BR112017014230B1

BR112017014230B1 - Combinação sintética e métodos para preparar uma semente compreendendo uma população de endófitos, e para modular uma característica de planta

Info

Publication number: BR112017014230B1
Application number: BR112017014230-9A
Authority: BR
Inventors: David R. Weisman; Phillip Samayoa; Xuecheng Zhang; Geoffrey von Maltzahn; Karen V. Ambrose; Nathan A. Billings; Slavica Djonovic; Richard Bailey Flavell; Trudi A. Gulick; David Morris Johnston; Jonathan W. Leff; Stephanie M. Liva; Jeffrey Lyford; Luis Miguel Marquez; Yves Alain Millet; Craig Sadowski; Gerardo V. Toledo
Original assignee: Indigo Ag, Inc
Priority date: 2014-12-30
Filing date: 2015-12-30
Publication date: 2022-06-14
Also published as: IL253200A0; BR112017014230A2; CA2972904C; AU2015373978B2; RU2017127214A; WO2016109758A2; US10667523B2; MX2017008676A; RU2017127214A3; WO2016109758A3; US20210076685A1; EP3240391A4; EP3240391A2; WO2016109758A8; AU2015373978A1; AU2019208201A1; CA3060491A1; US20180020677A1; MX2019012100A; CA2972904A1

Abstract

endófitos de semente através de cultivares e espécies, composições associadas e métodos de uso dos mesmos. materiais e métodos para melhorar as características da planta e para fornecer benefícios de capacidade da planta são proporcionados. em algumas modalidades, os materiais e os métodos, que empregam o mesmo, podem compreender endófitos.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Internacional PCT/US2015/038187, depositado em 26 de junho de 2015, Pedido Provisório US 62/156.021, depositado em 1° de maio de 2015, Pedido Provisório US 62/156.028, depositado em 1° de maio de 2015, Pedido Provisório US 62/098.296, depositado em 30 de dezembro de 2014, Pedido Provisório US 62/098.298, depositado em 30 de dezembro de 2014, Pedido Provisório US 62/098.299, depositado em 30 de dezembro de 2014, Pedido Provisório US 62/098.302, depositado em 30 de dezembro de 2014 e Pedido Provisório US 62/098.304, depositado em 30 de dezembro de 2014, cada um dos quais é incorporado por referência em sua totalidade.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0002] O pedido do momento contém uma Listagem de Sequências que foi apresentada via EFS-Web e está incorporada em sua totalidade por meio deste para referência. A referida a cópia ASCII, criada em 30 de dezembro de 2015, é nomeada 10035_Final_ST25. txt, e tem 20 bytes de tamanho.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0003] Entre outras coisas, as invenções aqui divulgadas se referem a composições e métodos para melhorar o cultivo de plantas, particularmente plantas agrícolas. Em um aspecto, as invenções aqui descritas se referem a bactérias e fungos benéficos que são capazes de viver em uma planta, o que pode ser usado para conferir propriedades agronômicas melhoradas às plantas. Em um outro aspecto, as invenções aqui descritas se referem a métodos de melhoria das caracte- rísticas da planta através da introdução de combinações sintéticas de tais bactérias benéficas e/ou fungos a essas plantas. Além disso, as invenções aqui descritas também fornecem métodos de tratamento de sementes e outros elementos de plantas com combinações sintéticas de bactérias e/ou fungos benéficos que são capazes de viver dentro de uma planta, para conferir características agronômicas melhoradas às plantas, particularmente às plantas agrícolas.

ANTECEDENTES

[0004] A agricultura enfrenta inúmeros desafios que tornam cada vez mais difícil fornecer alimentos, materiais e combustíveis para a população mundial. O crescimento da população e as mudanças na dieta associadas ao aumento dos rendimentos estão aumentando a demanda global de alimentos, enquanto muitos recursos-chave para a agricultura estão se tornando cada vez mais escassos. Em 2050, a FAO projeta que a produção total de alimentos deve aumentar em 70% para atender às necessidades da população em crescimento, um desafio que é exacerbado por numerosos fatores, incluindo a diminuição dos recursos de água doce, o aumento da concorrência para as terras aráveis, o aumento dos preços da energia, aumentando os custos de entrada e a provável necessidade de que as culturas se adaptem às pressões de um clima global mais extremo. A necessidade de cultivar quase duas vezes mais alimentos em climas mais incertos está gerando uma necessidade crítica de novas inovações.

[0005] Hoje, o desempenho das culturas é otimizado através de tecnologias direcionadas para a interação entre o genótipo da cultura (por exemplo, criação de plantas, culturas geneticamente modificadas (GM)) e seu ambiente circundante (por exemplo, fertilizantes, herbicidas sintéticos, pesticidas). Embora esses paradigmas tenham ajudado a duplicar a produção mundial de alimentos nos últimos cinquenta anos, as taxas de crescimento do rendimento ficaram paralisadas em muitas grandes culturas e as mudanças no clima foram associadas a declínios de produção em culturas importantes, como o trigo. Além dos longos padrões de desenvolvimento e regulação, os temores públicos de culturas GM e produtos químicos sintéticos desafiaram seu uso em muitas culturas e países chave, resultando em uma completa falta de aceitação de traços de GM no trigo e na exclusão de culturas GM e muitos químicos sintéticos dos mercados europeus. Assim, existe uma necessidade significativa de abordagens inovadoras, eficazes e publicamente aceitáveis para melhorar o rendimento intrínseco e a resiliên- cia das culturas às tensões graves.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0006] As descrições de PCT/US2014/044427, depositado em 26 de junho de 2014, Pedido US 14/316. 469, depositado em 26 de junho de 2014 e PCT/US2014/054160, depositado em 4 de setembro de 2014, são incorporadas por referência na sua totalidade, incluindo as listagens de sequências contendo as SEQ ID NOs:1-1448.

[0007] A presente invenção baseia-se na descoberta de um elemento de planta (por exemplo, uma planta inteira, mudas, tecido me- ristemático, tecido moído, tecido vascular, tecido dérmico, semente, folha, raiz, rebento, caule, flor, fruta, estólon, bulbo, tubérculo, grão, kelkis, rebento, broto) pode ser efetivamente aumentado associando sua superfície a uma cepa de endófito único ou a uma pluralidade de endófitos em uma quantidade que normalmente não é encontrada no elemento de planta. Os endófitos aqui descritos podem ser isolados do interior da mesma planta ou de uma planta diferente, ou de dentro de uma parte ou tecido da mesma planta ou planta diferente. O elemento de planta assim associado a uma cepa de endófito único ou a uma pluralidade de endófitos pode ser usado para conferir traços ou traços agronômicos melhorados para a semente ou planta que é cultivada ou derivada do elemento de planta.

[0008] Em uma modalidade, a invenção apresenta um método para melhorar uma característica agrícola em uma planta agrícola. Em uma modalidade, o método inclui proporcionar uma planta agrícola, semente ou tecido da mesma; contatar a planta, a semente ou o tecido da mesma com uma formulação que compreende um endófito que é comum a pelo menos dois tipos de plantas doadoras que estão presentes na formulação em uma quantidade eficaz para colonizar a planta; e cultivar as plantas em condições que permitem ao endófito melhorar uma característica na planta. Em algumas modalidades, as duas plantas doadoras são da mesma família. Em algumas modalidades, as duas plantas doadoras são do mesmo gênero. Em algumas modalidades, as duas plantas doadoras são da mesma espécie. Em algumas modalidades, o tecido da planta agrícola é uma semente. Em uma outra modalidade, a população está disposta na superfície da semente.

[0009] Em uma modalidade, o método para melhorar um traço agrícola em uma planta agrícola inclui proporcionar uma planta agrícola, semente ou tecido da mesma; contatar a planta, a semente ou o tecido da mesma com uma formulação que compreende um endófito derivado de uma planta ancestral em uma quantidade eficaz para colonizar a planta; e permitir que a planta cresça em condições que permitam ao endófito colonizar a planta.

[0010] A invenção também apresenta um método para preparar uma semente que compreende uma população de endófito. O método que compreende a aplicação a uma superfície externa de uma semente, uma formulação que compreende uma população de endófitos que consiste essencialmente em um endófito que compreende uma sequência de ácido nucleico 16S rRNA ou ITS rRNA pelo menos 95% idêntica a uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs:1-455.

[0011] Em algumas modalidades, é proporcionado aqui um méto- do para o tratamento de mudas. O método inclui contatar a folhagem ou a rizosfera de uma pluralidade de mudas de plantas agrícolas com uma semente uma formulação que compreende uma população de endófitos que consiste essencialmente em um endófito que compreende uma sequência de ácido nucleico 16S rRNA ou ITS rRNA, pelo menos 95% idêntica a uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs:1-455; e cultivar as mudas contatadas.

[0012] A invenção também possui um método para modular uma característica da planta. O método inclui a aplicação à vegetação ou uma área adjacente à vegetação, uma semente uma formulação compreendendo uma população de endófitos consistindo essencialmente em um endófito que compreende uma sequência de ácido nucleico 16S rRNA ou ITS rRNA, pelo menos 95% idêntica a uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs:1- 455, em que a formulação é capaz de proporcionar um benefício à vegetação, ou a uma cultura produzida a partir da vegetação.

[0013] Um método para modular um traço de planta também é apresentado. O método compreendendo a aplicação de uma formulação ao solo, a semente uma formulação compreendendo uma população de endófitos consistindo essencialmente em um endófito que compreende uma sequência de ácido nucleico 16S rRNA ou ITS rRNA pelo menos 95% idêntica a uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs:1-455, em que a formulação é capaz de proporcionar um benefício às sementes plantadas no solo ou a uma cultura produzida a partir de plantas cultivadas no solo.

[0014] Em algumas modalidades, o endófito compreende uma sequência de ácido nucleico 16S rRNA ou ITS rRNA pelo menos 95% idêntica a uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs:1-455. Em algumas modalidades, o endófito é capaz de uma função ou atividade selecionada do grupo que consiste em produção de auxina, fixação de nitrogênio, produção de um composto antimicrobiano, solubilização de fosfato mineral, produção de sideróforo, produção de celulase, produção de quitinase, produção de xilanase e produção de acetoína. Em algumas modalidades, o endófito exibe pelo menos dois dos seguintes:produção de auxina, fixação de nitrogênio, produção de um composto antimicrobi- ano, solubilização de fosfato mineral, produção de sideróforos, produção de celulase, produção de quitinase, produção de xilanase e produção de acetoína.

[0015] Em algumas modalidades, o endófito é capaz de metaboli- zar pelo menos um substrato selecionado do grupo que consiste em :a-D-glicose, arabinose, arbutina, b-metil-D-galactosídeo, b-metil-D- glicosídeo, D-alanina, D-arabitol, ácido D-aspártico, D-celobiose, dextrina, D-frutose, D-galactose , ácido D-glucônico, D-glucosamina, di- hidroxiacetona, ácido DL-málico, D-manitol, D-manose, D-melezitose, D-melibiose, D-rafinose, D-ribose, D-serina, D-treonina, D-trealose, D-xilose, ácido g-amino-N-butírico, g-ciclodextrina, gelatina, gentiobi- ose, glicogênio, ácido glicil-L-aspártico, ácido glicil-L-glutâmico, glicil- L-prolina, ácido glioxílico, i-eritritol, inosina, L-alanina, L-alanil-glicina, L-arabinose, L-asparagina, ácido L-aspártico, ácido-g-lactona-L- galactônico, ácido L-glutâmico, L-glutamina, L-histidina, L-prolina, L- ramnose, L-serina, L-treonina, maltitol, maltose, maltotriose, manose, N-acetil-D-glucosamina, ácido oxálico, palatinose, pectina, prolina, salicina, estaquiose, sacarose, trealose, turanose, tiramina, uridina e xilose.

[0016] Em algumas modalidades, o endófito é capaz de metaboli- zar pelo menos dois substratos selecionados do grupo que consiste em: a-D-glicose, arabinose, arbutina, b-metil-D-galactosídeo, b-metil- D-glicosídeo, D-alanina, D-arabitol, ácido D-aspártico, D-celobiose, dextrina, D-frutose, D-galactose , ácido D-glucônico, D-glucosamina, di-hidroxiacetona, ácido DL-málico, D-manitol, D-manose, D- melezitose, D-melibiose, D-rafinose, D-ribose, D-serina, D-treonina, D-trealose, D-xilose, ácido g-amino-N-butírico, g-ciclodextrina, gelatina, gentiobiose, glicogênio, ácido glicil-L-aspártico, ácido glicil-L- glutâmico, glicil-L-prolina, ácido glioxílico, i-eritritol, inosina, L-alanina, L-alanil-glicina, L-arabinose, L-asparagina, ácido L-aspártico, ácido-g- lactona-L-galactônico, ácido L-glutâmico, L-glutamina, L-histidina, L- prolina, L-ramnose, L-serina, L-treonina, maltitol, maltose, maltotriose, manose, N-acetil-D-glucosamina, ácido oxálico, palatinose, pec- tina, prolina, salicina, estaquiose, sacarose, trealose, turanose, tira- mina, uridina e xilose.

[0017] Em algumas modalidades, o endófito está presente em uma concentração de pelo menos 102 CFU ou esporos por semente na superfície das sementes após o contato. Em algumas modalidades, a aplicação ou o contato compreende pulverizar, imergir, revestir, encapsular ou esvaziar as sementes ou mudas com a formulação.

[0018] Em algumas modalidades, o benefício ou a característica agrícola são selecionados do grupo que consiste em: aumento da biomassa da raiz, aumento do comprimento da raiz, aumento da altura, aumento do comprimento do raio, aumento do número de folhas, aumento da eficiência do uso da água, aumento da tolerância à baixa tensão de nitrogênio, aumento da eficiência do uso de nitrogênio, aumento da biomassa geral, aumento do rendimento de grãos, aumento da taxa de fotossíntese, aumento da tolerância à seca, aumento da tolerância ao calor, aumento da tolerância ao sal, aumento da resistência a tensão de nematódeos, aumento da resistência a um patóge- no fúngico, aumento da resistência a um patógeno bacteriano, aumento da resistência a um agente patógeno viral, modulação detectável no nível de um metabolito, uma modulação detectável no transcriptoma, e uma modulação detectável no proteoma, em relação às sementes de referência ou plantas agrícolas derivadas de sementes de referência. Em algumas modalidades, o benefício ou a característica agrícola compreendem pelo menos dois benefícios ou traços agrícolas selecionados do grupo que consiste em: aumento da biomassa da raiz, aumento do comprimento da raiz, aumento da altura, aumento do comprimento do raio, aumento do número de folhas, aumento da eficiência do uso da água, aumento da tolerância à baixa tensão de nitrogênio, aumento da eficiência do uso de nitrogênio, aumento da biomassa geral, aumento do rendimento de grãos, aumento da taxa de fotossínte- se, aumento da tolerância à seca, aumento da tolerância ao calor, aumento da tolerância ao sal, aumento da resistência a tensão de nema- tódeos, aumento da resistência a um patógeno fúngico, aumento da resistência a um patógeno bacteriano, aumento da resistência a um agente patógeno viral, modulação detectável no nível de um metaboli- to, uma modulação detectável no transcriptoma, e uma modulação de- tectável no proteoma, em relação às sementes de referência ou plantas agrícolas derivadas de sementes de referência. Em algumas modalidades, o benefício é o aumento da tolerância à baixa tensão de nitrogênio ou ao aumento da eficiência do uso de nitrogênio, e o endó- fito não é diazotrófico.

[0019] Em algumas modalidades, a formulação compreende pelo menos um membro selecionado do grupo que consiste em um veículo compatível com a agricultura, um agente de pegajosidade, um estabilizador microbiano, um fungicida, um agente antibacteriano, um herbicida, um nematicida, um insecticida, um regulador de crescimento de plantas, um rodenticida e um nutriente.

[0020] Em algumas modalidades, o endófito compreende uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 97% idêntica a uma se- quência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs:1-455, em que o endófito está presente na formulação em uma quantidade eficaz para colonizar a planta agrícola madura. Em algumas modalidades, o endófito compreende uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 99% idêntica a uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs:1-455, em que o endófito está presente na formulação em uma quantidade eficaz para colonizar a planta agrícola madura. Em algumas modalidades, o endófito compreende uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 99,5% idêntica a uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs:1-455, em que o endófi- to está presente na formulação em uma quantidade eficaz para coloni-zar a planta agrícola madura.

[0021] Em algumas modalidades, a planta, a semente ou o tecido da mesma é contatada com pelo menos 10 CFU ou esporos, pelo menos 100 CFU ou esporos, pelo menos 300 CFU ou esporos, pelo menos 1.000 CFU ou esporos, pelo menos 3.000 CFU ou esporos, pelo menos 10.000 CFU ou esporos, pelo menos 30.000 CFU ou esporos, pelo menos 100.000 CFU ou esporos, pelo menos 300.000 CFU ou esporos, pelo menos 1.000.000 CFU ou esporos, ou mais, do endófito.

[0022] Em algumas modalidades, a formulação compreende pelo menos dois endófitos que compreendem uma sequência de ácido nu- cleico que é pelo menos 97% idêntica, pelo menos 98% idêntica, pelo menos 99% idêntica, pelo menos 99,5% idêntica ou 100% idêntica a uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs:1-455, em que os pelo menos dois endófitos estão presentes na formulação em uma quantidade eficaz para colonizar a planta agrícola madura. Em algumas modalidades, a formulação compreende pelo menos dois endófitos proporcionados na Tabela 1, Tabela 2, Tabela 7 e Tabela 8.

[0023] Em algumas modalidades, a planta é uma monocotiledô- nea. A monocotiledônea pode ser milho, trigo, cevada ou arroz. Em algumas modalidades, a planta é uma dicotiledônea. A dicotiledônea pode ser uma soja, amendoim, canola, algodão, Brassica Napus, repolho, alface, melão, morango, nabo, melancia, tomate ou pimenta.

[0024] Em algumas modalidades, o endófito está presente na formulação em uma quantidade eficaz para ser detectável dentro de um tecido alvo da planta agrícola selecionada a partir de uma fruta, semente, folha, raiz ou porção da mesma.

[0025] Em algumas modalidades, o endófito é detectado em uma quantidade de pelo menos 10 CFU ou esporos, pelo menos 100 CFU ou esporos, pelo menos 300 CFU ou esporos, pelo menos 1.000 CFU ou esporos, pelo menos 3.000 CFU ou esporos, pelo menos 10.000 CFU ou esporos, pelo menos, 30.000 CFU ou esporos, pelo menos 100.000 CFU ou esporos, pelo menos 300.000 CFU ou esporos, pelo menos 1.000.000 CFU ou esporos, ou mais, no tecido alvo.

[0026] Em algumas modalidades, o endófito está presente na formulação em uma quantidade eficaz para aumentar a biomassa e/ou rendimento da fruta ou sementes produzidas pela planta em pelo menos 1%, pelo menos 2%, pelo menos 3%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos, 80%, pelo menos 90%, pelo menos 100%, ou mais, quando comparados com a fruta ou semente de uma planta agrícola de referência.

[0027] Em algumas modalidades, o endófito está presente na formulação em uma quantidade eficaz para aumentar de forma detectá- vel a biomassa da planta ou tecido da mesma. Em algumas modalidades, a biomassa da planta ou tecido da mesma é aumentada de forma detectável em pelo menos 1%, pelo menos 2%, pelo menos 3%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 100% ou mais, quando comparados com uma planta agrícola de referência.

[0028] Em algumas modalidades, o endófito está presente na formulação em uma quantidade eficaz para aumentar de forma detectá- vel a taxa de germinação da semente. Em algumas modalidades, a taxa de germinação da semente é aumentada em pelo menos 0,5%, pelo menos 1%, pelo menos 2%, pelo menos 3%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 100% ou mais, quando comparada com uma planta agrícola de referência.

[0029] Em algumas modalidades, o endófito está presente na formulação em uma quantidade eficaz para induzir de forma detectável a produção de auxina na planta. Em algumas modalidades, a produção de auxina na planta é aumentada em pelo menos 1%, pelo menos 2%, pelo menos 3%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 100% ou mais, quando comparada com uma planta agrícola de referência.

[0030] A invenção também apresenta uma planta agrícola ou uma porção de tecido da mesma, compreendendo uma formulação compreendendo um endófito que é comum a pelo menos dois tipos de plantas doadoras que está disposto sobre uma superfície externa da planta ou porção de tecido da mesma, ou dentro da planta ou porção de tecido da mesma em uma quantidade eficaz para colonizar a planta, e em uma quantidade eficaz para fornecer um benefício para a planta agrícola moderna.

[0031] Em algumas modalidades da planta agrícola ou porção de tecido da mesma, o endófito compreende uma sequência de ácido nu- cleico que é pelo menos 97% idêntica a uma sequência de ácido nu- cleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs:1-455. Em algumas modalidades da planta agrícola ou porção de tecido da mesma, o endófito compreende uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 99% idêntica a uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs:1-455. Em algumas modalidades da planta agrícola ou porção de tecido da mesma, o endófito compreende uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 99,5% idêntica a uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs:1-455.

[0032] Em algumas modalidades da planta agrícola ou porção de tecido da mesma, o endófito é capaz de uma função ou atividade selecionada do grupo que consiste em produção de auxina, fixação de nitrogênio, produção de um composto antimicrobiano, solubilização de fosfato mineral, produção de sideróforo, produção de celulase, produção de quitinase, produção de xilanase e produção de acetoína.

[0033] Em algumas modalidades da planta agrícola, ou porção de tecido da mesma, o endófito exibe pelo menos dois dos seguin- tes:produção de auxina, fixação de nitrogênio, produção de um composto antimicrobiano, solubilização de fosfato mineral, produção de sideróforos, produção de celulase, produção de quitinase, produção de xilanase e produção de acetoína.

[0034] Em algumas modalidades da planta agrícola, ou porção de tecido da mesma, o endófito é capaz de metabolizar pelo menos um substrato selecionado do grupo que consiste em: a-D-glicose, arabinose, arbutina, b-metil-D-galactosídeo, b-metil-D-glicosídeo, D-alanina, D-arabitol, ácido D-aspártico, D-celobiose, dextrina, D-frutose, D- galactose , ácido D-glucônico, D-glucosamina, di-hidroxiacetona, ácido DL-málico, D-manitol, D-manose, D-melezitose, D-melibiose, D- rafinose, D-ribose, D-serina, D-treonina, D-trealose, D-xilose, ácido g- amino-N-butírico, g-ciclodextrina, gelatina, gentiobiose, glicogênio, ácido glicil-L-aspártico, ácido glicil-L-glutâmico, glicil-L-prolina, ácido glio- xílico, i-eritritol, inosina, L-alanina, L-alanil-glicina, L-arabinose, L- asparagina, ácido L-aspártico, ácido-g-lactona-L-galactônico, ácido L- glutâmico, L-glutamina, L-histidina, L-prolina, L-ramnose, L-serina, L- treonina, maltitol, maltose, maltotriose, manose, N-acetil-D- glucosamina, ácido oxálico, palatinose, pectina, prolina, salicina, esta- quiose, sacarose, trealose, turanose, tiramina, uridina e xilose.

[0035] Em algumas modalidades da planta agrícola, ou porção de tecido da mesma, o endófito é capaz de metabolizar pelo menos dois substratos selecionados do grupo que consiste em: a-D-glicose, arabinose, arbutina, b-metil-D-galactosídeo, b-metil-D-glicosídeo, D-alanina, D-arabitol, ácido D-aspártico, D-celobiose, dextrina, D-frutose, D- galactose , ácido D-glucônico, D-glucosamina, di-hidroxiacetona, ácido DL-málico, D-manitol, D-manose, D-melezitose, D-melibiose, D- rafinose, D-ribose, D-serina, D-treonina, D-trealose, D-xilose, ácido g- amino-N-butírico, g-ciclodextrina, gelatina, gentiobiose, glicogênio, ácido glicil-L-aspártico, ácido glicil-L-glutâmico, glicil-L-prolina, ácido glio- xílico, i-eritritol, inosina, L-alanina, L-alanil-glicina, L-arabinose, L- asparagina, ácido L-aspártico, ácido-g-lactona-L-galactônico, ácido L- glutâmico, L-glutamina, L-histidina, L-prolina, L-ramnose, L-serina, L- treonina, maltitol, maltose, maltotriose, manose, N-acetil-D- glucosamina, ácido oxálico, palatinose, pectina, prolina, salicina, esta- quiose, sacarose, trealose, turanose, tiramina, uridina e xilose.

[0036] Em algumas modalidades da planta agrícola, ou porção de tecido da mesma a formulação está disposta sobre uma superfície externa da planta ou porção de tecido da mesma, ou dentro da planta ou porção de tecido da mesma, por pulverização, imersão, revestimento, encapsulamento ou remoção de pó da planta ou porção de tecido da mesma com a formulação.

[0037] Em algumas modalidades da planta agrícola, ou porção de tecido da mesma, compreende ainda uma formulação compreende pelo menos um membro selecionado do grupo que consiste em um veículo compatível com a agricultura, um agente de pegajosidade, um estabilizador microbiano, um fungicida, um agente antibacteriano, um herbicida, um nematicida, um insecticida, um regulador de crescimento de plantas, um rodenticida e um nutriente.

[0038] Em algumas modalidades da planta agrícola, ou porção de tecido da mesma, o benefício é selecionado do grupo que consiste em: aumento da biomassa da raiz, aumento do comprimento da raiz, aumento da altura, aumento do comprimento do raio, aumento do número de folhas, aumento da eficiência do uso da água, aumento da tolerância à baixa tensão de nitrogênio, aumento da eficiência do uso de nitrogênio, aumento da biomassa geral, aumento do rendimento, aumento da taxa de fotossíntese, aumento da tolerância à seca, aumento da tolerância ao calor, aumento da tolerância ao sal, aumento da resistência a tensão de nematódeos, aumento da resistência a um patóge- no fúngico, aumento da resistência a um patógeno bacteriano, aumento da resistência a um agente patógeno viral, aumento da resistência à herbivoria, modulação detectável no nível de um metabolito, uma modulação detectável no proteoma, e uma modulação detectável no transcriptoma, em relação a uma planta agrícola de referência.

[0039] Em algumas modalidades da planta agrícola, ou porção de tecido da mesma, o benefício compreende pelo menos dois benefícios selecionados do grupo que consiste em aumento:da biomassa da raiz, aumento do comprimento da raiz, aumento da altura, aumento do comprimento do raio, aumento do número de folhas, aumento da eficiência do uso da água, aumento da tolerância à baixa tensão de nitro- gênio, aumento da eficiência do uso de nitrogênio, aumento da biomassa geral, aumento do rendimento, aumento da taxa de fotossínte- se, aumento da tolerância à seca, aumento da tolerância ao calor, aumento da tolerância ao sal, aumento da resistência a tensão de nema- tódeos, aumento da resistência a um patógeno fúngico, aumento da resistência a um patógeno bacteriano, aumento da resistência a um agente patógeno viral, aumento da resistência à herbivoria, modulação detectável no nível de um metabolito, uma modulação detectável no proteoma, e uma modulação detectável no transcriptoma, em relação a uma planta agrícola de referência. Em algumas modalidades da planta agrícola, ou porção de tecido da mesma, o benefício é uma tolerância aumentada ao baixa tensão de nitrogênio ou aumento da eficiência do uso de nitrogênio, e o endófito não é diazotrófico.

[0040] Em algumas modalidades da planta agrícola, ou porção de tecido da mesma, a planta, a semente ou o tecido da mesma é contatada com pelo menos 10 CFU ou esporos, pelo menos 100 CFU ou esporos, pelo menos 300 CFU ou esporos, pelo menos 1.000 CFU ou esporos, pelo menos 3.000 CFU ou esporos, pelo menos 10.000 CFU ou esporos, pelo menos 30.000 CFU ou esporos, pelo menos 100.000 CFU ou esporos, pelo menos 300.000 CFU ou esporos, pelo menos 1.000.000 CFU ou esporos, ou mais, do endófito. Em algumas modalidades da planta agrícola, ou porção de tecido da mesma, o tecido vegetal é uma semente. Em uma outra modalidade, o endófito está dis-posto na superfície da semente.

[0041] Em algumas modalidades da planta agrícola, ou porção de tecido da mesma, compreende pelo menos dois endófitos que compreendem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 97% idêntica, pelo menos 98% idêntica, pelo menos 99% idêntica, pelo menos 99,5% idêntica ou 100% idêntica a uma sequência de ácido nu- cleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs:1-455 em uma quantidade eficaz para colonizar a planta agrícola madura. Em algumas modalidades da planta agrícola, ou porção de tecido da mesma, os dois endófitos são selecionados dos grupos descritos na Tabela 1, Tabela 2, Tabela 7 e Tabela 8.

[0042] Em algumas modalidades, a planta agrícola é uma monoco- tiledônea. Em algumas modalidades, a porção de tecido da mesma é derivada de uma monocotiledônea. A monocotiledônea pode ser milho, trigo, cevada ou arroz.

[0043] Em algumas modalidades, a planta agrícola é uma dicotile- dônea. Em algumas modalidades, a porção de tecido da mesma é derivada de uma dicotiledônea. A dicotiledônea pode ser uma soja, canola, algodão, Brassica Napus, tomate ou pimenta.

[0044] Em algumas modalidades da planta agrícola, ou porção de tecido da mesma o endófito está disposto em uma quantidade eficaz para ser detectável dentro de um tecido alvo do tecido alvo maduro da planta agrícola madura selecionada de uma fruta, semente, folha, raiz ou porção da mesma.

[0045] Em algumas modalidades da planta agrícola, ou porção de tecido da mesma, a população está disposta em uma quantidade eficaz para aumentar a taxa de germinação da semente. A taxa de germinação da semente pode ser aumentada em pelo menos 0,5%, pelo menos 1%, pelo menos 2%, pelo menos 3%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 100% ou mais, quando comparada com uma planta agrícola de referência.

[0046] Em algumas modalidades da planta agrícola, ou porção de tecido da mesma, a população está disposta em uma quantidade eficaz para ser detectável dentro de um tecido alvo da planta madura. O tecido alvo pode ser a raiz, rebento, folha, flor, fruta ou semente.

[0047] Em algumas modalidades da planta agrícola, ou porção de tecido da mesma, a população é detectada em uma quantidade de pelo menos 10 CFU ou esporos, pelo menos 100 CFU ou esporos, pelo menos 300 CFU ou esporos, pelo menos 1.000 CFU ou esporos, pelo menos 3.000 CFU ou esporos, pelo menos 10.000 CFU ou esporos, pelo menos, 30.000 CFU ou esporos, pelo menos 100.000 CFU ou esporos, pelo menos 300.000 CFU ou esporos, pelo menos 1.000.000 CFU ou esporos, ou mais, no tecido alvo.

[0048] Em algumas modalidades da planta agrícola, ou porção de tecido da mesma, a população está disposta em uma quantidade eficaz para ser detectável na rizosfera em torno da planta. A população pode ser detectada em uma quantidade de pelo menos 10 CFU ou esporos, pelo menos 100 CFU ou esporos, pelo menos 300 CFU ou esporos, pelo menos 1.000 CFU ou esporos, pelo menos 3.000 CFU ou esporos, pelo menos 10.000 CFU ou esporos, pelo menos, 30.000 CFU ou esporos, pelo menos 100.000 CFU ou esporos, pelo menos 300.000 CFU ou esporos, pelo menos 1.000.000 CFU ou esporos, ou mais, na rizosfera em torno da planta.

[0049] Em algumas modalidades da planta agrícola, ou porção de tecido da mesma, a população está disposta em uma quantidade eficaz para aumentar de forma detectável a biomassa da planta. A biomassa da planta ou tecido da mesma pode ser aumentada de forma detectável em pelo menos 1%, pelo menos 2%, pelo menos 3%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 100% ou mais, quando comparados com uma planta agrícola de referência.

[0050] Em algumas modalidades da planta agrícola, ou porção de tecido da mesma, a população está disposta em uma quantidade eficaz para aumentar a biomassa de uma fruta ou semente da planta. A biomassa da fruta ou semente da planta pode ser aumentada de forma detectável em pelo menos 1%, pelo menos 2%, pelo menos 3%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 100% ou mais, quando comparada com a fruta ou semente de uma planta agrícola de referência.

[0051] Em algumas modalidades da planta agrícola, ou porção de tecido da mesma, a população está disposta em uma quantidade eficaz para aumentar a altura da planta. A altura da planta pode ser aumentada de forma detectável em pelo menos 1%, pelo menos 2%, pelo menos 3%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 100% ou mais, quando comparados com uma planta agrícola de referência.

[0052] Em algumas modalidades da planta agrícola, ou porção de tecido da mesma, a população está disposta em uma quantidade eficaz para aumentar a produção de auxina na planta. A produção de au- xina da planta pode ser aumentada em pelo menos 1%, pelo menos 2%, pelo menos 3%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, em pelo menos, 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 100% ou mais, quando comparado com a produção de auxina de uma planta agrícola de referência.

[0053] Em algumas modalidades da planta agrícola, ou porção de tecido da mesma, a população está disposta em uma quantidade eficaz para aumentar a produção de acetoína na planta. A produção de acetoína da planta pode ser aumentada em pelo menos 1%, pelo menos 2%, pelo menos 3%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo me- nos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, em pelo menos, 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 100% ou mais, quando comparado com a produção de auxina de uma planta agrícola de referência.

[0054] Em algumas modalidades da planta agrícola, ou porção de tecido da mesma, a população está disposta em uma quantidade eficaz para aumentar a produção de sideróforo na planta. A produção de sideróforo da planta pode ser aumentada em pelo menos 1%, pelo menos 2%, pelo menos 3%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, em pelo menos, 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 100% ou mais, quando comparado com a produção de auxina de uma planta agrícola de referência.

[0055] Em algumas modalidades da planta agrícola, ou porção de tecido da mesma, a população está disposta em uma quantidade eficaz para aumentar a resistência a uma ou mais condições de tensão selecionadas do grupo que consiste em um tensão por seca, tensão por calor, tensão por frio, tensão por sal e tensão por baixo mineral.

[0056] Em algumas modalidades da planta agrícola, ou porção de tecido da mesma, a população está disposta em uma quantidade eficaz para ser eficaz para aumentar a resistência a uma ou mais condições de tensão biótica selecionadas do grupo que consiste em um tensão de nemátodos, tensão de herbivoria de insetos, tensão de pa- tógeno fúngico, tensão de patógeno bacteriano e tensão patogênico viral.

[0057] A invenção também apresenta uma bolsa compreendendo pelo menos 1.000 sementes, em que cada semente compreende uma formulação que compreende um endófito que é comum a pelo menos dois tipos de plantas doadoras que está disposta sobre uma superfície externada planta ou porção de tecido da mesma, ou dentro da planta ou uma porção de tecido da mesma, em uma quantidade eficaz para colonizar a planta e em uma quantidade eficaz para proporcionar um benefício para a planta agrícola moderna, em que cada semente é contatada com pelo menos 10 CFU ou esporos, pelo menos 100 CFU ou esporos, pelo menos 300 CFU ou esporos, pelo menos 1.000 CFU ou esporos, pelo menos 3.000 CFU ou esporos, pelo menos 10.000 CFU ou esporos, pelo menos 30.000 CFU ou esporos, pelo menos 100.000 CFU ou esporos, pelo menos 300.000 CFU ou esporos, em pelo menos 1.000.000 CFU ou esporos, ou mais, do endófito, e em que o saco compreende ainda um rótulo descrevendo as sementes e/ou a população.

[0058] Em uma modalidade, a invenção apresenta uma formulação agrícola compreendendo um endófito que compreende uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 97% idêntica, pelo menos 98% idêntica, pelo menos 99% idêntica, pelo menos 99,5% idêntica ou 100% idêntica a uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs:1-455 que está presente em uma quantidade eficaz para colonizar uma planta agrícola madura, em que a formulação compreende ainda pelo menos um membro selecionado do grupo que consiste em um veículo compatível com a agricultura, um agente de pegajosidade, um estabilizador microbiano, um fungicida, um agente antibacteriano, um herbicida, um nematicida, um inseticida, um regulador do crescimento da planta, um rodenticida e um nutriente.

[0059] Em algumas modalidades da formulação agrícola, a planta agrícola é uma monocotiledônea. A monocotiledônea pode ser milho, cevada, arroz ou trigo. Em algumas modalidades da formulação agrícola, a planta agrícola é uma dicotiledônea. A dicotiledônea pode ser soja, canola, algodão, Brassica Napus, tomate, abóbora, pepino, pimenta, amendoim, girassol ou beterraba açucareira.

[0060] Em algumas modalidades da formulação agrícola, a popu- lação consiste essencialmente em um endófito que compreende uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 99% idêntica a uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs:1-455. Em algumas modalidades da formulação agrícola, a população consiste essencialmente em um endófito que compreende uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 99,5% idêntica a uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs:1-455.

[0061] Preparação, de acordo com a reivindicação 87, compreendendo pelo menos dois endófitos diferentes que compreendem uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 97% idêntica, pelo menos 98% idêntica, pelo menos 99% idêntica, pelo menos 99,5% idêntica ou 100% idêntica a uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs:1-455.

[0062] Em algumas modalidades da formulação agrícola, cada um dos dois endófitos diferentes compreende a sequência de ácido nu- cleico descrita na Tabela 1, Tabela 2, Tabela 7 e Tabela 8.

[0063] Em algumas modalidades da formulação agrícola, pelo menos 1%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% ou mais, da população está em forma de esporos.

[0064] Em algumas modalidades da formulação agrícola, os endó- fitos foram adaptados à cultura em meio de crescimento.

[0065] Em algumas modalidades da formulação agrícola, a preparação é substancialmente estável a temperaturas entre cerca de 0°C e cerca de 50°C durante pelo menos três dias. Em algumas modalidades da formulação agrícola, a preparação é substancialmente estável a temperaturas entre cerca de 4°C e cerca de 37°C durante pelo menos trinta dias.

[0066] Em algumas modalidades, a formulação agrícola é formulada para proporcionar uma população de plantas que demonstra uma taxa de crescimento substancialmente homogênea quando introduzida na produção agrícola.

[0067] A invenção também apresenta um método para fazer a planta compreendendo uma formulação compreendendo um endófito que é comum a pelo menos dois tipos de plantas doadoras que está disposto sobre uma superfície externa da planta ou porção de tecido da mesma, ou dentro da planta ou porção de tecido da mesma em uma quantidade eficaz para colonizar a planta, e em uma quantidade eficaz para fornecer um benefício para a planta agrícola moderna. O método inclui proporcionar uma planta agrícola moderna e aplicar à planta uma formulação compreendendo um endófito que compreende um micróbio endofítico que compreende uma sequência de ácido nu- cleico que é pelo menos 97% idêntica, pelo menos 98% idêntica, pelo menos 99% idêntica, pelo menos 99,5% idêntica ou 100% idêntica a uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs:1-455 que está presente em uma quantidade eficaz para colonizar a planta.

[0068] A invenção também apresenta um produto vegetal de base compreendendo uma planta, ou uma porção ou parte da mesma, com-preendendo uma formulação compreendendo um endófito que é comum a pelo menos dois tipos de plantas doadoras que está disposto sobre uma superfície externa da planta ou porção de tecido da mesma, ou dentro da planta ou porção de tecido da mesma em uma quantidade eficaz para colonizar a planta, e em uma quantidade eficaz para fornecer um benefício para a planta agrícola moderna. O produto vegetal de base pode ser um grão, uma farinha, um amido, um xarope, uma farinha, um óleo, um filme, uma embalagem, um produto nutra- cêutico, uma polpa, uma alimentação animal, uma forragem de peixe, um material a granel para produtos químicos industriais, um produto de cereais, um produto humano processado, um açúcar ou um álcool e uma proteína.

[0069] A invenção também apresenta um método de produção de um produto vegetal de base. O método inclui obter uma planta ou tecido vegetal a partir de uma planta, progênie ou derivado da mesma, a planta compreendendo uma formulação compreendendo um endófito que é comum a pelo menos dois tipos de plantas doadoras que está disposto sobre uma superfície externa da planta ou porção de tecido da mesma, ou dentro da planta ou porção de tecido da mesma, em uma quantidade eficaz para colonizar a planta, e em uma quantidade eficaz para fornecer um benefício para a planta agrícola moderna; e produzir o produto vegetal de base dessa planta.

[0070] A invenção também apresenta uma combinação sintética compreendendo uma população microbiana purificada em associação com uma pluralidade de sementes ou mudas de uma planta agrícola, em que a população microbiana purificada compreende um primeiro endófito, em que o primeiro endófito compreende uma sequência de ácido nucleico 16S rRNA ou ITS rRNA pelo menos 97% idêntica a uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs:1-455, e em que o endófito está presente na combinação sintética em uma quantidade eficaz para proporcionar um benefício para as sementes ou mudas ou as plantas derivadas das sementes ou mudas.

[0071] Em algumas modalidades da combinação sintética compreendendo uma população microbiana purificada, o primeiro endófito é capaz de pelo menos um dos seguintes:produção de uma auxina, fixação de nitrogênio, produção de um antimicrobiano, produção de um sideróforo, solubilização de fosfato mineral, produção de uma celulase, produção de uma quitinase, produção de uma xilanase e produção de acetoína, ou uma combinação de duas ou mais das mesmas.

[0072] Em algumas modalidades da combinação sintética que compreende uma população microbiana purificada, a população microbiana compreende ainda um segundo endófito. Em uma outra modalidade, a população microbiana compreende um segundo endófito microbiano com uma sequência de ácido nucleico 16S rRNA ou ITS rRNA que é menos que 95% idêntica a do primeiro endófito microbiano.

[0073] Em algumas modalidades da combinação sintética compreendendo uma população microbiana purificada, a população microbiana compreende ainda um segundo endófito, e em que o primeiro e o segundo endófitos são independentemente capazes de pelo menos um de produção de uma auxina, fixação de nitrogênio, produção de um antimicrobiano, produção de um sideróforo, solubilização de fosfato mineral, produção de uma celulase, produção de uma quitinase, produção de uma xilanase ou produção de acetoína, ou uma combinação de duas ou mais das mesmas.

[0074] Em algumas modalidades da combinação sintética compreendendo uma população microbiana purificada, o primeiro e o segundo endófitos são independentemente capazes de pelo menos uma produção de uma auxina, fixação de nitrogênio, produção de um antimicro- biano, produção de um sideróforo, solubilização de fosfato mineral, produção de uma celulase, produção de uma quitinase, produção de uma xilanase, ou produção de acetoína, ou uma combinação de duas ou mais das mesmas.

[0075] Em algumas modalidades da combinação sintética compreendendo uma população microbiana purificada, a população microbiana compreende ainda um segundo endófito, em que o primeiro e o segundo endófitos são independentemente capazes de metabolizar pelo menos um substrato selecionado do grupo que consiste em: a-D- glicose, arabinose, arbutina, b-metil-D-galactosídeo, b-metil-D- glicosídeo, D-alanina, D-arabitol, ácido D-aspártico, D-celobiose, dextrina, D-frutose, D-galactose , Ácido D-glucônico, D-glucosamina, di- hidroxiacetona, ácido DL-málico, D-manitol, D-manose, D-melezitose, D-melibiose, D-rafinose, D-ribose, D-serina, D-treonina, D-trealose, D- xilose, ácido g-amino-N-butírico, g-ciclodextrina, gelatina, gentiobiose, glicogênio, ácido glicil-L-aspártico, ácido glicil-L-glutâmico, glicil-L- prolina, ácido glioxílico, i-eritritol, inosina, L-alanina, L-alanil-glicina, L- arabinose, L-asparagina, ácido L-aspártico, ácido-g-lactona L- galactônica, ácido L-glutâmico, L-glutamina, L-histidina, L-prolina, L- ramnose, L-serina, L-treonina, maltitol, maltose, maltotriose, manose, N-acetil-D-glucosamina, ácido oxálico, palatinose, pectina, prolina, sa- licina, estaquiose, sacarose, trealose, turanose, tiramina, uridina e xi- lose, ou uma combinação de duas ou mais das mesmas.

[0076] A invenção também apresenta uma combinação sintética compreendendo pelo menos dois endófitos associados a uma semente, em que pelo menos o primeiro endófito é heterólogo para a semente e em que o primeiro endófito compreende uma sequência de ácido nucleico 16S rRNA ou ITS rRNA pelo menos 97% idêntica a uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs:1-455, em que os endófitos estão presentes na formulação em uma quantidade eficaz para proporcionar um benefício para as sementes ou mudas ou as plantas derivadas das sementes ou mudas.

[0077] Em algumas modalidades da combinação sintética que compreende pelo menos dois endófitos, o segundo endófito é um en- dófito bacteriano. Em algumas modalidades da combinação sintética que compreende pelo menos dois endófitos, o segundo endófito é um endófito fúngico.

[0078] Em algumas modalidades da combinação sintética que compreende pelo menos dois endófitos, o primeiro endófito é um en- dófito fúngico. Em algumas modalidades da combinação sintética que compreende pelo menos dois endófitos, o primeiro endófito é um en- dófito fúngico e o segundo endófito é um endófito fúngico. Em algumas modalidades da combinação sintética compreendendo pelo menos dois endófitos, o primeiro endófito é um endófito fúngico e o segundo endófito é um endófito bacteriano.

[0079] Em algumas modalidades da combinação sintética compreendendo pelo menos dois endófitos, o primeiro e o segundo endófitos são independentemente capazes de metabolizar pelo menos um substrato selecionado do grupo que consiste em: a-D-glicose, arabinose, arbutina, b-metil-D-galactosídeo, b-metil-D-glicosídeo, D-alanina, D- arabitol, ácido D-aspártico, D-celobiose, dextrina, D-frutose, D- galactose , Ácido D-glucônico, D-glucosamina, di-hidroxiacetona, ácido DL-málico, D-manitol, D-manose, D-melezitose, D-melibiose, D- rafinose, D-ribose, D-serina, D-treonina, D-trealose, D-xilose, ácido g- amino-N-butírico, g-ciclodextrina, gelatina, gentiobiose, glicogênio, ácido glicil-L-aspártico, ácido glicil-L-glutâmico, glicil-L-prolina, ácido glio- xílico, i-eritritol, inosina, L-alanina, L-alanil-glicina, L-arabinose, L- asparagina, ácido L-aspártico, ácido-g-lactona L-galactônica, ácido L- glutâmico, L-glutamina, L-histidina, L-prolina, L-ramnose, L-serina, L- treonina, maltitol, maltose, maltotriose, manose, N-acetil-D- glucosamina, ácido oxálico, palatinose, pectina, prolina, salicina, esta- quiose, sacarose, trealose, turanose, tiramina, uridina e xilose, ou uma combinação de duas ou mais das mesmas.

