiroplasma al sobrenadante y se incubaron a 29 °C durante cinco días y luego se inoculó 1 j l del filtrado incubado en un medio de espiroplasma fresco que contenía rojo fenol como marcador de color para el crecimiento celular. El tiempo requerido para el cambio de color se correlaciona con la concentración inicial de espiroplasma y, por lo tanto, se usó como parámetro cuantitativo para el efecto inhibidor de los filtrados. El crecimiento de espiroplasma en caldo fresco sirvió como control positivo y se usó como referencia el efecto inhibidor de 0,5 jg/ml de oxitetraciclina. El índice de inhibición se definió como la relación entre el número de días para el cambio de color en el filtrado y el tiempo requerido en el control positivo. El índice de inhibición de 0,5 jg/ml de oxitetraciclina fue de 2,3. Así, un aislado se consideró inhibitorio si el índice de inhibición de su filtrado era <2.

Identificación de los extractos de la fracción activa: Para identificar los volátiles con actividad potencial, la bacteria se cultivó en 500 ml de medio acuoso que contiene 6 g/l de LB, 2 g/l de K²HPO⁴ y 0,5 g/l de KH²PO⁴ durante tres días. El cultivo se centrifugó a 8000 rpm durante 5 min y el sobrenadante se extrajo dos veces con 500 ml de metil terc-butil éter (MTBE). La fase orgánica se evaporó a sequedad mediante el uso de una corriente suave de nitrógeno y el extracto seco se resuspendió con MTBE. Este extracto crudo fue separado en fracciones por una columna que contenía lana de vidrio, arena y sílice mediante el uso de los diferentes solventes: metanol, acetona, MTB^e , cloroformo y hexano. Se realizó el mismo procedimiento de extracción en medio estéril como control. Cada fracción, obtenida por separación en columna, se evaporó a sequedad mediante el uso de una corriente suave de nitrógeno y las sustancias secas se resuspendieron con 1 ml de etanol. Para examinar el efecto de cada extracto de fracción sobre el crecimiento de espiroplasma, se realizó la siguiente prueba: 1 ml de medio de espiroplasma, 10 pl de células de espiroplasma y 20 pl de cada extracto de fracción se incubaron durante tres días a 29 °C. El crecimiento de espiroplasma en caldo fresco sirvió como control positivo y se usó medio estéril que contenía 20 pl del extracto de fase como control negativo. Los cambios en el color de rojo a amarillo indicaron crecimiento de espiroplasma. Identificación de volátiles en los extractos de la fracción activa de las bacterias: para identificar los compuestos en los extractos de la fracción activa seleccionados (véanse los resultados), se inyectó una alícuota de 1 pl de la muestra en un aparato GC-MSD (6890N/5973N Agilent Technologies CA, EE. UU.) equipado con una Rxi-5 SIL MS (30 m * 0,25 mm * 0,25 pm), columna capilar de sílice fundida (Restek). Se usó helio (presión constante 15,2 psi) como gas portador. La temperatura del inyector fue de 250 °C, ajustada para inyección sin división. El horno se ajustó a 50 °C durante 1 min y luego se aumentó la temperatura a 260 °C a una velocidad de 5 °C/min. La temperatura del detector fue de 280 °C. El intervalo de masas se registró de 41 a 350 m/z, con energía electrónica de 70 eV. Se inyectó en la columna una mezcla de alcanos de cadena lineal (C7-C23) en las condiciones mencionadas anteriormente para la determinación de los índices de retención. Los perfiles de espectro de GC-MS se analizaron mediante el uso del software chamstation. La identificación de los volátiles se asignó por comparación de sus índices de retención con los de la literatura y por comparación de datos espectrales con el estándar o con las bibliotecas W9N08 y HPCH2205 GC-MS.