[0080] Em algumas modalidades de qualquer das combinações sintéticas, o primeiro endófito é capaz de metabolizar pelo menos um substrato selecionado do grupo de:a-D-glicose, arabinose, arbutina, b- metil-D-galactosídeo, b-metil-D-glicosídeo, D-alanina, D-arabitol, ácido D-aspártico, D-celobiose, dextrina, D-frutose, D-galactose , ácido D- glucônico, D-glucosamina, di-hidroxiacetona, ácido DL-málico, D- manitol, D-manose, D-melezitose, D-melibiose, D-rafinose, D-ribose, D-serina, D-treonina, D-trealose, D-xilose, ácido g-amino-N-butírico, g- ciclodextrina, gelatina, gentiobiose, glicogênio, ácido glicil-L-aspártico, ácido glicil-L-glutâmico, glicil-L-prolina, ácido glioxílico, i-eritritol, inosina, L-alanina, L-alanil-glicina, L-arabinose, L-asparagina, ácido L- aspártico, ácido-g-lactona-L-galactônico, ácido L-glutâmico, L- glutamina, L-histidina, L-prolina, L-ramnose, L-serina, L-treonina, malti- tol, maltose, maltotriose, manose, N-acetil-D-glucosamina, ácido oxáli- co, palatinose, pectina, prolina, salicina, estaquiose, sacarose, trealo- se, turanose, tiramina, uridina e xilose. Em algumas modalidades da combinação sintética que compreende pelo menos dois endófitos associados a uma semente, ambos os endófitos são heterólogos para a semente.

[0081] Em algumas modalidades de qualquer das combinações sintéticas, a combinação sintética está disposta dentro de um material de embalagem selecionado de uma bolsa, caixa, compartimento, envelope, caixa de papelão ou recipiente. Em uma modalidade de qualquer uma das combinações sintéticas, a combinação sintética compreende uma quantidade de sementes de 1000 sementes, em que o material de embalagem compreende opcionalmente um dessecante, e em que a combinação sintética compreende opcionalmente um agente antifúngico.

[0082] Em algumas modalidades de qualquer das combinações sintéticas, o primeiro endófito é localizado na superfície das sementes ou mudas. Em algumas modalidades de qualquer das combinações sintéticas, o primeiro endófito é obtido de uma espécie de planta diferente das sementes ou mudas da combinação sintética. Em algumas modalidades de qualquer das combinações sintéticas, o primeiro endó- fito é obtido a partir de uma cultivar vegetal diferente da cultivar das sementes ou mudas da combinação sintética. Em algumas modalidades de qualquer das combinações sintéticas, o primeiro endófito é ob- tido a partir de uma cultivar vegetal que é a mesma que a cultivar das sementes ou mudas da combinação sintética.

[0083] Em algumas modalidades de qualquer das combinações sintéticas, o primeiro endófito é um endófito bacteriano.

[0084] Em algumas modalidades de qualquer das combinações sintéticas, o primeiro endófito é capaz de pelo menos dois da produção de auxina, fixação de nitrogênio, produção de um composto antimicro- biano, solubilização de fosfato mineral, produção de sideróforo, produção de celulase, produção de quitinase, produção de xilanase e produção de acetoína.

[0085] Em algumas modalidades de qualquer das combinações sintéticas, o primeiro endófito é capaz de metabolizar pelo menos dois substratos selecionados do grupo que consiste em: a-D-glicose, arabinose, arbutina, b-metil-D-galactosídeo, b-metil-D-glicosídeo, D-alanina, D-arabitol, ácido D-aspártico, D-celobiose, dextrina, D-frutose, D- galactose , ácido D-glucônico, D-glucosamina, di-hidroxiacetona, ácido DL-málico, D-manitol, D-manose, D-melezitose, D-melibiose, D- rafinose, D-ribose, D-serina, D-treonina, D-trealose, D-xilose, ácido g- amino-N-butírico, g-ciclodextrina, gelatina, gentiobiose, glicogênio, ácido glicil-L-aspártico, ácido glicil-L-glutâmico, glicil-L-prolina, ácido glio- xílico, i-eritritol, inosina, L-alanina, L-alanil-glicina, L-arabinose, L- asparagina, ácido L-aspártico, ácido-g-lactona-L-galactônico, ácido L- glutâmico, L-glutamina, L-histidina, L-prolina, L-ramnose, L-serina, L- treonina, maltitol, maltose, maltotriose, manose, N-acetil-D- glucosamina, ácido oxálico, palatinose, pectina, prolina, salicina, esta- quiose, sacarose, trealose, turanose, tiramina, uridina e xilose.

[0086] Em algumas modalidades de qualquer das combinações sintéticas, o benefício é selecionado do grupo que consiste em: aumento da biomassa da raiz, aumento do comprimento da raiz, aumento da altura, aumento do comprimento do raio, aumento do número de folhas, aumento da eficiência do uso da água, aumento da tolerância à baixa tensão de nitrogênio, aumento da eficiência do uso de nitrogênio, aumento da biomassa geral, aumento do rendimento de grãos, aumento da taxa de fotossíntese, aumento da tolerância à seca, aumento da tolerância ao calor, aumento da tolerância ao sal, aumento da resistência a tensão de nematódeos, aumento da resistência a um patógeno fúngico, aumento da resistência a um patógeno bacteriano, aumento da resistência a um agente patógeno viral, modulação detec- tável no nível de um metabolito, uma modulação detectável no trans- criptoma, e uma modulação detectável no proteoma, em relação às sementes de referência ou plantas agrícolas derivadas de sementes de referência. Em algumas modalidades, o benefício compreende pelo menos dois benefícios selecionados do grupo que consiste em: aumento da biomassa da raiz, aumento do comprimento da raiz, aumento da altura, aumento do comprimento do raio, aumento do número de folhas, aumento da eficiência do uso da água, aumento da tolerância à baixa tensão de nitrogênio, aumento da eficiência do uso de nitrogênio, aumento da biomassa geral, aumento do rendimento de grãos, aumento da taxa de fotossíntese, aumento da tolerância à seca, aumento da tolerância ao calor, aumento da tolerância ao sal, aumento da resistência a tensão de nematódeos, aumento da resistência a um patógeno fúngico, aumento da resistência a um patógeno bacteriano, aumento da resistência a um agente patógeno viral, modulação detec- tável no nível de um metabolito, uma modulação detectável no trans- criptoma, e uma modulação detectável no proteoma, em relação às sementes de referência ou plantas agrícolas derivadas de sementes de referência.

[0087] Em algumas modalidades de qualquer das combinações sintéticas, a combinação compreende sementes e o primeiro endófito está associado às sementes como um revestimento na superfície das sementes. Em algumas modalidades de qualquer das combinações sintéticas, a combinação compreende mudas e o primeiro endófito é posto em contato com as mudas como um spray aplicado a uma ou mais folhas e/ou uma ou mais raízes das mudas. Em algumas modalidades de qualquer das combinações sintéticas, a combinação sintética compreende ainda uma ou mais espécies de endófitos adicionais.

[0088] Em algumas modalidades de qualquer das combinações sintéticas, a quantidade eficaz é pelo menos 1x102 CFU ou espo- ros/por semente. Em algumas modalidades de qualquer das combinações sintéticas, a quantidade eficaz é pelo menos 1x103 CFU ou espo- ros/por semente. Em algumas modalidades de qualquer das combinações sintéticas, a combinação compreende sementes e a quantidade eficaz é de aproximadamente 1x102 CFU ou esporos/por semente até cerca de 1x108 CFU ou esporos/por semente.

[0089] Em algumas modalidades de qualquer das combinações sintéticas, a semente é uma semente de uma planta agrícola. Em algumas modalidades de qualquer das combinações sintéticas, a semente é uma semente transgênica.

[0090] Em algumas modalidades de qualquer das combinações sintética, os primeiros endófitos estão presentes em uma quantidade de pelo menos 10 CFU ou esporos, pelo menos 100 CFU ou esporos, pelo menos 300 CFU ou esporos, pelo menos 1.000 CFU ou esporos, pelo menos 3.000 CFU ou esporos, pelo menos 10.000 CFU ou esporos, pelo menos 30.000 CFU ou esporos, pelo menos 100.000 CFU ou esporos, pelo menos 300.000 CFU ou esporos, ou pelo menos 1.000.000 de esporos CFU por semente.

[0091] Em algumas modalidades, qualquer das combinações sintéticas compreende ainda um ou mais dos seguintes: um estabilizador, ou um conservante, ou um veículo, ou um tensoativo, um agente anti- complexo ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modali- dades, qualquer das combinações sintéticas compreende ainda um ou mais dos seguintes: fungicida, nematicida, bactericida, inseticida e herbicida.

[0092] A invenção também apresenta uma pluralidade de qualquer uma das combinações sintéticas colocadas em um meio que promove o crescimento da planta, o meio selecionado do grupo que consiste em: solo, aparelho hidropônico e meio de crescimento artificial. A invenção também apresenta uma pluralidade de qualquer das combinações sintéticas, em que as combinações sintéticas têm validade prolongada.

[0093] A invenção também apresenta uma planta cultivada a partir de qualquer das combinações sintéticas aqui divulgadas, a planta apresentando um fenótipo melhorado de interesse agronômico, selecionado do grupo que consiste em: aumento da biomassa da raiz, aumento do comprimento da raiz, aumento da altura, aumento do comprimento do raio, aumento do número de folhas, aumento da eficiência do uso da água, aumento da tolerância à baixa tensão de nitrogênio, aumento da eficiência do uso de nitrogênio, aumento da biomassa geral, aumento do rendimento de grãos, aumento da taxa de fotossínte- se, aumento da tolerância à seca, aumento da tolerância ao calor, aumento da tolerância ao sal, aumento da resistência a tensão de nema- tódeos, aumento da resistência a um patógeno fúngico, aumento da resistência a um patógeno bacteriano, aumento da resistência a um patógeno viral, modulação detectável no nível de um metabolito, uma modulação detectável no transcriptoma e uma modulação detectável no proteoma.

[0094] Em algumas modalidades, a invenção apresenta um método para preparar uma composição de semente agrícola compreendendo contatar a superfície de uma pluralidade de sementes com uma formulação compreendendo uma população microbiana purificada que compreende pelo menos dois endófitos que são heterólogos para a semente, em que o primeiro endófito é capaz de metabolizar pelo menos um de a-D-glicose, arabinose, arbutina, b-metil-D-galactosídeo, b- metil-D-glicosídeo, D-alanina, D-arabitol, ácido D-aspártico, D- celobiose, dextrina, D-frutose, D- Galactose, ácido D-glucônico, D- glucosamina, di-hidroxiacetona, ácido DL-málico, D-manitol, D- manose, D-melezitose, D-melibiose, D-rafinose, D-ribose, D-serina, D- treonina, D-trealose, D-xilose, ácido g-amino-N-butírico, g- ciclodextrina, gelatina, gentiobiose, glicogênio, ácido glicil-L-aspártico, ácido glicil-L-glutâmico, glicil-L-prolina, ácido glioxílico, I-eritritol, inosina, L-alanina, L-alanil-glicina, L-arabinose, L-asparagina, ácido L- aspártico, ácido-g-lactona L-galactônica, ácido L-glutâmico, L- glutamina, L-histidina , L-prolina, L-ramnose, L-serina, L-treonina, mal- titol, maltose, maltotriose, manose, N-acetil-D-glucosamina, ácido oxá- lico, palatinose, pectina, prolina, salicina, estaquiose, sacarose, trealo- se, turanose, tiramina, uridina e xilose, em que os endófitos estão presentes na formulação em uma quantidade capaz de modular uma característica de importância agronômica, em comparação com plantas de isolina cultivadas a partir de sementes não contatadas com a referida formulação.

[0095] Em algumas modalidades, a invenção apresenta um método para preparar uma composição de semente agrícola, compreendendo contatar a superfície de uma pluralidade de sementes com uma formulação compreendendo uma população microbiana purificada que compreende pelo menos dois endófitos que são heterólogos com a semente, em que o primeiro endófito é capaz de pelo menos uma função ou atividade selecionada do grupo que consiste em produção de auxina, fixação de nitrogênio, produção de um composto antimicrobia- no, solubilização de fosfato mineral, produção de sideróforo, produção de celulase, produção de quitinase, produção de xilanase e produção de acetoína, em que os endófitos estão presentes na formulação em uma quantidade capaz de modular uma característica de importância agronômica, em comparação com plantas isolinas cultivadas a partir de sementes não contatadas com a referida formulação.

[0096] Em algumas modalidades, a invenção apresenta um método para melhorar um fenótipo durante condições limitadas de água de uma pluralidade de plantas hospedeiras cultivadas a partir de uma pluralidade de sementes, caracterizado pelo fato de que compreende o tratamento das sementes com uma formulação compreendendo pelo menos dois endófitos que são heterólogos às sementes, em que o primeiro endófito é capaz de metabolizar pelo menos um de a-D- glicose, arabinose, arbutina, b-metil-D-galactosídeo, b-metil-D- glicosídeo, D-alanina, D-arabitol, ácido D-aspártico, D-celobiose, dextrina, D-frutose , D-galactose, ácido D-glucônico, D-glucosamina, di- hidroxiacetona, ácido DL-málico, D-manitol, D-manose, D-melezitose, D-melibiose, D-rafinose, D-ribose, D-serina, D-treonina, D-trealose, D- xilose, ácido g-amino-N-butírico, g-ciclodextrina, gelatina, gentiobiose, glicogênio, ácido glicil-L-aspártico, ácido glicil-L-glutâmico, glicil-L- prolina, ácido glioxílico, i-eritritol, inosina, L-alanina, L-alanil-glicina, L- arabinose, L-asparagina, ácido L-aspártico, ácido g-lactona L- galactônico, ácido L-glutâmico, L-glutamina, L-histidina, L-prolina, L- ramnose, L-serina, L-treonina, maltitol, maltose, maltotriose, manose, N-acetil-D-glucosamina, ácido oxálico, palatinose, pectina, prolina, sa- licina, estaquiose, sacarose, trealose, turanose, tiramina, uridina e xi- lose, a referida melhoria do fenótipo selecionada do grupo que consiste em: aumento da biomassa da raiz, aumento do comprimento da raiz, aumento da altura, aumento do comprimento do raio, aumento do número de folhas, aumento da eficiência do uso da água, aumento da tolerância à baixa tensão de nitrogênio, aumento da eficiência do uso de nitrogênio, aumento da biomassa geral, aumento do rendimento de grãos, aumento da taxa de fotossíntese, aumento da tolerância à seca, aumento da tolerância ao calor, aumento da tolerância ao sal, aumento da resistência a tensão de nematódeos, aumento da resistência a um patógeno fúngico, aumento da resistência a um patógeno bacteriano, aumento da resistência a um patógeno viral, modulação detectável no nível de um metabolito, uma modulação detectável no transcriptoma e uma modulação detectável no proteoma.

[0097] Em algumas modalidades dos métodos, o primeiro endófito é um endófito bacteriano. Em algumas modalidades dos métodos, o primeiro endófito é um endófito bacteriano e o segundo endófito é um endófito bacteriano. Em algumas modalidades dos métodos, o primeiro endófito é um endófito bacteriano e o segundo endófito é um endófito fúngico. Em algumas modalidades dos métodos, o primeiro endófito é um endófito fúngico. Em algumas modalidades dos métodos, o primeiro endófito é um endófito fúngico e o segundo endófito é um endófito fúngico. Em algumas modalidades dos métodos, o primeiro endófito é um endófito fúngico e o segundo endófito é um endófito bacteriano.

[0098] Em algumas modalidades dos métodos, o primeiro endófito é capaz de metabolizar pelo menos duas de a-D-glicose, arabinose, ar- butina, b-metil-D-galactosídeo, b-metil-D-glicosídeo, D-alanina, D- arabitol, ácido D-aspártico, D-celobiose, dextrina, D-frutose, D-galactose , Ácido D-glucônico, D-glucosamina, di-hidroxiacetona, ácido DL-málico, D-manitol, D-manose, D-melezitose, D-melibiose, D-rafinose, D-ribose, D-serina, D-treonina, D-trealose, D-xilose, ácido g-amino-N-butírico, g- ciclodextrina, gelatina, gentiobiose, glicogênio, ácido glicil-L-aspártico, ácido glicil-L-glutâmico, glicil-L-prolina, ácido glioxílico, i-eritritol, inosina, L-alanina, L-alanil-glicina, L-arabinose, L-asparagina, ácido L-aspártico, ácido-g-lactona L-galactônica, ácido L-glutâmico, L-glutamina, L- histidina, L-prolina, L-ramnose, L-serina, L-treonina, maltitol, maltose, maltotriose, manose, N-acetil-D-glucosamina, ácido oxálico, palatinose, pectina, prolina, salicina, estaquiose, sacarose, trealose, turanose, tira- mina, uridina e xilose.

[0099] Em algumas modalidades dos métodos, o segundo endófito é capaz de metabolizar pelo menos duas de a-D-glicose, arabinose, arbutina, b-metil-D-galactosídeo, b-metil-D-glicosídeo, D-alanina, D- arabitol, ácido D-aspártico, D-celobiose, dextrina, D-frutose, D- galactose , Ácido D-glucônico, D-glucosamina, di-hidroxiacetona, ácido DL-málico, D-manitol, D-manose, D-melezitose, D-melibiose, D- rafinose, D-ribose, D-serina, D-treonina, D-trealose, D-xilose, ácido g- amino-N-butírico, g-ciclodextrina, gelatina, gentiobiose, glicogênio, ácido glicil-L-aspártico, ácido glicil-L-glutâmico, glicil-L-prolina, ácido glio- xílico, i-eritritol, inosina, L-alanina, L-alanil-glicina, L-arabinose, L- asparagina, ácido L-aspártico, ácido-g-lactona L-galactônica, ácido L- glutâmico, L-glutamina, L-histidina, L-prolina, L-ramnose, L-serina, L- treonina, maltitol, maltose, maltotriose, manose, N-acetil-D- glucosamina, ácido oxálico, palatinose, pectina, prolina, salicina, esta- quiose, sacarose, trealose, turanose, tiramina, uridina e xilose.

[0100] Em algumas modalidades dos métodos, a formulação compreende a população microbiana purificada a uma concentração de pelo menos cerca de 1 x 102 CFU/ml ou esporos/ml em uma formulação líquida ou cerca de 1 x 102 CFU/gm ou esporos/ml em uma formulação não líquida.

[0101] Em algumas modalidades dos métodos para preparar uma composição de semente agrícola, a característica de importância agronômica é selecionada do grupo que consiste em: aumento da biomassa da raiz, aumento do comprimento da raiz, aumento da altura, aumento do comprimento do raio, aumento do número de folhas, aumento da eficiência do uso da água, aumento da tolerância à baixa tensão de nitrogênio, aumento da eficiência do uso de nitrogênio, aumento da biomassa geral, aumento do rendimento de grãos, aumento da taxa de fotossíntese, aumento da tolerância à seca, aumento da tolerância ao calor, aumento da tolerância ao sal, aumento da resistência a tensão de nematódeos, aumento da resistência a um patóge- no fúngico, aumento da resistência a um patógeno bacteriano, aumento da resistência a um patógeno viral, modulação detectável no nível de um metabolito, uma modulação detectável no transcriptoma e uma modulação detectável no proteoma.

[0102] Em algumas modalidades dos métodos, pelo menos um dos endófitos é capaz de se localizar em um elemento de planta de uma planta cultivada a partir da semente, o elemento de planta selecionado do grupo que consiste em: planta inteira, mudas, tecido meris- temático, tecido moído, tecido vascular, tecido dérmico, semente, folha, raiz, rebento, caule, flor, fruta, estólon, bulbo, tubérculo, grão, kei- kis e broto.

[0103] Em algumas modalidades dos métodos, pelo menos um dos endófitos é capaz de colonizar um elemento de planta de uma planta cultivada a partir da semente, o elemento de planta selecionado do grupo que consiste em: planta inteira, mudas, tecido meristemático, tecido moído, tecido vascular, tecido dérmico, semente, folha, raiz, rebento, caule, flor, fruta, estólon, bulbo, tubérculo, grão, keikis e broto.

[0104] Em algumas modalidades dos métodos, a formulação compreende ainda um ou mais dos seguintes: um estabilizador, ou um conservante, ou um veículo, ou um tensoativo, um agente anticomple- xo ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades dos métodos, a formulação compreende ainda um ou mais dos seguintes: fungicida, nematicida, bactericida, inseticida e herbicida.

[0105] Em algumas modalidades dos métodos, a semente é uma semente transgênica.

[0106] A invenção também apresenta uma planta derivada de um dos métodos para a preparação de uma composição de semente agrí- cola, em que a planta compreende em pelo menos um dos seus elementos de planta os endófitos. Em algumas modalidades, a invenção também apresenta progênie da planta derivada de um dos métodos para a preparação de uma composição de semente agrícola em que a progênie compreende em pelo menos um dos seus elementos de planta os endófitos.

[0107] Em algumas modalidades de qualquer dos métodos, o en- dófito expressa um ou mais genes que codificam uma proteína cuja sequência de aminoácidos é pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs:479, 483, 519, 532, 549, 557, 561, 562, 577, 578, 611, 626, 640, 656, 660, 666, 674, 676, 685, 686, 688, 689, 690, 691, 692, 710, 711, 716, 717, 718, 719, 720, 730, 731, 732, 733, 734, 735, 737, 748, 749, 751, 753, 756, 757, 759, 768, 769, 771, 772, 773, 774, 775, 784, 785, 786, 788, 790, 793, 795, 804, 805, 806, 807, 808, 809, 810, 819, 820, 822, 823, 824, 825, 826, 839, 840, 841, 842, 843, 844, 846, 857, 858, 859, 860, 864, 865, 866, 875, 876, 877, 878, 879, 880, 881, 891, 892, 893, 894, 895, 897, 898, 907, 908, 910, 911, 912, 913, 914, 923, 924, 926, 927, 928, 930, 931, 939, 940, 941, 942, 943, 944, 945, 954, 955, 956, 957, 958, 959, 960, 974, 976, 978, 979, 980, 984, 985, 677, 678, 679, 680, 682, 683, 684, 693, 696, 697, 698, 701, 704, 706, 721, 722, 723, 724, 727, 728, 729, 738, 741, 743, 744, 745, 746, 747, 761, 762, 763, 764, 765, 766, 767, 776, 777, 778, 779, 780, 782, 783, 796, 797, 798, 800, 801, 802, 803, 811, 812, 813, 815, 816, 817, 818, 829, 830, 833, 835, 836, 837, 838, 848, 850, 851, 853, 854, 855, 856, 868, 869, 870, 871, 872, 873, 874, 882, 884, 886, 887, 888, 889, 890, 899, 901, 902, 903, 904, 905, 906, 915, 916, 917, 918, 920, 921, 922, 932, 933, 934, 935, 936, 937, 938, 946, 947, 948, 949, 950, 952, 953, 961, 962, 963, 964, 968, 969, 971, 987, 988, 989, 992, 993, 994, 995, 996, 998, 1000, 1001, 1002, 1003, 1006, 1008, 1010, 1011, 1012, 1014, 1015, 1016, 1017, 1018, 1019, 1021, 1022, 1023, 1024, 1025, 1028, 1029, 1030, 1031, 1032, 1033, 1034, 1036, 1037, 1038, 1040, 1041, 1042, 1043, 1044, 1045, 1046, 1047, 1048, 1049, 1050, 1051, 1055, 1056, 1058, 1059, 1060, 1062, 1064, 1065, 1066, 1068, 1070, 1071, 1072, 1076, 1077, 1079, 1080, 1081, 1083, 1085, 1086, 1087, 1088, 1090, 1091, 1092, 1094, 1095, 1096, 1097, 1098, 1099, 1101, 1102, 1103, 1104, 1106, 1107, 1108, 1110, 1111, 1112, 1113, 1114, 1115, 1116, 1117, 1118, 1119, 1121, 1122, 1123, 1124, 1126, 1127, 1129, 1130, 1131, 1132, 1133, 1134, 1136, 1137, 1138, 1139, 1140, 1142, 1143, 1144, 1145, 1146, 1147, 1148, 1149, 1151, 1153, 1155, 1156, 1157, 1158, 1159, 1160, 1161, 1162, 1163, 1165, 1166, 1167, 1168, 1169, 1170, 1171, 1172, 1174, 1176, 1178, 1179, 1180, 1181, 1182, 1183, 1184, 1185, 1186, 1188, 1189, 1190, 1191, 1192, 1193, 1194, 1196, 1197, 1198, 1199, 1200, 1201, 1203, 1205, 1206, 1207, 1208, 1209, 1210, 1211, 1213, 1214, 1216, 1217, 1218, 1219, 1221, 1222, 1223, 1225, 1226, 1228, 1229, 1230, 1231, 1232, 1233, 1235, 1237, 1238, 1239, 1241, 1242, 1243, 1244, 1245, 1246, 1247, 1248, 1249, 1250, 1251, 1252, 1253, 1255, 1256, 1257, 1258, 1259, 1260, 1261, 1262, 1263, 1264, 1265, 1266, 1267, 1268, 1269, 1270, 1271, 1272, 1273, 1274, 1275, 1276, 1277, 1279, 1280, 1281, 1282, 1283, 1284, 1285, 1286, 1287, 1288, 1290, 1292, 1293, 1296, 1297, 1298, 1300, 1301, 1303, 1304, 1306, 1307, 1308, 1309, 1311, 1312, 1313, 1314, 1317, 1319, 1320, 1321, 1322, 1323, 1324, 1325, 1326, 1327, 1328, 1330, 1331, 1333, 1334, 1335, 1336, 1337, 1338, 1339, 1340, 1341, 1342, 1343, 1344, 1345, 1346, 1347, 1348, 1350, 1351, 1352, 1353, 1355, 1356, 1357, 1358, 1359, 1360, 1361, 1362, 1363, 1364, 1365, 1366, 1368, 1369, 1370, 1371, 1372, 1374, 1375, 1376, 1379, 1380, 1382, 1383, 1384, 1385, 1386, 1388, 1389, 1390, 1391, 1392, 1393, 1396, 1397, 1398, 1399, 1400, 1402, 1403, 1404, 1405, 1406, 1407, 1408, 1409, 1410, 1411, 1412, 1413, 1414, 1415, 1416, 1417, 1418, 1419, 1420, 1421, 1422, 1424, 1425, 1426, 1427, 1428, 1430, 1431, 1432, 1433, 1437, 1438, 1439, 1440, 1441, 1442, 1443, 1444, 1445, 1446, 1447, 1448, 1449, 1450, 1452, 1453, 1456, 1459, 1466, 1467, 1469, 1471, 1478, 1479, 1482, 1483, 1484, 1485, 1487, 1488, 1489, 1490, 1495, 1497, 1498, 1499, 1500, 1501, 1504, 1505, 1506, 1508, 1511, 1513, 1514, 1516, 1520, 1526, 1529, 1534, 1535, 1537, 1538, 1540, 1545, 1547, 1548, 1549, 1550, 1551, 1552, 1553, 1554, 1556, 1559, 1561, 1562, 1565, 1566, 1568, 1569, 1570, 1571, 1573, 1574, 1575, 1576, 1577, 1578, 1579, 1580, 1581, 1582, 1583, 1585, 1588, 1589, 1591, 1592, 1593, 1594, 1595, 1596, 1597, 1598, 1601, 1603, 1604, 1605, 1607, 1608, 1609, 1611, 1612, 1613, 1614, 1615, 1616, 1617, 1618, 1619, 1620, 1622, 1624, 1625, 1626, 1627, 1628, 1629, 1630, 1632, 1633, 1636, 1637, 1638, 1639, 1640, 1641, 1642, 1643, 1644, 1646, 1647, 1648, 1650, 1651, 1652, 1654, 1657, 1659, 1660, 1661, 1664, 1665, 1666, 1667, 1668, 1671, 1673, 1675, 1676, 1678, 1679, 1681, 1684, 1685, 1686, 1689, 1690, 1692, 1693, 1694, 1695, 1696, 1697, 1698, 1701, 1705, 1706, 1707, 1709, 1711, 1712, 1713, 1714, 1716, 1717, 1718, 1720, 1721, 1723, 1724, 1725, 1726, 1728, 1729, 1731, 1732, 1734, 1735, 1736, 1737, 1738, 1739, 1740, 1741, 1743, 1744, 1745, 1746, 1747, 1750, 1751, 1753, 1754, 1755, 1760, 1761, 1762, 1763, 1764, 1765, 1767, 1770, 1771, 1772, 1775, 1776, 1777, 1778, 1779, 1780, 1781, 1782, 1786, 1787, 1788, 1789, 1791, 1792, 1793, 1794, 1795, 1797, 1798, 1799, 1800, 1801, 1803, 1804, 1805, 1806, 1809, 1810, 1811, 1814, 1815, 1818, 1819, 1820, 1821, 1822, 1823, 1824, 1825, 1826, 1828, 1830, 1831, 1833, 1835, 1836, 1837, 1838, 1839, 1840, 1841, 1842, 1843, 1846, 1851, 1852, 1854, 1857, 1858, 1860, 1861, 1862, 1863, 1864, 1866, 1868, 1869, 1870, 1872, 1873, 1874, 1875, 1876, 1878, 1879, 1880, 1881, 1883, 1884, 1885, 1887, 1888, 1892, 1893, 1894, 1896, 1898, 1899, 1900, 1901, 1902, 1903, 1904, 1905, 1906, 1907, 1910, 1911, 1913, 1915 1916, 1917, 1918, 1920, 1921, 1924, 1925, 1926, 1927, 1928, 1930 1932, 1933, 1934, 1935, 1938, 1939, 1940, 1942, 1943, 1945, 1946 1948, 1949, 1950, 1951, 1953, 1954, 1955, 1959, 1960, 1961, 1962 1963, 1965, 1966, 1967, 1970, 1971, 1973, 1975, 1976, 1977, 1979 1981, 1982, 1983, 1984, 1985, 1986, 1988, 1990, 1994, 1995, 1996 1998, 1999, 2000, 2001, 2002, 2003, 2006, 2007, 2008, 2009, 2010 2011, 2013, 2014, 2015, 2016, 2017, 2018, 2019, 2020, 2021, 2022 2024, 2025, 2026, 2027, 2028, 2029, 2030, 2031, 2032, 2034, 2035 2036, 2037, 2038, 2039, 2040, 2041, 2042, 2043, 2044, 2045, 2046 2047, 2048, 2049, 2050, 2052, 2054, 2055, 2059, 2060, 2062, 2065 2066, 2067, 2068, 2069, 2070, 2071, 2074, 2076, 2077, 2080, 2081 2082, 2083, 2085, 2086, 2087, 2088, 2089, 2090, 2091, 2092, 2093 2095, 2096, 2097, 2098, 2100, 2101, 2102, 2103, 2104, 2105, 2108 2109, 2110, 2112, 2113, 2115, 2116, 2117, 2118, 2119, 2120, 2121 2125, 2127, 2128, 2129, 2131, 2132, 2134, 2135, 2136, 2138, 2140 2141, 2142, 2143, 2145, 2146, 2147, 2148, 2149, 2150, 2153, 2154 2155, 2156, 2158, 2159, 2160, 2162, 2163, 2165, 2166, 2167, 2168 2169, 2170, 2171, 2172, 2174, 2176, 2177, 2179, 2180, 2181, 2182 2183, 2184, 2185, 2186, 2188, 2190, 2191, 2192, 2193, 2194, 2195 2196, 2197, 2198, 2200, 2202, 2204, 2205, 2206, 2207, 2208, 2210 2211, 2212, 2214, 2215, 2216, 2217, 2218, 2219, 2220, 2221, 2222 2223, 2225, 2226, 2227, 2228, 2229, 2230, 2231, 2232, 2233, 2234 2235, 2236, 2238, 2239, 2241, 2242, 2243, 2244, 2245, 2246, 2248 2249, 2251, 2253, 2254, 2255, 2257, 2258, 2259, 2261, 2262, 2265 2267, 2268, 2269, e 2270.

[0108] Em algumas modalidades dos métodos, a expressão da proteína é modulada em resposta ao primeiro endófito que contata com um elemento de planta. Em algumas modalidades, a expressão da proteína é suprarregulada em resposta ao primeiro endófito que contata um elemento de planta. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos da proteína suprarregulada é pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs:549, 640, 656, 676, 684, 690, 937, 1456, 1467, 1479, 1484, 1488, 1490, 1498, 1499, 1500, 1504 1505, 1508, 1513, 1529, 1534, 1538, 1540, 1547, 1551, 1554, 1561 1566, 1568, 1570, 1571, 1574, 1578, 1581, 1583, 1591, 1592, 1593 1597, 1598, 1604, 1605, 1609, 1615, 1616, 1619, 1622, 1624, 1626 1629, 1630, 1632, 1636, 1638, 1642, 1643, 1647, 1650, 1651, 1652 1659, 1661, 1664, 1666, 1671, 1675, 1676, 1678, 1684, 1685, 1689 1692, 1694, 1695, 1696, 1701, 1706, 1709, 1711, 1712, 1718, 1723 1725, 1728, 1729, 1732, 1737, 1738, 1740, 1741, 1744, 1746, 1747 1751, 1755, 1761, 1763, 1771, 1772, 1775, 1778, 1779, 1782, 1787 1788, 1791, 1792, 1797, 1798, 1799, 1800, 1805, 1819, 1824, 1828 1835, 1840, 1842, 1843, 1846, 1854, 1860, 1862, 1868, 1875, 1892 1893, 1900, 1901, 1910, 1918, 1924, 1925, 1926, 1928, 1932, 1933 1934, 1938, 1943, 1946, 1949, 1950, 1953, 1963, 1967, 1971, 1973 1975, 1985, 1990, 1994, 1998, 2000, 2003, 2006, 2010, 2013, 2016 2018, 2021, 2025, 2027, 2028, 2030, 2034, 2035, 2036, 2048, 2050 2052, 2054, 2059, 2062, 2065, 2066, 2067, 2068, 2074, 2080, 2091 2092, 2093, 2095, 2097, 2098, 2100, 2101, 2104, 2108, 2110, 2112 2117, 2119, 2125, 2131, 2134, 2135, 2145, 2149, 2150, 2156, 2159 2162, 2168, 2181, 2185, 2193, 2195, 2196, 2206, 2211, 2216, 2217 2219, 2220, 2221, 2223, 2231, 2236, 2239, 2242, 2243, 2248, 2255 2257, 2258, 2259, ou 2262.

[0109] Em algumas modalidades dos métodos, a expressão da proteína é reprimida em resposta ao primeiro endófito que contata com um elemento de planta. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos da proteína reprimida é pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs:479, 483, 519, 532, 557, 626, 674, 678, 680, 683, 685, 688, 690, 696, 697, 701, 704, 706, 710, 711, 717, 720, 722, 723, 724, 728, 729, 730, 732, 733, 734, 737, 741, 744, 745, 748, 749, 751, 753, 756, 757, 761, 764, 766, 768, 769, 772, 773, 774, 778, 779, 782, 783, 784, 788, 790, 793, 795, 796, 797, 800, 802, 803, 806, 807, 808, 810, 812, 817, 818, 819, 820, 822, 825, 826, 833, 836, 837, 839, 841, 846, 848, 851, 853, 854, 855, 856, 857, 860, 864, 865, 866, 870, 872, 874, 876, 878, 879, 880, 881, 882, 884, 886, 887, 890, 891, 893, 894, 895, 898, 901, 903, 905, 907, 908, 910, 911, 912, 913, 915, 917, 918, 921, 924, 926, 927, 928, 933, 934, 935, 936, 937, 938, 940, 942, 944, 945, 946, 947, 950, 952, 954, 955, 957, 960, 961, 962, 963, 964, 968, 971, 976, 978, 979, 985, 987, 989, 992, 1000, 1001, 1002, 1003, 1019, 1021, 1022, 1024, 1025, 1028, 1040, 1042, 1043, 1046, 1047, 1050, 1068, 1070, 1072, 1077, 1079, 1083, 1098, 1102, 1103, 1104, 1110, 1111, 1118, 1121, 1126, 1130, 1132, 1133, 1147, 1151, 1155, 1156, 1158, 1159, 1170, 1172, 1174, 1176, 1180, 1182, 1194, 1196, 1197, 1198, 1209, 1214, 1223, 1225, 1226, 1230, 1237, 1242, 1260, 1261, 1262, 1264, 1270, 1272, 1284, 1285, 1286, 1288, 1290, 1292, 1311, 1312, 1313, 1320, 1321, 1324, 1336, 1337, 1339, 1340, 1344, 1346, 1359, 1360, 1361, 1363, 1364, 1365, 1383, 1384, 1386, 1390, 1391, 1392, 1405, 1408, 1411, 1412, 1418, 1420, 1422, 1427, 1428, 1431, 1433, 1438, 1439, 1440, 1442, 1444, 1445, 1449, ou 1450.

[0110] Em algumas modalidades dos métodos, a proteína é expressa com pelo menos uma diferença de duas vezes, pelo menos uma diferença de três vezes, pelo menos uma diferença de quatro vezes, pelo menos uma diferença de cinco vezes, pelo menos uma diferença de seis vezes, pelo menos uma diferença de sete vezes, pelo menos uma diferença de oito vezes, pelo menos uma diferença de nove vezes, pelo menos uma diferença de dez vezes ou mais no nível de expressão em comparação com o nível de expressão da proteína de um micro-organismo de referência. Em algumas modalidades, a diferença no nível de expressão da proteína é positiva. Em algumas modalidades, a diferença no nível de expressão da proteína é negativa.

[0111] Em algumas modalidades dos métodos, a proteína está envolvida em pelo menos uma via de KEGG selecionada do grupo que consiste em: endocitose, metabolismo de purina, metabolismo de fosfato de inositol e peroxissoma. Em algumas modalidades dos métodos, a proteína está envolvida em pelo menos uma via de KEGG selecionada do grupo que consiste em: Ko00403 (biossíntese de alcaloides de indol diterpeno), ko00522 (biossíntese de macrolídeos de 12, 14 e 16 membros), ko00550 (biossíntese de peptidoglicano), ko00601 (série de biossíntese glicosfingolipídica - lacto e neolacto), ko0901 (biossín- tese de alcaloides indolais), ko01052 (estruturas de politetídeos de tipo I), ko010503 (biossíntese de peptídeos não reagossômicos do grupo sideróforo), ko01501 (resistência beta-Lactam) e ko04071 (via de sinalização de esfingolipídeos).

[0112] Em algumas modalidades de qualquer dos métodos, a planta, a cultura, a muda ou a planta cultivada a partir da semente expressa um ou mais genes cuja sequência de ácido nucleico é pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, Pelo me- nos 99% ou 100% idêntica a uma sequência de ácido nucleico seleci-onada do grupo que consiste em SEQ ID NOs:4127, 4128, 4129, 4130, 4131, 4132, 4133, 4134, 4135, 4136, 4137, 4138, 4139, 4140, 4141, 4142, 4143, 4144, 4145, 4146, 4147, 4148, 4149, 4150, 4151, 4152, 4153, 4154, 4155, 4156, 4157, 4158, 4159, 4160, 4161, 4162, 4163, 4164, 4165, 4166, 4167, 4168, 4169, 4170, 4171, 4172, 4173, 4174, 4175, 4176, 4177, 4178, 4179, 4180, 4181, 4182, 4183, 4184, 4185, 4186, 4187, 4188, 4189, 4190, 4191, 4192, 4193, 4194, 4195, 4196, 4197, 4198, 4199, 4200, 4201, 4202, 4203, 4204, 4205, 4206, 4207, 4208, 4209, 4210, 4211, 4212, 4213, 4214, 4215, 4216, 4217, 4218, 4219, 4220, 4221, 4222, 4223, 4224, 4225, 4226, 4227, 4228, 4229, 4230, 4231, 4232, 4233, 4234, 4235, 4236, 4237, 4238, 4239, 4240, 4241, 4242, 4243, 4244, 4245, 4246, 4247, 4248, 4249, 4250, 4251, 4252, 4253, 4254, 4255, 4256, 4257, 4258, 4259, 4260, 4261, 4262, 4263, 4264, 4265, 4266, 4267, 4268, ou 4269.

[0113] Em algumas modalidades, os um ou mais genes de plantas são modulados em resposta ao primeiro endófito que contata o elemento de planta ou planta em comparação com um micro-organismo de referência que contata a planta ou elemento de planta. Em algumas modalidades, os um ou mais genes de plantas são suprarregulados em resposta ao primeiro endófito que contata um elemento de planta em comparação com um micro-organismo de referência que contata a planta ou elemento de planta. Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico de genes suprarregulados é pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica a uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs:4131, 4140, 4142, 4153, 4162, 4167, 4181, 4183, 4184, 4195, 4199, 4201, 4206, 4213, 4222, 4223, 4250, 4253, ou 4269.

[0114] Em algumas modalidades, a transcrição de um ou mais ge nes de plantas é reprimida em resposta ao primeiro endófito que contata um elemento de planta em comparação com um micro-organismo de referência que contata a planta ou elemento de planta. Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico de genes reprimidos é pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica a uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 4150.

[0115] Em algumas modalidades, os um ou mais genes são expressos com pelo menos uma diferença de 0,5 vez, pelo menos uma diferença de 0,6 vez, pelo menos uma diferença de 0,7 vez, pelo menos uma diferença de 0,8 vez, pelo menos uma diferença de 0,9 vez, pelo menos uma diferença de 1,0 vez, pelo menos uma diferença de 1,1 vezes, pelo menos uma diferença de 1,2 vezes, pelo menos uma diferença de 1,3 vezes ou mais no nível de expressão em comparação com o nível de expressão do gene de um micro-organismo de referência. Em algumas modalidades, a diferença no nível de expressão é positiva. Em algumas modalidades, a diferença no nível de expressão é negativa.

[0116] Em algumas modalidades, os um ou mais genes tem pelo menos uma função de gene selecionada do grupo que consiste em: modificação da parede celular, resposta à defesa, processo de oxidação-redução, processo biológico, regulação da transcrição, processo metabólico, processo de biossintética do glucosinolato, resposta ao karrikin, fosforilação de proteína, dobramento de proteínas, resposta à quitina, proteólise, resposta ao estímulo de auxina, regulação de transcrição dependente de DNA, miristoilação de proteínas N-terminal, resposta a tensão oxidativa, componente celular, senescência foliar, via de sinalização de resposta de defesa dependente do gene de resistência, ligação de íons de zinco, resposta ao frio, processo metabólico de malato, transporte, atividade catalítica, resposta ao ozônio, mo- tivo VQ, regulação da resistência adquirida sistêmica, transporte de íons de potássio, respiração anaeróbica, desenvolvimento organizacional multicelular, resposta ao calor, atividade de metiltransferase, resposta ao ferimento, processo de oxidação-redução, atividade de mono- oxigenase, processo de oxidação-redução, processo metabólico de carboidratos, exocitose, encurtamento de cauda de mRNA poli(A) transcrita nuclear, transporte de íons de sódio, processo metabólico de glicerol, fator A3 de von Willebrand, resposta à privação de água, resposta à tensão salino e processo biossintético de clorofila. Em algumas modalidades, o gene tem um identificador de ontologia de gene (GO) selecionado do grupo que consiste em: GO:0003824, GO, atividade catalítica; GO:0006355, GO, regulação de transcrição, dependente de DNA; GO:0009870, GO, caminho de sinalização de resposta de defesa, dependente de genes de resistência; GO:0008150, GO, biológico_processo; GO:0010200, GO, resposta à quitina; GO:0006508, GO, proteólise; GO:0010193, GO, resposta ao ozônio; GO:0006979, GO, resposta a tensão oxidativa; e GO:0005975, GO, processo metabólico de carboidratos.

[0117] Em algumas modalidades, a função do gene é selecionada do seguinte grupo:atividade de endodeoxirribonuclease específica de DNA de cadeia simples, atividade de fator de transcrição de ligação de DNA específica de sequência, atividade de NAD+ ADP- ribosiltransferase, atividade de metaloencepêndase, processo catabó- lico de DNA, homeostase de íon de ferro celular, resposta à tensão osmótico, atividade de metopeptidase, ligação de íons de zinco, resposta a feridas, processo de biossintética de camalexina, atividade de endoribonuclease, produção de 5'-fosfono-monômeros, resposta celular ao calor, atividade de endonuclease específica de incompatibilidade T/G, atividade de poliamina oxidase, ligação de dinucleotídeo de flavi- na adenina, aclimatação de calor celular, resposta celular ao estímulo de etileno, resposta celular a óxido nítrico e processo metabólico das espécies reativas de oxigênio.

[0118] Em algumas modalidades, o endófito compreende uma sequência de ácido nucleico ITS rRNA pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO:344.

[0119] Em algumas modalidades de qualquer dos métodos, o en- dófito expressa um ou mais genes que codificam uma proteína cuja sequência de aminoácidos é pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs:477-501, 505, 514, 518, 521, 528, 530, 531, 550, 566, 567, 572, 579, 580, 581, 587, 593, 600, 602, 614, 623, 630, 635, 643, 645, 652, 657, 661, 662, 667, 670, 672, 673, 4510-4535, 4540, 4541, 4542, 4547, 4555, 4558, 4560, 4569, 4570, 4571, 4572, 4577, 4582, 4592, 4594, 4602, 4608, 4609, 4622, 4626, 4641, 4643, 4653, 4654, 4742-4766, 4734, 4739, 4740, 477, 478, 480, 482, 484, 485, 487, 489, 494, 496, 497, 501, 530, 567, 587, 602, 614, 633, 645, 649, 651, 652, 658, 665, 666, 667, 673, 874, 934, 1013, 1249, 1342, 2252, 2272, 2273, 2281, 2282, 2284, 2285, 2286, 2287, 2289, 2290, 2291, 2292, 2293, 2296, 4510, 4514, 4515, 4518, 4520, 4521, 4525, 4526, 4527, 4529, 4532, 4538, 4539, 4540, 4555, 4559, 4560, 4562, 4569, 4570, 4571, 4572, 4577, 4581, 4582, 4594, 4595, 4597, 4608, 4615, 4618, 4623, 4624, 4626, 4630, 4632, 4635, 4641, 4642, 4646, 4650, 4658, 4659, 4661, 4662, 4663, 4666, 4667, 4668, 4670, 4799, 4801, 4802, 4803, 4804, 4805, 4826, 4827, 4828, 4829, 4830, 4831, 4832, 4833, 4834, 4835, 4836, 4837, 4838, 4839, 4840, 4841, 4863, 4864, 4865, 4866, 4867, 4868, 4869, 4870, 4871, 4872, 4873, 4874, 4875, 4876, 4877, 4878, 4879, 4880, 4881, 4882, 4883, 4884, 4885, 4886, 4887, 4888, 4889, 4890, 4891, 4892, 4893, 4894, 4917, 4918, 4919, 4920, 4921, 4922, 4923, 4924, 4925, 4939, 4940, 4941, 4943, 4947, 4948, 4950, 4951, 4955, 4956, 4957, 2315, 2320, 2322, 2326, 2349, 2350, 2352, 2377, 2382, 2390, 2407, 2422, 2436, 2443, 2457, 2463, 2464, 2470, 2477, 2483, 2721, 2968, 3093, 3185, 4096, 4097, 4098, 4099, 4100, 4101, 4102, 4103, 4104, 4105, 4106, 4107, 4108, 4109, 4110, 4111, 4112, 4113, 4114, 4115, 4116, 4117, 4118, 4119, 4120, 4121, 4122, 4123, 4124, 4125, 4126, 4346, 4353, 4362, 4369, 4386, 4391, 4394, 4408, 4410, 4413, 4415, 4422, 4423, 4432, 4433, 4442, 4469, 4487, 4489, 4491, 4493, 4494, 4495, 4496, 4497, 4498, 4499, 4500, 4501, 4502, 4503, 4504, 4505, 4506, 4507, 4508, 4509, 4343, 4484, 4485, 4486, 4488, 4490, e 4492. Em algumas modalidades de qualquer dos métodos, o endófito expressa um ou mais genes envolvidos no metabolismo de amido e sacarose, na degradação da parede celular ou na proteção da tensão oxidativa.