Prueba antagónica de los compuestos específicos de la bacteria: después de que se identificaran los compuestos inhibidores potenciales (4-quinolinacarboxaldehído y 5-hidroximetil-2-furaldehído) en los extractos de la fracción activa del sobrenadante de la bacteria, se compraron los compuestos sintéticos paralelos (Sigma) y se examinaron en espiroplasma in vitro: 1 ml de medio de espiroplasma, 10 pl de células de espiroplasma y 10 pl de cada compuesto (concentración final de 1 milimolar) se incubaron durante tres días a 29 °C. El crecimiento de espiroplasma en caldo fresco sirvió como control positivo y se usó medio estéril que contenía 20 pl del extracto de fase como control negativo. Los cambios en el color del indicador de rojo a amarillo indicaron el crecimiento de espiroplasma.

Introducción de la bacteria a la planta: La capacidad del aislado para penetrar en la vid se probó en plántulas ex vitro de bígaro y vid de 6-8 semanas de edad cv. Chardonnay. Las plántulas se trataron en el cultivo aislado o en PBS (como control). Todos los tratamientos se realizaron en 3-5 repeticiones. Se probaron varios métodos: A) las plántulas en frasco se lavaron a fondo, se cortaron en el borde de la raíz y se sumergieron durante 24 horas antes de la siembra. B) inyección en el tallo: se inyectaron 20 pl de solución en la base del tallo mediante el uso de una aguja de calibre 30. C) las hojas se pincharon y se untaron con solución mediante el uso de un hisopo de algodón. Las plántulas tratadas se plantaron luego en tierra comercial para macetas (EN12580, Tuf Merom Golan) en macetas de 0/5 l.

La presencia del aislado en las plantas se examinó mediante PCR específica (véase la tabla 1) de las hojas por encima del punto de inoculación 7-10 días después de la inoculación. Se tomaron 300 mg de hojas de cada planta para probar la presencia de la bacteria. Se tuvo cuidado de tomar muestras de hojas nuevas que se desarrollaron después de la inoculación, para asegurar que no hubiera contaminación externa. El experimento se realizó en tres repeticiones y se usó PBS como control.

Detección de las bacterias:

PCR. Para determinar la presencia de bacterias y fitoplasmas en sus huéspedes eucariotas, se extrajo ADN de las plantas e insectos; el ADN de las nuevas hojas emergentes se extrajo mediante el método CTAB, mientras que el ADN de cada saltamontes individual se extrajo poniendo a tierra al insecto en tampón de lisis seguido de incubación a 65 °C durante 15 min y luego a 95 °C durante 10 min. Todas las muestras de ADN se mantuvieron a -20 °C hasta su uso posterior.

La reacción de PCR (25 pl) contenía 10 pl de Apex™ Taq ADN polimerasa Master Mix (Genorama, Tartu, Estonia), 5 pmol de cada cebador, 12,5 pl de DDW y 1 pl de plantilla de ^a Dⁿ . La PCR consistió en 35 ciclos de 94 °C -0,5 min, Tm de hibridación - 0,5 min (Tabla 1) y 72 °C - 0,5 min seguidos de 10 min a 72 °C. La bacteria se identificó mediante dos conjuntos de cebadores dirigidos al gen 16S de ARNr y el dominio ITS (Tabla 1), mientras que la presencia de fitoplasma se probó con PCR anidada como se describió anteriormente.

Microscopio. El cultivo bacteriano se visualizó al microscopio óptico (BX61, Olympus). Se aplicó el procedimiento de hibridación in situ con fluorescencia (FISH) para verificar la presencia de la bacteria y determinar su ubicación dentro de la vid. Las vides infectadas y no infectadas con la bacteria se seccionaron manualmente mediante el uso de una hoja de afeitar y las secciones se sumergieron en FAA (20 % de etanol, 2,5 % (v/v) de ácido acético, 2,5 % (v/v) de formaldehído). Las muestras con FAA se aspiraron durante 3 horas y permanecieron durante 20 horas más a temperatura ambiente y, posteriormente, se transfirieron a etanol al 50 % y se mantuvieron a -20 °C hasta su posterior análisis. Las secciones se deshidrataron mediante transferencias de secuencia a etanol al 80 % y al 100 % y luego se sumergieron en tampón de hibridación (Tris-HCl 20 mM [pH 8,0], NaCl 0,9 M, dodecilsulfato de sodio al 0,01 %, formamida al 30 %) con diez pmol de las sondas fluorescentes; Eub338 para bacterias generales y específico para DLB (véase la tabla 1) durante 4 h en TA. Luego, las secciones se lavaron en PBS y se visualizaron en un microscopio confocal IX81Olympus FluoView500. La especificidad de la detección se confirmó mediante el uso de un control sin sonda.

Bacterias como bioagentes contra el fitoplasma: con el fin de examinar el potencial de las bacterias como bioagentes contra el fitoplasma, se inocularon cinco repeticiones de plántulas de bígaro y vid saludables e infectadas con fitoplasma con la bacteria y se replantaron como se describió anteriormente. A continuación, las plantas se cultivaron durante ocho semanas, después de lo cual se examinaron características como la longitud de los brotes, la longitud de las hojas, el número de entrenudos y el peso seco. El experimento se realizó en cinco repeticiones, con PBS como control.

Pruebas de campo: se realizó un experimento de campo para estudiar el efecto de rociar el aislado en la reducción de los síntomas de amarillamiento en vides cultivadas en el campo.

Aplicación bacteriana. Una parcela de Chardonnay en los Altos del Golán de 468 vides con un 35 % de infección se dividió en siete parcelas no tratadas y tratadas que se rociaron una vez cada dos semanas durante la temporada de crecimiento (abril-noviembre). Las plantas se rociaron con una suspensión celular al 10 % más una aplicación de Tween20 al 0,1 %, 500 ml por planta mediante el uso de un pulverizador con ruedas con una pistola turbo de boquilla de 1,8 mm (Achim Raz Ltd). Las parcelas sin rociar sirvieron como control.

Detección. La presencia de la bacteria se examinó a los 7 y 14 días de la aspersión mediante análisis de PCR y aislamiento de DLB a partir de las muestras de hojas. Las hojas muestreadas fueron de la mitad de la vid (dos hojas de dos vides por parcela). Se molieron 300 mg de tejido de la base del pecíolo y del limbo para la extracción de ADN y 1000 mg del tejido de la base del pecíolo y del limbo para el aislamiento celular en medio de agar nutritivo (NA). Las hojas se lavaron minuciosamente con jabón comercial bajo agua corriente y se realizó una esterilización adicional sumergiéndolas en etanol al 70 % seguido de hipoclorito al 1 % y tres lavados en agua estéril antes del aislamiento celular.

Evaluación del efecto en el viñedo. En el momento de la cosecha, se puntuó la gravedad de la enfermedad de cada vid mediante el uso de una escala cualitativa de 0 -asintomática a 4 -severamente sintomática. El rendimiento y número de racimos y se midió para 148 vides de vides rociadas y no rociadas cosechadas manualmente. El peso de poda se midió durante el período de latencia. Mosto Brix, pH y peso de la baya se midieron de bayas seleccionadas al azar de 55 vides rociadas y no rociadas. La carga de rendimiento para cada vid se calculó como la relación entre el rendimiento y el peso de poda.

Introducción de bacterias en zanahorias a través del recubrimiento de las semillas: treinta semillas de zanahoria sin tratar (Cv. Dordogne) se incubaron en 10 ml de una formulación de bacterias de 10A8 CFU/ml durante 2 h a temperatura ambiente. A continuación, la formulación se filtró y las semillas se recolectaron, se colocaron sobre papel absorbente, se secaron y luego se sembraron en macetas de 400 ml que contenían perlita o tierra para macetas. Como control, se incubó la misma cantidad de semillas de manera similar con formulación estéril. Las semillas se dejaron germinar en el invernadero en condiciones de luz diurna natural y un intervalo de temperatura de 25-27 °C. Por cada lote de semillas tratadas se sembraron cuatro macetas, dos con perlita y dos con tierra para macetas y cada maceta contenía seis semillas.

Dieciocho días después de la siembra, se tomaron dos hojas jóvenes de una plántula en cada maceta. El ADN se extrajo y se siguió por PCR clásica con cebadores específicos de bacterias.