[0120] Em algumas modalidades, a proteína é expressa com pelo menos uma diferença de duas vezes, pelo menos uma diferença de três vezes, pelo menos uma diferença de quatro vezes, pelo menos uma diferença de cinco vezes, pelo menos uma diferença de seis vezes, pelo menos uma diferença de sete vezes, pelo menos uma diferença de oito vezes, pelo menos uma diferença de nove vezes, pelo menos uma diferença de dez vezes ou mais no nível de expressão em comparação com o nível de expressão da proteína de um microorganismo de referência. Em algumas modalidades, a diferença no nível de expressão é positiva. Em algumas modalidades, a diferença no nível de expressão é negativa.

[0121] Em algumas modalidades, o endófito compreende uma sequência de ácido nucleico ITS rRNA que é pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica a uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs:344 e 447. Em algumas modalida- des, o endófito compreende uma sequência de ácido nucleico 16S rRNA que é pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica a uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs:439 ou 441.

[0122] Em algumas modalidades de qualquer dos métodos, o en- dófito expressa um ou mais genes que codificam uma proteína cuja sequência de aminoácidos é pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs:479, 483, 519, 532, 549, 557, 561, 562, 577, 578, 611, 626, 640, 656, 660, 666, 674, 676, 677, 678, 679, 680, 682, 683, 684, 685, 686, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 696, 697, 698, 701, 704, 706, 710, 711, 716, 717, 718, 719, 720, 721, 722, 723, 724, 727, 728, 729, 730, 731, 732, 733, 734, 735, 737, 738, 741, 743, 744, 745, 746, 747, 748, 749, 751, 753, 756, 757, 759, 761, 762, 763, 764, 765, 766, 767, 768, 769, 771, 772, 773, 774, 775, 776, 777, 778, 779, 780, 782, 783, 784, 785, 786, 788, 790, 793, 795, 796, 797, 798, 800, 801, 802, 803, 804, 805, 806, 807, 808, 809, 810, 811, 812, 813, 815, 816, 817, 818, 819, 820, 822, 823, 824, 825, 826, 829, 830, 833, 835, 836, 837, 838, 839, 840, 841, 842, 843, 844, 846, 848, 850, 851, 853, 854, 855, 856, 857, 858, 859, 860, 864, 865, 866, 868, 869, 870, 871, 872, 873, 874, 875, 876, 877, 878, 879, 880, 881, 882, 884, 886, 887, 888, 889, 890, 891, 892, 893, 894, 895, 897, 898, 899, 901, 902, 903, 904, 905, 906, 907, 908, 910, 911, 912, 913, 914, 915, 916, 917, 918, 920, 921, 922, 923, 924, 926, 927, 928, 930, 931, 932, 933, 934, 935, 936, 937, 938, 939, 940, 941, 942, 943, 944, 945, 946, 947, 948, 949, 950, 952, 953, 954, 955, 956, 957, 958, 959, 960, 961, 962, 963, 964, 968, 969, 971, 974, 976, 978, 979, 980, 984, 985, 987, 988, 989, 992, 993, 994, 995, 996, 998, 1000, 1001, 1002, 1003, 1006, 1008, 1010, 1011, 1012, 1014, 1015, 1016, 1017, 1018, 1019, 1021, 1022, 1023, 1024, 1025, 1028, 1029, 1030, 1031, 1032, 1033, 1034, 1036, 1037, 1038, 1040, 1041, 1042, 1043, 1044, 1045, 1046, 1047, 1048, 1049, 1050, 1051, 1055, 1056, 1058, 1059, 1060, 1062, 1064, 1065, 1066, 1068, 1070, 1071, 1072, 1076, 1077, 1079, 1080, 1081, 1083, 1085, 1086, 1087, 1088, 1090, 1091, 1092, 1094, 1095, 1096, 1097, 1098, 1099, 1101, 1102, 1103, 1104, 1106, 1107, 1108, 1110, 1111, 1112, 1113, 1114, 1115, 1116, 1117, 1118, 1119, 1121, 1122, 1123, 1124, 1126, 1127, 1129, 1130, 1131, 1132, 1133, 1134, 1136, 1137, 1138, 1139, 1140, 1142, 1143, 1144, 1145, 1146, 1147, 1148, 1149, 1151, 1153, 1155, 1156, 1157, 1158, 1159, 1160, 1161, 1162, 1163, 1165, 1166, 1167, 1168, 1169, 1170, 1171, 1172, 1174, 1176, 1178, 1179, 1180, 1181, 1182, 1183, 1184, 1185, 1186, 1188, 1189, 1190, 1191, 1192, 1193, 1194, 1196, 1197, 1198, 1199, 1200, 1201, 1203, 1205, 1206, 1207, 1208, 1209, 1210, 1211, 1213, 1214, 1216, 1217, 1218, 1219, 1221, 1222, 1223, 1225, 1226, 1228, 1229, 1230, 1231, 1232, 1233, 1235, 1237, 1238, 1239, 1241, 1242, 1243, 1244, 1245, 1246, 1247, 1248, 1249, 1250, 1251, 1252, 1253, 1255, 1256, 1257, 1258, 1259, 1260, 1261, 1262, 1263, 1264, 1265, 1266, 1267, 1268, 1269, 1270, 1271, 1272, 1273, 1274, 1275, 1276, 1277, 1279, 1280, 1281, 1282, 1283, 1284, 1285, 1286, 1287, 1288, 1290, 1292, 1293, 1296, 1297, 1298, 1300, 1301, 1303, 1304, 1306, 1307, 1308, 1309, 1311, 1312, 1313, 1314, 1317, 1319, 1320, 1321, 1322, 1323, 1324, 1325, 1326, 1327, 1328, 1330, 1331, 1333, 1334, 1335, 1336, 1337, 1338, 1339, 1340, 1341, 1342, 1343, 1344, 1345, 1346, 1347, 1348, 1350, 1351, 1352, 1353, 1355, 1356, 1357, 1358, 1359, 1360, 1361, 1362, 1363, 1364, 1365, 1366, 1368, 1369, 1370, 1371, 1372, 1374, 1375, 1376, 1379, 1380, 1382, 1383, 1384, 1385, 1386, 1388, 1389, 1390, 1391, 1392, 1393, 1396, 1397, 1398, 1399, 1400, 1402, 1403, 1404, 1405, 1406, 1407, 1408, 1409, 1410, 1411, 1412, 1413, 1414, 1415, 1416, 1417, 1418, 1419, 1420, 1421, 1422, 1424, 1425, 1426, 1427, 1428, 1430, 1431, 1432, 1433, 1437, 1438, 1439, 1440, 1441, 1442, 1443, 1444, 1445, 1446, 1447, 1448, 1449, 1450, 1452, 1453, 1456, 1459, 1466, 1467, 1469, 1471, 1478, 1479, 1482, 1483, 1484, 1485, 1487, 1488, 1489, 1490, 1495, 1497, 1498, 1499, 1500, 1501, 1504, 1505, 1506, 1508, 1511, 1513, 1514, 1516, 1520, 1526, 1529, 1534, 1535, 1537, 1538, 1540, 1545, 1547, 1548, 1549, 1550, 1551, 1552, 1553, 1554, 1556, 1559, 1561, 1562, 1565, 1566, 1568, 1569, 1570, 1571, 1573, 1574, 1575, 1576, 1577, 1578, 1579, 1580, 1581, 1582, 1583, 1585, 1588, 1589, 1591, 1592, 1593, 1594, 1595, 1596, 1597, 1598, 1601, 1603, 1604, 1605, 1607, 1608, 1609, 1611, 1612, 1613, 1614, 1615, 1616, 1617, 1618, 1619, 1620, 1622, 1624, 1625, 1626, 1627, 1628, 1629, 1630, 1632, 1633, 1636, 1637, 1638, 1639, 1640, 1641, 1642, 1643, 1644, 1646, 1647, 1648, 1650, 1651, 1652, 1654, 1657, 1659, 1660, 1661, 1664, 1665, 1666, 1667, 1668, 1671, 1673, 1675, 1676, 1678, 1679, 1681, 1684, 1685, 1686, 1689, 1690, 1692, 1693, 1694, 1695, 1696, 1697, 1698, 1701, 1705, 1706, 1707, 1709, 1711, 1712, 1713, 1714, 1716, 1717, 1718, 1720, 1721, 1723, 1724, 1725, 1726, 1728, 1729, 1731, 1732, 1734, 1735, 1736, 1737, 1738, 1739, 1740, 1741, 1743, 1744, 1745, 1746, 1747, 1750, 1751, 1753, 1754, 1755, 1760, 1761, 1762, 1763, 1764, 1765, 1767, 1770, 1771, 1772, 1775, 1776, 1777, 1778, 1779, 1780, 1781, 1782, 1786, 1787, 1788, 1789, 1791, 1792, 1793, 1794, 1795, 1797, 1798, 1799, 1800, 1801, 1803, 1804, 1805, 1806, 1809, 1810, 1811, 1814, 1815, 1818, 1819, 1820, 1821, 1822, 1823, 1824, 1825, 1826, 1828, 1830, 1831, 1833, 1835, 1836, 1837, 1838, 1839, 1840, 1841, 1842, 1843, 1846, 1851, 1852, 1854, 1857, 1858, 1860, 1861, 1862, 1863, 1864, 1866, 1868, 1869, 1870, 1872, 1873, 1874, 1875, 1876, 1878, 1879, 1880, 1881, 1883, 1884, 1885, 1887, 1888, 1892, 1893, 1894, 1896, 1898, 1899, 1900, 1901, 1902, 1903, 1904, 1905, 1906, 1907, 1910, 1911, 1913, 1915, 1916, 1917, 1918, 1920, 1921, 1924, 1925, 1926, 1927, 1928, 1930 1932, 1933, 1934, 1935, 1938, 1939, 1940, 1942, 1943, 1945, 1946 1948, 1949, 1950, 1951, 1953, 1954, 1955, 1959, 1960, 1961, 1962 1963, 1965, 1966, 1967, 1970, 1971, 1973, 1975, 1976, 1977, 1979 1981, 1982, 1983, 1984, 1985, 1986, 1988, 1990, 1994, 1995, 1996 1998, 1999, 2000, 2001, 2002, 2003, 2006, 2007, 2008, 2009, 2010 2011, 2013, 2014, 2015, 2016, 2017, 2018, 2019, 2020, 2021, 2022 2024, 2025, 2026, 2027, 2028, 2029, 2030, 2031, 2032, 2034, 2035 2036, 2037, 2038, 2039, 2040, 2041, 2042, 2043, 2044, 2045, 2046 2047, 2048, 2049, 2050, 2052, 2054, 2055, 2059, 2060, 2062, 2065 2066, 2067, 2068, 2069, 2070, 2071, 2074, 2076, 2077, 2080, 2081 2082, 2083, 2085, 2086, 2087, 2088, 2089, 2090, 2091, 2092, 2093 2095, 2096, 2097, 2098, 2100, 2101, 2102, 2103, 2104, 2105, 2108 2109, 2110, 2112, 2113, 2115, 2116, 2117, 2118, 2119, 2120, 2121 2125, 2127, 2128, 2129, 2131, 2132, 2134, 2135, 2136, 2138, 2140 2141, 2142, 2143, 2145, 2146, 2147, 2148, 2149, 2150, 2153, 2154 2155, 2156, 2158, 2159, 2160, 2162, 2163, 2165, 2166, 2167, 2168 2169, 2170, 2171, 2172, 2174, 2176, 2177, 2179, 2180, 2181, 2182 2183, 2184, 2185, 2186, 2188, 2190, 2191, 2192, 2193, 2194, 2195 2196, 2197, 2198, 2200, 2202, 2204, 2205, 2206, 2207, 2208, 2210 2211, 2212, 2214, 2215, 2216, 2217, 2218, 2219, 2220, 2221, 2222 2223, 2225, 2226, 2227, 2228, 2229, 2230, 2231, 2232, 2233, 2234 2235, 2236, 2238, 2239, 2241, 2242, 2243, 2244, 2245, 2246, 2248 2249, 2251, 2253, 2254, 2255, 2257, 2258, 2259, 2261, 2262, 2265 2267, 2268, 2269, e 2270.

[0123] Em algumas modalidades de qualquer dos métodos, a expressão da proteína é modulada em resposta ao primeiro endófito que contata com um elemento de planta.

[0124] Em algumas modalidades, a expressão da proteína é su- prarregulada em resposta ao primeiro endófito que contata um ele- mento de planta. Em algumas modalidades, a sequência de aminoáci- dos da proteína suprarregulada é pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs:549, 640, 656, 676, 684, 690, 937, 1456, 1467, 1479, 1484, 1488, 1490, 1498, 1499, 1500, 1504, 1505, 1508, 1513, 1529 1534, 1538, 1540, 1547, 1551, 1554, 1561, 1566, 1568, 1570, 1571 1574, 1578, 1581, 1583, 1591, 1592, 1593, 1597, 1598, 1604, 1605 1609, 1615, 1616, 1619, 1622, 1624, 1626, 1629, 1630, 1632, 1636 1638, 1642, 1643, 1647, 1650, 1651, 1652, 1659, 1661, 1664, 1666 1671, 1675, 1676, 1678, 1684, 1685, 1689, 1692, 1694, 1695, 1696 1701, 1706, 1709, 1711, 1712, 1718, 1723, 1725, 1728, 1729, 1732 1737, 1738, 1740, 1741, 1744, 1746, 1747, 1751, 1755, 1761, 1763 1771, 1772, 1775, 1778, 1779, 1782, 1787, 1788, 1791, 1792, 1797 1798, 1799, 1800, 1805, 1819, 1824, 1828, 1835, 1840, 1842, 1843 1846, 1854, 1860, 1862, 1868, 1875, 1892, 1893, 1900, 1901, 1910 1918, 1924, 1925, 1926, 1928, 1932, 1933, 1934, 1938, 1943, 1946 1949, 1950, 1953, 1963, 1967, 1971, 1973, 1975, 1985, 1990, 1994 1998, 2000, 2003, 2006, 2010, 2013, 2016, 2018, 2021, 2025, 2027 2028, 2030, 2034, 2035, 2036, 2048, 2050, 2052, 2054, 2059, 2062 2065, 2066, 2067, 2068, 2074, 2080, 2091, 2092, 2093, 2095, 2097 2098, 2100, 2101, 2104, 2108, 2110, 2112, 2117, 2119, 2125, 2131 2134, 2135, 2145, 2149, 2150, 2156, 2159, 2162, 2168, 2181, 2185 2193, 2195, 2196, 2206, 2211, 2216, 2217, 2219, 2220, 2221, 2223 2231, 2236, 2239, 2242, 2243, 2248, 2255, 2257, 2258, 2259, ou 2262.

[0125] Em algumas modalidades, a expressão da proteína é reprimida em resposta ao primeiro endófito que contata um elemento de planta. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos da proteína reprimida é pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 479, 483, 519, 532, 557, 626, 674, 678, 680, 683, 685, 688, 690, 696, 697, 701, 704, 706, 710, 711, 717, 720, 722, 723, 724, 728, 729, 730, 732, 733, 734, 737, 741, 744, 745, 748, 749, 751, 753, 756, 757, 761, 764, 766, 768, 769, 772, 773, 774, 778, 779, 782, 783, 784, 788, 790, 793, 795, 796, 797, 800, 802, 803, 806, 807, 808, 810, 812, 817, 818, 819, 820, 822, 825, 826, 833, 836, 837, 839, 841, 846, 848, 851, 853, 854, 855, 856, 857, 860, 864, 865, 866, 870, 872, 874, 876, 878, 879, 880, 881, 882, 884, 886, 887, 890, 891, 893, 894, 895, 898, 901, 903, 905, 907, 908, 910, 911, 912, 913, 915, 917, 918, 921, 924, 926, 927, 928, 933, 934, 935, 936, 937, 938, 940, 942, 944, 945, 946, 947, 950, 952 954 955 957 960 961 962 963 964 968 971 976 978 979 1002, 1003, 1006, 1008, 1012, 1014, 1025, 1028, 1031, 1032, 1034, 1037, 1047, 1050, 1051, 1056, 1059, 1064, 1079, 1083, 1086, 1087, 1091, 1094, 1110, 1111, 1112, 1113, 1114, 1116, 1132, 1133, 1134, 1136, 1139, 1143, 1158, 1159, 1160, 1162, 1163, 1165, 1180, 1182, 1183, 1186, 1188, 1192, 1209, 1214, 1217, 1218, 1219, 1221, 1237, 1242, 1244, 1249, 1251, 1253, 1270, 1272, 1274, 1276, 1279, 1280, 1290, 1292, 1298, 1300, 1303, 1307, 1321, 1324, 1325, 1328, 1330, 1331, 1344, 1346, 1352, 1353, 1355, 1357, 1364, 1365, 1370, 1375, 1376, 1379, 1391, 1392, 1393, 1396, 1399, 1400, 1418, 1420, 1422, 1427, 1428, 1431, 1433, 1438, 1439, 1440, 1442, 1444, 1445, 1449, ou 1450.

[0126] Em algumas modalidades, a proteína é expressa com pelo menos uma diferença de duas vezes, pelo menos uma diferença de três vezes, pelo menos uma diferença de quatro vezes, pelo menos uma diferença de cinco vezes, pelo menos uma diferença de seis vezes, pelo menos uma diferença de sete vezes, pelo menos uma diferença de oito vezes, pelo menos uma diferença de nove vezes, pelo menos uma diferença de dez vezes ou mais no nível de expressão em comparação com o nível de expressão da proteína de um microorganismo de referência. Em algumas modalidades de qualquer dos métodos, a diferença no nível de expressão é positiva. Em algumas modalidades, a diferença no nível de expressão é negativa.

[0127] Em algumas modalidades, a proteína está envolvida em pelo menos uma via de KEGG selecionada do grupo que consiste em: endocitose, metabolismo de purina, metabolismo de fosfato de inositol e peroxissoma. Em algumas modalidades, a proteína está envolvida em pelo menos uma via de KEGG selecionada do grupo que consiste em: Ko00403 (biossíntese de alcaloides de indol diterpeno), ko00522 (biossíntese de macrolídeos de 12, 14 e 16 membros), ko00550 (bios- síntese de peptidoglicano), ko00601 (série de biossíntese glicosfingoli- pídica - lacto e neolacto), ko0901 (biossíntese de alcaloides indolais), ko01052 (estruturas de politetídeos de tipo I), ko010503 (biossíntese de peptídeos não reagossômicos do grupo sideróforo), ko01501 (resistência beta-Lactam) e ko04071 (via de sinalização de esfingolipídeos).

[0128] Em algumas modalidades de qualquer das plantas, formulações, combinações sintéticas ou outras composições da invenção, a planta, a cultura, a muda ou a planta cultivada a partir da semente expressa um ou mais genes cuja sequência de ácido nucleico é pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica a uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs:4127, 4128, 4129, 4130, 4131, 4132, 4133, 4134, 4135, 4136, 4137, 4138, 4139, 4140, 4141, 4142, 4143, 4144, 4145, 4146, 4147, 4148, 4149, 4150, 4151, 4152, 4153, 4154, 4155, 4156, 4157, 4158, 4159, 4160, 4161, 4162, 4163, 4164, 4165, 4166, 4167, 4168, 4169, 4170, 4171, 4172, 4173, 4174, 4175, 4176, 4177, 4178, 4179, 4180, 4181, 4182, 4183, 4184, 4185, 4186, 4187, 4188, 4189, 4190, 4191, 4192, 4193, 4194, 4195, 4196, 4197, 4198, 4199, 4200, 4201, 4202, 4203, 4204, 4205, 4206, 4207, 4208, 4209, 4210, 4211, 4212, 4213, 4214, 4215, 4216, 4217, 4218, 4219, 4220, 4221, 4222, 4223, 4224, 4225, 4226, 4227, 4228, 4229, 4230, 4231, 4232, 4233, 4234, 4235, 4236, 4237, 4238, 4239, 4240, 4241, 4242, 4243, 4244, 4245, 4246, 4247, 4248, 4249, 4250, 4251, 4252, 4253, 4254, 4255, 4256, 4257, 4258, 4259, 4260, 4261, 4262, 4263, 4264, 4265, 4266, 4267, 4268, ou 4269.

[0129] Em algumas modalidades, os um ou mais genes de plantas são modulados em resposta ao primeiro endófito que contata o elemento de planta ou planta em comparação com um micro-organismo de referência que contata a planta ou elemento de planta.

[0130] Em algumas modalidades, os um ou mais genes de plantas são suprarregulados em resposta ao primeiro endófito que contata um elemento de planta em comparação com um micro-organismo de refe-rência que contata a planta ou elemento de planta. Em algumas moda-lidades, a sequência de ácido nucleico de genes suprarregulados é pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica a uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs:4131, 4140, 4142, 4153, 4162, 4167, 4181, 4183, 4184, 4195, 4199, 4201, 4206, 4213, 4222, 4223, 4250, 4253, ou 4269.

[0131] Em algumas modalidades, a transcrição de um ou mais genes de plantas é reprimida em resposta ao primeiro endófito que con- tata um elemento de planta em comparação com um micro-organismo de referência que contata a planta ou elemento de planta. Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico de genes reprimidos é pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica a uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs:4150.

[0132] Em algumas modalidades, os um ou mais genes são expressos com pelo menos uma diferença de 0,5 vez, pelo menos uma diferença de 0,6 vez, pelo menos uma diferença de 0,7 vez, pelo menos uma diferença de 0,8 vez, pelo menos uma diferença de 0,9 vez, pelo menos uma diferença de 1,0 vez, pelo menos uma diferença de 1,1 vezes, pelo menos uma diferença de 1,2 vezes, pelo menos uma diferença de 1,3 vezes ou mais no nível de expressão em comparação com o nível de expressão do gene de um micro-organismo de referência. Em algumas modalidades, a diferença no nível de expressão é positiva. Em algumas modalidades, a diferença no nível de expressão é negativa.

[0133] Em algumas modalidades, os um ou mais genes tem pelo menos uma função de gene selecionada do grupo que consiste em: modificação da parede celular, resposta à defesa, processo de oxidação-redução, processo biológico, regulação da transcrição, processo metabólico, processo de biossintética do glucosinolato, resposta ao karrikin, fosforilação de proteína, dobramento de proteínas, resposta à quitina, proteólise, resposta ao estímulo de auxina, regulação de transcrição dependente de DNA, miristoilação de proteínas N-terminal, resposta a tensão oxidativa, componente celular, senescência foliar, via de sinalização de resposta de defesa dependente do gene de resistência, ligação de íons de zinco, resposta ao frio, processo metabólico de malato, transporte, atividade catalítica, resposta ao ozônio, motivo VQ, regulação da resistência adquirida sistêmica, transporte de íons de potássio, respiração anaeróbica, desenvolvimento organizacional multicelular, resposta ao calor, atividade de metiltransferase, resposta ao ferimento, processo de oxidação-redução, atividade de mono- oxigenase, processo de oxidação-redução, processo metabólico de carboidratos, exocitose, encurtamento de cauda de mRNA poli(A) transcrita nuclear, transporte de íons de sódio, processo metabólico de glicerol, fator A3 de von Willebrand, resposta à privação de água, resposta à tensão salino e processo biossintético de clorofila. Em algumas modalidades, o gene tem um identificador de ontologia de gene (GO) selecionado do grupo que consiste em: GO:0003824, GO, atividade catalítica; GO:0006355, GO, regulação de transcrição, dependente de DNA; GO:0009870, GO, caminho de sinalização de resposta de defesa, dependente de genes de resistência; GO:0008150, GO, biológico_processo; GO:0010200, GO, resposta à quitina; GO:0006508, GO, proteólise; GO:0010193, GO, resposta ao ozônio; GO:0006979, GO, resposta a tensão oxidativa; e GO:0005975, GO, processo metabólico de carboidratos.

[0134] Em algumas modalidades, a função do gene é selecionada do seguinte grupo:atividade de endodeoxirribonuclease específica de DNA de cadeia simples, atividade de fator de transcrição de ligação de DNA específica de sequência, atividade de NAD+ ADP-ribosil- transferase, atividade de metaloencepêndase, processo catabólico de DNA, homeostase de íon de ferro celular, resposta à tensão osmótico, atividade de metopeptidase, ligação de íons de zinco, resposta a feridas, processo de biossintética de camalexina, atividade de endoribonuclease, produção de 5'-fosfono-monômeros, resposta celular ao calor, atividade de endonuclease específica de incompatibilidade T/G, atividade de poliamina oxidase, ligação de dinucleotídeo de flavina adenina, aclimatação de calor celular, resposta celular ao estímulo de etileno, resposta celular a óxido nítrico e processo metabólico das es- pécies reativas de oxigênio.

[0135] Em algumas modalidades, o endófito compreende uma sequência de ácido nucleico ITS rRNA pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO:344.

[0136] Em algumas modalidades de qualquer das plantas, formulações, combinações sintéticas ou outras composições da invenção, o endófito expressa um ou mais genes que codificam uma proteína cuja sequência de aminoácidos é pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs:477-501, 505, 514, 518, 521, 528, 530, 531, 550, 566, 567, 572, 579, 580, 581, 587, 593, 600, 602, 614, 623, 630, 635, 643, 645, 652, 657, 661, 662, 667, 670, 672, 673, 4510-4535, 4540, 4541, 4542, 4547, 4555, 4558, 4560, 4569, 4570, 4571, 4572, 4577, 4582, 4592, 4594, 4602, 4608, 4609, 4622, 4626, 4641, 4643, 4653, 4654, 4742-4766, 4734, 4739, 4740, 477, 478, 480, 482, 484, 485, 487, 489, 494, 496, 497, 501, 530, 567, 587, 602, 614, 633, 645, 649, 651, 652, 658, 665, 666, 667, 673, 874, 934, 1013, 1249, 1342, 2252, 2272, 2273, 2281, 2282, 2284, 2285, 2286, 2287, 2289, 2290, 2291, 2292, 2293, 2296, 4510, 4514, 4515, 4518, 4520, 4521, 4525, 4526, 4527, 4529, 4532, 4538, 4539, 4540, 4555, 4559, 4560, 4562, 4569, 4570, 4571, 4572, 4577, 4581, 4582, 4594, 4595, 4597, 4608, 4615, 4618, 4623, 4624, 4626, 4630, 4632, 4635, 4641, 4642, 4646, 4650, 4658, 4659, 4661, 4662, 4663, 4666, 4667, 4668, 4670, 4799, 4801, 4802, 4803, 4804, 4805, 4826, 4827, 4828, 4829, 4830, 4831, 4832, 4833, 4834, 4835, 4836, 4837, 4838, 4839, 4840, 4841, 4863, 4864, 4865, 4866, 4867, 4868, 4869, 4870, 4871, 4872, 4873, 4874, 4875, 4876, 4877, 4878, 4879, 4880, 4881, 4882, 4883, 4884, 4885, 4886, 4887, 4888, 4889, 4890, 4891, 4892, 4893, 4894, 4917, 4918, 4919, 4920, 4921, 4922, 4923, 4924, 4925, 4939, 4940, 4941, 4943, 4947, 4948, 4950, 4951, 4955, 4956, 4957, 2315, 2320, 2322, 2326, 2349, 2350, 2352, 2377, 2382, 2390, 2407, 2422, 2436, 2443, 2457, 2463, 2464, 2470, 2477, 2483, 2721, 2968, 3093, 3185, 4096, 4097, 4098, 4099, 4100, 4101, 4102, 4103, 4104, 4105, 4106, 4107, 4108, 4109, 4110, 4111, 4112, 4113, 4114, 4115, 4116, 4117, 4118, 4119, 4120, 4121, 4122, 4123, 4124, 4125, 4126, 4346, 4353, 4362, 4369, 4386, 4391, 4394, 4408, 4410, 4413, 4415, 4422, 4423, 4432, 4433, 4442, 4469, 4487, 4489, 4491, 4493, 4494, 4495, 4496, 4497, 4498, 4499, 4500, 4501, 4502, 4503, 4504, 4505, 4506, 4507, 4508, 4509, 4343, 4484, 4485, 4486, 4488, 4490, e 4492.

[0137] Em algumas modalidades de qualquer das plantas, formulações, combinações sintéticas ou outras composições da invenção, o endófito expressa um ou mais genes envolvidos no metabolismo de amido e sacarose, na degradação da parede celular ou na proteção da tensão oxidativa. Em algumas modalidades, a proteína é expressa com pelo menos uma diferença de duas vezes, pelo menos uma diferença de três vezes, pelo menos uma diferença de quatro vezes, pelo menos uma diferença de cinco vezes, pelo menos uma diferença de seis vezes, pelo menos uma diferença de sete vezes, pelo menos uma diferença de oito vezes, pelo menos uma diferença de nove vezes, pelo menos uma diferença de dez vezes ou mais no nível de expressão em comparação com o nível de expressão da proteína de um microorganismo de referência. Em algumas modalidades, a diferença no nível de expressão é positiva.

[0138] Em algumas modalidades, a diferença no nível de expressão é negativa. Em algumas modalidades, o endófito compreende uma sequência de ácido nucleico ITS rRNA que é pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica a uma sequência de ácido nucleico selecionada do gru- po que consiste em SEQ ID NOs:344 e 447. Em algumas modalidades, em que o endófito compreende uma sequência de ácido nucleico 16S rRNA que é pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica a uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs:439 ou 441.

[0139] Portanto, em um primeiro aspecto, as invenções aqui descritas proporcionam uma combinação sintética de um elemento de planta de uma primeira planta e uma preparação de um endófito que é revestido na superfície do elemento de planta da primeira planta, de modo que o endófito esteja presente a um nível superior na superfície do elemento de planta do que está presente na superfície de um elemento de planta de referência não revestido, em que o endófito é isolado do interior do elemento de planta de uma segunda planta. Em algumas modalidades, uma combinação sintética compreende um elemento de planta de uma primeira planta e uma preparação de um ou mais endófitos. Em algumas modalidades, os um ou mais endófitos são selecionados do grupo que consiste em fungos, bactérias e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, um ou mais endófi- tos da combinação sintética são fungos. Em algumas modalidades, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais endófitos da combinação sintética são fungos. Em algumas modalidades, um ou mais en- dófitos da combinação sintética são bactérias. Em algumas modalidades, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais endófitos da combinação sintética são bactérias. Em algumas modalidades, um ou mais endófitos da combinação sintética compreendem tanto fungos quanto bactérias. Em algumas modalidades, um ou mais endófitos da combinação sintética compreendem pelo menos um fungo e pelo menos uma bactéria. Em algumas modalidades, um ou mais endófitos da combinação sintética compreendem pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais bactérias, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais fungos, e combinações dos mesmos.

[0140] Em algumas modalidades, o endófito compreende um táxon presente em pelo menos duas espécies que são selecionadas de cereais, frutas e vegetais, pastagens selvagens e plantas oleaginosas. Em algumas modalidades, o endófito compreende um ácido nucleico que é pelo menos 97% idêntico, por exemplo, pelo menos 98% idêntico, pelo menos 99% idêntico, pelo menos 99,5% idêntico ou 100% idêntico à sequência de ácido nucleico selecionada dos grupos fornecidos na Tabela 1, Tabela 2, Tabela 7 e Tabela 8.

[0141] Em algumas modalidades, o endófito isolado é cultivado, por exemplo, antes de ser revestido na superfície do elemento de planta. O endófito pode ser cultivado em meio semissintético ou sintético.

[0142] O endófito isolado pode ser associado à superfície da semente da primeira planta. Em algumas modalidades, o endófito não está associado à superfície do elemento de planta da primeira planta.

[0143] A presente invenção contempla uma combinação sintética na qual a primeira planta e a segunda planta são da mesma espécie. Em uma modalidade particular, a primeira planta e a segunda planta são a mesma cultivar. A combinação sintética também pode fazer uso de um endófito isolado de uma planta que é uma espécie diferente da primeira planta.

[0144] Em algumas modalidades, o elemento de planta da primeira planta é de uma planta monocotiledônea. Por exemplo, o elemento de planta da primeira planta é de uma planta de cereais. O elemento de planta da primeira planta pode ser selecionado do grupo que consiste em milho, trigo, cevada, cebola, arroz ou sorgo. Em uma modalidade alternativa, a semente da primeira planta é de uma planta dicotiledô- nea. O elemento de planta da primeira planta pode ser selecionado do grupo que consiste em algodão, Brassica napus, tomate, pimenta, re- polho, alface, melão, morango, nabo, melancia, amendoim ou soja. Em uma modalidade particular, a planta não é uma planta de algodão. Em ainda uma outra modalidade, a planta não é uma soja. Em outra mo-dalidade, a planta não é milho. Em ainda uma outra modalidade, a planta não é trigo.

[0145] Em algumas modalidades, o elemento de planta da primeira planta pode ser de uma planta geneticamente modificada. Em uma outra modalidade, o elemento de planta da primeira planta pode ser um elemento de planta híbrido.

[0146] A combinação sintética pode compreender um elemento de planta da primeira planta que é esterilizado em superfície antes de se combinar com os endófitos.

[0147] Conforme indicado acima, o endófito usado na combinação sintética é derivado do elemento de planta de uma segunda planta. Em algumas modalidades, a segunda planta é uma planta monocotiledô- nea ou tecido da mesma. Em uma modalidade particular, a segunda planta é uma planta de cereais ou um tecido da mesma. Em algumas modalidades, a segunda planta é selecionada do grupo que consiste em uma planta de milho, uma planta de cevada, uma planta de trigo, uma planta de cebola, uma planta de arroz ou uma planta de sorgo. Em algumas modalidades, o elemento de planta é uma semente que é um grão nu (isto é, sem cascos ou cascas de frutas). Em uma modalidade alternativa, a segunda planta é uma planta dicotiledônea. Por exemplo, a segunda planta pode ser selecionada do grupo que consiste em uma planta de algodão, uma planta Brassica Napus , uma planta de tomate, uma planta de pimenta, uma planta de repolho, uma planta de alface, uma planta de melão, uma planta de morango, um nabo, uma planta de melancia, uma planta de amendoim ou uma planta de soja.

[0148] Em algumas modalidades, o endófito é revestido na super- fície do elemento de planta da primeira planta em uma quantidade eficaz para conferir no elemento de planta ou na planta resultante uma característica agronômica melhorada. Por exemplo, em uma modalidade, a característica agronômica é selecionada do grupo que consiste em: biomassa foliar melhorada, melhor vigor, massa de fruta melhorada, melhor produção de grãos, melhora da massa radicular, aumento do número de flores, aumento da altura da planta, floração precoce e aumento da taxa de germinação. Alternativamente, ou adicionalmente, a característica agronômica é selecionada do grupo que consiste em: resistência à seca melhorada, eficiência do uso da água melhorada, eficiência do uso de nitrogênio melhorada, absorção de nitrogênio me-lhorada, resistência à tensão salina melhorada, resistência ao calor melhorada, resistência ao frio melhorada, tolerância ao metal melhorada e melhor conteúdo nutricional, melhor absorção de micronutrientes, incluindo íons de metal, melhor absorção de fósforo e melhor absorção de potássio. Em algumas modalidades, a característica agronômica é selecionada do grupo que consiste em: resistência melhorada a nema- tódeos, resistência melhorada aos patógenos fúngicos, resistência me-lhorada ao patógeno, resistência melhorada aos herbívoros, resistência melhorada ao agente patogênico viral.

[0149] Em algumas modalidades, a semente da primeira planta é revestida com pelo menos 1 CFU ou esporos do endófito por semente, por exemplo, pelo menos 2 CFU ou esporos, pelo menos 5 CFU ou esporos, pelo menos 10 CFU ou esporos, pelo menos 30 CFU ou es-poros, pelo menos 100 CFU ou esporos, pelo menos 300 CFU ou es-poros, pelo menos 1.000 CFU ou esporos, pelo menos 3.000 CFU ou esporos, pelo menos 10.000 CFU ou esporos, pelo menos 30.000 CFU ou esporos ou mais por semente.

[0150] A combinação sintética pode compreender adicionalmente uma composição de revestimento de sementes. A composição de re- vestimento de semente pode compreender um agente selecionado do grupo que consiste em: um fungicida, um agente antibacteriano, um herbicida, um nematicida, um inseticida, um regulador do crescimento da planta, um rodenticida, um nutriente e combinações dos mesmos. A composição de revestimento de semente pode ainda compreender um agente selecionado do grupo que consiste em um veículo aceitável em agricultura, um agente de pegajosidade, um estabilizador microbiano e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, a composição de revestimento de semente pode conter uma segunda preparação microbiana, incluindo mas não se limita a uma preparação de bactérias rizobiais.

[0151] A presente invenção contempla a utilização de endófitos que não são modificados, bem como aqueles que são modificados. Em algumas modalidades, o endófito é um endófito recombinante. Em uma modalidade particular, o endófito é modificado antes do revestimento sobre a superfície da semente de modo que tenha uma compatibilidade melhorada com um agente antimicrobiano quando comparado com o não modificado. Por exemplo, o endófito pode ser modificado de modo que tenha maior compatibilidade com um agente antibacteri- ano. Em uma modalidades alternativa, o endófito aumentou a compatibilidade com um agente antifúngico. O endófito pode ser modificado de tal forma que exiba pelo menos 3 vezes mais, por exemplo, pelo menos 5 vezes mais, pelo menos 10 vezes mais, pelo menos 20 vezes mais, pelo menos 30 vezes mais ou mais resistência a um agente an- timicrobiano quando comparado com o endófito não modificado. O en- dófito pode ser substancialmente purificado a partir de qualquer outra entidade microbiana . Em uma modalidade, o agente antimicrobiano é um agente antibacteriano. Em uma outra modalidade, o agente antimi- crobiano é um agente antifúngico.

[0152] Em uma modalidade particular, o agente antimicrobiano é o glifosato. Por exemplo, o endófito modificado exibe pelo menos 3 vezes mais, por exemplo, pelo menos 5 vezes mais, pelo menos 10 vezes mais, pelo menos 20 vezes mais, pelo menos 30 vezes mais ou mais resistência ao agente antimicrobiano quando comparado com o endófito não modificado. Em alternativa, o endófito modificado tem um tempo de duplicação em meio de crescimento contendo pelo menos 1 mM de glifosato, por exemplo, pelo menos 2 mM de glifosato, pelo menos 5 mM de glifosato, pelo menos 10 mM de glifosato, pelo menos 15 mM de glifosato ou mais, isso não é mais que 250%, por exemplo, não mais que 200%, não mais que 175%, não mais que 150% ou não mais que 125%, do tempo de duplicação do endófito no mesmo meio de crescimento que não contém glifosato. Em ainda uma outra modalidade, o endófito modificado tem um tempo de duplicação em um tecido vegetal contendo pelo menos 10 ppm de glifosato, por exemplo, pelo menos 15 ppm de glifosato, pelo menos 20 ppm de glifosato, pelo menos 30 ppm de glifosato, pelo menos 40 ppm de glifosato ou mais, isso não é mais que 250%, por exemplo, não mais que 200%, não mais que 175%, não mais que 150% ou não mais que 125%, do tempo de duplicação do endófito não modificado em um tecido vegetal de referência que não contém glifosato.

[0153] A presente invenção também contempla o uso de múltiplos endófitos. Por exemplo, em algumas modalidades, a combinação sin-tética descrita acima pode compreender uma pluralidade de endófitos purificados, por exemplo, 2, 3, 4 ou mais tipos diferentes de endófitos.

[0154] Em um outro aspecto, a presente invenção proporciona um método para melhorar uma característica em uma planta agrícola, o método compreendendo:proporcionar uma planta agrícola, contatar a planta com uma formulação compreendendo uma entidade microbiana endofítica compreendendo uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 97% idêntica, pelo menos 98% idêntica, pelo menos 99% idêntica, pelo menos 99,5% idêntica ou 100% Idêntica à sequência de ácido nucleico selecionada dos grupos fornecidos na Tabela 1,Tabela 2, Tabela 7, e Tabela 8 que está presente na formulação em uma quantidade eficaz para colonizar a planta e permitir que a planta cresça em condições que permitam que a entidade microbiana endofítica colonize a planta.

[0155] Também são descritas aqui preparações que compreendem uma população de endófitos modificados isolados descritos acima. As preparações aqui descritas compreendem ainda um veículo aceitável em agricultura, e a preparação compreende uma quantidade de endófitos suficientes para melhorar uma característica agronômica da população de sementes. Por exemplo, em uma modalidade, a característica agronômica é selecionada do grupo que consiste em: biomassa foliar melhorada, melhor vigor, massa de fruta melhorada, melhor produção de grãos, melhora da massa radicular, aumento do número de flores, aumento da altura da planta, floração precoce, aumento da taxa de germinação e combinações dos mesmos. Alternativamente, ou adicionalmente, a característica agronômica é selecionada do grupo que consiste em: resistência à seca melhorada, eficiência do uso da água melhorada, eficiência do uso de nitrogênio melhorada, absorção de nitrogênio melhorada, resistência à tensão salina melhorada, resistência ao calor melhorada, resistência ao frio melhorada, tolerância ao metal melhorada e melhor conteúdo nutricional, melhor absorção de micronutrientes, incluindo íons de metal, melhor absorção de fósforo, melhor absorção de potássio e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, a característica agronômica é selecionada do grupo que consiste em: resistência melhorada a nematódeos, resistência melhorada aos patógenos fúngicos, resistência melhorada ao patógeno, resistência melhorada aos herbívoros, resistência melhorada ao agente patogênico viral e combinações dos mesmos. Em algu- mas modalidades, a preparação é substancialmente estável a tempe-raturas entre cerca de 2 oC e cerca de 45 oC por pelo menos cerca de trinta dias.

[0156] As preparações podem ser convenientemente formuladas para fornecer o número ideal de endófitos em uma semente para produzir combinações sintéticas descritas acima. Em algumas modalidades, uma preparação é formulada para fornecer pelo menos 100 endó- fitos, por exemplo, pelo menos 300 endófitos, 1.000 endófitos, 3.000 endófitos, 10.000 endófitos ou mais por semente. Em algumas modalidades, a preparação é formulada para proporcionar uma população de plantas que demonstra uma taxa de crescimento substancialmente homogênea quando introduzida na produção agrícola. As invenções aqui descritas também contemplam uma preparação que compreende dois ou mais endófitos purificados diferentes.

[0157] Também aqui descritos são produtos vegetais de produtos básicos que compreendem uma planta ou parte de uma planta (incluindo uma semente) e compreendendo ainda o endófito modificado descrito acima que está presente em um nível detectável, por exemplo, conforme detectado pela presença de seu ácido nucleico por PCR.

[0158] Em um outro aspecto da presente invenção, é proporcionada uma semente compreendendo combinações sintéticas aqui descritas. Em ainda um outro aspecto, é divulgada uma população substancialmente uniforme de sementes que compreende uma pluralidade de tais sementes. Em uma modalidade, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos, 90%, pelo menos, 95% ou mais das sementes na população, contém um endófito ou endófitos viáveis dispostos na superfície das sementes. Em uma modalidade particular, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos, pelo menos 90%, pelo menos, 95% ou mais das sementes na população contém pelo menos 10 CFU ou esporos, por exemplo, pelo menos 30 CFU ou esporos, pelo menos 100 CFU ou esporos, pelo menos 300 CFU ou esporos, pelo menos 1.000 CFU ou esporos, pelo menos 3.000 CFU ou esporos, pelo menos 10.000 CFU ou esporos ou mais, do endófito ou endófitos revestidos na superfície da semente.

[0159] Em ainda um outro aspecto, a presente invenção divulga uma população substancialmente uniforme de plantas produzida por crescimento da população de sementes descrita acima. Em uma mo-dalidade, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou mais das plantas compreendem em um ou mais tecidos uma quantidade eficaz do endófito ou endófitos. Em outra modalidade, pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou mais das plantas compreendem uma população de micróbios que é substancialmente similar.

[0160] Em um outro aspecto, aqui descrito é um campo agrícola, incluindo uma estufa que compreende a população de plantas descrita acima. Na modalidade, o campo agrícola compreende pelo menos 100 plantas. Em uma outra modalidade, a população ocupa pelo menos cerca de 100 pés quadrados de espaço, em que pelo menos cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais de 90% da população compreende uma quantidade eficaz do micróbio. Em uma outra modalidade, a população ocupa pelo menos cerca de 100 pés quadrados de espaço, em que pelo menos cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais de 90% da população compreende o micróbio no tecido reprodutivo. Em ainda uma outra modalidade, a população ocupa pelo menos cerca de 100 pés quadrados de espaço, em que pelo menos cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais do que 90% da população compreende pelo menos 10 CFUs ou esporos, 100 CFUs ou esporos, 1.000 CFUs ou esporos, 10.000 CFUs ou esporos ou mais do micróbio. Em ainda uma outra modalidade, a população ocupa pelo menos cerca de 100 pés quadrados de espaço, em que pelo menos cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais que 90% da população compreende um micróbio exógeno (ou seja, o endófito) de origem monoclonal.

[0161] Em um outro, é divulgado um método para produzir um produto vegetal básico, que compreende a obtenção de uma planta ou tecido vegetal a partir da combinação sintética descrita acima, e produzir o produto vegetal da mesma. O produto vegetal de base pode ser produzido a partir da semente, ou a planta (ou uma parte da planta) cultivada a partir da semente. O produto vegetal de base também pode ser produzido a partir da progênie dessa planta ou parte da planta. O produto vegetal de base pode ser selecionado do grupo que consiste em grãos, farinha, amido, óleo de sementes, xarope, farinha, óleo, filme, embalagem, produto nutracêutico, alimentação animal, forragem de peixe, produto de cereal, produto humano consumado, um açúcar ou um álcool e proteína.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0162] Os desenhos são apenas para fins ilustrativos, não para limitação.

[0163] A FIG. 1 representa um esquema exemplificativo de uma via KEGG para Glicólise/Gliconeogênese. O proteoma segregado de uma Agrobacterium benéfica e neutra foi contrastado, e as IDs de KEGG que foram enriquecidas são retratadas. 5AY representa SYM01004 benéfico (SEQ ID NO:441). 5BY representa SYM00091 neutro (SEQ ID NO:427). Oval cinza claro representa proteínas cor- respondentes a 5AY. Oval cinza escuro representa proteínas corres-pondentes a 5BY. Oval cinza médio representa proteínas correspon-dentes com 5AY e 5BY. Valor P=1. 36e-8

[0164] A FIG. 2 representa um esquema exemplificativo de uma via de KEGG para o metabolismo de amido e sacarose. O proteoma segregado de bactérias e fungos benéficos e neutros foram contrastados, e as IDs de KEGG que foram enriquecidas são retratadas.