Tabla 1: Cebadores y sondas usadas

Ejemplo 1

Aislamiento e identificación de la bacteria descrita en la presente descripción

Aislamiento e identificación de la bacteria: el homogeneizado de placas del saltamontes en agar CV después de la esterilización de la superficie dio como resultado un crecimiento de 7 *105 unidades formadoras de colonias con idéntica morfología. La secuencia de ADN de 1421 pb de longitud del gen 16S de ARNr mostró una identidad del 97% con Dyella ginsengisoli (número de acceso EF191353) y Frateuria aurantia (número de acceso CP003350) (Xanthomonadaceae), aislada del suelo y planta, respectivamente. La identidad de este aislado se confirmó mediante su secuencia espaciadora transcrita interna (ITS) de 877 pb de longitud, que mostró una identidad del 84 % con Frateuria aurantia (número de acceso CP003350). Estos resultados indican que el aislado es un nuevo género.

Análisis del genoma bacteriano: El genoma de la bacteria contiene 4 191 471 pb, con un contenido de G+C del 68,6 %. La puntuación de superposición efectiva mutua entre la bacteria y el fitoplasma fue 0, lo que indica que la capacidad de crecimiento de ambas especies no depende de metabolitos comunes. Se identificaron un total de cinco grupos potenciales de metabolitos secundarios en el genoma bacteriano, que incluyen los tres grupos de bacteriocinas, un grupo de terpenos y un grupo de NRP.

Ejemplo 2

Efecto antagónico del sobrenadante bacteriano.

Ensayo antagónico del sobrenadante bacteriano: el filtrado del sobrenadante bacteriano inhibió el desarrollo de espiroplasma in vitro (Figura 1).

Identificación de los extractos de la fracción activa: cuando se evaluó el efecto de cada extracto de la fracción sobre el crecimiento de espiroplasma, solo los extractos de metanol y acetona inhibieron el espiroplasma in vitro, mientras que ninguna de las fracciones obtenidas del medio de control estéril inhibió esta bacteria modelo (Figura 2).

Identificación de los volátiles en los extractos de la fracción activa de Dyella: al comparar el patrón de los volátiles en los extractos de la fracción activa (metanol y acetona) con el mismo extracto de la fracción del medio de control estéril, se identificaron dos compuestos como inhibidores potenciales contra el espiroplasma (Figura 3). Estos compuestos fueron 4-quinolinacarboxaldehído y 5-hidroximetil-2-furaldehído. Además, el compuesto pirrolo[1,2-a]pirazina se identificó mediante análisis LC-MS (datos no mostrados).

Prueba antagonista: solo la 4-quinolinacarboxaldehído fue capaz de inhibir el crecimiento de espiroplasma a la concentración de 1 milimolar, mientras que no se mostró inhibición en presencia de 5-hidroximetil-2-furaldehído a la misma concentración.

Ejemplo 3

Detección de las bacterias en las plantas después de la inoculación

PCR. la bacteria fue capaz de penetrar las plántulas mediante todos los métodos examinados, que incluyen la pulverización, el contacto con las hojas, la inyección en el tallo y la inmersión de la raíz en un cultivo bacteriano. Sin embargo, la mejor inoculación se logró mediante aspersión foliar llegando a que hasta el 73 % de las plantas estaban habitadas por la bacteria una semana después de la aspersión. La bacteria pudo moverse en la planta hasta 28 cm (3 entrenudos) pero la mayoría de las muestras mostraron que permaneció en el primer entrenudo en el que se inyectó. El examen de la presencia de bacterias en plántulas inoculadas mediante PCR específico mostró que las bacterias ocuparon las nuevas hojas emergentes de las plantas de vid tres semanas después de la inoculación, mientras que no se detectó ningún producto de PCR en las plantas no inoculadas. Además, seis semanas después de la inoculación no se pudo detectar la bacteria en ninguna de las plantas.

Microscopio. Las observaciones en el cultivo de bacterias mostraron que esta bacteria tiene forma de varilla de 1 pm de largo. El análisis FISH mostró que la bacteria estaba restringida al floema de las vides dos semanas después de la inoculación de la bacteria (como se muestra en la figura 4).

Las bacterias como bioagentes contra el fitoplasma: no se observaron diferencias significativas entre las plantas de control saludables y las habitadas por las bacterias. Cuando la bacteria se introdujo en las plántulas infectadas con fitoplasma, la influencia del fitoplasma en la planta se redujo significativamente, como se puede ver en todos los parámetros registrados (longitud de los brotes, longitud de las hojas y entrenudos) observados ocho semanas después de la inoculación (Figuras 5A-E).

Se observaron resultados similares cuando la bacteria se introdujo en la vincapervinca: no hubo diferencias significativas en las características de las plantas saludables, pero la presencia de bacterias en la vincapervinca infectada con fitoplasma redujo el efecto del fitoplasma en estas plantas en términos de longitud de los brotes y peso seco, según se midió ocho semanas después de la inoculación (Figuras 6A-E).

Ejemplo 4

Experimentos de campo

La pulverización con una suspensión al 10 % dio como resultado la velocidad más alta de penetración en las hojas mejorada por la adición de un tensioactivo. La bacteria se detectó en muestras rociadas 7 días después de la introducción (dpi) en las fechas de muestreo 9/17 y 7/17 mediante PCR y métodos de aislamiento celular, respectivamente. Los resultados positivos oscilaron entre el 2-85 %. La bacteria estuvo presente en las hojas principalmente de 5-8 dpi pero hasta 15 dpi. En vides rociadas, la gravedad de los síntomas se redujo en un 25 % (Figura 7A), el rendimiento aumentó en un 12 % (Figura 7B) y la velocidad de remisión de los síntomas aumentó en aproximadamente 20 % en comparación con el control. El nivel de azúcar fue superior en 0,5 Brix pero no se detectó ninguna diferencia en el pH (Figura 7C, D). La carga de rendimiento de las vides rociadas aumentó significativamente en las vides rociadas y las vides saludables, pero no en las gravemente infectadas (Figura 8A, B, D).

En resumen, se aisló una bacteria del vector de saltamontes del fitoplasma de la vid. Esta bacteria está más estrechamente relacionada con Dyella ginsengisoli, pero puede resultar ser un género separado. La bacteria fue capaz de penetrar en las plantas tanto por las raíces como por las hojas, asentarse en el floema durante al menos tres semanas y su presencia parece afectar la morfología de las plantas infectadas con fitoplasma pero no las saludables. En algunos parámetros, el efecto del fitoplasma sobre la morfología de la planta se redujo notablemente. Los experimentos de campo respaldaron las observaciones de laboratorio. Los resultados indican que las bacterias poseen la capacidad de migrar de las semillas tratadas a las plántulas.

Ejemplo 5

Caracterización del sustrato bacteriano

Los inventores de la presente invención analizaron y caracterizaron el sustrato de crecimiento de la bacteria. La tabla 2 muestra la prueba de susceptibilidad a los antibióticos DLB (29 antibióticos probados).

La bacteria es resistente a los siguientes antibióticos: nitrofuración, ciprofloxacina, cefalotina, meropenem, norfloxacina, ácido nalidíxico, sulfato de colistina, imipenem, cefepima, aztreonam y cefuroxima (11 de 29 antibióticos probados, Tabla 2).

Tabla 2 Prueba de susceptibilidad a antibióticos DLB.

Metabolismo de DLB: los metabolitos ambientales que pueden ser utilizados por DLB se determinaron mediante el uso del kit BD BBL™ Crystal™ En/non-fermenters. Los resultados muestran los metabolitos que la bacteria usa o no (Tabla 3 y 4, respectivamente):

Tabla 3.

Tabla 4

Ejemplo 6

Inhibición de espiroplasma por sustancias secretadas por la bacteria descritas en la presente descripción