DESCRIÇÃO DETALHADA Definições

[0165] No intuito da presente invenção ser mais facilmente com-preendida, determinados termos são definidos abaixo. Definições adi-cionais para os seguintes termos e outros termos são apresentadas em todo o relatório descritivo.

[0166] Tal como aqui utilizado, uma "semente agrícola" é uma semente utilizada para cultivar uma planta tipicamente utilizada na agricultura (uma "planta agrícola"). A semente pode ser de uma planta monocotiledônea ou dicotiledônea, e pode ser plantada para a produção de um produto agrícola, por exemplo, grãos, comida, alimentos, fibras, combustível, etc. Tal como aqui utilizado, uma semente agrícola é uma semente preparada para plantação, por exemplo, em fazendas para cultivo.

[0167] Um "endófito" ou "entidade endofítica" ou "micróbio endofí- tico" é um organismo simbiótico (por exemplo, um micro-organismo, por exemplo, uma bactéria, por exemplo, um fungo) capaz de viver dentro de uma planta ou de outra forma associado a ela e não causar doença ou prejudicar a planta de outra forma, e confere uma ou mais propriedades benéficas à planta hospedeira. Em algumas modalidades, um endófito é um micro-organismo. Em algumas modalidades, um endófito é um micro-organismo que está associado a um ou mais tecidos da planta hospedeira e está em uma relação simbiótica, por exemplo, benéfica com os referidos tecidos vegetais hospedeiros. Em algumas modalidades, um endófito é um micro-organismo, por exemplo, um organismo bacteriano ou fúngico, que confere um aumento no rendimento, um aumento na biomassa, um aumento da resistência à tensão, um aumento da aptidão física ou combinações dos mesmos na planta hospedeira. Os endófitos podem ocupar os espaços intracelulares ou extracelulares do tecido vegetal, incluindo as folhas, caules, flores, frutos, sementes, raízes e combinações dos mesmos. Tal como aqui utilizado, o termo "componente endofítico" se refere a uma composição e/ou estrutura que é parte do endófito.

[0168] Tal como aqui utilizado, o termo "micróbio" ou "microorganismo" se refere a qualquer espécie ou táxon de micro-organismo, incluindo, mas não limitado a, arqueias, bactérias, microalgas, fungos (incluindo espécies de mofo e leveduras), micoplasmas, microesporos, nanobactérias, oomicetos e protozoários. Em algumas modalidades, um micróbio ou micro-organismo é um endófito. Em algumas modalidades, um micróbio é um endófito. Em algumas modalidades, um micróbio ou micro-organismo abrange células individuais (por exemplo, micro-organismos unicelulares) ou mais de uma célula (por exemplo, micro-organismo multicelular). Uma "população de micro-organismos" pode, portanto, referir-se a células múltiplas de um único microorganismo, nas quais as células compartilham a derivação genética comum. Tal como aqui utilizado, o termo micro-organismo "neutro" se refere a um micro-organismo que é não benéfico e não patogênico para uma planta hospedeira.

[0169] Tal como aqui utilizado, o termo "bactéria" ou "bactérias" se refere em geral a qualquer organismo procariótico e pode referir um organismo do Reino da Eubactéria (Bactérias), do Reino da Archae- bacteria (Archae) ou ambos.

[0170] Tal como aqui utilizado, o termo "fungo" ou "fungos" se refe- re em geral a qualquer organismo do Reino dos Fungos.

[0171] Um "esporo" ou uma população de "esporos" se refere a bactérias ou fungos que são geralmente viáveis, mais resistentes a influências ambientais, tais como calor e agentes bactericidas ou fungicidas do que outras formas das mesmas bactérias ou fungos, e tipicamente capazes de germinação e crescimento externo. Bactérias e fungos que são "capazes de formar esporos" são aquelas bactérias e fungos que compõem os genes e outras habilidades necessárias para produzir esporos em condições ambientais adequadas.

[0172] "Espaçador Transcrito Interno" (ITS) se refere ao DNA es- paçador (DNA não codificador) situado entre os genes RNA (rRNA) ribossômico de subunidade pequena e rRNA de subunidade grande no cromossomo ou a região transcrita correspondente na transcrição pre-cursora de rRNA policistrônico.

[0173] Uma "pluralidade de endófitos" significa dois ou mais tipos de entidades endófitas, por exemplo, de bactérias simples ou fungos simples, fungos complexos ou combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, os dois ou mais tipos de entidades endófitas são duas ou mais cepas de endófitos. Em outras modalidades, os dois ou mais tipos de entidades endófitas são duas ou mais espécies de endófitos. Em ainda outras modalidades, os dois ou mais tipos de entidades en- dófitas são dois ou mais gêneros de endófitos. Em ainda outras modalidades, os dois ou mais tipos de entidades endófitas são duas ou mais famílias de endófitos. Em ainda outras modalidades, os dois ou mais tipos de entidades endófitas são duas ou mais ordens de endófitos.

[0174] Uma "população" de endófitos se refere a uma pluralidade de células de um único endófito, nas quais as células compartilham derivação genética comum.

[0175] Uma "rede complexa" significa uma pluralidade de endófitos colocalizados em um ambiente, como sobre ou dentro de uma planta agrícola. De preferência, uma rede complexa inclui dois ou mais tipos de entidades endófitas que interagem de forma sinérgica, tais populações endofíticas sinérgicas capazes de proporcionar um benefício para a semente agrícola, planta ou planta derivada desse meio.

[0176] Os termos "patógeno" e "patogênico" em referência a uma bactéria ou fungo incluem qualquer organismo desse tipo que seja capaz de causar ou afetar uma doença, distúrbio ou condição de um hospedeiro que compreende o organismo.

[0177] Um "esporo" ou uma população de "esporos" se refere a bactérias ou fungos que são geralmente viáveis, mais resistentes a influências ambientais, tais como calor e agentes bactericidas ou fungicidas do que outras formas das mesmas bactérias ou fungos, e tipicamente capazes de germinação e crescimento externo. Bactérias e fungos que são "capazes de formar esporos" são aquelas bactérias e fungos que compõem os genes e outras habilidades necessárias para produzir esporos em condições ambientais adequadas.

[0178] Tal como aqui utilizado, uma "unidade de formação de colônias" ("CFU") é utilizada como uma medida de micro-organismos viáveis em uma amostra. Uma CFU é uma célula viável individual capaz de formar em um meio sólido uma colônia visível cujas células individuais são derivadas pela divisão celular de uma célula parental.

[0179] O termo "isolado" destina-se a referenciar especificamente um organismo, célula, tecido, polinucleotídeo ou polipeptídeo que é removido da sua fonte original e purificado a partir de componentes adicionais com os quais foi originalmente associado. Por exemplo, um endófito pode ser considerado isolado de uma semente se for removido daquela fonte de semente e purificado para que seja isolado de quaisquer componentes adicionais com os quais foi originalmente associado. Da mesma forma, um endófito pode ser removido e purificado a partir de um elemento de planta ou planta de modo que este seja isolado e não esteja mais associado com a planta de origem ou elemento de planta.

[0180] Tal como aqui utilizado, uma cepa isolada de um micróbio é uma cepa que foi removida do seu meio natural. As "culturas puras" ou "culturas isoladas" são culturas nas quais os organismos presentes são apenas uma cepa de um gênero e espécie em particular. Isso contrasta com as "culturas mistas", que são culturas nas quais estão presentes mais de um gênero e/ou espécies de micro-organismos. Como tal, o termo "isolado" não reflete necessariamente a medida em que o micróbio foi purificado. Uma "cultura substancialmente pura" da cepa do micróbio se refere a uma cultura a qual não contém substancialmente nenhum outro micróbio que não a cepa ou cepas de micróbio desejada(s). Em outras palavras, uma cultura substancialmente pura de uma cepa de micróbio é substancialmente isenta de outros conta- minantes, os quais podem incluir contaminantes microbianos. Além disso, tal como aqui utilizado, uma cepa "biologicamente pura" destina- se a significar a cepa separada de materiais com os quais normalmente é associada na natureza. Uma cepa associada a outras cepas, ou com compostos ou materiais que normalmente não são emaranhados com a natureza, ainda é definida como "biologicamente pura". Uma monocultura de uma cepa particular é, obviamente, "biologicamente pura". Tal como aqui utilizado, o termo "cultura enriquecida" de uma cepa microbiana isolada se refere a uma cultura microbiana que contém mais de 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% da cepa isolada.

[0181] Um "elemento de planta" destina-se a referir genericamente a uma planta inteira ou um componente de planta, incluindo, entre outros, os tecidos, as partes e os tipos de células da planta. Um elemento de planta é preferencialmente um dos seguintes: planta inteira, plân- tulas, tecido meristemático, tecido moído, tecido vascular, tecido dér- mico, semente, folha, raiz, rebento, caule, flor, fruta, estólon, bulbo, tubérculo, grão, keikis, rebento, broto. Tal como aqui utilizado, um "elemento de planta" é sinônimo de uma "porção" de uma planta e se refere a qualquer parte da planta e pode incluir tecidos e/ou órgãos distintos e pode ser usado permutavelmente com o termo "tecido" ao longo deste documento.

[0182] Da mesma forma, um "elemento reprodutivo da planta" destina-se a referenciar genericamente qualquer parte de uma planta que seja capaz de iniciar outras plantas através de reprodução sexual ou assexuada dessa planta, por exemplo, mas não limitado a:Semente, plântula, raiz, rebento, estólon, bulbo, tubérculo, milho, keikis ou broto.

[0183] Uma "população" de plantas, tal como aqui utilizado, se refere a uma pluralidade de plantas que são da mesma categoria taxo- nômica, tipicamente da mesma espécie, e também geralmente compartilham uma derivação genética comum.

[0184] Tal como aqui utilizado, uma "semente agrícola" é uma semente utilizada para cultivar uma planta tipicamente utilizada na agricultura (uma "planta agrícola"). A semente pode ser de uma planta monocotiledônea ou dicotiledônea, e pode ser plantada para a produção de um produto agrícola, por exemplo, alimentos, comida, fibras, combustível, etc. Tal como aqui utilizado, uma semente agrícola é uma semente preparada para plantação, por exemplo, em fazendas para cultivo.

[0185] "Plantas agrícolas", ou "plantas de importância agronômica", incluem plantas que são cultivadas por seres humanos para fins de ali-mentação, comida, fibra e de combustível. As plantas agrícolas incluem espécies monocotiledôneas, tais como: milho (Zea mays), trigo comum (Triticum aestivum), espelta (Triticum spelta), trigo de Einkorn (Triticum monococcum), trigo de emmer (Triticum dicoccum), trigo duro (Triticum Durum), arroz asiático (Oryza sativa), arroz africano (Oryza glabaerrei- ma), arroz selvagem (Zizania aquatica, Zizania latifolia, Zizania palus- tris, Zizania texana), cevada (Hordeum vulgare), Sorgo (Sorgo bicolor), Painço de dedo (Eleusine coracana), milho Proso (Panicum miliaceum), milho de pérolas (Pennisetum glaucum), milho salgado (Setaria italica), Aveia (Avena sativa), Triticale (Triticosecale), centeio (Secale cereal), centeio selvagem russo (Psathyrostachys juncea), Bambu (Bambu- seae), ou cana-de-açúcar (por exemplo,Saccharum arundinaceum, Saccharum barberi, Saccharum bengalense, Saccharum edule, Sac- charum munja, Saccharum officinarum, Saccharum procerum, Sac- charum ravennae, Saccharum robustum, Saccharum sinense, ou Sac- charum spontaneum); bem como espécies dicotiledôneas, tais co- mo:Soja (Glycine max), cultivares de canola e colza (Brassica napus), algodão (gênero Gossypium), alfafa (Medicago sativa), mandioca (gênero Manihot), batata (Solanum tuberosum), tomate (Solanum lycopersi- cum), ervilha (Pisum sativum), grão de bico (Cicer arietinum), lentilha (Lens culinaris), linhagemça (Linum usitatissimum)amendoim (Arachis hypogaea) e muitas variedades de vegetais.

[0186] Uma "planta hospedeira" inclui qualquer planta, particularmente uma planta de importância agronômica, que um endófito pode colonizar. Tal como aqui utilizado, se diz que um endófito "coloniza" um elemento de planta ou planta quando pode ser detectado de forma estável dentro da planta ou elemento da planta durante um período de tempo, comos um ou mais dias, semanas, meses ou anos, em outras palavras, uma entidade colonizadora não está associada temporariamente ao elemento de planta ou planta. Tais plantas hospedeiras são, de preferência, plantas de importância agronômica.

[0187] Um "alvo não hospedeiro" significa um organismo ou composto químico que é alterado de alguma forma depois de entrar em contato com uma planta hospedeira ou fungo hospedeiro que compreende um endófito, como resultado de uma propriedade conferida à planta hospedeira ou ao fungo hospedeiro pelo endófito.

[0188] Tal como aqui utilizado, uma "planta híbrida" se refere geralmente a uma planta que é o produto de cruzo entre duas plantas parentais geneticamente diferentes. Uma planta híbrida é gerada por um processo natural ou artificial de hibridação, pelo qual todo o geno- ma de uma espécie, variedade cultivar, linhagem de criação ou planta individual é combinada intra ou interespecificamente no genoma de espécies, variedade ou cultivar ou linhagem, linhagem de criação ou planta individual por cruzamento.

[0189] Uma "planta consanguínea", tal como aqui utilizado, se refere a uma linhagemgem de planta ou planta que foi repetidamente cruzada ou sofreu cruzamentos consanguíneos para alcançar um alto grau de uniformidade genética e baixa heterocigosidade, como é conhecido na técnica.

[0190] O termo "isolinhagemgem" é um termo comparativo, e refere organismos que são geneticamente idênticos, mas podem diferir no tratamento. Em um exemplo, dois embriões de plantas de milho gene-ticamente idênticas podem ser separados em dois grupos diferentes, um que recebe um tratamento (como transformação com um polinu- cleotídeo heterólogo, para criar uma planta geneticamente modificada) e um controle que não recebe esse tratamento. Qualquer diferença fenotípica entre os dois grupos pode, portanto, ser atribuída unicamente ao tratamento e não a qualquer herança da composição genética da planta. Em outro exemplo, duas sementes geneticamente idênticas podem ser tratadas com uma formulação que introduz uma composição endófita. Todas as diferenças fenotípicas entre as plantas derivadas dessas sementes podem ser atribuídas ao tratamento, formando assim uma comparação de isolinhagem.

[0191] Da mesma forma, pelos termos "planta de referência", "planta agrícola de referência" ou "semente de referência", entende-se uma planta agrícola ou semente da mesma espécie, cepa ou cultivar aos quais um tratamento, formulação, composição ou preparação de endófito como aqui descrito não é administrado/contatado. Uma planta ou semente agrícola de referência, portanto, é idêntica à planta tratada, com exceção da presença do endófito e pode servir como controle para detectar os efeitos do endófito que é conferido à planta.

[0192] Um "ambiente de referência" se refere ao ambiente, tratamento ou condição da planta em que uma medida é feita. Por exemplo, a produção de um composto em uma planta associada a um endó- fito pode ser medida em um ambiente de referência da tensão por seca e comparada com os níveis do composto em uma planta agrícola de referência sob as mesmas condições de tensão por seca. Alternativamente, os níveis de um composto em planta associados a uma planta agrícola de endófito e de referência podem ser medidos em condições idênticas de nãa tensão.

[0193] Uma "população" de plantas se refere a mais de uma planta, que são da mesma catástria taxonômica, geralmente são da mesma espécie, e também normalmente compartilham uma derivação genética comum.

[0194] Em algumas modalidades, a invenção contempla o uso de micróbios que são "exógenos" para uma semente ou planta. Tal como aqui utilizado, um micróbio é considerado exógeno para a semente ou planta se o elemento de planta que não está modificado (por exemplo, um elemento de planta que não é tratado com a pluralidade de endófi- tos aqui descritos) não contém o micróbio.

[0195] Em algumas modalidades, um micróbio pode ser "endógeno" para uma semente ou planta. Tal como aqui utilizado, um micróbio é considerado "endógeno" para uma planta ou semente, se o componente endófito ou o endófito é derivado de, ou é encontrado de outra forma, um elemento de planta da amostra de planta a partir do qual é proveniente. Em modalidades nas quais um endófito endógeno é apli- cado, o micróbio endógeno é aplicado em uma quantidade que difere dos níveis tipicamente encontrados na planta.

[0196] Em algumas modalidades, a presente invenção contempla as composições sintéticas compreendendo a combinação de um elemento de planta, planta de semente ou plantas inteiras e uma população de endófitos, na qual a população de endófitos é "disposta hetero- logicamente".

[0197] Em alguns aspectos, "disposto heterologicamente" significa que o elemento de planta, plântula ou planta não contém níveis detec- táveis do micróbio no mesmo elemento de planta, plântula ou planta. Por exemplo, se o referido elemento de planta ou plântula ou planta não tiver naturalmente o endófito associado a ele e o endófito for aplicado, o endófito será considerado disposto heterologicamente. Em alguns aspectos, "disposto heterologicamente" significa que o endófito está sendo aplicado a um elemento de planta diferente daquele ao qual o endófito está naturalmente associado. Por exemplo, se o referido elemento de planta ou plântula ou planta tiver o endófito normalmente encontrado no tecido radicular, mas não no tecido foliar, e o en- dófito for aplicado à folha, o endófito será considerado disposto hetero- logicamente. Em alguns aspectos, "disposto heterologicamente" significa que o endófito é aplicado a um tecido ou camada celular diferente do elemento de planta daquele no qual o micróbio é naturalmente en-contrado. Por exemplo, se o endófito for encontrado naturalmente na camada mesofílica do tecido foliar, mas está sendo aplicado na camada epitelial, o endófito seria considerado disposto heterologicamente. Em alguns aspectos, "disposto heterologicamente" significa que o en- dófito que está sendo aplicado está em maior concentração, número ou quantidade do elemento de planta, plântula ou planta, do que o que é naturalmente encontrado no referido elemento da planta, planta ou planta. Por exemplo, uma concentração de endófito que está sendo aplicada é pelo menos 1,5 vezes, entre 1,5 e 2 vezes, 2 vezes, entre 2 e 3 vezes, 3 vezes, entre 3 e 5 vezes, 5 vezes, entre 5 e 7 vezes, 7 vezes, entre 7 e 10 vezes, 10 vezes maior ou até mesmo maior que 10 vezes o número, a quantidade ou a concentração do que o que está naturalmente presente, o endófito seria considerado disposto heterolo- gicamente. Em alguns aspectos, "disposto heterologicamente" significa que o endófito é aplicado a uma fase de desenvolvimento do elemento de planta, plântula ou planta ao qual o referido endófito não está naturalmente associado, mas pode estar associado em outras fases. Por exemplo, se um endófito é normalmente encontrado na fase de floração de uma planta e em nenhuma outra fase, um endófito aplicado na fase de semente pode ser considerado descartado heterologicamente. Para evitar dúvidas, "dispostos heterologicamente" contempla o uso de micróbios que são "exógenos" a uma semente ou planta.

[0198] Em alguns casos, a presente invenção contempla o uso de micróbios que são "compatíveis" com produtos químicos agrícolas, in-cluindo, mas não se limitando a, um fungicida, um composto anticom- plexo, um bactericida, um virucida, um herbicida, um nematicida, um parasiticida, um pesticida ou qualquer outro agente amplamente utilizado em agricultura que tenha o efeito de matar ou de outra forma interferir no crescimento ideal de outro organismo. Tal como aqui utilizado, um micróbio é "compatível" com um produto químico agrícola, quando o micróbio é modificado, tal como por modificação genética, por exemplo, contém um transgene que confere resistência a um herbicida, ou de outro modo adaptado para crescer ou sobreviver de outra forma, a concentração do produto químico agrícola utilizado na agricultura. Por exemplo, um micróbio disposto na superfície do elemento de planta é compatível com o fungicida metalaxil se for capaz de sobreviver às concentrações que são aplicadas na superfície do elemento de planta.

[0199] "Biomassa" significa a massa ou peso total (fresco ou seco), em um dado momento, de um tecido vegetal, tecido vegetaiss, uma planta inteira ou população de plantas, geralmente indicado como peso por unidade de área. O termo também pode se referir a todas as plantas ou espécies da comunidade (biomassa comunitária).

[0200] Algumas das composições e métodos aqui descritos envolvem cepas de endófito simples ou pluralidade de endófitos em uma quantidade eficaz para colonizar uma planta. Tal como aqui utilizado, diz-se que um micróbio "coloniza" uma planta ou semente quando pode existir em uma relação endofítica com a planta no ambiente da planta, por exemplo, dentro da planta ou em uma parte ou tecido da mesma, incluindo a semente.

[0201] As composições e os métodos aqui contidos podem proporcionar um "traço agronômico" melhorado ou "característica de importância agronômica" para uma planta hospedeira, que pode incluir, mas não se limitar ao seguinte:teor de óleo alterado, teor de proteína alterada, composição de carboidrato de semente alterada, composição de óleo de semente alterada e composição de proteína de semente alterada, tolerância química, tolerância ao frio, senescência tardia, resistência a doenças, tolerância à seca, peso da espiga, melhoria do crescimento, aumento da saúde, tolerância ao calor, tolerância a herbicidas, resistência a herbívoros, fixação de nitrogênio melhorada, melhor aproveitamento de nitrogênio, arquitetura de raiz melhorada, eficiência de uso de água melhorada, aumento da biomassa, aumento do comprimento da raiz, aumento do peso da semente, aumento do comprimento do rebento, aumento do rendimento, aumento do rendimento em condições limpas em água, massa de grão, teor de umidade do grão, tolerância ao metal, número de espigas, número de grãos por espiga, número de vagens, melhoramento nutricional, resistência aos agentes patogênicos, resistência a pragas, melhora da capacidade fo- tossintética, tolerância à salinidade, permanência de verde, aumento do vigor, aumento do peso seco de sementes maduras, aumento do peso fresco de sementes maduras, aumento do número de sementes maduras por planta, aumento do teor de clorofila, aumento do número de vagens por planta, aumento do comprimento de vagens por planta, número reduzido de folhas murchas por planta, número reduzido de folhas gravemente murchas por planta e aumento do número de folhas não murchas por planta, uma modulação detectável no nível de um metabolito, uma modulação detectável no nível de uma transcrição e uma modulação detectável no proteoma, em comparação com uma planta de isolinhagem cultivada a partir de uma semente sem o referido tratamento de semente.

[0202] Além disso, "função metabólica alterada" ou "função enzi- mática alterada" pode incluir, mas não se limitar ao seguinte: produção alterada de uma auxina, fixação de nitrogênio alterada, produção alterada de um composto antimicrobiano, produção alterada de um sideró- foro, solubilização de fosfato mineral alterado, produção alterada de celulase, produção alterada de quitinase, produção alterada de xila- nase, produção alterada de acetoina e capacidade alterada para me- tabolizar uma fonte de carbono.

[0203] Um "rendimento aumentado" pode referir-se a qualquer aumento na biomassa ou peso de sementes ou frutas, tamanho da semente, número de sementes por planta, número de sementes por unidade de área, bushels por acre, toneladas por acre, quilo por hectare ou rendimento de carboidratos. Tipicamente, a característica particular é designada quando se refere ao aumento do rendimento, por exemplo, aumento do rendimento de grãos ou aumento do tamanho da semente.

[0204] "Potencial de característica agronômica" pretende significar a capacidade de um elemento de planta para exibir um fenótipo, de preferência um traço agronômico melhorado, em algum momento do ciclo de vida, ou transmitir esse fenótipo para outro elemento de planta com o qual está associado na mesma planta. Por exemplo, um elemento de planta pode compreender um endófito que proporcionará benefício para o tecido foliar de uma planta a partir da qual o elemento de planta é cultivado; nesse caso, o elemento de planta que compreende esse endófito tem o potencial de características agronômicas para um fenótipo particular (por exemplo, aumento da biomassa na planta), mesmo que a própria semente não exiba o referido fenótipo.

[0205] Pelo termo "capaz de metabolizar" um substrato de carbono particular, significa que o endófito pode utilizar esse substrato de carbono como fonte de energia.

[0206] O termo "combinação sintética" significa uma pluralidade de elementos associados pelo esforço humano, em que a referida associ-ação não é encontrada na natureza. Em algumas modalidades, "com-binação sintética" é utilizada para se referir a uma formulação de tra-tamento associada com um elemento de planta. Em alguns aspectos da presente invenção, a "combinação sintética" se refere a uma população purificada de endófitos em uma formulação de tratamento com-preendendo composições adicionais com as quais os referidos endófi- tos não são encontrados na natureza. A combinação pode ser obtida, por exemplo, revestir a superfície da semente de uma planta, tal como uma planta agrícola, ou elementos de planta hospedeira com um en- dófito. Em algumas modalidades da presente invenção, a "combinação sintética" se refere a um ou mais elementos de planta em associação com uma população isolada e purificada de endófitos em uma formulação de tratamento compreendendo composições adicionais com as quais os referidos endófitos não são encontrados na natureza.

[0207] Uma "formulação de tratamento" se refere a uma mistura de substâncias químicas que facilitam a estabilidade, armazenamento e/ou aplicação da(s) composição(ões) de endófitos. Em algumas mo-dalidades, um veículo compatível com a agricultura pode ser utilizado para formular uma formulação agrícola ou outra composição que inclua uma preparação de endófitos purificada. Tal como aqui utilizado, um "veículo economicamente compatível" se refere a qualquer material, que não seja água, que pode ser adicionado a um elemento de planta sem causar ou ter um efeito adverso no elemento da planta (por exemplo, reduzir a germinação da semente) ou a planta que cresce a partir do elemento de planta, ou semelhantes.

[0208] Em alguns casos, a presente invenção contempla a utilização de composições que são "compatíveis" com produtos químicos agrícolas, por exemplo, um fungicida, um composto anticomplexo ou qualquer outro agente amplamente utilizado em agricultura que tenha o efeito de matar ou interferir de outra forma no crescimento ideal de outro organismo.

[0209] Algumas composições aqui descritas contemplam o uso de um veículo compatível com agricultura. Tal como aqui utilizado um "veículo compatível com agricultura" destina-se a referir-se a qualquer material, que não seja a água, que pode ser adicionado a uma semente ou plântula sem causar/ter um efeito adverso sobre a semente, a planta que cresce a partir da semente, germinação de sementes ou semelhantes.

[0210] Tal como aqui utilizado, um ácido nucleico tem "homologia" ou é "homólogo" para um segundo ácido nucleico se a sequência de ácido nucleico tiver uma sequência semelhante à segunda sequência de ácido nucleico. Os termos "identidade", "percentagem de identidade de sequência" ou "idêntico" no contexto de sequências de ácido nu- cleico se referem aos resíduos nas duas sequências que são iguais quando alinhados para correspondência máxima. Existem vários algoritmos diferentes conhecidos na técnica que podem ser usados para medir identidade de sequência de nucleotídeos. Por exemplo, as se-quências de polinucleotídeos podem ser comparadas usando FASTA, Gap ou Bestfit, que são programas da Wisconsin Package Versão 10. 0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI. O FASTA fornece alinhamentos e percentagem de identidade de sequência das regiões da melhor sobreposição entre a consulta e as sequências de pesquisa. Em algumas modalidades, as sequências podem ser comparadas utilizando Geneious (Biomatters, Ltd. ,Auckland, Nova Zelândia). Em outras modalidades, as sequências de polinucleotídeos podem ser comparadas utilizando o algoritmo de alinhamento de múltiplas sequências MUSCLE. Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico a ser alinhada é um gene completo. Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico a ser alinhada é um fragmento de gene. Em algumas modalidades, se a sequência de ácido nucleico a ser alinhada for um fragmento de gene, a percentagem de identidade para uma segunda sequência de ácido nucleico é considerada X% idêntica se as duas sequências forem X% idênticas ao comprimento da sequência mais curta.

[0211] O termo "homologia substancial" ou "similaridade substancial", quando se refere a um ácido nucleico ou um fragmento do mesmo, indica que, quando alinhados de forma ideal com inserções ou de- leções de nucleotídeos apropriadas com outro ácido nucleico (ou sua cadeia complementar), existe uma identidade de sequência de nucleo- tídeos em pelo menos cerca de 76%, 80%, 85% ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% das bases de nucleotídeos, conforme medido por qualquer algoritmo de identidade de sequência conhecido, como FASTA, BLAST, MUSCLE ou Gap, conforme discutido acima.

[0212] Tal como aqui utilizado, os termos "unidade taxonômica operacional", "OTU", "táxon", "agrupamento hierárquico" e "agrupa- mento" são usados permutavelmente. Uma unidade de táxon operacional (OTU) se refere a um grupo de um ou mais organismos que compreende um nó em uma árvore de agrupamento. O nível de um agrupamento é determinado pela sua ordem hierárquica. Em algumas modalidades, uma OTU é um grupo tentativamente assumido como um táxon válido para fins de análise filogenética. Em outras modalidades, uma OTU é uma das unidades taxonômicas existentes em estudo. Em outra modalidades, uma OTU recebe um nome e uma classificação. Por exemplo, uma OTU pode representar um domínio, um subdomínio, um reino, um sub-reino, um filo, um subfilo, uma classe, uma subclasse, uma ordem, uma subordem, uma família, uma subfamília, um gênero, um subgênero ou uma espécie. Em algumas modalidades, as OTUs podem representar um ou mais organismos dos reinos eubacte- ria, protista ou fungos em qualquer nível de uma ordem hierárquica. Em algumas modalidades, uma OTU representa uma ordem procarió- tica ou fúngica.

[0213] Tal como aqui utilizado, os termos "condição de água limitada", "condição de tensão hídrica" e "condição de seca", ou "água limitada", "tensão hídrica" e "seca", podem ser usados permutavelmen- te. Por exemplo, um método ou composição para melhorar a capacidade de uma planta de crescer sob condições de seca significa o mesmo que a capacidade de crescer sob condições limitadas por água. Nesses casos, pode-se dizer que a planta exibe ainda uma tolerância melhorada a tensão por seca.

[0214] Os termos "diminuído", "menos", "mais lento" e "aumentado", "mais rápido", "melhorado", "maior", tal como aqui utilizado, se referem a uma diminuição ou aumento de uma característica da semente tratada com endófito ou planta resultante em comparação com uma semente não tratada ou planta resultante. Por exemplo, uma diminuição de uma característica pode ser pelo menos 1%, pelo menos 2%, pelo menos 3%, pelo menos 4%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos 100%, pelo menos 200%, pelo menos cerca de 300%, pelo menos cerca de 400% ou mais inferior ao controle não tratado. Por exemplo, uma diminuição pode ser entre 1% e 5%, ou entre 5% e 10%, ou entre 10% e 15%, ou entre 15% e 20%, ou entre 20% e 25%, ou entre 25% e 30%, ou entre 30% e 35%, ou entre 35% e 40%, ou entre 45% e 50% menor que o controle não tratado ou o controle da formulação. Um aumento pode ser pelo menos 1%, pelo menos 2%, pelo menos 3%, pelo menos 4%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos, 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos 100%, pelo menos 200%, pelo menos cerca de 300%, pelo menos cerca de 400% ou mais superior ao controle não tratado. Por exemplo, um aumento pode ser entre 1% e 5%, ou entre 5% e 10%, ou entre 10% e 15%, ou entre 15% e 20%, ou entre 20% e 25%, ou entre 25% e 30%, ou entre 30% e 35%, ou entre 35% e 40%, ou entre 45% e 50% maior que o controle não tratado ou o controle da formulação. Endófitos

[0215] As plantas agrícolas parecem associar-se a microorganismos simbióticos chamados endófitos, particularmente bactérias e fungos, que podem ter sido importantes durante a evolução e podem contribuir para a sobrevivência e desempenho das plantas. No entanto, os processos agrícolas modernos podem ter perturbado essa relação, resultando em maiores perdas de culturas, diminuição da resis- tência à tensão, perdas de biodiversidade e crescente dependência de produtos químicos externos, fertilizantes e outras práticas agrícolas insustentáveis. Existe uma necessidade de novos métodos para a ge-ração de plantas com novas propriedades de microbioma que possam aumentar de forma sustentável o rendimento, a resistência à tensão e diminuir o uso de fertilizantes e químicos.

[0216] Os inventores realizaram uma comparação sistemática das comunidades microbianas que residem dentro de uma grande diversidade de plantas. Como tal, os micróbios endofíticos úteis para a invenção geralmente se relacionam com micróbios endofíticos que estão presentes em plantas agrícolas.

[0217] Em parte, a presente invenção descreve preparações de novos endófitos e a criação de combinações sintéticas de sementes agrícolas e/ou mudas com endófitos heterólogos e formulações que contenham as combinações sintéticas, bem como o reconhecimento de que tais combinações sintéticas apresentam uma diversidade de propriedades benéficas presente nas plantas agrícolas e nas populações de endófitos associadas recentemente criadas pelos presentes inventores. Tais propriedades benéficas incluem metabolismo, expressão transcrita, alterações proteômicas, morfologia e a resiliência a uma variedade de estresses ambientais e a combinação de uma pluralidade dessas propriedades.

[0218] São fornecidas novas composições, métodos e produtos relacionados com a capacidade da nossa invenção para superar as limitações da técnica anterior, a fim de proporcionar aumentos confiáveis no rendimento das culturas, biomassa, germinação, vigor, resili- ência à tensão e outras propriedades para as culturas agrícolas.

[0219] Acredita-se que os micróbios benéficos podem ser derivados de forma robusta a partir de elementos de plantas, opcionalmente cultivados, administrados de forma heteróloga a elementos de plantas agrícolas, tais como sementes, e colonizar os tecidos ve-getais resultantes com alta eficiência para conferir múltiplas propriedades benéficas.

[0220] Acredita-se que os micróbios podem conferir propriedades benéficas em uma variedade de concentrações.

[0221] Acredita-se que os endófitos podem ser heterologicamente dispostos em plântula de uma cultivar, espécie ou tipo de cultivo distintos e conferem benefícios a esses novos destinatários. Por exemplo, os endófitos das cultivares de milho são fornecidos heterologicamente às cultivares de trigo para conferir um benefício. Isso é surpreendente, dado as observações de preferências distintas de microbiomas em hospedeiros distintos de plantas e mamíferos e, em particular, a pro-babilidade de que os micróbios derivados de sementes tenham sido evoluídos de forma codesenvolvida para serem especializados em um hospedeiro particular.

[0222] Acredita-se ainda que as combinações de endófitos hetero- logicamente dispostos conferem vantagens aditivas às plantas, incluindo múltiplas propriedades funcionais e resultando em geradores de sementes, mudas e plântulas que exibem propriedades agronômicas melhoradas únicas ou múltiplas.

[0223] Os endófitos são micróbios que crescem dentro de uma planta. A apreciação recente de que os endófitos podem conferir traços notáveis sobre a planta hospedeira é a base para a presente invenção. Os inventores desenvolveram um método para introduzir en- dófitos isolados em outra planta, cobrindo os micróbios na superfície de uma semente de uma planta. Ao combinar um endófito proveniente de uma planta, é possível transferir a característica agronômica benéfica para uma planta agrícola e, portanto, é uma grande promessa para aumentar a produtividade agrícola.

[0224] A combinação de uma espécie de planta selecionada, OTU, cepa ou cultivar com um ou mais tipos de endófitos, fornece mecanismos pelos quais, isoladamente ou em paralelo com a produção de plantas e tecnologias transgênicas, proporciona um rendimento melhorado das culturas e a geração de produtos das mesmas. Por conseguinte, em um primeiro aspecto, a presente invenção proporciona uma combinação sintética que compreende a combinação de um elemento de planta, plântula ou plantas inteiras e uma cepa de endófito único ou uma pluralidade de endófitos, em que a cepa de endófito único ou uma pluralidade de endófitos estão "dispostos heterologicamente". Composições sintéticas de elementos de plantas e endófitos

[0225] A presente invenção contempla uma combinação sintética de um elemento de planta de uma planta que é revestida com um en- dófito na sua superfície. O elemento de planta pode ser qualquer elemento da planta agrícola, por exemplo, uma semente agrícola. Em uma modalidade, o elemento de planta da primeira planta é de uma planta monocotiledônea. Por exemplo, o elemento de planta da primeira planta é de uma planta de cereais. O elemento de planta da primeira planta pode ser selecionado do grupo que consiste em uma planta de milho, uma planta de trigo, uma cevada, uma planta de cebola, uma planta de sorgo ou uma planta de arroz. Em uma modalidade alternativa, o elemento de planta da primeira planta é de uma planta dicotile- dônea. O elemento de planta da primeira planta pode ser selecionado do grupo que consiste em uma planta de algodão, uma planta Brassica Napus, uma planta de tomate, uma planta de pimenta, uma planta de repolho, uma planta de alface, uma planta de melão, uma planta de morango, um nabo, uma planta de melancia, uma planta de amendoim ou uma planta de soja. Em uma modalidade particular, a planta não é uma planta de algodão. Em ainda uma outra modalidade, a semente da primeira planta pode ser de uma planta geneticamente modificada. Em uma outra modalidade, a semente da primeira planta pode ser uma semente híbrida.

[0226] A combinação sintética pode compreender um elemento de planta da primeira planta que é esterilizado em superfície antes de se combinar com os endófitos. Tal pré-tratamento antes do revestimento do elemento da planta com endófitos remove a presença de outros micróbios que podem interferir com a colonização, crescimento e/ou função ideal do endófito. A esterilização superficial dos elementos de planta pode ser realizada sem matar os elementos de planta como descrito aqui em outro lugar (ver, por exemplo, a seção Isolamento de endófitos). Fontes de Endófitos

[0227] Conforme aqui descrito, os endófitos podem ser derivados de fontes heterólogas, homólogas ou geradas, cultivados opcionalmente, administrados heterologicamente como uma cepa de endófito único ou uma pluralidade de endófitos para elementos de planta e, como resultado da administração, conferem múltiplas propriedades benéficas. Em algumas modalidades, os endófitos são derivados de elementos de planta ou solo. Em algumas modalidades, o elemento de planta a partir do qual o endófito é derivado é uma planta monocotile- dônea. Em uma modalidade particular, a planta é uma planta de cereais ou um tecido da mesma. Em ainda uma outra modalidade, a planta é selecionada do grupo que consiste em uma planta de milho, uma planta de cevada, uma planta de trigo, uma planta de cana-de-açúcar, uma planta de sorgo ou uma planta de arroz. Em algumas modalidades, o elemento de planta é um grão nu (isto é, sem cascos ou cascas de frutas). Em uma modalidade alternativa, o elemento de planta a partir do qual o endófito é derivado é uma planta dicotiledônea. Por exemplo, a planta pode ser selecionada do grupo que consiste em uma planta de algodão, uma planta Brassica Napus, uma planta de tomate, uma planta de pimenta, uma planta de repolho, uma planta de alface, uma planta de melão, uma planta de morango, um nabo, uma planta de melancia, uma planta de amendoim ou uma planta de soja.

[0228] Em algumas modalidades, os endófitos podem ser obtidos a partir de um elemento de planta da mesma cultura ou diferente, e podem ser da mesma cultivar ou de cultivar diferente ou de variedade como o elemento de planta ao qual a composição está heterologica- mente associada. Por exemplo, os endófitos de uma variedade de milho em particular podem ser isolados e revestidos na superfície de uma semente de milho da mesma variedade. Em outras modalidades, os endófitos podem ser isolados de uma espécie relacionada (por exemplo, um endófito isolado de Triticum monococcum (trigo einkorn) pode ser revestido na superfície de um elemento de planta de T. aes- tivum (trigo mole) ou um endófito de Hordeum A vulgare (cevada) pode ser isolado e revestido sobre o elemento de planta de outro membro da família Triticeae, por exemplo, elementos de plantas da planta de centeio, Secale cereale). Em ainda outra modalidade, os endófitos podem ser isolados a partir de uma parte da planta de uma planta que está distantemente relacionada ao elemento de planta sobre o qual o endófito deve ser revestido. Por exemplo, endófitos derivados de tomate são isolados e revestidos sobre um elemento de planta de arroz. Em ainda outra modalidade, os endófitos utilizados em uma composição ou utilizados para produzir uma composição sintética podem ser obtidos a partir de um elemento de planta de uma planta que está distantemente relacionada ao elemento de planta sobre o qual o endófito deve ser revestido. Por exemplo, um endófito derivado de tomate pode ser isolado e revestido sobre um elemento de planta de arroz.

[0229] Em algumas modalidades, a presente invenção contempla o uso de endófitos que podem conferir um caractere agronômico benéfico sobre a semente ou planta resultante sobre a qual é revestido. Em uma outra modalidade, os endófitos de sementes úteis para a presente invenção também podem ser isolados a partir de sementes de plantas adaptadas a um ambiente particular, incluindo, mas não limitado a, um ambiente com deficiência de água, salinidade, tensão térmico agudo e/ou crônico, agudo e/ou tensão frio crônico, solos com nutrientes, incluindo, mas não limitado a, solos privados de micronutrientes, solos minerais de macronutrientes (por exemplo, potássio, fosfato, nitrogênio), tensão patogênico, incluindo fungos, nemátodos, insetos, vírus, tensão patogênico bacteriano. Em um exemplo, o endófito é isolado da semente de uma planta que cresce em um ambiente deficiente em água.

[0230] A combinação sintética da presente invenção contempla a presença de um endófito na superfície da semente da primeira planta. Em uma modalidade, a semente da primeira planta é revestida com pelo menos 10 CFU ou esporos do endófito por semente, por exemplo, pelo menos 20 CFU ou esporos, pelo menos 50 CFU ou esporos, pelo menos 100 CFU ou esporos, pelo menos 200 CFU ou esporos, pelo menos 300 CFU ou esporos, pelo menos 500 CFU ou esporos, pelo menos 1.000 CFU ou esporos, pelo menos 3.000 CFU ou esporos, pelo menos 10.000 CFU ou esporos, pelo menos 30.000 CFU ou esporos ou mais por elemento de planta. Em uma outra modalidade, o elemento de planta é revestido com pelo menos 10, por exemplo, pelo menos 20, pelo menos 50, pelo menos 100, pelo menos 200, pelo menos 300, pelo menos 500, pelo menos, 1000, pelo menos, 3.000, pelo menos, 10.000, pelo menos 30.000, pelo menos 100.000, pelo menos 300.000, pelo menos 1.000.000 ou mais do endófito como detectado pelo número de cópias de um gene endófito particular detectado, por exemplo, por PCR quantitativa.

[0231] O endófito útil para a presente invenção pode ser um fungo. Em uma outra modalidade, o endófito pode ser uma bactéria. Em uma outra modalidade, o endófito não é uma Agrobacterium. Em outra mo- dalidade, o endófito não é capaz de fixação de nitrogênio (por exemplo, do gênero Rhizobium). Em ainda uma outra modalidade, o endófi- to não é do gênero Acetobacter. Em ainda uma outra modalidade, o endófito não é do gênero Bacilus. Em uma modalidade particular, o endófito não é Bacillus mojavensis. Em ainda uma outra modalidade, o endófito não é do gênero Neotyphodium.

[0232] A classificação taxonômica histórica dos fungos tem sido de acordo com a apresentação morfológica. A partir de meados dos anos 1800, reconheceu-se que alguns fungos têm um ciclo de vida pleomór- fico e que diferentes designações de nomenclatura foram usadas para diferentes formas do mesmo fungo. Em 1981, o Congresso de Sydney da International Mycological Association estabeleceu regras para a nomeação de fungos de acordo com seu status como anamorfo, tele- omorfo ou holomorfo. Com o desenvolvimento do sequenciamento ge- nômico, tornou-se evidente que a classificação taxonômica baseada em filogenética molecular não se alinha com a nomenclatura baseada na morfologia. Como resultado, em 2011, o Congresso Internacional de Botânica aprovou uma resolução aprovando o Código Internacional de Nomenclatura para Algas, Fungos e Plantas (Código de Melbourne) (2012), com o resultado declarado de designar "One Fungus = One Name". No entanto, os especialistas em sistemática não se alinharam na nomenclatura comum para todos os fungos, nem todos os bancos de dados e recursos de informação existentes, incluindo as taxonomi- as atualizadas. Como tal, muitos fungos aqui referidos podem ser descritos pela sua forma de anamorfo, mas entende-se que, com base em sequenciação genômica idêntica, qualquer estado pleomórfico desse fungo pode ser considerado como o mesmo organismo. Por exemplo, o gênero Alternaria é a forma anamórfica do gênero teleomorfo Lewia, os dois seriam entendidos como sendo o mesmo organismo com a mesma sequência de DNA.

Endófitos exógenos

[0233] Em uma modalidade, o endófito é um micróbio endofítico que foi isolado de uma planta diferente da planta inoculada. Por exemplo, em uma modalidade, o endófito pode ser um endófito isolado a partir de uma planta diferente da mesma espécie que a planta inoculada. Em alguns casos, o endófito pode ser isolado de uma espécie relacionada à planta inoculada.

[0234] A criação de plantas para a agricultura, bem como as práticas culturais usadas para combater patógenos microbianos, podem resultar na perda de cultivares modernas dos endófitos presentes em seus antepassados selvagens ou outras plantas selvagens, ou essas práticas podem ter promovido outras interações novas ou raras de plantas-endófitos, ou de outra forma alterado a população microbiana. O primeiro é o caso no milho e seu antepassado selvagem direto, filo- geneticamente confirmado, o Parviglumis teosinte (Zea mays ssp. Par- viglumis). Embora ambas as espécies tenham sementes que parecem conter um núcleo comum bacterianas endofíticas, a abundância relativa de certos grupos é maior em sementes de teosinto do que o milho moderno. É possível que esta maior diversidade e título de endófitos no antepassado esteja correlacionada com uma ampla gama de respostas fisiológicas derivadas da simbiose que permitem que a planta se adapte melhor ao meio ambiente e tolere a tensão. Para pesquisar grupos de plantas para endófitos potencialmente úteis, as sementes de seus ancestrais selvagens, parentes selvagens, raças autênticas primitivas, variedades modernas, linhas de criação modernas e variedades agronômicas modernas de elite podem ser rastreadas para en- dófitos microbianas por métodos independentes de cultura e cultura como aqui descrito . Além disso, os endófitos microbianos podem ser isolados de outras plantas selvagens, como plantas de pastagem.