Las actividades antagónicas de las sustancias secretadas por DLB sobre el fitoplasma no pueden probarse directamente debido a la incapacidad de cultivar fitoplasmas en un medio artificial. Por este motivo, se probó la inhibición potencial de estas sustancias en Spiroplasma melliferum, un Mollicute cultivable. El experimento se realizó en una microplaca de 96 pocillos. Se adicionaron 150 pl de caldo fresco que contiene rojo fenol y 4 pl de células de espiroplasma (aproximadamente 105 células) a cada pocillo. Se eligieron tres compuestos en base al análisis que mostró que son secretados por DLB, y sus equivalentes sintéticos se usaron en el experimento: se adicionaron quinolinacarboxaldehído, hidroximetil-2-furaldehído y pirrolo[1,2-a]pirazina (Sigma-Aldrich, EE. UU.) en diferentes concentraciones (2 - 0,02 mM) al medio inoculado en cinco repeticiones. La microplaca se incubó durante dos días a 28 °C y se puntuó el color del medio mediante un lector de placas (Multiskan EX, Thermo Scientific, Waltham, MA EE. UU.) a OD = 595 nm. El crecimiento de espiroplasma en caldo fresco sirvió como control positivo, el medio sin espiroplasma sirvió como control negativo y el efecto inhibidor de la oxitetraciclina en diferentes concentraciones se usó como referencia.

Además de puntuar cada sustancia por separado, se probó la combinación de estas tres sustancias adicionando diferentes concentraciones (2-0,02 mM cada una) de dos compuestos al mismo pocillo. La concentración inhibitoria mínima (MIC) de oxitetraciclina fue de 0,35 mM (Figura 9).

La quinolinacarboxaldehído inhibió el crecimiento del espiroplasma a concentraciones de 2 y 1 mM, mientras que la pirrolo[1,2-a]pirazina inhibe el espiroplasma solo a 2 mM. El hidroximetil-2-furaldehído no mostró inhibición a las concentraciones examinadas. La combinación de quinolinacarboxaldehído con pirrolo o hidroximetilo no mostró un impacto significativo a 2 mM pero influyó en la inhibición de espiroplasma a 1 mM (Figura 10). La combinación de pirrolo[1,2-a]pirazina con hidroximetilo cambió la absorción del medio (véase el control de pirrolo con hidroxi) y, por lo tanto, la medida de inhibición no es válida.

En conclusión, los compuestos sintéticos equivalentes a las sustancias secretadas por DLB variaron en su efecto sobre el crecimiento de espiroplasma, una bacteria modelo para el fitoplasma. El compuesto más eficaz fue la quinolinacarboxaldehído, pero su concentración inhibitoria mínima (MIC) sigue siendo superior a la de los antibióticos de referencia, la oxitetraciclina.

La combinación de este compuesto con pirrolo[1,2-a]pirazina mostró un efecto antagónico a 1 mM, lo que sugiere que la inhibición de espiroplasma fue significativamente menor en presencia de estos dos compuestos juntos que con solo quinolinacarboxaldehído.

La combinación de quinolinacarboxaldehído con hidroximetilo mostró un efecto sinérgico a 1 mM, lo que sugiere que la inhibición de espiroplasma en presencia de estos dos compuestos juntos fue significativamente mayor que la inhibición de espiroplasma con solo quinolinacarboxaldehído.

Se examinó el efecto de la combinación de quinolinacarboxaldehído con hidroximetilo, que inhibía el espiroplasma, en diferentes especies bacterianas: Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Bacillus cereus. Estas cepas se examinaron en microplacas de 96 pocillos. Se adicionaron 150 pl de medio LB y 4 pl de células bacterianas (aproximadamente 105 células) a cada pocillo. La microplaca se incubó durante un día a 37 °C y la turbidez se calificó con un lector de placas (Multiskan EX, Thermo Scientific, Waltham, MA EE. UU.) a OD = 620 nm. Las bacterias que crecían en caldo fresco sirvieron como control positivo, el medio sin bacterias sirvió como control negativo.

Las especies bacterianas examinadas se inhibieron a 2 mM, mientras que solo Escherichia coli se vio afectada a 1 mM.

Ejemplo 7

Inhibición de Ca. Liberibacter

Ca. Liberibacter es un género de bacterias Gram-negativas que comprende varios patógenos de plantas económicamente importantes de los cuales, Ca. L. asiaticus y Ca. L. solanacearum son los presuntos agentes causales de las devastadoras enfermedades del enverdecimiento de los cítricos (Haunglongbing-HLB) y de las virutas de cebra/amarillos de zanahoria, respectivamente. Similar a los fitopatógenos del fitoplasma de Ca., Liberibacter, también son transmitidos por vectores (por psílidos) y residen exclusivamente en el tejido del floema de la planta. Debido a estas características similares y otras, los inventores de la invención exploraron el uso potencial de DLB como bioagente contra enfermedades causadas por Ca. Liberibacter, centrándose en el amarillo de la zanahoria causado por Ca. L. solanacearum.

Se diseñan diferentes conjuntos de cebadores de PCR en tiempo real en función de la secuencia del genoma de DLB. Estos cebadores se prueban primero en ADN purificado diluido en serie para determinar la sensibilidad de los cebadores. El cebador más sensible se prueba mediante el uso de las extracciones de ADN de plantas de bígaro infectadas para determinar su eficacia y especificidad.

La aplicación de DLB se realiza mediante riego o pulverización y, posteriormente, se determina el método de aplicación más eficiente mediante PCR en tiempo real. A continuación, se determina la dispersión y la abundancia de DLB en diferentes tejidos vegetales con respecto al método de aplicación mediante PCR en tiempo real. La longevidad de DLB se determina en plantas de zanahoria con respecto al método de aplicación mediante PCR en tiempo real.

DLB se aplica a zanahorias (de acuerdo con el procedimiento optimizado anterior) expuestas a vectores de psílidos calientes. La aparición de los síntomas y el título de Candidatus Liberibacter solanacearum (Lso) se puntúan a lo largo del tiempo en comparación con las plantas de zanahoria no tratadas con DLB.

Para determinar el efecto de DLB en la colonización de plantas de psílidos, las plantas se inoculan de acuerdo con el protocolo optimizado anterior y luego los psílidos (limpios o calientes) se introducen en pequeñas jaulas de red, la supervivencia de los psílidos, el número de huevos puestos y la supervivencia de las ninfas. Para determinar la capacidad de los psílidos para captar DLB de la zanahoria y transmitirlo, se inoculan plantas de zanahoria con DLB y se verifica su establecimiento en la planta mediante PCR en tiempo real. Luego, se permite que los psílidos limpios se alimenten de las plantas infectadas durante 2 días y luego se analizan mediante PCR en tiempo real para detectar la presencia de Lso en su cuerpo.

En procedimientos ejemplares adicionales, estos psílidos se colocan luego en plantas de zanahoria limpias, lo que les permite alimentarse durante 4 días. Las plantas inoculadas se prueban a lo largo del tiempo para determinar la transmisión de DLB a las zanahorias mediante PCR en tiempo real.

En procedimientos ilustrativos adicionales, se permite que los psílidos infectados con Lso se alimenten de plantas de zanahoria limpias o de plantas infectadas con Lso. El título de Lso dentro del psílido se determina con el tiempo mediante PCR en tiempo real.

Específicamente, las plantas de zanahoria en la etapa de 3-4 hojas verdaderas se rociaron hasta la escorrentía o se irrigaron con 50 ml de formulación de DLB con una concentración de 10A8 CFU/ml. Luego se tomaron las muestras de plantas de zanahoria 3, 7, 10 y 16 días después de la inoculación para determinar la presencia de DLB en las hojas. Se usó medio gramo de hojas recién emergidas para la extracción de ADN seguido de PCR con cebadores específicos de DLB. Los resultados se presentan en la tabla 5 más abajo.

Claims (3)

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende quinolinacarboxaldehído 1 mM e hidroximetil-2-furaldehído que tienen la actividad de eliminar un fitopatógeno o reducir el crecimiento del mismo.

2. La composición de la reivindicación 1, que comprende además un material seleccionado del grupo que consiste en: un fertilizante, un herbicida, un pesticida o cualquier combinación de los mismos.

3. Un método para tratar o reducir los síntomas de un fitopatógeno, el método comprende la etapa de poner en contacto dicho fitopatógeno con la composición de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que trata o reduce de esta manera los síntomas del fitopatógeno, dicho fitopatógeno se selecciona de Xanthomonas campestris, Candidatus Liberibacter, Spiroplasma melliferum y fitoplasma.