[0235] Em alguns casos, as plantas são inoculadas com endófitos que são exógenos à semente da planta inoculada. Em uma outra mo- dalide, o endófito é derivado de uma planta de outra espécie. Por exemplo, um endófito que normalmente é encontrado em dicotiledô- neas é aplicado a uma planta monocotiledônea (por exemplo, inoculando milho com um endófito derivado de feijão de soja), ou vice-versa. Em outros casos, o endófito a ser inoculado em uma planta pode ser derivado de uma espécie relacionada da planta que está sendo inoculada. Em uma modalidade, o endófito pode ser derivado de um táxon relacionado, por exemplo, de uma espécie relacionada. A planta de outra espécie pode ser uma planta agrícola. Por exemplo, um endófito derivado de Hordeum irregulare pode ser usado para inocular uma planta Hordeum vulgare L , . Alternativamente, pode ser derivado de uma planta "selvagem" (isto é, uma planta não agrícola). Por exemplo, endófitos normalmente associados ao algodão selvagem Gossypium klotzschianum podem ser usados para inocular variedades comerciais de plantas Gossypium hirsutum. Os endófitos normalmente associados a uma planta de nabo selvagem ou a uma planta de melancia selvagem podem ser utilizados para inocular variedades comerciais de nabo ou plantas de melancia, respectivamente. Como um exemplo alternativo de derivar um endófito de uma planta "selvagem", bactérias endofí- ticas isoladas da orquídea da selva do sudeste asiático, Cymbidium eburneum, podem ser isoladas e testadas para sua capacidade de beneficiar o desenvolvimento de plântulas e a sobrevivência de culturas agrícolas, como trigo, milho, soja e outros. . Em outro exemplo, os en- dófitos podem ser isolados de plantas de pastagem selvagens. Em outros casos, o endófito pode ser isolado de uma espécie ancestral da planta inoculada. Por exemplo, um endófito derivado de Zea diplope- rennis pode ser usado para inocular uma variedade comercial de milho moderno ou Zea mays. Seleção de espécies de plantas dos habitats desejados para iso- lamento de endófitos microbianos

[0236] Diferentes ambientes podem conter populações significativamente diferentes de endófitos. Por exemplo, os solos geograficamente isolados de diferentes partes das Américas mostraram ser diferentes em 96% das espécies bacterianas que contêm. Os solos que contêm diferentes populações microbianas podem influenciar fortemente a população bacteriana endofítica observada dentro de Arabi- dopsis, ilustrando que o meio ambiente pode alterar, pelo menos parcialmente, a população microbiana associada a uma planta. Isso sugere que as plantas que crescem e especialmente prosperam em ambientes escolhidos são colonizadas por endófitos diferentes e talvez benéficos, cujo isolamento e inoculação em plantas de cultivo podem ajudar essas plantas a sobreviver melhor no mesmo ambiente de escolha ou a resistir melhor a certos estresses encontrados em um meio ambiente de agricultura normal. Por exemplo, pelo menos algumas das bactérias isoladas de plantas que crescem em ambientes áridos, deverão conferir tolerância à seca às plantas hospedeiras nas quais são transplantadas. Além disso, novos endófitos podem ser encontrados em variedades de culturas relacionadas cultivadas no ambiente escolhido. Uma vez selecionado um ambiente de escolha, as sementes de plantas escolhidas a serem amostradas serão identificadas pelo seu crescimento saudável e/ou robusto, e serão então amostradas pelo menos 5 de cada vez, escavando todas as plantas, além de pequenas raízes, incluindo raízes e solos associados e quaisquer sementes ou frutos presentes na planta. Estes serão colocados em um local frio (ambiente de 4oC) para armazenamento e transporte rápido de volta ao laboratório para extração de endófitos e DNA usando os métodos aqui descritos. A identificação de ambientes ou ecossistemas de escolha para bioprospecção de endófitos associados à planta de plantas selvagens ou plantas de cultivo que crescem nos ambientes escolhi- dos ou ecossistemas segue os protocolos aqui descritos.

[0237] Em uma modalidade, a planta associada ao endófito é colhida de um tipo de solo diferente do tipo de solo normal no qual a planta de cultivo é cultivada, por exemplo, a partir de um gelissolo (solos com permafrost a 2 m da superfície), por exemplo, de um histosso- lo (solo orgânico), por exemplo, a partir de um espodossolo (solos da floresta ácida com acumulação subterrânea de complexos metal- húmus), por exemplo, a partir de um andissolo (solos formados em cinzas vulcânicas), por exemplo, de um oxissolo (solos intensamente degradados de vegetação tropical e ambientes subtropicais), por exemplo, de um vertissolo (solos argilosos com alta capacidade de en- colhimento/inchaço), por exemplo, a partir de um aridissolo (solos con-tendo CaCO3 de ambientes áridos com desenvolvimento do horizonte subterrâneo), por exemplo, a partir de um ultissolo (solos fortemente lixiviados com uma zona subterrânea de acumulação de argila e <35% de saturação de base), por exemplo, a partir de um molissolo (solos depastagem com alto estado de base), por exemplo, de um alfissolo (solos moderadamente lixiviados com uma zona subterrânea de acu-mulação de argila e > 35% de saturação de base), por exemplo, de um inceptissolo (solos com horizontes subterrâneos fracos desenvolvidos), por exemplo, de um entissolo (solos com pouco ou nenhum desenvol-vimento morfológico).

[0238] Em outra modalidade, a planta associada ao endófito é colhida a partir de um ecossistema onde a planta agrícola não é normalmente encontrada, por exemplo, um ecossistema de tundra em oposição a uma fazenda agrícola temperada, por exemplo, de florestas tropicais e subtropicais úmidas (tropical e subtropical, úmidas), por exemplo, de florestas tropicais e subtropicais (tropicais e subtropicais, semiúmidas), por exemplo, de florestas tropicais e subtropicais de coníferas (tropicais e subtropicais, semiúmidas), por exemplo, de plantio médio temperado e florestas mistas (temperadas, úmidas) por exemplo, de florestas de coníferas temperadas (temperadas, úmidas a se- miúmidas), por exemplo, de florestas boreais/taiga (subártica, úmida), por exemplo, de pastagens tropicais e subtropicais, savanas e arbustos (tropicais e subtropicais, semiáridos), por exemplo, de pastagens temperadas, savanas e matagais (temperadas, semiáridas), por exemplo, de pastagens de inundação e savanas (temperadas a tropicais, frescas ou inundadas com água salobra), por exemplo, de pastagens montanas e arraiais (clima alpino ou montano), por exemplo, de florestas mediterrâneas, florestas e florestas de arbustos ou esclerofilo (temperado quente, semiúmida a semiárida com precipitação de inverno), por exemplo, de manguezais e, por exemplo, de desertos e matagais xéricas (temperado a tropical, árido).

[0239] Em outra modalidade, a planta associada ao endófito é colhida a partir de um solo com uma faixa de pH média que é diferente da faixa ideal de pH do solo da planta de cultivo, por exemplo, a planta pode ser colhida de um solo ultra ácido (<3,5) de um solo ácido extremo (3,5-4,4), de um solo ácido muito forte (4,5-5,0), de um solo ácido forte (5,1-5,5), de um solo ácido moderado (5,6-6,0), de um solo ácido ácido (6,1-6,5), de um solo neutro (6,6-7,3), de um solo ligeiramente alcalino (7,4-7,8), de um solo moderadamente alcalino (7,9-8,4), de um solo fortemente alcalino (8,5-9,0), ou de um solo muito forte (> 9,0).

[0240] Em uma modalidade, a planta associada a endófitos é colhida a partir de um ambiente com temperaturas médias do ar inferiores à temperatura de crescimento normal da planta de cultura, por exemplo, 2-5oC mais frio do que a média, por exemplo, pelo menos 5- 10oC mais frio, pelo menos 10-15oC mais frio, pelo menos pelo menos 15-20oC mais frio, pelo menos 20-25oC mais frio, pelo menos 25-30oC mais frio, pelo menos 30-35oC mais frio, pelo menos 35-40oC mais frio, pelo menos 40-45oC mais frio, pelo menos 45-50oC mais frio, pelo me- nos 50-55oC mais frio ou mais, quando comparado com plantas de cultivo cultivadas em condições normais durante uma estação de crescimento média.

[0241] Em uma modalidade, a planta associada ao endófito é colhida a partir de um ambiente com temperaturas médias do ar superiores à temperatura de crescimento normal da planta de cultivo, por exemplo, 2-5oC mais quente do que a média, por exemplo, pelo menos 5-10oC mais quente, pelo menos 10-15oC mais quente, pelo menos 15-20oC mais quente, pelo menos 20-25oC mais quente, pelo menos 25-30oC mais quente, pelo menos 30-35oC mais quente, pelo menos 35-40oC mais quente, pelo menos 40-45oC mais quente, pelo menos 45-50oC mais quente, pelo menos 50-55oC mais quente ou mais, quando comparado com plantas de cultivo cultivadas em condições normais durante uma estação de crescimento média.

[0242] Em outra modalidade, a planta associada ao endófito é colhida a partir de um ambiente com chuvas médias inferiores às chuvas médias ideais recebidas pela planta de cultivo, por exemplo, 2-5% menos precipitação do que a média, por exemplo, pelo menos 5 a 10% menos precipitação, pelo menos 10 a 15% menos precipitação, pelo menos 15 a 20% menos precipitação, pelo menos 20 a 25% menos precipitação, pelo menos 25 a 30% menos precipitação, pelo menos 30 a 35% menos precipitação, pelo menos 35 a 40% menos precipitação, pelo menos 40 a 45% menos precipitação, pelo menos 45-a 50% menos precipitação, pelo menos 50 a 55% menos precipitação, pelo menos 55 a 60% menos precipitação, pelo menos 60 a 65% menos precipitação, pelo menos 65 a 70% menos precipitação, pelo menos 70 a 75% menos precipitação, pelo menos 80 a 85% menos precipitação, pelo menos 85 a 90% menos precipitação, pelo menos 90 a 95% menos precipitação, ou menos, quando em comparação com plantas de cultivo cultivadas em condições normais durante uma estação de crescimento média.

[0243] Em uma modalidade, a planta associada ao endófito é colhida de um ambiente com uma precipitação média maior que a precipitação média ideal da planta de cultivo, por exemplo, 2 a 5% mais precipitação do que a média, por exemplo, pelo menos 5 a 10% mais precipitação, pelo menos 10 a 15% mais precipitação, pelo menos 15 a 20% mais precipitação, pelo menos 20 a 25% mais precipitação, pelo menos 25 a 30% mais precipitação, pelo menos 30 a 35% mais precipitação, pelo menos 35 a 40% mais precipitação, pelo menos 40 a 45% mais precipitação, pelo menos 45 a 50% mais precipitação, pelo menos 50 a 55% de precipitação, pelo menos 55 a 60% mais precipitação, pelo menos 60 a 65% mais precipitação, pelo menos 65-70% mais precipitação, pelo menos 70 a 75% mais precipitação, pelo menos 80 a 85% mais precipitação, pelo menos 85 a 90% mais precipitação, pelo menos 90 a 95% mais precipitação, pelo menos 95 a 100% mais precipitação, ou até mesmo mais que 100% mais precipitação, ou até mesmo mais que 200% mais precipitação, ou até mesmo mais que 300% mais precipitação ou até mesmo mais que 400% mais precipitação ou até mesmo mais que 500% mais precipitação, quando comparado com plantas de cultivo cultivadas em condições normais durante uma estação de crescimento média.

[0244] Em outra modalidade, a planta associada ao endófito é colhida de um tipo de solo com classificação de umidade do solo diferente do tipo de solo normal no qual a planta de cultivo é cultivada, por exemplo, a partir de um solo ácricos (o solo é saturado com água e praticamente isento de gás oxigênio por períodos de tempo suficientes, de modo que exista evidência de falta de aeração), por exemplo, de um solo úrico (a umidade do solo é suficientemente alta durante todo o ano na maioria dos anos para atender às exigências da planta), por exemplo, de um solo usático (a umidade do solo é intermediária entre os regimes uídico e arídico, em geral, a umidade disponível na planta durante a estação de crescimento, mas podem ocorrer períodos severos de seca), por exemplo, de um solo arídico (o solo está seco durante pelo menos metade da estação de crescimento e úmido por menos que 90 dias consecutivos), por exemplo, de um solo xérico (o regime de umidade do solo é encontrado em climas do tipo mediterrâneo, com invernos frios e úmidos e verões quentes e secos).

[0245] Em uma modalidade, a planta associada ao endófito é colhida a partir de um ambiente com chuvas médias inferiores às chuvas médias ideais da planta de cultivo, por exemplo, 2 a 95% menos precipitação do que a média, por exemplo, pelo menos 5 a 90% menos precipitação, pelo menos 10 a 85% menos precipitação, pelo menos 15 a 80% menos precipitação, pelo menos 20 a 75% menos precipitação, pelo menos 25 a 70% menos precipitação, pelo menos 30 a 65% menos precipitação, pelo menos 35 a 60% menos precipitação, pelo menos 40 a 55% menos precipitação, pelo menos 45 a 50% menos precipitação, quando comparado com plantas cultivadas em condições normais durante uma estação de crescimento média.

[0246] Em uma modalidade, a planta associada ao endófito é colhida de um ambiente com uma precipitação média maior que a precipitação média ideal da planta de cultivo, por exemplo, 2 a 5% mais precipitação do que a média, por exemplo, pelo menos 5 a 10% mais precipitação, pelo menos 10 a 15% mais precipitação, pelo menos 15 a 20% mais precipitação, pelo menos 20 a 25% mais precipitação, pelo menos 25 a 30% mais precipitação, pelo menos 30 a 35% mais precipitação, pelo menos 35 a 40% mais precipitação, pelo menos 40 a 45% mais precipitação, pelo menos 45 a 50% mais precipitação, pelo menos 50 a 55% de precipitação, pelo menos 55 a 60% mais precipitação, pelo menos 60 a 65% mais precipitação, pelo menos 65-70% mais precipitação, pelo menos 70 a 75% mais precipitação, pelo me- nos 80 a 85% mais precipitação, pelo menos 85 a 90% mais precipitação, pelo menos 90 a 95% mais precipitação, pelo menos 95 a 100% mais precipitação, ou até mesmo mais que 100% mais precipitação, ou até mesmo mais que 200% mais precipitação, ou até mesmo mais que 300% mais precipitação ou até mesmo mais que 400% mais precipitação ou até mesmo mais que 500% mais precipitação, quando comparado com plantas de cultivo cultivadas em condições normais durante uma estação de crescimento média.

[0247] Em outra modalidade, a planta associada ao endófito é colhida de um ambiente agrícola com um rendimento de colheita menor que o rendimento médio das culturas esperado da planta de cultivo cultivada sob práticas de cultivo normais em terras agrícolas normais, por exemplo, 2 a 5% menos rendimento do que a média, por exemplo, pelo menos 5 a 10% menos rendimento, pelo menos 10 a 15% menos rendimento, pelo menos 15 a 20% menos rendimento, pelo menos 20 a 25% menos rendimento, pelo menos 25 a 30% menos rendimento, pelo menos 30 a 35% menos rendimento, pelo menos 35 a 40% menos rendimento, pelo menos 40 a 45% menos rendimento, pelo menos 45 a 50% menos rendimento, pelo menos 50 a 55% menos rendimento, pelo menos 55 a 60% menos rendimento, pelo menos 60 a 65% menos rendimento, pelo menos 65 a 70% menos rendimento, pelo menos 70 a 75% menos rendimento, pelo menos 80 a 85% menos rendimento, pelo menos 85 a 90% menos rendimento, pelo menos 90 a 95% menos rendimento, ou menos, quando comparado com plantas de cultivo cultivadas em condições normais durante uma estação de crescimento média.

[0248] Em uma modalidade relacionada, a planta associada ao endófito é colhida de um ambiente agrícola com um rendimento de colheita menor que o rendimento médio da safra esperado da planta de cultivo cultivada sob práticas de cultivo normais em terras agrícolas normais, por exemplo, 2 95% menos rendimento do que a média, por exemplo, pelo menos 5 a 90% menos rendimento, pelo menos 10 a 85% menos rendimento, pelo menos 15 a 80% menos rendimento, pelo menos 20 a 75% menos rendimento, pelo menos 25 a 70% menos rendimento, pelo menos 30 a 65% menos rendimento, pelo menos 35 a 60% menos rendimento, pelo menos 40 a 55% menos rendimento, pelo menos 45 a 50% menos rendimento, quando comparado com plantas cultivadas em condições normais durante uma estação de crescimento média.

[0249] Em uma modalidade, a planta associada ao endófito é colhida a partir de um ambiente com rendimento médio de colheita superior ao rendimento médio ideal da planta de cultivo, por exemplo, 2 a 5% mais rendimento do que a média, por exemplo, pelo menos 5 a 10% mais rendimento, pelo menos 10 a 15% mais rendimento, pelo menos 15 a 20% mais rendimento, pelo menos 20 a 25% mais rendimento, pelo menos 25 a 30% mais rendimento, pelo menos 30 a 35% mais rendimento, pelo menos 35 a 40% mais rendimento, pelo menos 40 a 45% mais rendimento, pelo menos 45 a 50% mais rendimento, pelo menos 50 a 55% mais rendimento, pelo menos 55- a 60% mais rendimento, pelo menos 60 a 65% mais rendimento, pelo menos 65 a 70% mais rendimento, pelo menos 70 a 75% mais rendimento, pelo menos 80 a 85% mais rendimento, pelo menos 85 a 90% mais rendi-mento, pelo menos 90 a 95% mais rendimento, pelo menos 95 a 100% mais rendimento, ou até mesmo mais que 100% mais rendimento, ou mesmo mais que 200% mais rendimento, ou mesmo mais que 300% mais rendimento, ou mesmo mais que 400% mais rendimento ou mesmo mais que 500% mais rendimento, quando comparado com plantas de cultivo cultivadas em condições normais durante uma estação de crescimento média.

[0250] Em uma modalidade relacionada, a planta associada ao en- dófito é colhida a partir de um ambiente com rendimento médio de co-lheita superior ao rendimento médio ideal da planta de cultivo, 2 a 500% mais rendimento do que a média, 2 a 400% mais rendimento do que a média, 2 a 300% mais rendimento do que a média, 2 a 200% mais ren-dimento do que a média, 2 a 95% mais rendimento do que a média, por exemplo, pelo menos 5 a 90% mais rendimento, pelo menos 10 a 85% mais rendimentos, pelo menos 15 a 80% mais rendimento, pelo menos 20 a 75% mais rendimento, pelo menos 25 a 70% mais rendimento, pelo menos 30 a 65% mais rendimento, pelo menos 35 a 60% mais ren-dimento, pelo menos 40 a 55% mais rendimento, pelo menos 45 a 50% de rendimento, quando comparado com plantas cultivadas em condições normais durante uma estação de crescimento média.

[0251] Em uma outra modalidade, a planta associada ao endófito é colhida de um ambiente onde o solo contém nitrogênio total mais baixo do que os níveis ideais recomendados para atingir o rendimento médio das culturas para uma planta cultivada sob práticas de cultivo normais em terras agrícolas normais, por exemplo, 2 a 5% menos nitrogênio do que a média, por exemplo, pelo menos 5 a 10% menos nitrogênio, pelo menos 10 a 15% menos nitrogênio, pelo menos 15 a 20% menos nitrogênio, pelo menos 20 a 25% menos nitrogênio, pelo menos 25 a 30% menos nitrogênio, pelo menos 30 a 35% menos nitrogênio, pelo menos 35 a 40% menos nitrogênio, pelo menos 40-45% menos nitrogênio, pelo menos 45-50% menos nitrogênio, pelo menos 50 a 55% menos nitrogênio, pelo menos 55 a 60% menos nitrogênio, pelo menos 60 a 65% menos nitrogênio, pelo menos 65 a 70% menos nitrogênio, pelo menos 70-a 75% menos nitrogênio, pelo menos 80-85% menos nitrogênio, pelo menos 85 a 90% menos nitrogênio, pelo menos 90 a 95% menos nitrogênio, ou menos, quando comparado com plantas de cultivo cultivadas em condições normais durante uma estação de crescimento média.

[0252] Em outra modalidade, a planta associada ao endófito é colhida de um ambiente onde o solo contém nitrogênio total mais alto do que os níveis ideais recomendados para atingir o rendimento médio das culturas para uma planta cultivada sob práticas de cultivo normais em terras agrícolas normais, por exemplo, 2 a 5% mais nitrogênio do que a média, por exemplo, pelo menos 5 a 10% mais nitrogênio, pelo menos 10 a 15% mais nitrogênio, pelo menos 15 a 20% mais nitrogênio, pelo menos 20 a 25% mais nitrogênio, pelo menos 25 a 30% mais nitrogênio, pelo menos 30 a 35% mais nitrogênio, pelo menos 35 a 40% mais nitrogênio, pelo menos 40 a 45% mais nitrogênio, pelo menos 45 a 50% de nitrogênio, pelo menos 50 a 55% mais nitrogênio, pelo menos 55 a 60% mais nitrogênio, pelo menos 60 a 65% mais nitrogênio, pelo menos 65 a 70% mais nitrogênio, pelo menos 70 a 75% mais nitrogênio, pelo menos 80 a 85% mais nitrogênio, pelo menos 85 a 90% mais nitrogênio, pelo menos 90 a 95% mais nitrogênio, pelo menos 95 a 100% mais nitrogênio ou até mesmo mais que 100% mais nitrogênio ou mesmo mais que 200% mais nitrogênio ou mesmo mais que 300% mais nitrogênio, ou mesmo mais que 400% mais nitrogênio, ou mesmo mais que 500% mais nitrogênio, quando comparado com plantas de cultivo cultivadas em condições normais durante uma estação de crescimento média.

[0253] Em uma outra modalidade, a planta associada ao endófito é colhida de um ambiente onde o solo contém menos fósforo total do que os níveis ideais recomendados para atingir os rendimentos médios das culturas para uma planta cultivada em práticas de cultivo normais em terras agrícolas normais, por exemplo, 2 a 5% menos de fósforo do que a média, por exemplo, pelo menos 5 a 10% menos de fósforo, pelo menos 10 a 15% menos de fósforo, pelo menos 15 a 20% menos de fósforo, pelo menos 20 a 25% menos de fósforo, pelo menos 25 a 30% menos de fósforo, pelo menos 30 a 35% menos de fósforo, pelo me- nos 35 a 40% menos de fósforo, pelo menos 40 a 45% menos de fósforo, pelo menos 45 a 50% menos de fósforo, pelo menos 50 a 55% menos de fósforo, pelo menos, 55 a 60% menos de fósforo, pelo menos 60 a 65% menos de fósforo, pelo menos 65 a 70% menos de fósforo, pelo menos 70 a 75% menos de fósforo, pelo menos 80 a 85% menos de fósforo, pelo menos 85 a 90% menos de fósforo, pelo menos 9 a 95% menos de fósforo, ou menos, quando comparado com plantas de cultivo cultivadas em condições normais durante uma estação de crescimento média.

[0254] Em uma outra modalidade, a planta associada ao endófito é colhida de um ambiente onde o solo contém mais fósforo total do que os níveis ideais recomendados para atingir o rendimento médio das culturas para uma planta cultivada sob práticas de cultivo normais em terras agrícolas normais, por exemplo, 2 a 5% mais de fósforo do que a média, por exemplo, pelo menos 5 a 10% mais de fósforo, pelo menos 10 a 15% mais de fósforo, pelo menos 15 a 20% mais de fósforo, pelo menos 20 a 25% mais de fósforo, pelo menos 25 a 30% mais de fósforo, pelo menos 30 a 35% mais de fósforo, pelo menos 35 a 40% mais de fósforo, pelo menos 40 a 45% mais de fósforo, pelo menos 45 a 50% mais de fósforo, pelo menos 50 a 55% mais de fósforo, pelo menos, 55 a 60% mais de fósforo, pelo menos 60 a 65% mais de fósforo, pelo menos 65 a 70% mais de fósforo, pelo menos 70 a 75% mais de fósforo, pelo menos 80 a 85% mais de fósforo, pelo menos 85 a 90% mais de fósforo, pelo menos 90 a 95% mais fósforo, pelo menos 95 a 100% mais de fósforo, ou até mesmo mais que 100% mais de fósforo, ou mesmo mais que 200% mais de fósforo, ou mesmo mais que 300% mais de fósforo, ou mesmo mais que 400% mais de fósforo ou mesmo mais que 500% mais de fósforo, quando comparado com plantas de cultivo cultivadas em condições normais durante uma estação de crescimento média.

[0255] Em outra modalidade, a planta associada ao endófito é colhida de um ambiente onde o solo contém potássio total mais baixo do que os níveis ideais recomendados para alcançar o rendimento médio das culturas para uma planta cultivada sob práticas de cultivo normais em terras agrícolas normais, por exemplo, 2 a 5% menos de potássio do que a média, por exemplo, pelo menos 5 a 10% menos de potássio, pelo menos 10 a 15% menos de potássio, pelo menos 15 a 20% menos de potássio, pelo menos 20 a 25% menos de potássio, pelo menos 25 a 30% menos de potássio, pelo menos 30 a 35% menos de potássio, pelo menos 35 a 40% menos de potássio, pelo menos 40 a 45% menos de potássio, pelo menos 45 a 50% menos de potássio, pelo menos 50 a 55% menos de potássio, menos 55 a 60% menos de potássio, pelo menos 60 a 65% menos de potássio, pelo menos 65 a 70% menos de potássio, pelo menos 70 a 75% menos de potássio, pelo menos 80 a 85% menos de potássio, pelo menos 85 a 90% menos de potássio, pelo menos 90 a 95% menos de potássio, ou menos, quando comparado com plantas de cultivo cultivadas em condições normais durante uma estação de crescimento média.

[0256] Em uma outra modalidade, a planta associada ao endófito é colhida de um ambiente onde o solo contém potássio total mais elevado do que os níveis ideais recomendados para atingir o rendimento médio das culturas para uma planta cultivada em práticas de cultivo normais em terras agrícolas normais, por exemplo, 2 a 5% mais de potássio do que a média, por exemplo, pelo menos 5 a 10% mais de potássio, pelo menos 10 a 15% mais de potássio, pelo menos 15 a- 20% mais de potássio, pelo menos 20 a 25% mais de potássio, pelo menos 25 a 30% mais de potássio, pelo menos 30 a 35% mais de potássio, pelo menos 35 a 40% mais de potássio, pelo menos 40 a 45% mais de potássio, pelo menos 45 a 50% mais de potássio, pelo menos 50 a 55% mais de potássio, pelo menos 55 a 60% mais de potássio, pelo menos 60 a 65% mais de potássio, pelo menos 65 a 70% mais de potássio, pelo menos 70 a 75% mais de potássio, pelo menos 80 a 85% mais de potássio, pelo menos 85 a 90% mais de potássio, pelo menos 90 a 95% mais de potássio, pelo menos 95 a 100% mais de potássio, ou até mesmo maios que 100% mais de potássio, ou mesmo mais que 200% mais de potássio, ou mesmo mais que 300% mais de potássio, ou mesmo mais que 400% mais de potássio, ou mesmo mais que 500% mais de potássio, quando comparado com plantas de cultivo cultivadas em condições normais durante uma estação de crescimento média.

[0257] Em outra modalidade, a planta associada ao endófito é colhida de um ambiente onde o solo contém menos teor de enxofre total do que os níveis ideais recomendados para atingir o rendimento médio das culturas para uma planta cultivada em práticas de cultivo normais em terras agrícolas normais, por exemplo, 2 a 5% menos de enxofre do que a média, por exemplo, pelo menos 5 a 10% menos de enxofre, pelo menos 10 a 15% menos de enxofre, pelo menos 15 a 20% menos de enxofre, pelo menos 20 a 25% menos de enxofre, pelo menos 25 a 30% menos de enxofre, pelo menos 30 a 35% menos de enxofre, pelo menos 35 a 40% menos de enxofre, pelo menos 40 a 45% menos de enxofre, pelo menos 45 a 50% menos de enxofre, pelo menos 50 a 55% menos de enxofre, pelo menos 55 a 60% menos de enxofre, pelo menos 60 a 65% menos de enxofre, pelo menos 65 a 70% menos de enxofre, pelo menos 70 a 75% menos de enxofre, pelo menos 80 a 85% menos de enxofre, pelo menos 85 a 90% menos enxofre, pelo menos 90 a 95% menos de enxofre, ou menos, quando comparado com plantas de cultivos cultivadas em condições normais durante uma estação de crescimento média.

[0258] Em uma outra modalidade, a planta associada ao endófito é colhida de um ambiente onde o solo contém mais enxofre total do que os níveis ideais recomendados para atingir o rendimento médio das culturas para uma planta cultivada sob práticas de cultivo normais em terras agrícolas normais, por exemplo, 2 a 5% mais de enxofre do que a média, por exemplo, pelo menos 5 a 10% mais de enxofre, pelo menos 10 a 15% mais de enxofre, pelo menos 15 a 20% mais de enxofre, pelo menos 20 a 25% mais de enxofre, pelo menos 25 a 30% mais de enxofre, pelo menos 30 a 35% mais de enxofre, pelo menos 35 a 40% mais de enxofre, pelo menos 40 a 45% mais de enxofre, pelo menos 45 a 50% mais de enxofre, pelo menos 50 a 55% mais de enxofre, pelo menos 55 a 60% mais de enxofre, pelo menos 60 a 65% mais de enxofre, pelo menos 65 a 70% mais de enxofre, pelo menos 70 a 75% mais de enxofre, pelo menos 80 a 85% mais de enxofre, pelo menos 85 a 90% mais enxofre, pelo menos 90 a 95% mais de enxofre, pelo menos 95 a 100% mais de enxofre, ou até mesmo mais que 100% mais de enxofre, ou mesmo mais que 200% mais de enxofre ou mesmo mais que 300% mais de enxofre ou mesmo mais que 400% mais de enxofre, ou mesmo mais que 500% mais de enxofre, quando comparado com plantas cultivadas em condições normais durante uma estação de crescimento média.

[0259] Em uma outra modalidade, a planta associada a endófitos é colhida de um ambiente onde o solo contém menos cálcio total do que os níveis ideais recomendados para atingir o rendimento médio das culturas para uma planta cultivada sob práticas de cultivo normais em terras agrícolas normais, por exemplo, 2 a 5% menos cálcio do que a média, por exemplo, pelo menos 5 a 10% menos cálcio, pelo menos 10 a 15% menos cálcio, pelo menos 15 a 20% menos cálcio, pelo menos 20 a 25% menos cálcio, pelo menos 25 a 30% menos cálcio, pelo menos 30 a 35% menos cálcio, pelo menos 35 a 40% menos cálcio, pelo menos 40 a 45% menos cálcio, pelo menos 45 a 50% menos cálcio, pelo menos 50 a 55% menos cálcio, pelo menos 55 a 60% me- nos cálcio, pelo menos 60 a 65% menos cálcio, pelo menos 65 a 70% menos cálcio, pelo menos 70 a 75% menos cálcio, pelo menos 80 a 85% menos cálcio, pelo menos 85 a 90% menos cálcio, pelo menos 90 a 95% menos de cálcio, ou menos, quando comparado com plantas cultivadas em condições normais durante uma estação de crescimento média.

[0260] Em uma outra modalidade, a planta associada ao endófito é colhida de um ambiente onde o solo contém menos magnésio total do que os níveis ideais recomendados para atingir o rendimento médio das culturas para uma planta cultivada sob práticas de cultivo normais em terras agrícolas normais, por exemplo, 2 a 5% menos de magnésio do que a média, por exemplo, pelo menos 5 a 10% menos de magnésio, pelo menos 10 a 15% menos de magnésio, pelo menos 15 a 20% menos de magnésio, pelo menos 20 a 25% menos de magnésio, pelo menos 25 a 30% menos de magnésio, pelo menos 30 a 35% menos de magnésio, pelo menos 35 a 40% menos de magnésio, pelo menos 40 a 45% menos de magnésio, pelo menos 45 a 50% menos de magnésio, pelo menos 50 a 55% menos de magnésio, pelo menos 55 a 60% menos de magnésio, pelo menos 60 a 65% menos de magnésio, pelo menos 65 a 70% menos de magnésio, pelo menos 70 a 75% menos de magnésio, pelo menos 80 a 85% menos de magnésio, pelo menos 85 a 90% menos de magnésio, pelo menos 90 a 95% menos de magnésio, ou menos, quando comparado com plantas de cultivo cultivadas em condições normais durante uma estação de crescimento média.

[0261] Em outra modalidade, a planta associada ao endófito é colhida de um ambiente onde o solo contém mais cloreto de sódio total (sal) do que os níveis ideais recomendados para atingir o rendimento médio das culturas para uma planta cultivada sob práticas de cultivo normais em terras agrícolas normais, por exemplo, 2 a 5% mais de sal do que a média, por exemplo, pelo menos 5 a 10% mais de sal, pelo menos 10 a 15% mais de sal, pelo menos 15 a 20% mais de sal, pelo menos 20 a 25% mais de sal, pelo menos 25 a 30% mais de sal, pelo menos 30 a 35% mais de sal, pelo menos 35 a 40% mais de sal, pelo menos 40 a 45% mais de sal, pelo menos 45 a 50% mais de sal, pelo menos 50 a 55% mais de sal, pelo menos 55 a 60% mais de sal, pelo menos 60 a 65% mais de sal, pelo menos 65 a 70% mais de sal, pelo menos 70 a 75% mais de sal, pelo menos 80 a 85% mais de sal, pelo menos 85 a 90% mais de sal, pelo menos 90 a 95% mais de sal, pelo menos 95 a 100% mais de sal, ou até mesmo mais que 100% mais de sal, ou mesmo mais que 200% mais de sal, ou mesmo mais que 300% mais de sal ou mesmo mais que 400% mais de sal, ou mesmo mais que 500% mais de sal, em comparação com plantas de cultivo cultivadas em condições normais durante uma estação de crescimento média. Relocalização de endófitos

[0262] Em algumas modalidades, uma cepa de endófito único ou uma pluralidade de endófitos que são usados para tratar um elemento de planta são capazes de se localizar em um tecido diferente da planta, independentemente da fonte original do endófito. Por exemplo, o endófito pode ser capaz de se localizar em qualquer um dos tecidos da planta, incluindo: raiz, raiz acidentada, raiz seminal, pelo da raiz, rebento, folha, flor, broto, pendão, meristema, pólen, pistilo, ovários, estame, fruta, estólon, rizoma, nódulo, tubérculo, tricômio, células de guarda, hidatoide, pétala, Sepal, gluma, ráquis, cambium vascular, flo- ema e xilema. Em uma modalidade, o endófito é capaz de localizar a raiz e/ou os pelos radiculares da planta. Em uma outra modalidade, o endófito é capaz de se localizar aos tecidos fotossintéticos, por exemplo, folhas e rebentos da planta. Em outros casos, o endófito é localizado nos tecidos vasculares da planta, por exemplo, no xilema e no floema. Ainda em outra modalidade, o endófito é capaz de se localizar aos tecidos reprodutivos (flor, pólen, pistilo, ovários, estames, frutos) da planta. Em outra modalidade, o endófito é capaz de localizar a raiz, os rebentos, as folhas e os tecidos reprodutivos da planta. Em ainda uma outra modalidade, o endófito coloniza uma fruta ou tecido de semente da planta. Em ainda uma outra modalidade, o endófito é capaz de colonizar a planta de modo que esteja presente na superfície da planta (isto é, a presença dele é detectável no exterior da planta ou no episfério da planta). Em ainda outras modalidades, o endófito é capaz de localizar substancialmente todos, ou todos, os tecidos da planta. Em certas modalidades, o endófito não está localizado na raiz de uma planta. Em outros casos, o endófito não está localizado nos tecidos fotossintéticos da planta. Endófitos capazes de alterar o metaboloma, epigenômetro ou transcriptoma de plantas

[0263] Os endófitos úteis para a invenção também podem ser classificados de acordo com as mudanças conferidas à planta. Por exemplo, o endófito pode alterar o estado hormonal ou os níveis de produção hormonal na planta, o que, por sua vez, pode afetar muitos parâmetros fisiológicos, incluindo o tempo de floração, a eficiência da água, a dominância apical e/ou a ramificação lateral, o aumento do pelo radicular e a alteração na maturação dos frutos. O endófito também pode introduzir outras alterações na planta, incluindo os perfis bioquímicos, metabolômicos, proteômicos, genômicos, epigenômicos e/ou transcriptômicos de plantas associadas a endófi- tos, podem ser comparados com plantas agrícolas de referência nas mesmas condições.

[0264] As diferenças metabólicas entre as plantas podem ser detectadas usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, uma amostra biológica (tecido inteiro, exsudato, seiva de floema, seiva de xilema, exsudato de raiz, etc.) das plantas agrícolas associadas ao endófito e de referência pode ser analisada essencialmente como des-crito em Fiehn et al. ,(2000) Nature Biotechnol. ,18, 1157-1161, ou Ro- essner et al., (2001) Plant Cell, 13, 11-29. Tais métodos metabolômi- cos podem ser usados para detectar diferenças em níveis de hormônio, nutrientes, metabolitos secundários, exsudatos radiculares, conteúdo de seiva do floema, conteúdo de seiva de xilema, conteúdo de metal pesado e semelhantes. Tais métodos também são úteis para detectar alterações no conteúdo e status microbiano; por exemplo, a presença e os níveis de moléculas de sinalização de bactérias/fungos (por exemplo, autoindutores e feromonas), que podem indicar o estado do comportamento baseado em grupo de endófitos com base, por exemplo, na população de plantas agrícolas de endófitos e de referência também podem ser realizadas para detectar mudanças na expressão de pelo menos uma transcrição, ou um conjunto ou rede de genes após a associação de endófitos. Da mesma forma, mudanças epigené- ticas podem ser detectadas usando imunoprecipitação com DNA meti- lado seguido de sequenciamento de alto rendimento. Combinações de endófitos

[0265] As combinações de endófitos podem ser selecionadas por qualquer um ou mais de vários critérios. Em uma modalidade, os endó- fitos compatíveis são selecionados. Tal como aqui utilizado, "compati-bilidade" se refere a populações de endófitos que não interferem signi-ficativamente no crescimento, na propagação e/ou na produção de substâncias benéficas do outro. Podem surgir populações de endófitas incompatíveis, por exemplo, onde uma das populações produz ou secreta um composto que é tóxico ou prejudicial ao crescimento da(s) outra(s) população(ões). A incompatibilidade resultante da produção de compostos/agentes deletérios pode ser detectada utilizando métodos conhecidos na técnica, e como descrito aqui em outro lugar. Da mesma forma, as populações distintas podem competir por recursos limitados de forma a tornar a coexistência difícil.

[0266] Em uma outra modalidade, as combinações são selecionadas com base em compostos produzidos por cada população de endó- fitos. Por exemplo, a primeira população é capaz de produzir siderófo- ros, e a outra população é capaz de produzir compostos antifúngicos. Em uma modalidade, a primeira população de endófitos ou componentes endofíticos é capaz de uma função selecionada do grupo que consiste em produção de auxina, fixação de nitrogênio e produção de um composto antimicrobiano, produção de sideróforo, solubilização de fos-fato mineral, produção de celulase, produção de quitinase, produção de xilanase e produção de acetoína, utilização da fonte de carbono e combinações dos mesmos. Em outra modalidade, a segunda população de endófitos ou componente endofítico é capaz de uma função selecionada do grupo que consiste em produção de auxina, fixação de nitrogênio, produção de um composto antimicrobiano, produção de si- deróforo, solubilização de fosfato mineral, produção de celulase, pro-dução de quitinase, produção de xilanase, e produção de acetona, e combinações dos mesmos. Em ainda uma outra modalidade, a primeira e a segunda populações são capazes de pelo menos uma função diferente.

[0267] Em ainda uma outra modalidade, as combinações de en- dófitos são selecionadas por sua localização distinta na planta após a colonização. Por exemplo, a primeira população de endófitos ou componentes endofíticos pode colonizar e, em alguns casos, colonizar preferencialmente, o tecido radicular, enquanto uma segunda população pode ser selecionada com base em sua colonização preferencial das partes aéreas da planta agrícola. Portanto, em uma modalidade, a primeira população é capaz de colonizar um ou mais dos tecidos selecionados do grupo consistindo em uma raiz, reben to, folha, flor e semente. Em uma outra modalidade, a segunda população é capaz de colonizar um ou mais tecidos selecionados do grupo que consiste em raiz, rebento, folha, flor e semente. Em ainda uma outra modalidade, a primeira e a segunda populações são capazes de colonizar um tecido diferente dentro da planta agrícola.

[0268] Em algumas modalidades, as combinações de endófitos são selecionadas por sua capacidade de conferir um benefício à planta hospedeira em diferentes pontos no ciclo de vida da referida planta hospedeira. Em um exemplo, um endófito pode ser selecionado para conferir vigor de semente melhorado, e um segundo en- dófito pode ser selecionado para melhorar a aquisição de nutrientes do solo pelas raízes da planta madura.

[0269] Em ainda uma outra modalidade, as combinações de en- dófitos são selecionadas por sua capacidade de conferir uma ou mais características distintas de aptidão na planta agrícola inoculada, individualmente ou em associação sinérgica com outros endófi- tos. Em uma outra modalidade, um endófito pode induzir a colonização de um segundo endófito. Alternativamente, dois ou mais endófi- tos podem induzir a colonização de um terceiro endófito. Por exemplo, a primeira população de endófitos ou componentes endofíticos é selecionada com base em que confere um aumento significativo na biomassa, enquanto a segunda população promove o aumento da tolerância à seca na planta agrícola inoculada. Portanto, em uma modalidade, a primeira população é capaz de conferir pelo menos uma característica selecionada do grupo que consiste em tolerância térmica, tolerância a herbicidas, resistência à seca, resistência a insetos, resistência a fungos, resistência a vírus, resistência a bactérias, esterilidade masculina, tolerância ao frio, tolerância ao sal, aumento do rendimento, maior eficiência no uso de nutrientes, aumento da eficiência do uso de nitrogênio, aumento do teor de carboidra- tos fermentáveis, menor teor de lignina, aumento do teor de antioxi- dantes, maior eficiência de uso da água, aumento do vigor, aumento da eficiência de germinação, floração precoce ou aumentada, aumento da biomassa, razão de biomassa raiz-para-broto alterada, retenção de água do solo melhorada ou uma combinação dos mesmos. Em outra modalidade, a segunda população é capaz de conferir uma característica selecionada do grupo que consiste em tolerância térmica, tolerância a herbicidas, resistência à seca, resistência a insetos, resistência a fungos, resistência a vírus, resistência a bactérias, esterilidade masculina, tolerância ao frio, tolerância ao sal, rendimento aumentado, maior eficiência de uso de nutrientes, aumento da eficiência do uso de nitrogênio, aumento do teor de carboidratos fermentáveis, menor teor de lignina, aumento do teor de antioxidan- tes, maior eficiência de uso da água, aumento do vigor, aumento da eficiência de germinação, floração precoce ou aumentada, aumento da biomassa, taxa de biomassa raiz-para-broto alterada, e retenção de água no solo melhorada. Em ainda uma outra modalidade, cada uma da primeira e da segunda populações é capaz de conferir uma característica diferente selecionada do grupo que consiste em tolerância térmica, tolerância a herbicidas, resistência à seca, resistência a insetos, resistência a fungos, resistência a vírus, resistência a bactérias, esterilidade masculina, tolerância ao frio, tolerância ao sal, aumento do rendimento, maior eficiência no uso de nutrientes, aumento da eficiência do uso de nitrogênio, aumento do teor de carboidratos fermentáveis, menor teor de lignina, aumento do teor de antioxidantes, maior eficiência de uso da água, aumento do vigor, aumento da eficiência de germinação, floração precoce ou aumentada, aumento da biomassa, razão de biomassa raiz-para-broto alterada e retenção de água do solo melhorada.

[0270] As combinações de endófitos também podem ser selecio- nadas com base em combinações dos critérios acima. Por exemplo, a primeira população de endófitos pode ser selecionada com base no composto que produz (por exemplo, sua capacidade de fixar o nitrogênio, fornecendo assim uma fonte potencial de nitrogênio para a planta), enquanto a segunda população pode ser selecionada com base na sua capacidade de conferir maior resistência da planta a um patógeno (por exemplo, um patógeno fúngico).

[0271] Em algumas modalidades da presente invenção, é contemplado que as combinações de endófitos podem proporcionar um benefício aumentado para a planta hospedeira, em comparação com o conferido por um único endófito, em virtude de efeitos aditivos. Por exemplo, uma cepa endófita que induz um benefício na planta hospedeira pode induzir esse benefício igualmente bem em uma planta que também é colonizada com uma cepa endófita diferente que também induz o mesmo benefício na planta hospedeira. A planta hospedeira apresenta assim o mesmo benefício total da combinação de diferentes cepas de endófitos, como o benefício aditivo para plantas individuais colonizadas com cada endófito individual da combinação. Em um exemplo, uma planta é colonizada com duas cepas endófitas diferentes:uma fornece um aumento de 1X na bio-massa quando associada à planta e a outra fornece um aumento de 2X na biomassa quando associada a uma planta diferente. Quando ambas as cepas de endófitos estão associadas à mesma planta, essa planta experimentaria um aumento de 3X (aditivo de efeitos únicos de 1X + 2X) na biomassa de auxina. Os efeitos aditivos são uma modalidade surpreendente da presente invenção, uma vez que a não compatibilidade de endófitos pode resultar em um cancelamento dos efeitos benéficos de ambos os endófitos.

[0272] Em algumas modalidades da presente invenção, é contemplado que uma combinação de endófitos podem proporcionar um benefício aumentado para a planta hospedeira, em comparação com o conferido por um único endófito, em virtude de efeitos sinergéticos. Por exemplo, uma cepa endófita que induz um benefício na planta hospedeira pode induzir esse benefício além dos efeitos aditivos em uma planta que também é colonizada com uma cepa endó- fita diferente que também induz aquele benefício na planta hospedeira. A planta hospedeira apresenta assim maior benefício total da combinação de diferentes cepas de endófitos, que poderia ser visto a partir do benefício aditivo de plantas individuais colonizadas com cada endófito individual da combinação. Em um exemplo, uma planta é colonizada com duas cepas endófitas diferentes:uma fornece um aumento de 1X na biomassa quando associada a uma planta e a outra fornece um aumento de 2X na biomassa quando associada a uma planta diferente. Quando ambas as cepas de endófitos estão associadas à mesma planta, essa planta experimentaria um aumento de 5X (maior do que a de um aditivo de efeitos únicos de 1X + 2X) na biomassa. Os efeitos sinérgicos são uma modalidade surpreendente da presente invenção. Inoculação com endófitos múltiplos

[0273] Em uma outra modalidade, a presente invenção contempla métodos de revestimento de um elemento de planta, por exemplo, uma semente de uma planta, com uma pluralidade de endófitos, bem como composições sintéticas compreendendo uma pluralidade de endófitos sobre e/ou no elemento de planta. Os métodos de acordo com esta modalidade podem ser realizados de uma maneira semelhante à descrita aqui para revestimento de endófito único. Em um exemplo, vários endófitos podem ser preparados em uma única preparação que é revestida sobre o elemento da planta, por exemplo, uma semente. Os endófitos podem ser de origem comum (ou seja, uma mesma planta). Alternativamente, os endófitos podem ser de plantas diferentes.

[0274] Onde endófitos múltiplos são revestidos em um elemento de planta, cada endófito pode ser uma bactéria. Em alternativa, cada endófito pode ser um fungo. Em ainda uma outra modalidade, uma pluralidade de endófitos bacterianos e fúngicos podem ser revestidos sobre a superfície de um elemento de planta.

[0275] Quando uma pluralidade de endófitos são revestidos sobre o elemento da planta, qualquer um ou todos os endófitos podem ser capazes de conferir uma característica benéfica à planta hospedeira. Em alguns casos, todos os endófitos são capazes de conferir uma característica benéfica à planta hospedeira. A característica conferida por cada um dos endófitos pode ser a mesma (por exemplo, melhorar a tolerância da planta hospedeira a um tensão biótica particular), ou pode ser distinta (por exemplo, melhora a tolerância da planta hospedeira à seca, enquanto outra melhora a utilização de fosfato). Em outros casos, o traço conferido pode ser o resultado de interações entre os endófitos.

[0276] Em uma modalidade, uma planta agrícola é contatada com uma formulação compreendendo pelo menos duas entidades microbianas endofíticas. Exemplos específicos de pares de entidades microbianas endofíticas que podem ser aplicadas a uma planta agrícola incluem, por exemplo, um par de micróbios endofíticos contendo sequências de ácido nucleico que são, pelo menos, 97% idênticas à sequência de ácido nucleico selecionada dos grupos fornecidos na Tabela 1, Tabela 2, Tabela 7 e Tabela 8. Isolamento de endófitos

[0277] De acordo com a presente invenção, os endófitos são isolados a partir de um elemento de planta, por exemplo, uma semente de uma planta. Uma vez que os endófitos são capazes de viver e/ou residir dentro da planta ou parte da planta (incluindo a semente), a natureza endofítica de um micróbio pode distinguir-se dos micróbios associados à superfície por sua resistência às técnicas de esterilização superficial. Portanto, em uma modalidade, os endófitos são isolados dos elementos de planta após a superfície do elemento de planta ser esterilizada por contato com agentes antimicrobianos não específicos, tais como hipoclorito de sódio, peróxido de hidrogênio, oxicloreto de cobre, hidróxido de cobre, sulfato de cobre, clorotalonil, óxido cuproso, estreptomicina, carbonato de amônio de cobre, complexo diacetato de cobre, octanoato de cobre, oxitetraciclina, fosetil- AL ou cloropicrina, em uma solução aquosa e também opcionalmente incluindo detergentes, tais como SDS, triton X-100, tween 20, podem ser utilizados. Além disso, as sementes secas podem ser embebidas em solventes orgânicos tais como etanol, por exemplo, 50% a 90% de etanol. Agentes antibacterianos ou antifúngicos (por exemplo, captam, manebe, tiram, fludioxonil, etc.), particularmente aqueles que não penetram no elemento de planta, também podem ser usados. Em geral, os elementos de planta são embebidos em uma solução aquosa ou formulação comercial contendos um ou mais destes compostos durante 30 segundos a 12 horas em um recipiente de plástico. Após a esterilização da superfície, o elemento de planta é removido da formulação antibacteriana e lavado 3-5 vezes com água destilada estéril. Em uma modalidade alternativa, na qual o elemento da planta é uma semente, o revestimento da semente pode ser removido sob condições estéreis e os micróbios dentro da semente isolados e caracterizados.

[0278] Uma vez que os micróbios residenciais de superfície são removidos, os micróbios sobreviventes presentes no elemento de planta são geralmente considerados endófitos. Esses endófitos podem ser uma bactéria ou um fungo e podem ser isolados homogeneizando as sementes esterilizadas superficiais e colocando o homoge- neizado em condições que permitem o crescimento do micróbio. Por-tanto, a perda de viabilidade dos micróbios após a esterilização su-perficial indica que os micróbios estão quase exclusivamente localizados na superfície da semente. Em contraste, a resistência da população de micróbios a tais métodos de esterilização de elementos de planta indica uma localização interna dos micróbios. Alternativamente, a presença de DNA microbiano após esterilização superficial com agentes que reticulam ou de outra forma destroem DNA pode ser detectada usando métodos sensíveis de detecção, como a PCR, para estabelecer a presença do micróbio no elemento de planta. Crescimento dos endófitos

[0279] A viabilidade do micróbio pode ser testada após a esterilização da superfície do elemento de planta, ou após a remoção do revestimento da semente, homogeneizando o elemento de planta e colocando o homogeneizado em condições que promovam o crescimento do micróbio. Em alternativa, a presença de micróbios pode ser detectada visualmente ou microscopicamente se os micróbios puderem formar uma colônia visível por essa inspeção. Os reagentes também estão disponíveis para a detecção de micróbios:A coloração de anilina azul pode ser utilizada para detectar hifas, outros ensaios são conhecidos na técnica.

[0280] Os endófitos podem exigir condições especiais para permitir o crescimento isoladamente. Uma série de meios de crescimento diferentes podem ser usados para cultivar os endófitos. Detalhes adicionais do crescimento do endófito são descritos nas seções dos exemplos. Atributos funcionais dos endófitos

[0281] Em alguns casos, uma cepa de endófito único, uma pluralidade de endófitos ou cada tipo individual de endófitos dessa pluralidade podem produzir um ou mais compostos e/ou ter uma ou mais atividades, por exemplo, um ou mais dos seguintes:produção de um metabolito, produção de um fitormônio, como auxina, produção de acetoína, produção de um composto antimicrobiano, produção de um sideróforo, produção de celulase, produção de pectinase, produção de quitinase, produção de xilanase, fixação de nitrogênio, ou solubilização de fosfatos minerais. Por exemplo, um endófito pode produzir um fitormônio selecionado do grupo que consiste em uma auxina, uma citoquinina, uma giberelina, etileno, um brassinosteroi- de e ácido abscísico. Em algumas modalidades, o endófito produz auxina (por exemplo, ácido indol-3-acético (IAA)). A produção de auxina pode ser ensaiada como aqui descrito. Muitos dos micróbios aqui descritos são capazes de produzir o ácido hormonal de auxina indol-3-acético (IAA) quando cultivado em cultura. A auxina desempenha um papel fundamental na alteração da fisiologia da planta, incluindo a extensão do crescimento radicular. Portanto, em outras modalidades, os endófitos são dispostos na superfície ou dentro de um tecido do elemento de planta em uma quantidade eficaz para aumentar de forma detectável a produção de auxina na planta agrícola em comparação com uma planta agrícola de referência. Em algumas modalidades, a produção aumentada de auxina pode ser detectada em um tipo de tecido selecionado do grupo que consiste em raiz, rebento, folhas e flores.

[0282] Em algumas modalidades, uma cepa de endófito único, uma pluralidade de endófitos ou cada tipo de endófitos individuais dessa pluralidade podem produzir um composto com propriedades antimicrobianas. Por exemplo, o composto pode ter propriedades antibacterianas, conforme determinado pelos ensaios de crescimento aqui proporcionados. Em algumas modalidades, o composto com propriedades antibacterianas mostra atividade bacteriostática ou bactericida contra E. coli e/ou Bacillus sp. Em outras modalidades, o endófito produz um composto com propriedades antifúngicas, por exemplo, atividade fungicida ou fungistática contra S. cerevisiae e/ou Rhizoctonia.

[0283] Em algumas modalidades, uma cepa de endófito único, uma pluralidade de endófitos ou cada tipo de endófitos individuais dessa pluralidade é capaz de fixar nitrogênio e, portanto, é capaz de produzir amônio a partir de nitrogênio atmosférico. A capacidade dos endófitos para fixar o nitrogênio pode ser confirmada testando o crescimento do fungo em meio de crescimento livre de nitrogênio, por exemplo, meio LGI, como aqui descrito.

[0284] Em algumas modalidades, uma cepa de endófito único, uma pluralidade de endófitos ou cada tipo de endófitos individuais dessa pluralidade podem produzir um composto que aumenta a solubilidade do fosfato mineral no meio, isto é, solubilização de fosfato mineral, por exemplo, usando ensaios de crescimento conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, os endófitos produzem um composto que permite que a bactéria cresça em meios de crescimento compreendendo Ca3HPO4 como única fonte de fosfato.

[0285] Em algumas modalidades, uma cepa de endófito único, uma pluralidade de endófitos ou cada tipo de endófitos individuais dessa pluralidade podem produzir um sideróforo. Sideróforos são pequenos agentes quelantes de ferro de alta afinidade segregados por micro-organismos que aumentam a biodisponibilidade do ferro. A produção de sideróforo pelos endófitos pode ser detectada, por exemplo, utilizando métodos conhecidos na técnica.

[0286] Em algumas modalidades, uma cepa de endófito único, uma pluralidade de endófitos ou cada tipo de endófitos individuais dessa pluralidade podem produzir uma enzima hidrolítica. Por exemplo, em algumas modalidades, um endófito pode produzir uma enzima hidrolítica selecionada do grupo que consiste em uma celu- lase, uma pectinase, uma quitinase e uma xilanase. As enzimas hi- drolíticas podem ser detectadas utilizando os métodos conhecidos na técnica. Seleção de endófitos que confirem características benéficas

[0287] A presente invenção contempla a inoculação de plantas com micróbios. Conforme descrito anteriormente, os micróbios podem ser derivados de muitas espécies de plantas diferentes, de diferentes partes de plantas e de plantas isoladas em diferentes ambientes. Uma vez que um micróbio é isolado, ele pode ser testado quanto à sua capacidade de conferir um traço benéfico. Numerosos testes podem ser realizados tanto in vitro quanto in vivo para avaliar quais benefícios, se houver, são conferidos à planta. Em uma modalidade, um micróbio é testado in vitro para uma atividade selecionada do grupo que consiste em: liberação de fosfatos complexados, liberação de ferro complexado (por exemplo, através da secreção de sideróforos), produção de fitormônios, produção de compostos anti- bacterianos, produção de compostos antifúngicos, produção de compostos inseticidas, produção de compostos nematicidas, produção e/ou secreção de ACC desaminase, produção e/ou secreção de acetoína, produção e/ou secreção de pectinase, produção e/ou secreção de celulase, e produção e/ou secreção de RNAase. Métodos in vitro exemplificativos para o acima podem ser encontrados nas seções Exemplos abaixo.

[0288] Note-se que o teste inicial para as atividades listadas acima também pode ser realizado usando uma mistura de micróbios, por exemplo, uma comunidade de micróbios isolados de uma única planta. Uma leitura de atividade positiva usando essa mistura pode ser seguida com o isolamento de micróbios individuais dentro dessa população e repetindo os testes in vitro para as atividades para isolar o micróbio responsável pela atividade particular. Uma vez valida- do usando um único isolado de micróbios, a planta pode ser inoculada com um micróbio e o teste realizado in vivo, na câmara de crescimento ou em condições de estufa, e em comparação com uma planta de controle que não foi inoculada com o micróbio. Preparações de endófitos

[0289] É também descrita aqui uma preparação compreendendos um ou mais endófitos modificados isolados descritos acima. A preparação compreende ainda um veículo aceitável em agricultura, e a preparação compreende uma quantidade de endófitos suficientes para melhorar uma característica agronômica da população de sementes. Em uma modalidade, o endófito isolado é cultivado, por exemplo, em meio de crescimento semissintético ou sintético. Em uma modalidade, o endófito é fornecido como um pó, por exemplo, um pó liofili- zado. Em uma outra modalidade, o endófito é aplicado em suspensão a uma concentração adequada. A preparação de micróbios pode ser uma solução aquosa, uma emulsão óleo-em-água ou emulsão água- em-óleo contendo uma concentração mínima de um micróbio. Os micróbios estão presentes como células vivas, células viáveis, esporos ou micélios. Normalmente, a concentração é de pelo menos 104 CFU/ml ou esporos/ml, por exemplo, pelo menos 3 X 104 CFU/mL ou esporos/ml, pelo menos 105 CFU/mL ou esporos/ml, pelo menos 3 X 105 CFU/mL ou esporos/ml, pelo menos 106 CFU/mL ou esporos/ml, pelo menos 3 X 106 CFU/mL ou esporos/ml, pelo menos 107CFU/ml ou esporos/ml, pelo menos 3 X 107 CFU/mL ou esporos/ml, pelo menos 108 CFU/mL ou esporos/ml, 109 CFU/mL ou esporos/ml, ou mais. Em uma modalidade, a preparação é uma solução contendo um micróbio a uma concentração entre cerca de 105 CFU/mL ou esporos/ml e cerca de 109 CFU/mL ou esporos/ml. Em uma outra modalidade, a preparação contém um micróbio a uma concentração entre cerca de 106 CFU/mL ou esporos/ml e cerca de 108 CFU/mL ou esporos/ml.

[0290] A preparação sintética também pode conter qualquer número de outros componentes. Em uma modalidade, a preparação sintética pode conter meios de crescimento ou constituintes necessários para o crescimento e propagação do micróbio. Em uma modalidade, o meio de crescimento é selecionado a partir do grupo fornecido na tabela abaixo. Tabela 100:Média de crescimento exemplificativa

[0291] A preparação sintética pode ser de uma faixa de pH definida. Em uma modalidade, o pH da preparação pode estar entre pH 5,5 - 6,0, pH 5,75-6,25, pH 6,0 - 6,5, pH 6,25-6,75, pH 6,5-7,0, pH 6,757,25 e pH 7,0-7,5. O pH do meio pode ser ajustado usando qualquer agente tampão biologicamente compatível.

[0292] A preparação sintética também pode compreender um veículo, tal como terra de diatomáceas, argila ou quitina, que atuam para complexar com agentes químicos, tais como agentes de controle.

[0293] A preparação sintética também pode compreender um aderente. Tais agentes são úteis para combinar os micróbios da invenção com veículos que podem conter outros compostos (por exemplo, agentes de controle que não são biológicos), para produzir uma composição de revestimento. Tais composições ajudam a criar revestimentos ao redor da planta ou semente para manter o contato entre o micróbio e outros agentes com a planta ou parte da planta. Em uma modalidade, os aderentes são selecionados do grupo que consiste em: alginato, gomas, amidos, lecitinas, formononetina, álcool polivinílico, formononi- tato alcalino, hesperetina, acetato de polivinil, cefalinas, goma árabe, goma xantana, óleo mineral, polietileno glicol (PEG), polivinilpirrolidona (PVP), arabino-galactano, celulose de metil, copolímeros de PEG 400, quitosana, poliacrilamida, poliacrilato, poliacrilitril, glicerol, trimetileno- glicol, acetato de vinil, goma de gellan, poliestireno, polivinil, carboxi- metilcelulose, Gum Ghatti e copolímeros em bloco de polioxietileno- polioxibutileno. Outros exemplos de composições aderentes que podem ser utilizadas na preparação sintética incluem os descritos em EP 0818135, CA 1229497, WO 2013090628, EP 0192342, WO 2008103422 e CA 1041788, cada um dos quais é incorporado por referência na sua totalidade.

[0294] A preparação sintética também pode conter um ou mais reagentes que promovam a internalização do micróbio na planta e podem incluir qualquer uma das seguintes classes de compostos:Um tensoativo, um abrasivo, um osmoticum e uma molécula de sinalização de planta.

[0295] A preparação também pode conter um tensoativo. Exem- plos não limitativos de tensoativos incluem misturas de nitrogênio- tensoativo, tais como Prefer 28 (Cenex), Surf-N (US), Inhance (Brandt), P-28 (Wilfarm) e Patrol (Helena); os óleos de sementes este- rificados incluem Sun-It II (AmCy), MSO (UAP), Scoil (Agsco), Hasten (Wilfarm) e Mes-100 (Drexel); e os tensoativos de organo-silicone incluem Silwet L77 (UAP), Silikin (Terra), Dyne-Amic (Helena), Kinetic (Helena), Sylgard 309 (Wilbur-Ellis) e Century (Precision). Em uma modalidade, o tensoativo está presente em uma concentração entre 0,01% v/v a 10% v/v. Em uma outra modalidade, o tensoativo está presente em uma concentração entre 0,1% v/v a 1% v/v.

[0296] A preparação sintética de uma osmolalidade definida também pode ser usada. Em uma modalidade, a preparação sintética tem uma osmolalidade inferior a cerca de 100 mOsm, por exemplo, inferior a cerca de 75 mOsm, inferior a cerca de 50 mOsm ou inferior a cerca de 25 mOsm. Em uma modalidade, a preparação sintética tem uma osmolalidade de pelo menos 250 mOsm, pelo menos 300 mOsm, pelo menos 400 mOsm, pelo menos 500 mOsm, pelo menos 600 mOsm, pelo menos 700 mOsm, pelo menos 800 mOsm, 900 mOsm ou mais. A osmolalidade da preparação pode ser ajustada pela adição de um osmoticum: o osmoticum pode ser qualquer osmoticum comumente usado, e pode ser selecionado do grupo que consiste em: manitol, sorbitol, NaCl, KCl, CaCl2MgSO4, sacarose, ou qualquer combinação dos mesmos.

[0297] O endófito pode ser obtido a partir do crescimento em cultura, por exemplo, utilizando meio de crescimento semissintético ou sintético. Além disso, o micróbio pode ser cultivado em meios sólidos, por exemplo, em pratos de Petri, raspado e suspenso na preparação. Podem ser utilizados micróbios em diferentes fases de crescimento. Por exemplo, podem ser utilizados micróbios em fase de atraso, fase de log inicial, fase de log intermediário, fase de log tardio, fase estacioná- ria, fase de morte precoce ou fase de morte.

[0298] Para certos micróbios que existem como micélios ou estruturas semelhantes a micélios, o pré-tratamento dos micróbios com enzimas (incluindo, mas não limitado a, driselase, gluculase, celulase, beta-glucanase, lisozima, zimoliase) pode ser usado para gerar proto- plastos para fornecer uma suspensão de micróbios. Após a geração de protoplastos, os micróbios podem ser autorizados a regenerar par-cialmente as paredes celulares deixando os protoplastos em um meio de crescimento ou solução com osmolaridade relativamente alta por um curto período de tempo (tipicamente menor que cerca de 12 horas à temperatura ambiente) para evitar o estourar de protoplastos.

Detecção e quantificação de endófitos e outros micróbios

[0299] A presença do endófito ou de outros micróbios pode ser detectada e a sua localização na ou sobre plantas hospedeiras (incluindo a semente) pode ser determinada utilizando várias metodologias diferentes. A presença do micróbio no embrião ou endosperma, bem como a sua localização em relação às células da planta, pode ser determinada usando métodos conhecidos na técnica, incluindo micros- copia de imunofluorescência usando anticorpos específicos de micróbios ou hibridação fluorescente in situ. A presença e a quantidade de outros micróbios podem ser estabelecidas pelos métodos FISH, imu- nofluorescência e PCR usando sondas específicas para o micróbio. Alternativamente, podem ser utilizadas sondas degeneradas que reco-nhecem sequências conservadas de muitas bactérias e/ou fungos para amplificar uma região, após o que a identidade dos micróbios presentes no tecido/célula testado pode ser determinada por sequenciamen- to.

[0300] Portanto, em uma modalidade na qual o endófito é revestido na superfície de um elemento de planta de uma primeira planta de tal modo que o endófito está presente em um nível mais elevado na superfície do elemento de planta do que está presente na superfície de um elemento de planta de referência não revestido, o nível do endófito presente na superfície do elemento da planta de referência não revestido é determinado pela cultura de micróbios que estão presentes na superfície do elemento de planta. Em uma outra modalidade, o nível do endófito presente na superfície do elemento de planta de referência não revestido é determinado por PCR. Uniformidade de sementes e plantas

[0301] Em um outro aspecto, as sementes de acordo com a presente invenção proporcionam uma população de sementes substancialmente uniforme com uma composição de endófito uniforme. A população uniforme de sementes pode ser de um peso predefinido. Por exemplo, uma quantidade substancialmente uniforme de sementes contendo pelo menos 100 g de sementes, por exemplo, pelo menos 1 kg de sementes, pelo menos 5 kg de sementes, pelo menos 10 kg de sementes, pode ser proporcionada pelo método de acordo com a presente invenção que contém - como um produto inteiro - mais de 1%, por exemplo, mais de 5%, mais de 10%, mais de 20%, mais de 30%, mais de 40%, especialmente mais de 50%, do micro-organismo endofí- tico, ou seja, a cepa que é revestida na superfície das sementes. De acordo com uma modalidade preferida, a presente invenção proporciona um produto de semente comercializável contendo pelo menos 100 g de sementes, por exemplo, pelo menos 1 kg de sementes, por exemplo, pelo menos 5 kg de sementes, pelo menos 10 kg de sementes, em que - como um produto inteiro - mais de 50%, por exemplo, mais de 60%, mais de 70%, mais de 80%, mais de 90%, mais de 95%, mais de 99%, ou 100% das sementes contêm o micróbio, ou seja, a cepa inoculante. Cada uma das sementes também pode conter um número uniforme de micróbios (por exemplo, endófitos viáveis): por exemplo, pelo menos 50% das sementes, por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 99% ou mais das sementes na população podem conter pelo menos 100 CFU ou esporos, pelo menos 300 CFU ou esporos, pelo menos 1.000 CFU ou esporos, pelo menos 3.000 CFU ou esporos, pelo menos 10.000 CFU ou esporos, pelo menos 30.000 CFU ou esporos ou mais, do micro-organismo endofítico. Em algumas modalidades, pelo menos 50% das sementes, por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 99% ou mais das sementes na população contém um único endófito ou uma pluralidade de endófitos a uma concentração entre cerca de 100 CFU ou esporos e cerca de 30 000 CFU ou esporos, entre cerca de 100 CFU ou esporos e cerca de 300 CFU ou esporos, entre cerca de 100 CFU ou esporos e cerca de 1000 CFU ou esporos, entre cerca de 100 CFU ou esporos e cerca de 3.000 CFU ou esporos, entre cerca de 100 CFU ou esporos e cerca de 10,00 CFU ou esporos, entre cerca de 100 CFU ou esporos e cerca de 30.000 CFU ou esporos, entre cerca de 300 CFU ou esporos e cerca de 1.000 CFU ou esporos, entre cerca de 300 CFU ou esporos e cerca de 3.000 CFU ou esporos, entre cerca de 300 CFU ou esporos e cerca de 10,00 CFU ou esporos, entre cerca de 300 CFU ou esporos e cerca de 30.000 CFU ou esporos, entre cerca de 1.000 CFU ou esporos e cerca de 3.000 CFU ou esporos, entre cerca de 1.000 CFU ou esporos e cerca de 10,00 CFU ou esporos, entre cerca de 1000 CFU ou esporos e cerca de 30,00 CFU ou esporos, entre cerca de 3.000 CFU ou esporos e cerca de 10.000 CFU ou esporos, entre cerca de 3.000 CFU ou esporos e cerca de 30,00 CFU ou esporos, ou entre cerca de 10.000 CFU ou esporos e cerca de 30.000 CFU ou esporos. O endófito também pode ser quantificado usando outros meios, por exemplo, usando PCR quantitativa, para detectar o número total de endófitos presentes em cada semente.

[0302] A uniformidade dos micróbios dentro da população de sementes pode ser medida de várias maneiras diferentes. Em uma modalidade, uma porção substancial da população de sementes, por exemplo, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou mais das sementes em uma população, contém um endófito viável em sua superfície. Em uma outra modalidade, uma porção substancial da população de sementes, por exemplo, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos, 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou mais das sementes em uma população contém na sua superfície um número limiar de micróbios viáveis que é pelo menos 1 CFU ou esporo por semente, pelo menos 10 CFU ou esporos por semente, por exemplo, pelo menos 100 CFU ou esporos, pelo menos 300 CFU ou esporos, pelo menos 1.000 CFU ou esporos, pelo menos 3.000 CFU ou esporos, ou mais, do micróbio por semente. Em algumas modalidades, uma porção substancial da população de sementes, por exemplo, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou mais das sementes em uma população contém na sua superfície um número limiar de micróbios viáveis que está entre 1 CFU ou esporo por semente e cerca de 3.000 CFU ou esporos por semente, entre 1 CFU ou esporo por semente e cerca de 10 CFU ou esporos por semente, entre 1 CFU ou esporo por semente e cerca de 100 CFU ou esporos por semente, entre 1 CFU ou esporo por semente e cerca de 300 CFU ou esporos por semente, entre 1 CFU ou esporo por semente e cerca de 1.000 CFU ou esporos por semente, entre 1 CFU ou esporo por semente e cerca de 3.000 CFU ou esporos por semente, entre cerca de 10 CFU ou esporos por semente e cerca de 100 CFU ou esporos por semente, entre cerca de 10 CFU ou esporos por semente e cerca de 300 CFU ou esporos por semente, entre cerca de 10 CFU ou esporo por semente e cerca de 1.000 CFU ou esporos por semente, entre cerca de 10 CFU ou esporos por semente e cerca de 3.000 CFU ou esporos por semente, entre cerca de 100 CFU ou esporos por semente e cerca de 300 CFU ou esporos por semente, entre cerca de 100 CFU ou esporos por semente e cerca de 1000 CFU ou esporos por semente, entre cerca de 100 CFU ou esporos por semente e cerca de 3.000 CFU ou esporos por semente, entre cerca de 300 CFU ou esporos por semente e cerca de 1.000 CFU ou esporos por semente, entre cerca de 300 CFU ou esporos por semente e cerca de 3.000 CFU ou esporos por semente, ou entre cerca de 1.000 CFU ou esporos por semente e cerca de 3.000 CFU ou esporos por semente.

[0303] Em ainda um outro aspecto, a presente invenção divulga uma população substancialmente uniforme de plantas produzida por crescimento da população de sementes descrita acima. Em uma mo-dalidade, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou mais das plantas compreendem em um ou mais tecidos uma quantidade eficaz do endófito ou endófitos. Em outra modalidade, pelo menos 1%, entre 1% e 10%, por exemplo, pelo menos 10%, entre 10% e 20%, pelo menos 20%, entre 20% e 30%, pelo menos 30%, entre 30% e 40%, pelo menos 40%, entre 40% e 50%, pelo menos 50%, entre 50% e 60%, pelo menos 60%, entre 60% e 70%, pelo menos 70%, entre 70% e 75%, pelo menos 75%, entre 75% e 80%, pelo menos 80%, entre 80% e 90%, pelo menos 90%, entre 90% e 95%, pelo menos 95% ou mais das plantas compreendem uma população de micróbios que é substancialmente similar.

[0304] Em alguns casos, uma porção substancial da população de plantas ou sementes, por exemplo, pelo menos 1%, entre 1% e 10%, por exemplo, pelo menos 10%, entre 10% e 20%, pelo menos 20%, entre 20% e 30%, pelo menos 30%, entre 30% e 40%, pelo menos 40%, entre 40% e 50%, pelo menos 50%, entre 50% e 60%, pelo menos 60%, entre 60% e 70%, pelo menos 70%, entre 70% e 75%, pelo menos 75%, entre 75% e 80%, pelo menos 80%, entre 80% e 90%, pelo menos 90%, entre 90% e 95%, pelo menos, 95% ou mais das sementes em uma população, é revestida com um endófito que é capaz de realizar uma das seguintes funções, incluindo:para estimular o crescimento das plantas, crescer em meios isentos de nitrogênio, so- lubilizar fosfato, sequestrar ferro, secretar RNAse, antagonizar patóge- nos, catabolizar o precursor de etileno, produzir auxina e acetoí- na/butanediol. Em alguns casos, uma porção substancial da população de sementes, por exemplo, pelo menos 1%, entre 1% e 10%, por exemplo, pelo menos 10%, entre 10% e 20%, pelo menos 20%, entre 20% e 30%, pelo menos 30%, entre 30% e 40%, pelo menos 40%, entre 40% e 50%, pelo menos 50%, entre 50% e 60%, pelo menos 60%, entre 60% e 70%, pelo menos 70%, entre 70% e 75%, pelo menos 75%, entre 75% e 80%, pelo menos 80%, entre 80% e 90%, pelo menos 90%, entre 90% e 95%, pelo menos, 95% ou mais das sementes em uma população, exibe pelo menos um dos atributos da comunidade endófita listados aqui (por exemplo, UFCs totais, presença de taxa, ausência de taxa, distribuição espacial, colonização intercelular, propriedades funcionais de endófitos, presença de cepa monoclonal, pre-sença de subconjunto conservado de repertório plasmídico microbiano, micróbio isolado de habitat que é distinto da localização da produção de sementes, etc.).

[0305] A uniformidade aumentada de micróbios em plantas ou sementes também pode ser detectada medindo a presença de ácidos nu- cleicos não genômicos presentes nos micróbios. Por exemplo, onde o micróbio que é inoculado na planta é conhecido por abrigar um plasmí- deo ou epissoma, a presença do plasmídeo ou epissoma pode ser de-tectada em plantas ou sementes individuais usando métodos convenci-onais de detecção de ácido nucleico. Portanto, em uma modalidade uma porção substancial da população de sementes, por exemplo, pelo menos 1%, entre 1% e 10%, por exemplo, pelo menos 10%, entre 10% e 20%, pelo menos 20%, entre 20% e 30%, pelo menos 30%, entre 30% e 40%, pelo menos 40%, entre 40% e 50%, pelo menos 50%, entre 50% e 60%, pelo menos 60%, entre 60% e 70%, pelo menos 70%, entre 70% e 75%, pelo menos 75%, entre 75% e 80%, pelo menos 80%, entre 80% e 90%, pelo menos 90%, entre 90% e 95%, pelo menos 95% ou mais das sementes em uma população, possui uma presença detectável do plasmídeo ou epissoma microbiano.

[0306] A uniformidade aumentada do estado epigenético dos micróbios também pode ser usada para detectar maior uniformidade de uma população de sementes ou plantas derivadas dessas sementes. Por exemplo, onde um micróbio que foi inoculado por uma planta também está presente na planta (por exemplo, em um tecido ou porção diferente da planta), ou onde o micróbio introduzido é suficientemente semelhante a um micróbio que está presente em algumas das plantas (ou porção da planta, incluindo sementes), ainda é possível distinguir entre o micróbio inoculado e o micróbio nativo, por exemplo, distinguindo entre os dois tipos de micróbios com base em seu estado epi- genético. Portanto, em uma modalidade, o estado epigenético é detectado em micróbios através de sementes individuais ou as plantas que crescem a partir dessas sementes.

[0307] Sabe-se também que certos vírus estão associados a fungos endofíticos (como o vírus de tolerância térmica Curvularia (CThTV) descrito em Márquez, LM, et al. ,(2007). Science 315:513515). Portanto, a presença e quantidade de um vírus pode ser usada para medir a uniformidade de sementes ou plantas que contêm o en- dófito. Por exemplo, onde o micróbio inoculado é conhecido por estar associado a um vírus, a presença desse vírus pode ser usada como um indicador substituto de uniformidade. Portanto, em uma modalidade uma porção substancial das sementes, por exemplo, pelo menos 1%, entre 1% e 10%, por exemplo, pelo menos 10%, entre 10% e 20%, pelo menos 20%, entre 20% e 30%, pelo menos 30%, entre 30% e 40%, pelo menos 40%, entre 40% e 50%, pelo menos 50%, entre 50% e 60%, pelo menos 60%, entre 60% e 70%, pelo menos 70%, entre 70% e 75%, pelo menos 75%, entre 75% e 80%, pelo menos 80%, entre 80% e 90%, pelo menos 90%, entre 90% e 95%, pelo menos 95% ou mais das sementes contêm o vírus. Em outras modalidades, onde um ou mais dos micróbios endógenos contêm vírus associados que não são encontrados e não compatíveis com o micróbio inoculado, a perda (ou seja, a ausência) do vírus pode ser usada para medir a uniformidade da população de sementes. Sendo assim, em uma outra modalidade uma porção substancial da população de sementes, por exemplo, pelo meno 1%, entre 1% e 10%, por exemplo, pelo menos 10%, entre 10% e 20%, pelo menos 20%, entre 20% e 30%, pelo menos 30%, entre 30% e 40%, pelo menos 40%, entre 40% e 50%, pelo menos 50%, entre 50% e 60%, pelo menos 60%, entre 60% e 70%, pelo menos 70%, entre 70% e 75%, pelo menos 75%, entre 75% e 80%, pelo menos 80%, entre 80% e 90%, pelo menos 90%, entre 90% e 95%, pelo menos 95% ou mais das sementes não contêm o vírus. Em outros casos, a sequência genética do vírus pode ser usada para medir a similaridade genética do vírus dentro de uma população. Em uma modalidade, uma proporção substancial das sementes, por exemplo, pelo menos 10%, pelo menos, 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou mais das se- mentes contêm o mesmo vírus, por exemplo, conforme determinado por análise de sequência.

[0308] Essa uniformidade na composição microbiana é única e é extremamente vantajosa para a agricultura de alta tecnologia e/ou in-dustrial. Permite uma padronização significativa em relação à carga qualitativa de endófitas de produtos de semente. Os volumes ou pesos adequados são aqueles que são atualmente utilizados para sementes de plantas (por exemplo, pelo menos 100 g, pelo menos 1, 5 ou 10 kg, mas também 25 ou mais, 40 ou mais, 50 kg ou mais, mesmo 100 kg ou mais, 500 kg ou mais, 1 tonelada ou mais, etc.). Os recipientes ou embalagens adequados são os tradicionalmente utilizados na comercialização de sementes de plantas: no entanto, também podem ser utilizados outros recipientes com capacidades de armazenamento mais sofisticadas (por exemplo, com embalagens microbiologicamente apertadas ou com contenções à prova de gás ou à prova d'água). A quantidade de endófitos (qualitativa e quantitativamente) contida nas sementes ou no produto de semente comercializável como um todo pode ser determinada por técnicas padrão em microbiologia prontamente disponíveis para qualquer versado na técnica de análise de en- dófitos de plantas.

[0309] Em alguns casos, uma subpopulação de sementes agrícolas pode ser ainda selecionada com base em maior uniformidade, por exemplo, com base na uniformidade da população microbiana. Por exemplo, as sementes individuais de conjuntos coletados de espigas individuais, plantas individuais, parcelas individuais (representando plantas inoculadas no mesmo dia) ou campos individuais podem ser testadas quanto à uniformidade da densidade microbiana, e apenas aqueles conjuntos que atendem às especificações (por exemplo, pelo menos 80% das sementes testadas têm densidade mínima, conforme determinado por métodos quantitativos descritos em outros lugares) são combinados para fornecer a subpopulação de sementes agrícolas.

[0310] Os métodos aqui descritos podem também compreender uma etapa de validação. A etapa de validação pode envolver, por exemplo, cultivar algumas sementes coletadas das plantas inoculadas em plantas agrícolas maduras e testar essas plantas individuais para uniformidade. Essa etapa de validação pode ser realizada em sementes individuais coletadas de espigas, plantas individuais, parcelas individuais (representando plantas inoculadas no mesmo dia) ou campos individuais e testadas como descrito acima para identificar conjuntos que atendam às especificações exigidas.

Campo Agrícola

[0311] Em um outro aspecto, aqui descrito é um campo agrícola, incluindo uma estufa que compreende a população de plantas descrita acima. Na modalidade, o campo agrícola compreende pelo menos 100 plantas. Em uma outra modalidade, a população ocupa pelo menos cerca de 100 pés quadrados de espaço, em que pelo menos cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais de 90% da população compreende uma quantidade eficaz do micróbio. Em outra modalidade, a população ocupa pelo menos cerca de 100 pés quadrados de espaço, em que pelo menos 1%, entre 1% e 10%, por exemplo, pelo menos 10%, entre 10% e 20%, pelo menos 20%, entre 20% e 30%, pelo menos 30%, entre 30% e 40%, pelo menos 40%, entre 40% e 50%, pelo menos 50%, entre 50% e 60%, pelo menos 60%, entre 60% e 70%, pelo menos 70%, entre 70% e 75%, pelo menos 75%, entre 75% e 80%, pelo menos 80%, entre 80% e 90%, pelo menos 90%, entre 90% e 95%, pelo menos 95% ou mais da população compreende o micróbio no tecido reprodutivo. Em ainda uma outra modalidade, a população ocupa pelo menos cerca de 100 pés quadrados de espaço, em que pelo menos cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais do que 90% da população compreende pelo menos 10 CFUs ou esporos, 100 CFUs ou esporos, 1.000 CFUs ou esporos, 10.000 CFUs ou esporos ou mais do micróbio. Em ainda uma outra modalidade, a população ocupa pelo menos cerca de 100 pés quadrados de espaço, em que pelo menos 1%, entre 1% e 10%, por exemplo, pelo menos 10%, entre 10% e 20%, pelo menos 20%, entre 20% e 30%, pelo menos 30%, entre 30% e 40%, pelo menos 40%, entre 40% e 50%, pelo menos 50%, entre 50% e 60%, pelo menos 60%, entre 60% e 70%, pelo menos 70%, entre 70% e 75%, pelo menos 75%, entre 75% e 80%, pelo menos 80%, entre 80% e 90%, pelo menos 90%, entre 90% e 95%, pelo menos 95% ou mais da população compreende entre cerca de 10 CFU ou esporos e cerca de 10.000 CFU ou esporos, entre cerca de 10 CFU ou esporos e cerca de 100 CFU ou esporos, entre cerca de 10 CFU ou esporos e cerca de 1000 CFU ou esporos, entre cerca de 100 CFU ou esporos e cerca de 1.000 CFU ou esporos, entre cerca de 100 CFU ou esporos e cerca de 10,00 CFU ou esporos, ou entre cerca de 1000 CFU ou esporos e cerca de 10.000 CFU ou esporos. Em ainda uma outra modalidade, a população ocupa pelo menos cerca de 100 pés quadrados de espaço, em que pelo menos 1%, entre 1% e 10%, por exemplo, pelo menos 10%, entre 10% e 20%, pelo menos 20%, entre 20% e 30%, pelo menos 30%, entre 30% e 40%, pelo menos 40%, entre 40% e 50%, pelo menos 50%, entre 50% e 60%, pelo menos 60%, entre 60% e 70%, pelo menos, 70%, entre 70% e 75%, pelo menos 75%, entre 75% e 80%, pelo menos 80%, entre 80% e 90%, pelo menos 90%, entre 90% e 95%, pelo menos 95% ou mais da população compreende um micróbio exógeno (ou seja, o endófito) de origem monoclonal.

[0312] As plantas podem ser cultivadas individualmente a partir das sementes revestidas com os endófitos para propagar os micróbios desejados em ambientes internos ou externos. Uma vantagem da pre-sente invenção é que permite que plantas múltiplas que abrigam endó- fitos sejam cultivadas sob métodos agrícolas como um meio para pro-porcionar uma uniformidade melhorada de benefícios derivados de mi-cróbios aos agricultores.

[0313] Portanto, em um outro aspecto, são fornecidas aqui arranjos internos de populações (por exemplo, estufa) de plantas geradas a partir dos métodos da presente invenção. Tais arranjos podem incluir pelo menos um número definido de plantas da presente invenção, tal como pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, entre 3 e 5, pelo menos 5, entre 5 e 10, pelo menos 10, entre 10 e 15, pelo menos 15, entre 15 e 20, pelo menos 20, entre 20 e 30, pelo menos 30, entre 30 e 50, pelo menos 50, entre 50 e 100, pelo menos 100, entre 100 e 200, pelo menos 200, entre 200 e 500, pelo menos 500, entre 500 e 1.000, pelo menos 1.000, entre 1.000 e 5.000, pelo menos 5.000, entre 5.000 e 10.000, pelo menos 10.000 ou mais plantas.

[0314] Também são proporcionados aqui campos agrícolas que contêm população de plantas geradas a partir das sementes da presente invenção. Os campos agrícolas podem ocupar apenas 100 pés quadrados ou menos, ou podem ocupar centenas ou milhares de hec-tares. A área de campo que contém uma população de plantas associ-adas a micróbios pode ser medida em pés quadrados, como pelo menos 100, 500, 1.000, 5.000, 10.000, 50.000 ou superior a 50.000 pés quadrados, ou pode ser medida em hectares, como pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, entre 3 e 5, pelo menos 5, entre 5 e 10, pelo menos 10, entre 10 e 15, pelo menos 15, entre 15 e 20, pelo menos 20, entre 20 e 30, pelo menos 30, entre 30 e 50, pelo menos 50, entre 50 e 100, pelo menos 100, entre 100 e 200, pelo menos 200, entre 200 e 500, pelo menos 500, entre 500 e 1000, pelo menos 1000, entre 1000 e 5.000, pelo menos 5.000, entre 5.000 e 10.000, pelo menos 10.000, entre 10.000 e 50.000, pelo menos 50.000 ou mais acres. O campo também pode ser medido em hectares, por exemplo, pelo me- nos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, entre 3 e 5, pelo menos 5, entre 5 e 10, pelo menos 10, entre 10 e 15, pelo menos 15, entre 15 e 20, pelo menos 20, entre 20 e 30, pelo menos 30, entre 30 e 50, pelo menos 50, entre 50 e 100, pelo menos 100, entre 100 e 200, pelo menos 200, entre 200 e 500, pelo menos 500, entre 500 e 1.000, pelo menos 1.000, entre 1.000 e 5.000, pelo menos 5.000, entre 5.000 e 10.000, pelo menos 10.000 ou mais hectares. Além disso, um campo contendo uma população de plantas associadas a micróbios pode ser caracterizado pelo número de plantas na população, geralmente um campo é pelo menos dois, como pelo menos 3, entre 3 e 5, pelo menos 5, entre 5 e 10, pelo menos 10, entre 10 e 15, pelo menos 15, entre 15 e 20, pelo menos 20, entre 20 e 30, pelo menos 30, entre 30 e 50, pelo menos 50, entre 50 e 100, pelo menos 100, entre 100 e 200, pelo menos 200, entre 200 e 500, pelo menos 500, entre 500 e 1.000, pelo menos 1.000, entre 1.000 e 5.000, pelo menos 5.000, entre 5.000 e 10.000, pelo menos 10.000, entre 10.000 e 25.000, pelo menos 250.000, entre 25.000 e 50.000, pelo menos 500.000, entre 50.000 e 75.000, pelo menos 750.000, entre 75.000 e 100.000, pelo menos 1.000.000 ou mais plantas. Um campo é geralmente uma área contígua, mas pode ser separado por características geográficas, como estradas, vias navegáveis, edifícios, cercas e semelhantes conhecidos pelos versados na técnica. Como as plantas associadas a micróbios aqui descritas se beneficiam de um aumento do nível de uniformidade de germinação e outras características, é desejável maximizar a porcentagem de plantas contendo micróbios. Por exemplo, pelo menos 10% (por exemplo, entre 10% e 20%, pelo menos 20%, entre 20% e 30%, pelo menos 30%, entre 30% e 40%, pelo menos 40%, entre 40% e 50%, pelo menos 50%, entre 50% e 60%, pelo menos 60%, entre 60% e 70%, pelo menos 70%, entre 70% e 75%, pelo menos 75%, entre 75% e 80%, pelo menos 80%, entre 80% e 90%, pelo menos 90%, entre 90% e 95%, entre 95% e 99%, pelo menos 99% ou mais) das plantas contêm os micróbios. Endófitos compatíveis com agroquímicos

[0315] Em certas modalidades, o endófito é selecionado com base na sua compatibilidade com produtos agroquímicos comumente usados. Como mencionado anteriormente, as plantas, particularmente as plantas agrícolas, podem ser tratadas com uma grande variedade de produtos agroquímicos, incluindo fungicidas, biocidas (agentes anti- bacterianos), herbicidas, inseticidas, nematicidas, rodenticidas, fertilizantes e outros agentes.

[0316] Em alguns casos, pode ser importante que o endófito seja compatível com agroquímicos, particularmente aqueles com proprie-dades fungicidas ou antibacterianas, a fim de persistir na planta, embora, como mencionado anteriormente, existem muitos desses agentes fungicidas ou antibacterianos que não penetram na planta, pelo menos em uma concentração suficiente para interferir com o endófito. Portanto, onde um agente fungicida ou antibacteriano sistêmico é usado na planta, a compatibilidade do endófito a ser inoculado com tais agentes será um critério importante.

[0317] Em uma modalidade, os isolados naturais de endófitos que são compatíveis com produtos agroquímicos podem ser utilizados para inocular as plantas de acordo com os métodos aqui descritos. Por exemplo, os endófitos fúngicos que são compatíveis com fungicidas empregados em agricultura podem ser isolados colocando uma cultura dos endófitos em um prato de Petri contendo uma concentração eficaz do fungicida e isolando as colônias do endófito que são compatíveis com o fungicida. Em uma outra modalidade, um endófito que é compatível com um fungicida é utilizado para os métodos aqui descritos. Os endófitos compatíveis com fungos podem também ser isolados por seleção em meio líquido. A cultura dos endófitos pode ser banhada em pratos de Petri sem qualquer forma de mutagênese; alternativamente, os endófitos podem ser mutagenizados usando qualquer meio conhecido na técnica. Por exemplo, as culturas microbianas podem ser expostas a luz UV, irradiação gama ou mutagênicos químicos, tais como etilmetanossulfonato (EMS) antes da seleção em meio contendo fungi-cidas. Finalmente, onde o mecanismo de ação de um fungicida particular é conhecido, o gene alvo pode ser mutado especificamente (seja por deleção de gene, substituição de gene, mutagênese dirigida ao local, etc.) para gerar um endófito que seja resiliente contra esse fungicida particular. Note-se que os métodos acima descritos podem ser utilizados para isolar fungos compatíveis com os compostos fungistáti- cos e fungicidas.

[0318] Será também apreciado por um versado na técnica que uma planta pode ser exposta a múltiplos tipos de compostos fungicidas ou antibacterianos, simultaneamente ou sucessivamente, por exemplo, em diferentes fases do crescimento da planta. Onde a planta alvo é suscetível de ser exposta a múltiplos agentes fungicidas e/ou antibacterianos, um endófito que é compatível com muitos ou todos estes produtos agroquímicos podem ser usados para inocular a planta. Um endófito que é compatível com vários agentes fungicidas pode ser isolado, por exemplo, por seleção em série. Um endófito que é compa-tível com o primeiro agente fungicida é isolado como descrito acima (com ou sem mutagênese prévia). Uma cultura do endófito resultante pode então ser selecionada pela capacidade de crescer em meios lí-quidos ou sólidos contendo o segundo composto antifúngico (novamente, com ou sem mutagênese prévia). As colônias isoladas da segunda seleção são então testadas para confirmar sua compatibilidade com ambos os compostos antifúngicos.

[0319] Da mesma forma, endófitos bacterianos que são compatíveis com biocidas (incluindo herbicidas, tais como glifosato ou compos- tos antibacterianos, bacteriostáticos ou bactericidas) que são empre-gados em agricultura podem ser isolados usando métodos semelhantes aos descritos para isolar endófitos compatíveis com fungicida. Em uma modalidade, a mutagênese da população microbiana pode ser realizada antes da seleção com um gente antibacteriano. Em uma outra modalidade, a seleção é realizada na população microbiana sem mutagênese prévia. Em ainda uma outra modalidade, a seleção em série é realizada em um endófito:O endófito é selecionado pela primeira vez para compatibilidade com um primeiro agente antibacteriano. O endófito compatível isolado é então cultivado e selecionado para compatibilidade com o segundo agente antibacteriano. Qualquer colônia assim isolada é testada quanto à compatibilidade para cada um, ou ambos os agentes antibacterianos para confirmar a compatibilidade com esses dois agentes.

[0320] A resistência ou compatibilidade com um agente antimicro- biano pode ser determinada por uma série de meios conhecidos na técnica, incluindo a comparação da concentração inibitória mínima (MIC) do endófito não modificado e modificado. Portanto, em uma modalidade a presente invenção descreve um endófito modificado isolado derivado de um endófito isolado a partir de uma planta ou tecido do mesmo, em que o endófito é modificado de modo que exibe pelo menos 3 vezes mais, por exemplo, pelo menos 5 vezes mais, pelo menos 10 vezes mais, pelo menos 20 vezes mais, pelo menos 30 vezes mais ou mais MIC para um agente antimicrobiano quando comparado com o endófito não modificado.

[0321] Em um aspecto particular, são divulgados aqui endófitos bacterianos com resistência reforçada ao herbicida glifosato. Em uma modalidade, o endófito bacteriano tem um tempo de duplicação em meio de crescimento contendo pelo menos 1 mM de glifosato, por exemplo, pelo menos 2 mM de glifosato, pelo menos 5 mM de glifosa- to, pelo menos 10 mM de glifosato, pelo menos 15 mM de glifosato ou mais, que não é superior a 250%, por exemplo, não mais de 200%, não mais de 175%, não mais de 150%, ou não mais de 125%, do tempo de duplicação do endófito no mesmo meio de crescimento que não contém glifosato. Em uma modalidade particular, o endófito bacteriano tem um tempo de duplicação em meio de crescimento contendo glifo- sato 5 mM que não é mais que 150% o tempo de duplicação do endó- fito no mesmo meio de crescimento que não contém glifosato.

[0322] Em uma outra modalidade, o endófitobacteriano tem um tempo de duplicação em um tecido vegetal contendo pelo menos 10 ppm de glifosato, por exemplo, pelo menos 15 ppm de glifosato, pelo menos 20 ppm de glifosato, pelo menos 30 ppm de glifosato, pelo menos 40 ppm de glifosato ou mais, isso não é mais que 250%, por exemplo, não mais que 200%, não mais que 175%, não mais que 150% ou não mais que 125%, do tempo de duplicação do endófito em um tecido vegetal de referência que não contém glifosato. Em uma modalidade particular, o endófito bacteriano tem um tempo de duplicação em um tecido vegetal contendo 40 ppm de glifosato que não é mais que 150% o tempo de duplicação do endófito em um tecido vegetal de referência que não contém glifosato.

[0323] O processo de seleção descrito acima pode ser repetido para identificar isolados do endófito que são compatíveis com uma infinidade de agentes antifúngicos ou antibacterianos.

[0324] Os isolados de candidatos podem ser testados para garantir que a seleção de compatibilidade agroquímica não resultou na perda de uma bioatividade microbiana desejada. Os isolados do endófito que são compatíveis com fungicidas comumente utilizados podem ser selecionados como descrito acima. O endófito compatível resultante pode ser comparado com o endófito parental nas plantas em sua capacidade de promover a germinação.

[0325] Os endófitos agroquímicos compatíveis gerados como descrito acima podem ser detectados em amostras. Por exemplo, onde um transgene foi introduzido para tornar o endófito resistente ao(s) agroquímico(s), o transgene pode ser usado como gene alvo para am-plificação e detecção por PCR. Além disso, quando mutações pontuais ou deleções para uma porção de um gene específico ou uma série de genes resultam em compatibilidade com o(s) agroquímico(s), as muta-ções pontuais únicas também podem ser detectadas por PCR ou outros meios conhecidos na técnica. Tais métodos permitem a detecção do micróbio, mesmo que já não seja viável. Assim, os produtos vegetais de base produzidos usando os micróbios compatíveis com agroquímicos aqui descritos podem ser facilmente identificados empregando estes e métodos relacionados de detecção de ácido nucleico. Características aprimoradas conferidas pelo endófito

[0326] A presente invenção contempla o estabelecimento de um simbionte microbiano em uma planta. Em uma modalidade, a associação microbiana resulta em uma alteração detectável na semente ou na planta. A mudança detectável pode ser uma melhoria em vários traços agronômicos (por exemplo, saúde geral melhorada, resposta aumentada a estresses bióticos ou abióticos ou propriedades melhoradas da planta ou uma parte da planta, incluindo frutas e grãos). Alternativamente, a mudança detectável pode ser uma mudança fisiológica ou biológica que pode ser medida por métodos conhecidos na técnica. As mudanças detectáveis são descritas em mais detalhes nas seções abaixo. Tal como aqui utilizado, considera-se que um endófito conferiu uma ca-racterística agrícola melhorada, independentemente da característica melhorada surgir da planta, do endófito ou da ação concertada entre a planta e o endófito. Portanto, por exemplo, se um hormônio ou produto químico benéfico é produzido pela planta ou endófito, para os propósitos da presente invenção, será considerado que o endófito conferiu uma característica agronômica melhorada na planta hospedeira.

[0327] Em algumas modalidades as combinações planta-endófitos conferem um benefício agronômico em plantas agrícolas. Em algumas modalidades, a característica agronômica é selecionada do grupo que consiste em teor de óleo alterado, teor de proteína alterada, composição de carboidrato de semente alterada, composição de óleo de semente alterada e composição de proteína de semente alterada, tolerância química, tolerância ao frio, senescência tardia, resistência a doenças, tolerância à seca, peso da espiga, melhoria do crescimento, aumento da saúde, tolerância ao calor, tolerância a herbicidas, resistência a herbívoros, fixação de nitrogênio melhorada, melhor aproveitamento de nitrogênio, arquitetura de raiz melhorada, eficiência de uso de água melhorada, aumento da biomassa, aumento do comprimento da raiz, aumento do peso da semente, aumento do comprimento do rebento, aumento do rendimento, aumento do rendimento em condições limpas em água, massa de grão, teor de umidade do grão, tolerância ao metal, número de espigas, número de grãos por espiga, número de vagens, melhoramento nutricional, resistência aos agentes patogênicos, resistência a pragas, melhora da capacidade fotossintéti- ca, tolerância à salinidade, permanência de verde, aumento do vigor, aumento do peso seco de sementes maduras, aumento do peso fresco de sementes maduras, aumento do número de sementes maduras por planta, aumento do teor de clorofila, aumento do número de vagens por planta, aumento do comprimento de vagens por planta, número reduzido de folhas murchas por planta, número reduzido de folhas gravemente murchas por planta e aumento do número de folhas não murchas por planta, uma modulação detectável no nível de um meta- bolito, uma modulação detectável no nível de uma transcrição e uma modulação detectável no proteoma, em relação a uma planta de referência. Em outras modalidades, pelo menos dois traços agronômicos são melhorados na planta agrícola.

[0328] Por exemplo, o endófito pode proporcionar um benefício ou tolerância melhorados para uma planta que seja de pelo menos 3%, entre 3% e 5%, pelo menos 5%, entre 5% e 10%, pelo menos 10%, entre 10% e 15%, pelo menos, 15%, entre 15% e 20%, pelo menos 20%, entre 20% e 30%, pelo menos 30%, entre 30% e 40%, pelo menos 40%, entre 40% e 50%, pelo menos 50%, entre 50% e 60%, pelo menos 60%, entre 60% e 75%, pelo menos 75%, entre 75% e 100%, pelo menos 100%, entre 100% e 150%, pelo menos 150%, entre 150% e 200%, pelo menos 200%, entre 200% e 300%, ou pelo menos 300% ou mais, quando comparado com plantas não inoculadas cultivadas nas mesmas condições.

[0329] Em alguns aspectos, são proporcionados aqui métodos para produzir uma semente de uma planta com uma característica hereditária alterada. A característica da planta pode ser alterada sem modificação genética conhecida do genoma da planta e compreende as seguintes etapas. Primeiro, é fornecida uma preparação de um endófi- to isolado que é exógeno à semente da planta e, opcionalmente, processada para produzir uma preparação microbiana. A preparação microbiana é então contatada com a planta. As plantas são então liberadas para a semente, e as sementes, que contêm os endófitos sobre e/ou na semente são coletadas. Os endófitos contidos na semente são incorporados viabilizados na semente.

[0330] O método da presente invenção pode facilitar a produtividade das culturas, aumentando a germinação, o vigor das mudas e a biomassa em comparação com um controle não tratado. Além disso, a introdução dos micro-organismos benéficos dentro da semente, em vez de, por exemplo, o revestimento de sementes, torna os endófitos menos suscetíveis à perturbação ambiental e mais compatíveis com revestimentos químicos de sementes (por exemplo, pesticidas e herbi- cidas). Usando sementes colonizadas com endófito , o crescimento da planta e o aumento da biomassa são estatisticamente similares aos obtidos utilizando métodos convencionais de inoculação, por exemplo, remoção de sementes exógenas e inoculação do solo (que são mais laboriosas e menos praticáveis em determinadas circunstâncias). Saúde geral melhorada

[0331] Também são descritos aqui plantas e campos de plantas, que estão associados a endófitos benéficos, de modo que a aptidão, a produtividade ou a saúde geral da planta ou uma porção dela seja man-tida, aumentada e/ou melhorada ao longo de um período de tempo. A melhoria da saúde geral da planta pode ser avaliada utilizando vários parâmetros fisiológicos, incluindo, entre outros, a altura, a biomassa to-tal, a biomassa das raízes e/ou do rebento, a germinação das sementes, a sobrevivência das plântulas, a eficiência fotossintética, a taxa de transpiração, o número ou a massa da semente/fruta, a produção de grãos ou frutas, o teor de clorofila foliar, a taxa de fotossíntese, o com-primento da raiz ou qualquer combinação dos mesmos. A melhoria da saúde das plantas, ou a melhoria da saúde no campo, também podem ser demonstradas através de uma melhor resistência ou resposta a um determinada tensão, tensão biótica ou abiótico, ou uma combinação de um ou mais estresses abióticos, conforme aqui previsto.

Outros estresses abióticos

[0332] Aqui estão incluídas plantas associadas ao endófito com maior resistência a um tensão abiótico. Os estresses abióticos exem- plificativos incluem, mas não estão limitados a:seca, sal, alto teor de metal, baixos nutrientes, tensão frio e tensão por calor. Tolerância à seca e ao calor

[0333] Quando a água do solo é esgotada ou se a água não está disponível durante os períodos de seca, os rendimentos das culturas são restritos. O déficit de água da planta se desenvolve se a transpira- ção das folhas exceder o abastecimento de água das raízes. O abas-tecimento de água disponível está relacionado à quantidade de água mantida no solo e à capacidade da planta de atingir essa água com seu sistema radicular. A transpiração da água das folhas está ligada à fixação do dióxido de carbono por fotossíntese através dos estômatos. Os dois processos estão positivamente correlacionados, de modo que o influxo de dióxido de carbono elevado através da fotossíntese está intimamente ligado à perda de água por transpiração. À medida que a água passa da folha, o potencial da água foliar é reduzido e os estomas tendem a fechar em um processo hidráulico que limita a quantidade de fotossíntese. Uma vez que o rendimento das culturas depende da fixação do dióxido de carbono na fotossíntese, a absorção de água e a transpiração são fatores que contribuem para o rendimento das culturas. As plantas que podem usar menos água para fixar a mesma quantidade de dióxido de carbono ou que são capazes de funcionar normalmente em um menor potencial de água têm o potencial de realizar mais fotossíntese e assim produzir mais biomassa e rendimento econômico em muitos sistemas agrícolas.

[0334] Em alguns casos, uma planta resultante de sementes ou outros elementos de plantas tratados com uma cepa de endófito único ou uma pluralidade de endófitos podem exibir uma alteração fisiológica, como uma compensação da redução induzida pela tensão na atividade fotossintética (expressa, por exemplo, como ΔFv/Fm) após exposição a choque térmico ou condições de seca em comparação com um controle correspondente, planta geneticamente idêntica que não contém os endófitos cultivados nas mesmas condições. Em alguns casos, a planta associada ao endófito como aqui divulgada pode exibir uma alteração aumentada na atividade fotossintética ΔFv (ΔFv/Fm) após o tratamento com choque térmico ou tensão por via seca, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 dias ou mais após o choque térmico ou tratamento de tensão por seca, ou até a fotossíntese cessar, em comparação com a planta de controle correspondente de fase de desenvolvimento seme-lhante, mas não compreendendo os endófitos. Por exemplo, uma planta com uma pluralidade de endófitos capazes de conferir calor e/ou tolerância à seca pode exibir um ΔFv/Fm de cerca de 0,1 a cerca de 0,8 após exposição ao choque térmico ou tensão por seca ou a uma faixa ΔFv/Fm de cerca de 0,03 a cerca de 0,8 em um dia, ou 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou durante 7 dias pós-choque de calor ou tratamento de tensão por seca, ou até a fotossíntese cessar. Em algumas modalidades, as reduções induzidas pela tensão na atividade fotossintética podem ser compensadas em pelo menos cerca de 0,25% (por exemplo, pelo menos cerca de 0,5%, entre 0,5% e 1%, pelo menos cerca de 1%, entre 1% e 2% pelo menos cerca de 2%, entre 2% e 3%, pelo menos cerca de 3%, entre 3% e 5%, pelo menos cerca de 5%, entre 5% e 10%, pelo menos cerca de 8%, pelo menos cerca de 10%, entre 10% e 15%, pelo menos cerca de 15%, entre 15% e 20%, pelo menos cerca de 20%, entre 20$ e 25%, pelo menos cerca de 25%, entre 25% e 30%, pelo menos aproximadamente 30%, entre 30% e 40%, pelo menos cerca de 40%, entre 40% e 50%, pelo menos cerca de 50%, entre 50% e 60%, pelo menos cerca de 60%, entre 60% e 75%, pelo menos cerca de 75%, entre 75% e 80%, pelo menos cerca de 80%, entre 80% e 85%, pelo menos cerca de 85%, entre 85% e 90%, pelo menos cerca de 90%, entre 90% e 95%, pelo menos cerca de 95%, entre 95% e 99%, pelo menos cerca de 99%, entre 99% e 100%, ou pelo menos 100%) em comparação com a diminuição da atividade fotossintética em uma planta agrícola de referência correspondente após condições de choque térmico. A significância da diferença entre plantas agrícolas endófitas e de referência pode ser estabelecida após demonstrar signi- ficância estatística, por exemplo, em p <0,05 com uma estatística paramétrica ou não paramétrica apropriada, por exemplo, teste do qui- quadrado, teste t de Student, teste de Mann-Whitney ou teste F com base na suposição ou fatos conhecidos de que a planta associada ao endófito e a planta agrícola de referência possuem genomas idênticos ou quase idênticos (comparação isoline).

[0335] Na seleção de características para melhorar as culturas, uma diminuição no uso da água, sem uma mudança no crescimento, teria um mérito particular em um sistema agrícola irrigado, onde os custos de entrada de água eram altos. Um aumento no crescimento sem um salto correspondente no uso da água teria aplicabilidade a todos os sistemas agrícolas. Em muitos sistemas agrícolas nos quais o abastecimento de água não é limitante, um aumento no crescimento, mesmo que seja realizado à custa de um aumento no uso da água, também aumenta o rendimento. A eficiência do uso da água (WUE) é um parâmetro frequentemente correlacionado com a tolerância à seca, e é a taxa de assimilação de CO2 por água transpirada pela planta. Uma maior eficiência de uso da água da planta relaciona-se, em alguns casos, com o aumento do tamanho ou número de frutas/grãos. Portanto, em algumas modalidades, as plantas aqui descritas exibem uma eficiência de uso da água aumentada quando comparada com uma planta agrícola de referência cultivada nas mesmas condições. Por exemplo, as plantas cultivadas a partir dos elementos de planta que compreendem a pluralidade de endófitos podem ter pelo menos 3%, entre 3% e 5%, pelo menos 5%, entre 5% e 10%, pelo menos 10%, entre 10% e 15%, por exemplo, pelo menos 15%, entre 15% e 20%, pelo menos 20%, entre 20% e 30%, pelo menos 30%, entre 30% e 40%, pelo menos 40%, entre 40% e 50%, pelo menos 50%, entre 50% e 60%, pelo menos 60%, entre 60% e 75%, pelo menos 75%, entre 75% e 100%, ou pelo menos 100% mais WUE do que uma planta agrícola de referência cultivada nas mesmas condições. Esse aumento da WUE pode ocorrer em condições sem déficit de água ou em condi- ções de déficit hídrico, por exemplo, quando o teor de água do solo é menor ou igual a 60% do solo saturado com água, por exemplo, menor ou igual a 50%, menor ou igual a 40%, menor ou igual a 30%, menor ou igual a 20%, menor ou igual a 10% de solo saturado com água em peso. Em uma modalidade relacionada, a planta que compreende a pluralidade de endófitos pode ter pelo menos 10% de teor relativo de água (RWC), por exemplo, pelo menos 3%, entre 3% e 5%, pelo menos 5%, entre 5% e 10%, pelo menos, 10%, entre 10% e 15%, por exemplo, pelo menos 15%, entre 15% e 20%, pelo menos 20%, entre 20% e 30%, pelo menos 30%, entre 30% e 40%, pelo menos 40%, entre 40% e 50%, pelo menos 50%, entre 50% e 60%, pelo menos 60%, entre 60% e 75%, pelo menos 75%, entre 75% e 100%, ou pelo menos RWC 100% maior que uma planta agrícola de referência cultivada nas mesmas condições.

[0336] Em algumas modalidades, as plantas compreendem uma cepa de endófito único ou uma pluralidade de endófitos capazes de aumentar o calor e/ou a tolerância à seca em quantidade suficiente, de modo que seja observado um crescimento aumentado ou uma recuperação melhorada do declínio em condições de tensão por calor ou por seca. Por exemplo, uma pluralidade de populações de endófi- tos aqui descritas pode estar presente em quantidade suficiente em uma planta, resultando em crescimento aumentado em comparação com uma planta que não contém endófitos, quando cultivada sob condições de seca ou condições de choque térmico ou seguindo tais condições. O aumento da tolerância ao calor e/ou à seca pode ser avaliado com parâmetros fisiológicos, incluindo, mas não limitado a, aumento da altura, biomassa global, biomassa da raiz e/ou do rebento, germinação de sementes, sobrevivência de plântulas, eficiência de fotossíntese, taxa de transpiração, número de semente/fruta ou produção de massa, grãos vegetaiss ou frutos, teor de clorofila foliar, ta xa de fotossíntese, comprimento da raiz, recuperação da folhagem, pressão do turgor ou qualquer combinação destes, em comparação com uma planta agrícola de referência cultivada em condições semelhantes. Por exemplo, o endófito pode proporcionar um benefício ou tolerância melhorados para uma planta que seja de pelo menos 3%, entre 3% e 5%, pelo menos 5%, entre 5% e 10%, pelo menos 10%, entre 10% e 15%, pelo menos, 15%, entre 15% e 20%, pelo menos 20%, entre 20% e 30%, pelo menos 30%, entre 30% e 40%, pelo menos 40%, entre 40% e 50%, pelo menos 50%, entre 50% e 60%, pelo menos 60%, entre 60% e 75%, pelo menos 75%, entre 75% e 100%, ou pelo menos 100%, em comparação com plantas não inoculadas cultivadas nas mesmas condições.

[0337] Em várias modalidades, uma cepa de endófito único ou pluralidade de endófitos introduzidos em microbiota de semente alterada pode conferir a tolerância térmica da planta resultante, tolerância a herbicidas, resistência à seca, resistência a insetos, resistência a fungos, resistência ao vírus, resistência a bactérias, esterilidade masculina, tolerância ao frio, tolerância ao sal, aumento do rendimento, maior eficiência de uso de nutrientes, aumento da eficiência do uso de nitro-gênio, aumento do teor de proteína, aumento do teor de carboidratos fermentáveis, menor teor de lignina, aumento do teor de antioxidantes, eficiência de uso da água aprimorada, aumento do vigor, aumento da eficiência de germinação, floração precoce ou aumentada, biomassa aumentada, razão de biomassa raiz-para-broto alterada, retenção de água do solo melhorada ou uma combinação dos mesmos. Uma diferença entre a planta associada ao endófito e uma planta agrícola de referência também pode ser medida utilizando outros métodos conhecidos na técnica. Tensão salino

[0338] Em outras modalidades, uma cepa de endófito único ou uma pluralidade de endófitos capazes de conferir tolerância aumentada à tensão de salinidade podem ser introduzidas nas plantas. As plantas resultantes que compreendem endófitos podem exibir uma resistência aumentada à tensão salina, seja medida em termos de sobrevivência em condições salinas, ou crescimento geral durante ou após tensão salino. Os parâmetros fisiológicos de saúde de planta citados acima, incluindo a altura, a biomassa global, a biomassa das raízes e/ou dos brotos, a germinação das sementes, a sobrevivência das plântulas, a eficiência fotossintética, a taxa de transpiração, o número ou a massa de sementes/frutos, o grão vegetal ou o rendimento da fruta, o teor de clorofila nas folhas, a taxa de fotossíntese, comprimento da raiz ou qualquer combinação dos mesmos, pode ser usado para medir o crescimento e comparado com a taxa de crescimento das plantas agrícolas de referência (por exemplo, plantas iso- gênicas sem endófitos) cultivadas em condições idênticas. Por exemplo, o endófito pode proporcionar um benefício ou tolerância melhorados para uma planta que seja de pelo menos 3%, entre 3% e 5%, pelo menos 5%, entre 5% e 10%, pelo menos 10%, entre 10% e 15%, pelo menos, 15%, entre 15% e 20%, pelo menos 20%, entre 20% e 30%, pelo menos 30%, entre 30% e 40%, pelo menos 40%, entre 40% e 50%, pelo menos 50%, entre 50% e 60%, pelo menos 60%, entre 60% e 75%, pelo menos 75%, entre 75% e 100%, ou pelo menos 100%, em comparação com plantas não inoculadas cultivadas nas mesmas condições.

[0339] Em outros casos, as plantas associadas ao endófito e as plantas agrícolas de referência podem ser cultivadas em solo ou meio de crescimento contendo diferentes concentrações de sódio para es-tabelecer a concentração inibitória de sódio (expressa, por exemplo, como a concentração na qual o crescimento da planta é inibido por 50% quando comparado com plantas cultivadas sob nenhum tensão de sódio). Portanto, em uma outra modalidade, uma planta resultante de sementes contendo um endófito capaz de conferir tolerância ao sal aqui descrita exibe um aumento na concentração de sódio inibitória em pelo menos 10 mM, pelo menos 15 mM, pelo menos 20 mM, pelo menos 30 MM, pelo menos 40 mM, pelo menos 50 mM, pelo menos 60 mM, pelo menos 70 mM, pelo menos 80 mM, pelo menos 90 mM, pelo menos 100 mM ou mais, quando comparados com as plantas agrícolas de referência. Teor de metal alto

[0340] As plantas são organismos sésseis e, portanto, devem lidar com o meio ambiente no qual são colocadas. Embora as plantas tenham adaptado muitos mecanismos para lidar com produtos químicos e substâncias que podem ser prejudiciais à sua saúde, os metais pesados representam uma classe de toxinas que são altamente relevantes para o crescimento de plantas e para a agricultura. As plantas usam uma série de mecanismos para lidar com níveis tóxicos de metais pesados (por exemplo, níquel, cádmio, chumbo, mercúrio, arsênico ou alumínio) no solo, incluindo excreção e sequestro interno. Para fins agrícolas, é importante ter plantas capazes de tolerar condições de outra forma hostis, por exemplo, solos que contenham níveis elevados de metais pesados tóxicos. Os endófitos capazes de conferir uma maior tolerância ao metal pesado podem fazê-lo aumentando o sequestro do metal em certos compartimentos. O uso de tais endófitos em uma planta permitiria o desenvolvimento de novas combinações planta-endófitos para fins de remediação ambiental (também conhecida como fitorremediação). Portanto, em uma modalidade, a planta que contém o endófito capaz de conferir uma maior tolerância ao metal exibe uma diferença em um parâmetro fisiológico que é pelo menos aproximadamente 5% maior, por exemplo, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 8%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% ou pelo menos 100%, pelo menos cerca de 200%, pelo menos cerca de 300%, pelo menos cerca de 400% ou superior a uma planta agrícola de referência cultivada sob a mesma concentração de metal pesado no solo.

[0341] Alternativamente, a concentração inibitória do metal pesado pode ser determinada para a planta associada ao endófito e comparada com uma planta agrícola de referência nas mesmas condições. Portanto, em uma modalidade, as plantas resultantes de sementes contendo um endófito capaz de conferir tolerância ao metal pesado aqui descritas apresentam um aumento na concentração de sódio inibitória em pelo menos 0,1 mM, pelo menos, 0,3 mM, pelo menos 0,5 mM, pelo menos 1 mM, pelo menos 2 mM, pelo menos 5 mM, pelo menos 10 mM, pelo menos 15 mM, pelo menos 20 mM, pelo menos 30 mM, pelo menos 50 mM ou mais, quando comparados com as plantas agrícolas de referência.

[0342] Finalmente, as plantas inoculadas com endófitos que são capazes de conferir uma maior tolerância ao metal exibem um aumento na acumulação global de metal em pelo menos 10%, pelo menos, 15%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 75%, pelo menos 100%, pelo menos 150%, pelo menos 200%, pelo menos 300% ou mais, quando comparados com plantas não inoculadas cultivadas nas mesmas condições. Tensão por nutriente baixo

[0343] Uma cepa de endófito único ou uma pluralidade de endófi- tos aqui descritos também podem conferir à planta uma capacidade aumentada para crescer em condições limitantes de nutrientes, por exemplo, solubilizando ou disponibilizando às plantas macronutrientes ou micronutrientes que são complexados, insolúveis ou de outro modo em uma forma indisponível. Em algumas modalidades, uma planta é inoculada com uma pluralidade de endófitos que conferem capacidade aumentada para liberar e/ou fornecer, de outra forma, à planta nutrientes selecionados do grupo que consiste em fosfato, nitrogênio, potássio, ferro, manganês, cálcio, molibdênio, vitaminas, ou outros micronu- trientes. Tal planta pode exibir um crescimento aumentado no solo, incluindo quantidades limitantes de tais nutrientes quando comparados com a planta agrícola de referência. As diferenças entre a planta asso-ciada ao endófito e a planta agrícola de referência podem ser medidas comparando a biomassa dos dois tipos de plantas cultivadas sob con-dições limitantes ou medindo os parâmetros físicos descritos acima. Portanto, em algumas modalidades, a planta que compreende endófi- tos mostra uma tolerância aumentada a condições limitantes de nutrientes em comparação com uma planta agrícola de referência cultivada sob a mesma concentração limitada de nutrientes no solo, conforme medido, por exemplo, por aumento de biomassa ou produção de semente de pelo menos 3%, entre 3% e 5%, pelo menos 5%, entre 5% e 10%, pelo menos 10%, entre 10% e 15%, por exemplo, pelo menos 15%, entre 15% e 20%, pelo menos 20%, entre 20% e 30%, pelo menos 30%, entre 30% e 40%, pelo menos 40%, entre 40% e 50%, pelo menos 50%, entre 50% e 60%, pelo menos 60%, entre 60% e 75%, pelo menos 75%, entre 75% e 100%, ou pelo menos 100%, quando comparados com plantas não inoculadas cultivadas nas mesmas condições. Em outras modalidades, a planta que contém a pluralidade de endófitos é capaz de crescer sob condições de tensão nutricional, enquanto não exibe diferença no parâmetro fisiológico em comparação com uma planta cultivada sem tensão por nutriente. Em algumas mo- dalidades, tal planta não apresentará diferença no parâmetro fisiológico quando cultivada com 2 a 5% menos de nitrogênio do que as práticas médias de cultivo em terras agrícolas normais, por exemplo, pelo menos 10%, entre 10% e 15%, por exemplo, pelo menos 15%, entre 15% e 20%, pelo menos 20%, entre 20% e 30%, pelo menos 30%, entre 30% e 40%, pelo menos 40%, entre 40% e 50%, pelo menos 50%, entre 50% e 60%, pelo menos 60%, entre 60% e 75%, pelo menos 75%, ou entre 75% e 100%, menos nitrogênio, em comparação com as plantas cultivadas em condições normais durante uma estação de crescimento média. Em algumas modalidades, o micróbio capaz de proporcionar tolerância à tensão nitrogenado a uma planta é diazotró- fico. Em outras modalidades, o micróbio capaz de proporcionar tolerância à tensão de nitrogênio a uma planta não é diazotrófico. Tensão ao frio

[0344] Em alguns casos, os endófitos podem conferir à planta a capacidade de tolerar a tensão ao frio. Existem muitos métodos co-nhecidos para medir a tolerância de uma planta à tensão ao frio (con-forme revisado, por exemplo, em Thomashow (2001) Plant Physiol. 125:89-93 e Gilmour et al. (2000) Plant Physiol. 124:1854-1865, ambos os quais são aqui incorporados por referência na sua totalidade). Tal como aqui utilizado, a tensão ao frio se refere tanto à tensão induzido por esfriamento (0oC - 15oC) e por congelamento (<0oC). Algumas cultivares de plantas agrícolas podem ser particularmente sensíveis à tensão ao frio, mas as características de tolerância ao frio podem ser multigênicas, dificultando o processo de reprodução. Os endófitos capazes de conferir tolerância ao frio poderiam potencialmente reduzir os danos sofridos anualmente pelos agricultores. A resposta melhorada da tensão ao frio pode ser medida pela sobrevivência das plantas, pela quantidade de necrose de partes da planta ou por uma mudança na perda de rendimento da cultura, bem como os parâmetros fisiológicos utilizados em outros exemplos. Portanto, em uma modalidade, a planta que contém o endófito capaz de conferir uma tolerância ao frio aumen-tada exibe uma diferença em um parâmetro fisiológico que é pelo menos aproximadamente 5% maior, por exemplo, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 8%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% ou pelo menos 100%, pelo menos cerca de 200%, pelo menos cerca de 300%, pelo menos cerca de 400% maior ou mais a uma planta agrícola de referência cultivada sob as mesmas condições de tensão por frio. Tensão biótica

[0345] Em outra modalidade, uma cepa de endófito único ou pluralidade de endófitos protege a planta de um tensão biótica, por exemplo, infestação de insetos, infestação de nemátodos, infecção complexa, infecção por fungos, infecção por oomicetos, infecção por protozoários, infecção viral e pastagem de herbívoros, ou uma combinação dos mesmos. Por exemplo, o endófito pode proporcionar um benefício ou tolerância melhorados para uma planta que seja de pelo menos 3%, entre 3% e 5%, pelo menos 5%, entre 5% e 10%, pelo menos 10%, entre 10% e 15%, pelo menos, 15%, entre 15% e 20%, pelo menos 20%, entre 20% e 30%, pelo menos 30%, entre 30% e 40%, pelo menos 40%, entre 40% e 50%, pelo menos 50%, entre 50% e 60%, pelo menos 60%, entre 60% e 75%, pelo menos 75%, entre 75% e 100%, ou pelo menos 100%, em comparação com plantas não inoculadas cultivadas nas mesmas condições. Herbivoração de insetos

[0346] Há uma abundância de espécies de insetos que podem in- fectar ou infestar uma grande variedade de plantas. A infestação de pragas pode causar danos significativos. As pragas de insetos que in-festam espécies de plantas são particularmente problemáticas na agri-cultura, pois podem causar sérios danos às culturas e reduzir significa-tivamente os rendimentos das plantas. Uma grande variedade de dife-rentes tipos de plantas são suscetíveis à infestação de pragas, incluindo culturas comerciais, como algodão, soja, trigo, cevada e milho.

[0347] Em algumas modalidades, os endófitos aqui descritos conferem à planta hospedeira a capacidade de repelir herbívoros de insetos. Em outros casos, os endófitos podem produzir, ou induzir a produção na planta de compostos que são insecticidas ou repelentes de insetos. O inseto pode ser qualquer um dos insetos patogênicos comuns que afetam plantas, particularmente plantas agrícolas. Exemplos incluem, mas não estão limitados a:Leptinotarsa spp. (por exemplo, L. decemlineata (besouro da batata do Colorado), L. juncta (besouro de batata falso), ou L. texana (besouro de batata falso texano)); Nilapar- vata spp. (por exemplo, N. lugens (marfim marrom)); Laode/phax spp. (por exemplo, L. striatellus (Fulgoromorpha pequena marrom)); Nephotettix spp. (por exemplo, N. virescens ou N. cincticeps (cigarra verde), ou N. nigropictus (cigarrinha do norte)); Sogatella spp. (por exemplo, S. furcifera (Fulgoromorpha com traseira branca)); Chilo spp. (por exemplo, C. suppressalis (barradeira de caule de arroz), C. auri- cilius (broca de caule dourado), ou C. polychrysus (broca de caule es-curo)); Sesamia spp. (por exemplo, S. inferens (broca de arroz rosa)); Tryporyza spp. (por exemplo, T. innotata (broca de arroz branco), ou T. incertulas (broca de arroz amarelo)); Anthonomus spp. (por exemplo, A. grandis (bicudo do algodoeiro)); Phaedon spp. (por exemplo, P. cochleariae (besouro da folha de mostarda)); Epilachna spp. (por exemplo, E. varivetis (besouro do feijão mexicano)); Tribolium spp. (por exemplo, T. castaneum (besouro do piso vermelho)); Diabrotica spp. (por exemplo, D. virgifera (crisomelídeo do milho do oeste), D. barberi (crisomelídeo do milho do norte), D. undecimpunctata howardi (crisomelídeo do milho do sul), D. virgifera zeae (crisomelídeo do milho mexicano); Ostrinia spp. (por exemplo,O. nubilalis (broca do milho europeu)); Anaphothrips spp. (por exemplo, A. obsirurus (grama thrips)); Pectinophora spp. (por exemplo, P. gossypiella (lagarta rosada do algodão)); Heliothis spp. (por exemplo, H. virescens (rúpia do tabaco)); Trialeurodes spp. (por exemplo, T. abutiloneus (mosca branca com asas) T. vaporariorum (mosca branca de estufa)); Bemisia spp. (por exemplo, B. argentifolii (mosca branca prateada)); Aphis spp. (por exemplo, A. gossypii (pulgão de algodão)); Lygus spp. (por exemplo, L. lineolaris (inseto de planta manchada) ou L. hesperus (inseto de planta manchada ocidental)); Euschistus spp. (por exemplo, E. conspersus (percevejo marrom)); Chlorochroa spp. (por exemplo, C. sayi (percevejo verde)); Nezara spp. (por exemplo, N. viridula (percevejo verde do sul)); Thrips spp. (por exemplo, T. tabaci (thrips da cebola)); Frankliniella spp. (por exemplo, F. fusca (thrips do tabaco), ou F. occidentalis (thrips de flor ocidental)); Acheta spp. (por exemplo, A. domesticus (grilo doméstico)); Myzus spp. (por exemplo, M. persi- cae (pulgão de pêssego verde)); Macrosiphum spp. (por exemplo, M. euphorbiae (pulgão de batata)); Blissus spp. (por exemplo, B. leucop- terus (percevejo preto)); Acrosternum spp. (por exemplo, A. hilare (percevejo verde)); Chilotraea spp. (por exemplo, C. polychrysa (broca de caule de arroz)); Lissorhoptrus spp. (por exemplo, L. oryzophilus (bicudo da água do arroz)); Rhopalosiphum spp. (por exemplo, R. maidis (pulgão da folha de milho)); Anuraphis spp. (por exemplo, A. maidiradicis (pulgão da raiz do milho)) e combinações dos mesmos.

[0348] A planta associada ao endófito pode ser testada quanto à sua capacidade de resistir, ou repelir, insetos patogênicos, por exemplo, carga de insetos, biomassa total da planta, biomassa da fruta ou grão, porcentagem de folhas intactas ou outros parâmetros fisiológicos descritos aqui, e comparando com uma planta agrícola de referência. Em algumas modalidades, a planta associada ao endófito exibe biomassa aumentada em comparação com uma planta agrícola de referência cultivada nas mesmas condições (por exemplo, cultivada lado a lado ou adjacente a plantas associadas ao endófito). Em outras modalidades, a planta associada ao endófito exibe produção de fruto ou grão aumentada em comparação com uma planta agrícola de referência cultivada nas mesmas condições (por exemplo, cultivada lado a lado ou adjacente a plantas associadas ao endófito). Em qualquer um dos acima, o endófito pode proporcionar um benefício ou tolerância melhorados para uma planta que seja de pelo menos 3%, entre 3% e 5%, pelo menos 5%, entre 5% e 10%, pelo menos 10%, entre 10% e 15%, pelo menos, 15%, entre 15% e 20%, pelo menos 20%, entre 20% e 30%, pelo menos 30%, entre 30% e 40%, pelo menos 40%, entre 40% e 50%, pelo menos 50%, entre 50% e 60%, pelo menos 60%, entre 60% e 75%, pelo menos 75%, entre 75% e 100%, ou pelo menos 100%, em comparação com plantas não inoculadas cultivadas nas mesmas condições. Nemátodos

[0349] Os nemátodos são lombrigas microscópicos que se alimentam das raízes, fluidos, folhas e caules de mais de 2.000 colheitas, legumes, frutas e plantas ornamentais, causando uma perda estimada de $100 bilhões de culturas em todo o mundo e representando 13% das perdas de culturas globais devido à doença. Uma variedade de espécies de nemátodos parasitas infectam plantas de cultivo, incluindo nemátodos de nódulo de raiz (RKN), nemátodos formadores de cisto e lesão. Os nemátodos de nódulos de raiz, que se caracterizam por causar formação de vesículas radiculares nos locais de alimentação, têm uma variedade de hospedeiros relativamente ampla e, portanto, são parasitas em um grande número de espécies de culturas. As espécies de nemátodos que formam cisto e lesão têm uma variedade de hospedeiro mais limitada, mas ainda causam perdas consideráveis em culturas susceptíveis.

[0350] Sinais de danos nos nemátodos incluem o encolhimento e amarelecimento das folhas, e murchamento das plantas durante períodos quentes. A infestação de nemátodos, no entanto, pode causar perdas significativas de rendimento sem sintomas evidentes de doença acima do solo. As principais causas de redução do rendimento são devidas ao dano radicular subterrâneo. As raízes infectadas por SCN são prejudicadas ou enfraquecidas. A infestação de nemátodos também pode diminuir o número de nódulos de fixação de nitrogênio nas raízes e pode tornar as raízes mais suscetíveis a ataques de outros nemátodos de plantas no solo.

[0351] Em algumas modalidades, a planta associada ao endófito tem uma maior resistência a um nemátodo quando comparada com uma planta agrícola de referência. Como antes, com os herbívoros de insetos, a biomassa da planta ou uma porção da planta, ou qualquer um dos outros parâmetros fisiológicos mencionados em outros lugares, pode ser comparada com a planta agrícola de referência cultivada nas mesmas condições. Medições particularmente úteis incluem biomassa total da planta, biomassa e/ou tamanho da fruta ou grão, e biomassa da raiz. Em algumas modalidades, a planta associada ao endófito exibe biomassa aumentada em comparação com uma planta agrícola de referência cultivada nas mesmas condições (por exemplo, cultivada lado a lado ou adjacente a plantas associadas ao endófito, sob condições de desafio de nemátodos). Em outras modalidades, a planta associada ao endófito exibe biomassa de raiz aumentada em comparação com uma planta agrícola de referência cultivada nas mesmas condições (por exemplo, cultivada lado a lado ou adjacente a plantas as- sociadas ao endófito). Em ainda outras modalidades, a planta associada ao endófito exibe produção de fruto ou grão aumentada em comparação com uma planta agrícola de referência cultivada nas mesmas condições (por exemplo, cultivada lado a lado ou adjacente a plantas associadas ao endófito). Em qualquer um dos acima, o endófito pode proporcionar um benefício ou tolerância melhorados para uma planta que seja de pelo menos 3%, entre 3% e 5%, pelo menos 5%, entre 5% e 10%, pelo menos 10%, entre 10% e 15%, pelo menos, 15%, entre 15% e 20%, pelo menos 20%, entre 20% e 30%, pelo menos 30%, entre 30% e 40%, pelo menos 40%, entre 40% e 50%, pelo menos 50%, entre 50% e 60%, pelo menos 60%, entre 60% e 75%, pelo menos 75%, entre 75% e 100%, ou pelo menos 100%, em comparação com plantas não inoculadas cultivadas nas mesmas condições. Patógenos fúngicos

[0352] As doenças fúngicas são responsáveis por perdas anuais de mais de $10 bilhões em culturas agrícolas nos EUA, representam 42% das perdas globais de culturas por doenças e são causadas por uma grande variedade de agentes patogênicos biologicamente diversos. Diferentes estratégias têm sido usadas tradicionalmente para controlá-las. As características de resistência foram criadas em variedades de importância agrícola, proporcionando assim vários níveis de resistência contra uma variedade restrita de isolados ou raças de patóge- nos, ou contra uma variedade mais ampla. No entanto, isso envolve o longo e intensivo processo de introdução de características desejáveis em linhagens comerciais por cruzamentos genéticos e, devido ao risco de que as pragas evoluam para superar a resistência natural das plantas, é necessário um esforço constante para produzir novas características de resistência em linhagens comerciais. Alternativamente, as doenças fúngicas foram controladas pela aplicação de fungicidas químicos. Esta estratégia geralmente resulta em controle eficiente, mas também está associada ao possível desenvolvimento de agentes pa-togênicos resistentes e pode ser associada a um impacto negativo no meio ambiente. Além disso, em certas culturas, como cevada e trigo, o controle de patógenos fúngicos por fungicidas químicos é difícil ou im-praticável.

[0353] A presente invenção contempla a utilização de uma cepa de endófito único ou de uma pluralidade de endófitos que é capaz de conferir resistência a patógenos fúngicos à planta hospedeira. O aumento da resistência à inoculação de fungos pode ser medido, por exemplo, usando qualquer dos parâmetros fisiológicos apresentados acima, comparando com plantas agrícolas de referência. Em algumas modalidades, a planta associada ao endófito exibe biomassa aumentada e/ou sintomas de doença menos pronunciados em comparação com uma planta agrícola de referência cultivada nas mesmas condições (por exemplo, cultivada lado a lado ou adjacente às plantas associadas ao endófito, infectado com o patógeno fúngico). Em ainda uma outra modalidades, a planta associada ao endófito exibe produção de fruto ou grão aumentada em comparação com uma planta agrícola de referência cultivada nas mesmas condições (por exemplo, cultivada lado a lado ou adjacente a plantas associadas ao endófito, infectada com o patógeno fúngico). Em outras modalidades, a planta associada ao endófito exibe diminuição do crescimento das hifas em comparação com uma planta agrícola de referência cultivada nas mesmas condições (por exemplo, cultivada lado a lado ou adjacente a plantas associadas ao endófito, infectada com o patógeno fúngico). Em qualquer um dos acima, o endófito pode proporcionar um benefício ou tolerância melhorados para uma planta que seja de pelo menos 3%, entre 3% e 5%, pelo menos 5%, entre 5% e 10%, pelo menos 10%, entre 10% e 15%, pelo menos, 15%, entre 15% e 20%, pelo menos 20%, entre 20% e 30%, pelo menos 30%, entre 30% e 40%, pelo menos 40%, entre 40% e 50%, pelo menos 50%, entre 50% e 60%, pelo menos 60%, entre 60% e 75%, pelo menos 75%, entre 75% e 100%, ou pelo menos 100%, em comparação com plantas não inoculadas cultivadas nas mesmas condições. Patógenos virais

[0354] Os vírus das plantas são estimados em 18% das perdas globais de colheitas devido à doença. Existem inúmeros exemplos de agentes patogênicos virais que afetam a produtividade agrícola. Exemplos incluem o vírus do mosaico estriado do trigo estriado americano (AWSMV) (mosaico estriado do trigo), vírus do mosaico de raiz da cevada (BSMV), vírus anão amarelo da cevada (BYDV), vírus do mosaico de Brome (BMV), vírus da mancha clorótica de cereais (CCMV), vírus de bandas de veias cloróticas do milho (CCVBV), vírus do mosaico do milho brasileiro, complexo viral da necrose letal do milho da mancha clorótica de milho (MCMV), vírus do mosaico anão do milho (MDMV), vírus do mosaico do raio do trigo A ou B (WSMV), vírus do mosaico do pepino (CMV), vírus da raia clorótica de Cynodon (CCSV), vírus do mosaico dagrama Johnson (JGMV), vírus associado ao transtorno espessante do milho (MLO) de organismos semelhantes a micoplasma, vírus anão clorótico do milho de anão clorótico do milho (MCDV), vírus da mancha clorótica do milho (MCMV), vírus do mosaico anão do milho (MDMV), cepas A, D, E e F, vírus da folha do milho (MLFV), vírus da linhagem do milho (MLV), mosaico do milho (risca de folhas de milho, vírus do mosaico de milho (MMV), enanismo rayado), vírus da mancha do milho e do transtorno clorótico, vírus da anêmona transparente do milho (MPRV), vírus raya gruesa do milho (MRGV), vírus de milho-rayado fino (risca fina) (MRFV), vírus da risca vermelha do milho (MRSV), vírus da mancha de anel do milho (MRMV), vírus rio cuarto do milho (MRCV), vírus anão grosseiro do milho (MRDV), vírus da doença do perfilhamento de cereais, vírus do transtorno estéril do milho, vírus estriado amarelo da cevada, vírus da raia do milho (MSV), vírus da risca do milho, vírus da risca clorótica do milho, vírus hoja blanca do milho, vírus do transtorno do milho; vírus do aborta de borla do milho (MTAV), vírus da veiculação do milho (MVEV), vírus do milho de Wallaby (MWEV), vírus da folha branca do milho, vírus do mosaico da risca branca do milho (MWLMV), vírus da folha vermelha do painço (MRLV), vírus do mosaico do cereal do norte (NCMV), vírus da pseu- dorosta da aveia, (zakuklivanie), vírus anão estéril da aveia (OSDV), vírus anão do arroz preto (RBSDV), vírus da risca do arroz (RSV), vírus do mosaico do sorgo (SrMV), vírus do mosaico da cana-de-açúcar (SCMV) cepas H, 1 e M, vírus da doença da cana-de-açúcar Fiji (FDV), vírus do mosaico da cana-de-açúcar (SCMV) cepas A, B, D, E, SC, BC, Sabi e MB (anteriormente MDMV-B), e vírus do mosaico do ponto de trigo (WSMV). Em uma modalidade, a planta associada ao endófito proporciona proteção contra agentes patogênicos virais de tal modo que haja uma biomassa de pelo menos 5% maior, por exemplo, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 100% ou mais de biomassa, do que a planta agrícola de referência cultivada nas mesmas condições. Em ainda uma outra modalidade, a planta associada ao endófito exibe pelo menos 5% mais rendimento de fruta ou grão, por exemplo, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 100% ou mais rendimento de fruta ou grão quando desafiada com um vírus, em comparação com uma planta agrícola de referência cultivada nas mesmas condições. Em ainda uma outra modalidade, a planta associada ao endófito exibe pelo menos 5% de título viral inferior, por exemplo, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos, 75%, pelo menos, um título viral inferior a 100% quando desafiada com um vírus, em comparação com uma planta agrícola de referência cultivada nas mesmas condições. Patógenosbacterianos

[0355] Da mesma forma, patógenos bacterianos são um problema significativo que afeta negativamente a produtividade agrícola e repre-senta 27% das perdas globais de culturas devido à doença das plantas. Em uma modalidade, a planta associada ao endófito descrita aqui proporciona proteção contra patógenos bacterianos de tal modo que haja pelo menos 5% mais de biomassa, por exemplo, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 100% ou mais de biomassa, do que a planta agrícola de referência cultivada nas mesmas condições. Em ainda uma outra modalidade, a planta associada ao endófito exibe pelo menos 5% mais rendimento de fruta ou grão, por exemplo, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 100% ou mais rendimento de fruta ou grão quando desafiada com um patógeno bacteriano do que a planta agrícola de referência cultivada nas mesmas condições. Em ainda uma outra modalidade, a planta associada ao endófito exibe pelo menos 5% menos de contagem bacteriana, por exemplo, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 100% menos de contagem bacteriana quando desafiada com uma bactéria, em comparação com uma planta agrícola de referência cultivada nas mesmas condições. Melhoria do rendimento e biomassa

[0356] Em outras modalidades, a característica melhorada pode ser um aumento na biomassa global da planta ou uma parte da planta, incluindo sua fruta ou semente. Em algumas modalidades, uma cepa de endófito único ou uma pluralidade de endófitos está disposta na su-perfície ou dentro de um tecido do elemento de planta em uma quantidade eficaz para aumentar a biomassa da planta, ou uma parte ou tecido da planta cultivada a partir do elemento de planta. O aumento da biomassa é útil na produção de produtos de base derivados da planta. Esses produtos de base incluem uma alimentação animal, uma forragem de peixe, um produto de cereais, um alimento humano processado, um açúcar ou um álcool. Tais produtos podem ser um produto de fermentação ou um produto fermentável, um desses produtos exempli- ficativos é um biocombustível. O aumento da biomassa pode ocorrer em uma parte da planta (por exemplo, o tecido radicular, rebentos, folhas, etc.), ou pode ser um aumento na biomassa total. Aumento da produção de biomassa, tal aumento no sentido de pelo menos 3%, entre 3% e 5%, pelo menos 5%, entre 5% e 10%, pelo menos 10%, entre 10% e 15%, por exemplo, pelo menos 15%, entre 15% e 20%, pelo menos 20%, entre 20% e 30%, pelo menos 30%, entre 30% e 40%, pelo menos 40%, entre 40% e 50%, pelo menos 50%, entre 50% e 60%, pelo menos 60%, entre 60% e 75%, pelo menos 75%, entre 75% e 100%, ou pelo menos 100%, em comparação com plantas não inoculadas cultivadas nas mesmas condições. Esse aumento na biomassa total pode estar em condições relativamente isentas de tensão. Em outros casos, o aumento da biomassa pode ser em plantas cultivadas sob qualquer número de estresses abióticos ou bióticos, incluinda tensão por seca, tensão salino, tensão por calor, tensão por frio, tensão de nutrientes baixos, tensão por nemátodo, tensão por herbívoro de insetos, tensão por patógenos fúngicos, tensão por patógenos bacteri- anos e tensão de agentes patogênicos virais. Em algumas modalidades, uma pluralidade de endófitos está disposta em uma quantidade eficaz para aumentar a biomassa da raiz em pelo menos 3%, entre 3% e 5%, pelo menos 5%, entre 5% e 10%, pelo menos 10%, entre 10% e 15%, por exemplo, pelo menos 15%, entre 15% e 20%, pelo menos 20%, entre 20% e 30%, pelo menos 30%, entre 30% e 40%, pelo menos 40%, entre 40% e 50%, pelo menos 50%, entre 50% e 60%, pelo menos 60%, entre 60% e 75%, pelo menos 75%, entre 75% e 100%, ou pelo menos 100%, quando comparado com plantas não inoculadas cultivadas nas mesmas condições, em comparação com uma planta agrícola de referência.

[0357] Em outros casos, uma pluralidade de endófitos é disposta no elemento da planta em uma quantidade eficaz para aumentar a biomassa média da fruta ou do sabugo da planta resultante pelo menos 3%, entre 3% e 5%, pelo menos 5%, entre 5% e 10%, pelo menos, 10%, entre 10% e 15%, por exemplo, pelo menos 15%, entre 15% e 20%, pelo menos 20%, entre 20% e 30%, pelo menos 30%, entre 30% e 40%, pelo menos 40%, entre 40% e 50%, pelo menos 50%, entre 50% e 60%, pelo menos 60%, entre 60% e 75%, pelo menos 75%, entre 75% e 100%, ou pelo menos 100%, em comparação com plantas não inoculadas cultivadas nas mesmas condições. Aumento dos hormônios de crescimento das plantas

[0358] Muitos dos micróbios aqui descritos são capazes de produzir o ácido hormonal de auxina indol-3-acético (IAA) quando cultivado em cultura. A auxina pode desempenhar um papel fundamental na alteração da fisiologia da planta, incluindo a extensão do crescimento radicular. Portanto, em outras modalidades uma cepa de endófito único ou uma pluralidade de endófitos está disposta na superfície ou dentro de um tecido do elemento de planta em uma quantidade eficaz para induzir de forma detectável a produção de auxina na planta agrícola. Por exemplo, o aumento da produção de auxina pode ser pelo menos 2%, pelo menos 3%, pelo menos 4%, pelo menos 5%, pelo menos 6%, pelo menos 7%, pelo menos 8%, pelo menos 9%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, por exemplo, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 75%, pelo menos 100% ou mais, quando comparado com uma planta agrícola de referência. Em algumas modalidades, a produção aumentada de auxina pode ser detectada em um tipo de tecido selecionado do grupo que consiste em raiz, rebento, folhas e flores.

[0359] Melhoria de outras características. Em outras modalidades, uma cepa de endófito único ou uma pluralidade de endófitos podem conferir outras características benéficas à planta. As características melhoradas podem incluir um conteúdo nutricional melhorado da planta ou elemento de planta usado para consumo humano. Em algumas modalidades, a planta associada a endófitos é capaz de produzir uma alteração detectável no conteúdo de pelo menos um nutriente. Exemplos de tais nutrientes incluem aminoácido, proteína, óleo (incluindo qualquer um de ácido oleico, ácido linoleico, ácido alfalinoleico, ácidos graxos saturados, ácido palmítico, ácido esteárico e gorduras trans), carboidratos (incluindo açúcares como sacarose, glicose e frutose, amido ou fibra dietética), vitamina A, tiamina (vit. B1), riboflavina (vit. B2), niacina (vit. B3), ácido pantotênico (B5), vitamina B6, folato (vit. B9), colina, vitamina C, vitamina E, vitamina K, cálcio, ferro, magnésio, manganês, fósforo, potássio, sódio, zinco. Em algumas modalidades, a planta associada ao endófito ou a sua parte contém pelo menos um nutriente aumentado quando comparado com plantas agrícolas de referência.

[0360] Em outros casos, a característica melhorada pode incluir conteúdo reduzido de uma substância prejudicial ou indesejável quando comparada com plantas agrícolas de referência. Tais compostos incluem aqueles que são prejudiciais quando ingeridos em grandes quantidades ou têm gosto amargo (por exemplo, ácido oxálico, amig- dalina, certos alcaloides, como solanina, cafeína, nicotina, quinina e morfina, taninos, cianeto). Como tal, em algumas modalidades, a plan ta associada ao endófito ou sua parte contém menos da substância indesejável quando comparada com a planta agrícola de referência. Em uma modalidade relacionada, a característica melhorada pode incluir um sabor melhorado da planta ou uma parte da planta, incluindo a fruta ou a semente. Em uma modalidade relacionada, a característica melhorada pode incluir a redução de compostos indesejáveis produzidos por outros endófitos em plantas, tais como a degradação do deso- xinivalenol produzido por Fusarium (também conhecido como vomito- xina e um fator de virulência envolvido na fusariose de milho e trigo) em uma parte da planta, incluindo a fruta ou a semente.

[0361] A planta associada ao endófito também pode ter um estado hormonal alterado ou níveis alterados de produção hormonal em com-paração com uma planta agrícola de referência. Uma alteração no estado hormonal pode afetar muitos parâmetros fisiológicos, incluindo tempo de floração, eficiência da água, dominância apical e/ou ramificação lateral, aumento da raiz radicular e alteração na amadurecimento do fruto.

[0362] A associação entre os endófitos e a planta também pode ser detectada usando outros métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, os perfis bioquímicos, genômicos, epigenômicos, transcrip- tômicos, metabolômicos e/ou proteômicos de plantas associadas a endófitos podem ser comparados com plantas agrícolas de referência nas mesmas condições.

[0363] A análise do transcriptoma de plantas agrícolas endófitas e de referência também pode ser realizada para detectar mudanças na expressão de pelo menos uma transcrição, ou um conjunto ou rede de genes após associação de endófitos. Da mesma forma, mudanças epigenéticas podem ser detectadas usando imunoprecipitação com DNA metilado seguido de sequenciamento de alto rendimento.

[0364] Diferenças metabólicas ou proteômicas entre as plantas podem ser detectadas usando métodos conhecidos na técnica. Os me- tabolitos, proteínas ou outros compostos aqui descritos podem ser de-tectados usando qualquer método adequado incluindo, mas não limitado à cromatografia em fase de eletroforese em gel, líquida e em fase gasosa, isolada ou acoplada à espectrometria de massa, NMR, imu- noensaios (ensaios de imunoabsorção enzimática ELISA)), ensaios químicos, espectroscopia e semelhantes. Em algumas modalidades, são utilizados sistemas comerciais para cromatografia e análise de NMR. Esses métodos metabolômicos podem ser usados para detectar diferenças em níveis de hormônio, nutrientes, metabolitos secundários, exsudatos radiculares, conteúdo de seiva do floema, conteúdo de seiva do xilema, conteúdo de metais pesados e semelhantes. Tais métodos também são úteis para detectar alterações no conteúdo e status do endófito; por exemplo, a presença e os níveis de moléculas de sina-lização (por exemplo, autoindutores e feromonas), que podem indicar o estado do comportamento baseado em grupo dos endófitos com base, por exemplo, na densidade populacional. Em algumas modalidades, uma amostra biológica (tecido inteiro, exsudato, seiva de floema, seiva de xilema, exsudato de raiz, etc.) de plantas agrícolas associadas a endófitos e de referência pode ser analisada essencialmente como é conhecido na técnica.

[0365] Em algumas modalidades, os metabolitos nas plantas podem ser modulados, criando combinações sintéticas de plantas com pluralidades de endófitos. Por exemplo, uma pluralidade de endófitos pode causar uma modulação detectável (por exemplo, um aumento ou diminuição) no nível de vários metabolitos, por exemplo, ácido indol-3- carboxílico, trans-zeatina, ácido abscísico, ácido fásico, ácido indol-3- acético, ácido indol-3-butírico, ácido indol-3-acrílico, ácido jasmônico, metil éster do ácido jasmônico, ácido dihidrofásico, giberelina A3, ácido salicílico, após colonização de uma planta.

[0366] Em algumas modalidades, uma cepa de endófito único ou uma pluralidade de endófitos modula o nível do metabolito diretamente (por exemplo, os micróbios produzem o metabolito, resultando em um aumento geral no nível do metabolito encontrado na planta). Em outros casos, a planta agrícola, como resultado da associação com a plurali-dade de endófitos, exibe um nível modulado do metabolito (por exemplo, a planta reduz a expressão de uma enzima biossintética responsável pela produção do metabolito como resultado da inoculação de micróbios). Ainda em outros casos, a modulação no nível do metaboli- to é consequência da atividade do micróbio e da planta (por exemplo, a planta produz quantidades aumentadas do metabolito quando comparada com uma planta agrícola de referência e o endófito também produz o metabolito). Portanto, tal como aqui utilizado, uma modulação no nível de um metabolito pode ser uma alteração no nível do metabo- lito através das ações do micróbio e/ou da planta inoculada.

[0367] Os níveis de um metabolito podem ser medidos em uma planta agrícola e comparados com os níveis do metabolito em uma planta agrícola de referência e cultivados nas mesmas condições que a planta inoculada. A planta não inoculada que é utilizada como planta agrícola de referência é uma planta que não foi aplicada com uma formulação com a pluralidade de endófitos (por exemplo, uma formulação compreendendo uma pluralidade de populações de endófitos purificados). A planta não inoculada utilizada como planta agrícola de referência é geralmente a mesma espécie e cultivar e é isogênica na planta inoculada.

[0368] O metabolito cujos níveis são modulados (por exemplo, aumentados ou diminuídos) na planta associada ao endófito pode servir como nutriente primário (isto é, fornece nutrição para os seres humanos e/ou animais que consomem a planta, o tecido da planta ou o produto vegetal de base derivado dela, incluindo, mas não limitado a, um açúcar, um amido, um carboidrato, uma proteína, um óleo, um ácido gordo ou uma vitamina). O metabolito pode ser um composto que é importante para o crescimento, desenvolvimento ou homeostasia da planta (por exemplo, uma fitormônio, como uma auxina, citoquinina, giberelina, um brassinosteroide, etileno ou ácido abscíssico, uma mo-lécula de sinalização ou um antioxidante). Em outras modalidades, o metabolito pode ter outras funções. Por exemplo, em algumas modali-dades, um metabolito pode ter propriedades bacteriostáticas, bacteri- cidas, fungistáticas, fungicidas ou antivirais. Em outras modalidades, o metabolito pode ter propriedades repelentes de insetos, insecticidas, repelentes de nemátodos ou nematicidas. Em ainda outras modalidades, o metabolito pode desempenhar um papel na proteção da planta contra estresses, pode ajudar a melhorar o vigor da planta ou a saúde geral da planta. Em ainda outras modalidades, o metabolito pode ser um composto útil para a produção industrial. Por exemplo, o próprio metabolito pode ser um composto útil que é extraído para uso industrial ou serve como intermediário para a síntese de outros compostos utilizados na indústria. Em uma modalidade particular, o nível do me- tabolito é aumentado dentro da planta agrícola ou uma porção da mesma, tal que está presente em uma concentração de pelo menos 0,1 ug/g de peso seco, por exemplo, pelo menos 0,3 ug/g de peso seco, entre 0,3 ug/g e 1,0 ug/g de peso seco, pelo menos 1,0 ug/g de peso seco, entre 1,0 ug/g e 3,0 ug/g de peso seco, pelo menos 3,0 ug/g de peso seco, entre 3,0 ug/g e 10 ug/g de peso seco, pelo menos 10 ug/g de peso seco, entre 10 ug/g e 30 ug/g de peso seco, pelo menos 30 ug/g de peso seco, entre 30 ug/g e 100 ug/g de peso seco, pelo menos 100 ug/g de peso seco, entre 100 ug/g e 300 ug/g de peso seco, pelo menos 300 ug/g de peso seco, entre 300 ug/g e 1 mg/g de peso seco ou mais de 1 mg/g de peso seco, da planta ou porção da mesma.

[0369] Da mesma forma, a modulação pode ser uma diminuição no nível de um metabolito. A redução pode ser em um metabolito que afeta o sabor de uma planta ou um produto da planta de base derivado de uma planta (por exemplo, um composto de gosto amargo), ou em um metabolito que faz uma planta ou o produto da planta de base resultante de outra forma menos valioso (por exemplo, redução do teor de oxalato em certas plantas, ou compostos que são deletérios para a saúde humana e/ou animal). O metabolito cujo nível deve ser reduzido pode ser um composto que afeta a qualidade de um produto vegetal de base (por exemplo, redução dos níveis de lignina). Produto vegetal de base

[0370] A presente invenção proporciona um produto vegetal de base, bem como métodos para a produção de um produto vegetal de base, que é derivado de uma planta da presente invenção. Tal como aqui utilizado, um "produto vegetal de base" se refere a qualquer composição ou produto que seja que consiste por material derivado de uma planta, semente, célula vegetal ou parte de planta da presente invenção. Os produtos de base podem ser vendidos aos consumidores e podem ser viáveis ou não viáveis. Os produtos de base não viáveis incluem, mas não estão limitados, a sementes e grãos não viáveis; sementes processadas, partes da semente, e partes do vegetal; tecido do vegetal desidratado, tecido do vegetal congelado e tecido do vegetal transformado; sementes e partes do vegetal processadas para rações para consumo de animal terrestre ou aquático, óleo, refeição, farinha, flocos, farelo, fibra, papel, chá, café, silagem, esmagado de grãos inteiros e qualquer outro alimento para consumo humano ou animal; e biomassas e produtos combustíveis; e matéria-prima de indústria. Os usos industriais de óleos derivados das plantas agrícolas aqui descritas incluem ingredientes para tintas, plásticos, fibras, detergentes, cosméticos, lubrificantes e biodiesel. O óleo de soja pode ser dividido, interesterificado, sulfatado, epoxidado, polimerizado, etoxilado ou clivado. Projetar e produzir derivados de óleo de soja com funciona-lidade melhorada e oligoquímica melhorada é um campo em rápido crescimento. A mistura típica de triglicerídeos é geralmente dividida e separada em ácidos graxos puros, que são então combinados com álcoois ou ácidos derivados de petróleo, nitrogênio, sulfonatos, cloro ou com álcoois graxos derivados de gorduras e óleos para produzir o tipo desejado de óleo ou gordura. Os produtos vegetais de base também incluem compostos industriais, como uma grande variedade de resinas utilizadas na formulação de adesivos, películas, plásticos, tintas, revestimentos e espumas.

[0371] Em alguns casos, os produtos de plantas de produtos derivados das plantas, ou a utilização dos métodos da presente invenção podem ser facilmente identificados. Em alguns casos, por exemplo, a presença de endófitos viáveis pode ser detectada usando os métodos descritos aqui em outro lugar. Em outros casos, particularmente quando não há endófitos viáveis, o produto da planta pode ainda conter pelo menos uma quantidade detectável do DNA específico e exclusivo correspondente aos micróbios aqui descritos. Qualquer método de detecção padrão para moléculas de polinucleotídeo pode ser usado, incluindo métodos de detecção divulgados neste documento. Formulações para uso agrícola

[0372] A presente invenção contempla uma combinação sintética de um elemento de planta que está associado a uma cepa de endófito único ou a uma pluralidade de endófitos para conferir uma característica melhorada de importância agronômica para a planta hospedeira ou um potencial de característica agronômica melhorado para um elemento de planta associado à endófitos, que após e depois da germinação conferirá o referido benefício à planta hospedeira resultante.

[0373] Em algumas modalidades, o elemento de planta está asso- ciado a uma cepa de endófito único ou a uma pluralidade de endófitos na sua superfície. Essa associação é contemplada para ser através de um mecanismo selecionado do grupo que consiste em: pulverização, imersão, revestimento, encapsulamento, remoção de pó, gotejamento, aerossolização, tratamento de sementes, lavagem de raízes, absorção de plântulas, aplicação foliar, inóculos de solo, aplicação de sulco, aplicação lateral, pré-tratamento de solo, inoculação de feridas, irrigação por gotejamento, mediação vetorial através de um polinizador, injeção, osmopriming, hidroponia, aquapônica e aeropônica.

[0374] Em algumas modalidades, o elemento de planta é uma folha e a combinação sintética é formulada para aplicação como tratamento foliar.

[0375] Em algumas modalidades, o elemento de planta é uma semente, e a combinação sintética é formulada para aplicação como revestimento de semente.

[0376] Em algumas modalidades, o elemento de planta é uma raiz e a combinação sintética é formulada para aplicação como tratamento radicular.

[0377] Em certas modalidades, o elemento de planta torna-se associado a uma pluralidade de endófitos através de exposição retardada. Por exemplo, o solo em que um elemento de planta deve ser introduzido é primeiro tratado com uma composição compreendendo uma pluralidade de endófitos. Em outro exemplo, a área ao redor da planta ou elemento de planta é exposta a uma formulação que compreende uma pluralidade de endófitos, e o elemento de planta torna-se subsequentemente associado aos endófitos devido ao movimento do solo, do ar, da água, dos insetos, dos mamíferos, da intervenção humana, ou outros métodos.

[0378] O elemento de planta pode ser obtido a partir de qualquer planta agrícola. Em algumas modalidades, o elemento de planta da primeira planta é de uma planta monocotiledônea. Por exemplo, o elemento de planta da primeira planta é de uma planta de cereais. O elemento de planta da primeira planta pode ser selecionado do grupo consistindo de uma semente de milho, uma semente de trigo, uma semente de cevada, uma semente de arroz, uma semente de cana-de- açúcar, uma raiz de milho, uma raiz de trigo, uma raiz de cevada, uma raiz de cana-de-açúcar, uma raiz de arroz, uma folha de milho, uma folha de trigo, uma folha de cevada, uma folha de cana-de-açúcar ou uma folha de arroz. Em uma modalidade alternativa, o elemento de planta da primeira planta é de uma planta dicotiledônea. O elemento de planta da primeira planta pode ser selecionado do grupo que consiste em uma semente de algodão, uma semente de tomate, uma semente de canola, uma semente de pimenta, uma semente de soja, uma raiz de algodão, uma raiz de tomate, uma raiz de canola, uma raiz de pimenta, uma raiz de soja, uma folha de algodão, uma folha de tomate, uma folha de canola, uma folha de pimenta ou uma folha de soja. Em ainda uma outra modalidade, o elemento de planta da primeira planta pode ser de uma planta geneticamente modificada. Em outras modalidades, o elemento de planta da primeira planta pode ser um elemento de planta híbrido.

[0379] A combinação sintética pode compreender um elemento de planta da primeira planta que é esterilizado em superfície antes de se combinar com uma pluralidade de endófitos. Tal pré-tratamento antes do revestimento da semente com endófitos remove a presença de outros micróbios que podem interferir com a colonização, crescimento e/ou função ideais dos endófitos. A esterilização da superfície de sementes pode ser realizada sem matar as sementes como aqui descrito.

[0380] Uma cepa de endófito único ou uma pluralidade de endófi- tos pretende ser útil na melhoria de plantas agrícolas e, como tal, pode ser formulada com outras composições como parte de um veículo compatível com agricultura. É contemplado que tais veículos podem incluir, mas não se limitar a:tratamento de sementes, tratamento radi-cular, tratamento foliar, tratamento do solo. A composição carreadora com uma pluralidade de endófitos, pode ser preparada para aplicação agrícola como uma formulação líquida, sólida ou gasosa. A aplicação à planta pode ser obtida, por exemplo, como um pó para deposição su-perficial sobre folhas de plantas, como um spray para toda a planta ou elemento de planta selecionado, como parte de um gotejamento para o solo ou raízes, ou como um revestimento para a semente antes da plantação. Tais exemplos devem ser ilustrativos e não limitativos ao âmbito da invenção.

[0381] Em algumas modalidades, a presente invenção contempla elementos de planta que compreendem uma cepa de endófito único ou uma pluralidade de endófitos, e compreendendo ainda uma formulação. A formulação útil para essas modalidades geralmente compreende pelo menos um membro selecionado do grupo que consiste em um veículo compatível com a agricultura, um agente de pegajosidade, um estabilizador microbiano, um fungicida, um agente antibacteriano, um herbicida, um nematicida, um insecticida, um regulador de crescimento de plantas, um rodenticida e um nutriente.

[0382] Em alguns casos, uma cepa de endófito único ou uma pluralidade de endófitos é misturada com um veículo compatível com a agricultura. O veículo pode ser um veículo sólido ou veículo líquido. O veículo pode ser um ou mais de um número de veículos que conferem uma variedade de propriedades, tais como maior estabilidade, umec- tabilidade ou dispersabilidade. Agentes umectantes, tais como tensoa- tivos naturais ou sintéticos, que podem ser tensoativos não iônicos ou iônicos, ou uma combinação dos mesmos podem ser incluídos em uma composição da invenção. As emulsões água-em-óleo também podem ser utilizadas para formular uma composição que inclui uma pluralidade de endófitos. As formulações adequadas que podem ser preparadas incluem pós umectáveis, grânulos, géis, tiras de ágar ou grânulos, espessantes e semelhantes, partículas microencapsuladas e semelhantes, líquidos, tais como fluidos aquosos, suspensões aquosas, emulsões água-em-óleo, etc. A formulação pode incluir produtos de grãos ou leguminosas, por exemplo, grãos de terra ou feijão, caldo ou farinha derivados de grãos ou feijões, amido, açúcar ou óleo.

[0383] Em algumas modalidades, o veículo agrícola pode ser meio de crescimento de solo ou planta. Outros veículos agrícolas que podem ser utilizados incluem fertilizantes, óleos vegetais, umectantes ou combinações dos mesmos. Alternativamente, o veículo agrícola pode ser um sólido, como terra de diatomáceas, limão, sílica, alginato, argila, bentonita, vermiculita, semente, outros produtos vegetais e animais, ou combinações, incluindo grânulos, peletes ou suspensões. As misturas de qualquer dos ingredientes acima mencionados também são contempladas como veículos, tais como, mas não limitados a, pesta (farinha e argila de caulino), ágar ou pastilhas à base de farinha em lima, areia ou argila, etc. As formulações podem incluir fontes de alimento para os organismos cultivados, como a cevada, o arroz ou outros materiais biológicos, como semente, folha, raiz, elementos de planta, bagaço de cana, cascos ou talos do processamento de grãos, material vegetal ou madeira de rejeição do local de construção, serradura ou fibras pequenas de reciclagem de papel, tecido ou madeira. Outras formulações adequadas serão conhecidas dos versados na técnica.

[0384] Em algumas modalidades, a formulação pode compreender um agente de pegajosidade ou aderente. Tais agentes são úteis para combinar a população microbiana da invenção com veículos que podem conter outros compostos (por exemplo, agentes de controle que não são biológicos), para produzir uma composição de revestimento. Tais composições ajudam a criar revestimentos ao redor da planta ou elemento de planta para manter o contato entre o micróbio e outros agentes com a planta ou parte da planta. Em algumas modalidades, os aderentes são selecionados do grupo que consiste em: alginato, gomas, amidos, lecitinas, formononetina, álcool polivinílico, formononitato alcalino, hesperetina, acetato de polivinil, cefalinas, goma árabe, goma xantana, carragenina, PGA, outros biopolímeros, óleo mineral, polietileno glicol (PEG), polivinilpirrolidona (PVP), arabi- no-galactano, celulose de metil, copolímeros de PEG 400, quitosana, poliacrilamida, poliacrilato, poliacrilitril, glicerol, trimetilenoglicol, acetato de vinil, goma de gellan, poliestireno, polivinil, carboximetilcelulo- se, Gum Ghatti e copolímeros em bloco de polioxietileno- polioxibutileno. Outros exemplos de composições aderentes que podem ser utilizadas na preparação sintética incluem os descritos em EP 0818135, CA 1229497, WO 2013090628, EP 0192342, WO 2008103422 e CA 1041788, cada um dos quais é incorporado neste documento por referência na sua totalidade.

[0385] É também contemplado que a formulação pode ainda compreender um agente antiaglomerante.

[0386] A formulação também pode conter um tensoativo, agente umectante, emulsionante, estabilizante ou agente antiespumante. Exemplos não limitativos de tensoativos incluem misturas de nitrogê- nio-tensoativo, tais como Prefer 28 (Cenex), Surf-N (US), Inhance (Brandt), P-28 (Wilfarm) e Patrol (Helena); óleos de sementes esteri- ficados incluem Sun-It II (AmCy), MSO (UAP), Scoil (Agsco), Hasten (Wilfarm) e Mes-100 (Drexel); e tensoativos de organo-silicone incluem Silwet L77 (UAP), Silikin (Terra), Dyne-Amic (Helena), Kinetic (Helena), Sylgard 309 (Wilbur-Ellis) e Century (Precision), polissorba- to 20, polissorbato 80, Tween 20, Tween 80, Scattics, Alktest TW20, Canarcel, Peogabsorb 80, Triton X-100, Conco NI, Dowfax 9N, Ige- bapl CO, Makon, Neutronyx 600, Nonipol NO, Plytergent B, Renex 600, Solar NO, Sterox, Serfonic N, T-DET-N, Tergitol NP, Triton N, IGEPAL CA-630, Nonident P-40 e Pluronic. Em algumas modalidades, o tensoativo está presente em uma concentração entre 0,01% v/v a 10% v/v. Em outras modalidades, o tensoativo está presente em uma concentração entre 0,1% v/v a 1% v/v. Um exemplo de um agente antiespumante é Antifoam-C.

[0387] Em certos casos, a formulação inclui um estabilizante microbiano. Esse agente pode incluir um dessecante. Tal como aqui utilizado, um "dessecante" pode incluir qualquer composto ou mistura de compostos que podem ser classificados como dessecantes independentemente do composto ou os compostos serem utilizados em tais concentrações que de fato tenham um efeito de dessecação no inocu- lante líquido. Esses dessecantes são idealmente compatíveis com os endófitos utilizados e devem promover a capacidade da população microbiana de sobreviver à aplicação nos elementos de planta e de sobreviver à dessecação. Exemplos de dessecantes adequados incluem uma ou mais de trealose, sacarose, glicerol e metilenoglicol. Outros dessecantes adequados incluem, mas não estão limitados a, açúcares não redutores e álcoois de açúcar (por exemplo, manitol ou sorbitol). A quantidade de dessecante introduzida na formulação pode variar de cerca de 5% a cerca de 50% em peso/volume, por exemplo, entre cerca de 10% a cerca de 40%, entre cerca de 15% e cerca de 35%, ou entre cerca de 20% e cerca de 30%.

[0388] Em alguns casos, é vantajoso que a formulação contenha agentes como um fungicida, um agente antibacteriano, um herbicida, um nematicida, um inseticida, um regulador de crescimento de plantas, um rodenticida, um bactericida, um virucida e um nutriente. Tais agentes são idealmente compatíveis com o elemento de planta agrícola ou a planta na qua a formulação é aplicada (por exemplo, não deve ser prejudicial ao crescimento ou à saúde da planta). Além disso, o agente é idealmente um que não causa preocupações de segurança para uso humano, animal ou industrial (por exemplo, sem problemas de segurança ou o composto é suficientemente lábil para que o produto da planta de base derivado da planta contenha quantidades insignificantes do composto).

[0389] Na forma líquida, por exemplo, soluções ou suspensões, uma pluralidade de endófitos pode ser misturada ou suspensa em soluções aquosas. Os diluentes ou veículos líquidos adequados incluem soluções aquosas, destilados de petróleo ou outros veículos líquidos.

[0390] As composições sólidas podem ser preparadas dispersando uma pluralidade de endófitos da invenção em e sobre um veículo sólido apropriadamente dividido, tal como turfa, trigo, farelo, vermiculi- ta, argila, talco, bentonita, terra de diatomáceas, terra completa, solo pasteurizado e semelhantes. Quando tais formulações são utilizadas como pós umectáveis, podem ser utilizados agentes dispersantes bio-logicamente compatíveis, tais como agentes dispersantes e emulsio- nantes não iônicos, aniônicos, anfotéricos ou catiônicos.

[0391] Os veículos sólidos utilizados na formulação incluem, por exemplo, veículos minerais, tais como argila de caulino, pirofilita, ben- tonita, montmorilonita, terra de diatomáceas, solo branco ácido, vermi- culita e perlite e sais inorgânicos, tais como sulfato de amônio, fosfato de amônio, nitrato de amônio, ureia, cloreto de amônio e carbonato de cálcio. Além disso, podem ser utilizados pós finos orgânicos, tais como farinha de trigo, farelo de trigo e farelo de arroz. Os veículos líquidos incluem óleos vegetais, tais como óleo de soja e óleo de semente de algodão, glicerol, etilenoglicol, polietileno glicol, propileno glicol, poli- propileno glicol, etc.

[0392] Em algumas modalidades, a formulação é ideal para o re- vestimento de uma pluralidade de endófitos sobre elementos de planta. A pluralidade de endófitos é capaz de conferir muitos benefícios agronômicos às plantas hospedeiras. A capacidade de conferir tais benefícios ao revestir a pluralidade de endófitos na superfície dos ele-mentos de planta tem muitas vantagens potenciais, particularmente quando usado em uma escala comercial (agrícola).

[0393] Uma cepa de endófito único ou uma pluralidade de endófi- tos pode ser combinada com um ou mais dos agentes descritos acima para produzir uma formulação adequada para se combinar com um elemento de planta agrícola ou plântula. A pluralidade de endófitos pode ser obtida a partir do crescimento em cultura, por exemplo, utilizando um meio de crescimento sintético. Além disso, o micróbio pode ser cultivado em meios sólidos, por exemplo, em pratos de Petri, raspado e suspenso na preparação. Podem ser utilizados micróbios em diferentes fases de crescimento. Por exemplo, podem ser utilizados micróbios em fase de atraso, fase de log inicial, fase de log intermediário, fase de log tardio, fase estacionária, fase de morte precoce ou fase de morte. Os esporos endofíticos podem ser utilizados para a presente invenção, por exemplo, mas não se limitando a:artrosporos, esporangiosporos, conídios, clamadosporos, picnidiosporos, endosporos, zoosporos.

[0394] As formulações compreendendo uma pluralidade de endófi- tos da presente invenção tipicamente contém entre cerca de 0,1 a 95% em peso, por exemplo, entre cerca de 1% e 90%, entre cerca de 3% e 75%, entre cerca de 5% e 60%, entre cerca de 10% e 50% em peso úmido de uma pluralidade de endófitos. Em algumas modalidades, a formulação contém pelo menos cerca de 10 A 2 por ml de formulação, pelo menos cerca de 10 A 3 por ml de formulação, por exemplo, pelo menos cerca de 10 A 4, pelo menos cerca de 10 A 5, pelo menos cerca de 10 A 6, pelo menos cerca de 10 A 7 CFU ou esporos, pelo menos cerca de 10 A 8 CFU ou esporos por ml de formulação. Em algumas modalidades, a formulação é aplicada ao elemento de planta em cerca de 10 A 2 CFU/semente, entre 10 A 2 e 10 A 3 CFU, pelo menos cerca de 10 A 3 CFU, entre 10 A 3 e 10 A 4 CFU, peio menos cerca de 10 A 4 CFU, entre 10 A 4 e 10 A 5 CFU, pelo menos cerca de 10 A 5 CFU, entre 10 A 5 e 10 A 6 CFU, pelo menos cerca de 10 A 6 CFU, entre 10 A 6 e 10 A 7 CFU, pelo menos cerca de 10 A 7 CFU, entre 10 A 7 e 10 A 8 CFU, ou mesmo mais que 10 A 8 CFU por semente.

[0395] As composições aqui proporcionadas são preferivelmente estáveis. O endófito pode ser não perecível, onde pelo menos 0,01%, de CFUs ou de esporos são viáveis após o armazenamento em forma dessecada (ou seja, um teor de umidade de 30% ou menos) para 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou superior a 10 semanas a 4°C ou à temperatura ambiente. Opcionalmente, uma formulação perecível é em uma formu-lação seca, uma formulação em pó ou uma formulação liofilizada. Em algumas modalidades, a formulação é formulada para proporcionar estabilidade para a população de endófitos. Em uma modalidade, a formulação é substancialmente estável a temperaturas entre cerca de - 20°C e cerca de 50°C durante pelo menos cerca de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 dias ou 1, 2, 3 ou 4 semanas, ou 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 meses, ou um ou mais anos. Em uma outra modalidade, a formulação é substancialmente estável a temperaturas entre cerca de 4°C e cerca de 37°C durante pelo menos cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30 ou superior a 30 dias.

[0396] Conforme descrito acima, em certas modalidades, a presente invenção contempla a utilização de uma cepa de endófito único ou uma pluralidade de endófitos dispostos heterologicamente na planta, por exemplo, o elemento de planta. Em certos casos, a planta agrícola pode conter bactérias que são substancialmente similares às bactérias que estão sendo aplicadas na planta, ou mesmo não são geneticamente indistinguíveis. Note-se que, em muitos casos, as bactérias que estão sendo aplicadas são substancialmente diferentes das bactérias já presentes de várias maneiras significativas. Em primeiro lugar, as bactérias que estão sendo aplicadas na planta agrícola foram adaptadas à cultura ou adaptadas para poder crescer em meios de crescimento isoladamente da planta. Em segundo lugar, em muitos casos, as bactérias que estão sendo aplicadas são derivadas de uma origem clonal, em vez de uma origem heteróloga e, como tal, podem ser dis-tinguidas das bactérias que já estão presentes na planta agrícola pela similaridade clonal. Por exemplo, onde um micróbio que foi inoculado por uma planta também está presente na planta (por exemplo, em um tecido ou porção diferente da planta), ou onde o micróbio introduzido é suficientemente semelhante a um micróbio que está presente em al-gumas das plantas (ou porção de planta, incluindo elementos de planta), ainda é possível distinguir entre o micróbio inoculado e o micróbio nativo, distinguindo entre os dois tipos de micróbios com base em seu estado epigenético (por exemplo, as bactérias que são aplicadas, bem como sua progênie, teriam um padrão muito mais uniforme e similar de metilação de citosina do seu genoma, em relação à extensão e/ou localização da metilação).

[0397] É claro, também é possível fornecer um revestimento com micro-organismos adicionais (o mesmo endófito que foi inoculado ou um diferente). Portanto, de acordo com outra modalidade da presente invenção, os micro-organismos que contêm sementes de plantas obtidos são, portanto, submetidos a uma outra etapa de impregnação de sementes.

[0398] Uma vez revestidos com a formulação do endófito, as sementes podem ser misturadas e deixadas secar antes da germinação ocorrer.

Endófitos compatíveis com agroquímicos

[0399] Em certas modalidades, a cepa de endófito único ou a plu- ralidade de endófitos é selecionada com base na sua compatibilidade com produtos agroquímicos comumente usados. Como mencionado anteriormente, as plantas, particularmente as plantas agrícolas, podem ser tratadas com uma grande variedade de produtos agroquímicos, incluindo fungicidas, biocidas (agentes anticomplexo), herbicidas, inse-ticidas, nematicidas, rodenticidas, fertilizantes e outros agentes.

[0400] Em alguns casos, pode ser importante que a cepa de endó- fito único ou a pluralidade de endófitos sejam compatíveis com produtos agroquímicos, particularmente aqueles com propriedades anticom- plexo, para persistirem na planta, embora, como mencionado anteriormente, existam muitos desses agentes anticomplexo que não penetram na planta, pelo menos em uma concentração suficiente para interferir com os endófitos. Portanto, onde um agente anticomplexo sistêmico é usado na planta, a compatibilidade dos endófitos a serem inoculados com esses agentes será um critério importante. Fungicidas

[0401] Em algumas modalidades, o agente de controle é um fungicida. Tal como aqui utilizado, um fungicida é qualquer composto ou agente (quer químico ou biológico) que pode inibir o crescimento de um fungo ou matar um fungo. Nesse sentido, um "fungicida", tal como aqui utilizado, engloba compostos que podem ser fungistáticos ou fungicidas. Tal como aqui utilizado, o fungicida pode ser um protetor, ou agentes que são eficazes predominantemente na superfície da semente, fornecendo proteção contra patógenos transmitidos pela superfície de sementes e fornecendo algum nível de controle de patógenos transmitidos pelo solo. Exemplos não limitativos de fungicidas protetores incluem captam, manebe, tiram ou fludioxonil.

[0402] O fungicida pode ser um fungicida sistêmico, que pode ser absorvido na planta emergente e inibe ou mata o fungo dentro dos te-cidos das plantas hospedeiras. Os fungicidas sistêmicos utilizados pa ra o tratamento de sementes incluem, entre outros, os seguin- tes:azoxistrobina, carboxina, mefenoxam, metalaxil, tiabendazol, tri- floxistrobina e vários fungicidas de triazol, incluindo difenoconazol, ipconazol, tebuconazol e triticonazol. Mefenoxam e metalaxil são utili-zados principalmente para atingir os fungos de fundição de água Pythium e Phytophthora. Alguns dos fungicidas são preferidos em relação aos demais, dependendo das espécies vegetais, quer por diferenças sutis na sensibilidade das espécies fúngicas patogênicas, quer pelas diferenças na distribuição de fungicida ou na sensibilidade das plantas. Em algumas modalidades, o endófito é compatível com pelo menos um dos fungicidas selecionados do grupo que consiste em: 2- (tiocianatometiltio)-benzotiazol, sulfato de 2-fenilfenol, 8- hidroxiquinolina, ametoctradina, amisulbrom, antimicina, Ampelomyces quisqualis, azaconazol, azoxistrobina, Bacillus subtilis, benalaxil, be- nomil, bentiavalicarbe-isopropil, sal de benzilaminobenzeno-sulfonato (BABS), bicarbonatos, bifenil, bismertiazol, bitertanol, bixafeno, blasti- cidina-S, bórax, mistura de Bordeaux, boscalide, bromuconazol, bupi- rimato, polissulfureto de cálcio, captafol, captan, carbendazim, carbo- xina, carpinídeo, carvona, cloronebe, clorotalonil, clozolinato, Coni- othyrium minitans, hidróxido de cobre, octanoato de cobre, oxicloreto de cobre, sulfato de cobre, sulfato de cobre (tribásico), óxido cuproso, cazofamida, cifufenamida, cmo-oxanil, ciproconazol, ciprodinil, dazomet, debacarbe, etilenobis- (ditiocarbamato de diamônio), diclofluani- da, diclorofeno, diclocímetro, diclomezina, diclorano, dietofencarbe, difenoconazol, difenzoquat ion, diflumetorim, dimetomorfe, dimoxistro- bina, diniconazol, diniconazol-M, dinobutono, dinocap, difenilamina, ditianono, dodemorfe, acetato de dodemorfe, dodina, base livre de do- dina, edifenfos, enestrobina, epoxiconazol, etaboxam, etoxiquina, etri- diazol, famoxadona, fenamidona, fenarimol, fenbuconazol, fenfuram, fenhexamida, fenoxanil, fenpiclonil, fenpropidina, fenpropimorfe, fenti- na, acetato de fentina, hidróxido de fentina, ferbam, ferimzona, fluazi- nam, fludioxonil, flumorfo, fluopicolide, fluopiram, fluoroimida, fluoxas- trobina, fluquinconazol, flusilazol, flusulfamida, flutianil, flutolanil, flutria- fol, fluxapiroxade, folpet, formaldeído, fosetil, fosetil-alumínio, fuberi- dazol, furalaxil, furametpir, guazatina,acetatos de guazatina, GY-81, hexaclorobenzeno, hexaconazol, himexazol, imazalil, imazalil sulfato, imibenconazol, iminoctadina, triacetato de iminoctadina, iminoctadina tris(albesilato), ipconazol, iprobenfos, iprodiona, iprovalicarbe, isoproti- olano, isopirazam, isotianil, kasugamicina, hidrato de cloridrato de kas- ugamicina, Kresoxim-metil, mancopper, mancozebe, mandipropamida, manebe, mepanipirima, mepronil, cloreto de mercúrio, óxido de mercúrio, cloreto de mercúrio, metalaxil, mefenoxam, metalaxil-M, metam, metam-amônio, metam-potássio, metam-sódico, metconazol, metasul- focarbe, iodeto de metil, isotiocianato de metil, metiram, metominostro- bina, metrafenona, mildiomicina, miclobutanil, nabam, nitroftal- isopropil, nuarimol, octilinona, açaí, ácido oleico (ácidos graxos), ori- sastrobina, oxadixil, oxalco-cobre, fumarato de oxpoconazol, oxicarbo- xina, pefurazoato, penconazol, pencicuron, penflufeno, pentaclorofe- nol, pentaclorofenil laurate, penthiopirad, acetato de fenilmercúrio, ácido fosfônico, ftalida, picoxistrobina, polioxina B, polioxinas, polioxorim, bicarbonato de potássio, sulfato de hidroxiquinolina de potássio, pro- benazol, procloraz, procimidona, propamocarbe, cloridrato de propa- mocarbe, propiconazol, propinebe, proquinazid, protioconazol, pi- raclostrobina, pirametostrobina, piraxistrobina, pirazofos, pirafeno, piri- buticarbe, pirifenox, pirimetanil, piroquilon, quinoclamina, quinoxifena, quintozeno, extrato de Reynoutria sachalinensis, sedaxano, siltiofam, simeconazol, 2-fenilfenóxido de sódio, bicarbonato de sódio, pentaclo- rofenoxido de sódio, espiroxamina, enxofre, SYP-Z071, SYP-Z048, óleos de alcatrão, tebuconazol, tebufloquina, tecnazeno, tetraconazol, tiabendazol, tifluzamida, tiofanato-metil, tiram, tiadinil, tolclofos-metil, tolilfluanido, triadimefão, triadimenol, triazóxido, triciclozol, tridemorfe, trifloxistrobina, triflumizol, triforina, triticonazol, valamicina, valifenalato, valifenol, vinclozolina, zinebe, ziram, zoxamida, Candida oleophila, Fu-sarium oxysporum, Gliocladium spp. ,Phlebiopsis gigantea, Strep- tomyces griseoviridis, Trichoderma spp., (RS)-N-(3,5-diclorofenil)-2- (metoximetil)-succinimida, 1,2-dicloropropano, hidrato de 1,3-dicloro- 1,1,3,3-tetrafluoroacetona, 1-cloro-2,4-dinitronaftaleno, 1-cloro-2- nitropropano, 2-(2-heptadecil-2-imidazolin-1-il)etanol, 2,3-di-hidro-5- fenil-1,4-ditiabina 1,1,4,4-tetraoxido, 2-metoxietilmercúrio acetato, cloreto de 2-metoxietilmercúrio, silicato de 2-metoxietilmercúrio, 3-(4- clorofenil) 5-metilrhodanina, tiocianato de 4-(2-nitroprop-1-enil)fenil, ampropilosfosfatos, anilazina, azitramina, polissulfureto de bário, Bayer 32394, benodanil, benquinox, bentaluron, benzamacril; benzamacril- isobutil, benzamorfe, binapacril, sulfato de bis(metilmercúrio), óxido de bis(tributilestanho), hexanobato de cálcio, sulfato de cromato de zinco de cálcio e cádmio, carbamínfo, CECA, clorobenziazona, cloraniforme- tano, clorfenazol, clorquinox, climbazoide, cicloafuramida, cipendazol, ciprofuram, decafentina, diclona, diclozolina, diclobutrazol, dimetirimol, dinocton, dinossulfono, dinoterbono, dipirtition, ditalimfos, dodicina, drazoxolon, EBP, ESBP, etaconazol, etem, etirim, fenaminosulf, fena- panil, fenitropan, 5-fluorocitosina e profanicidas dos mesmos, fluotri- mazol, furcarbanil, furconazol, furconazol-cis, furmeciclox, furofanato, glicodina, griseofulvina, halacrinato, Hercules 3944, hexilthiofos, ICIA0858, isopamfos, isovalediona, mebenil, mecanbinzida, metazoxo- lono, metfuroxam, metilmercúrio dicianodiamida, metsulfovax, milnebe, anidrido mucoclorico, miclozolina, N-3,5-diclorofenil-succinimida, N-3- nitrofenilitaconimida, natamicina, N-etilmercurio-4- toluenossulfonanilida, bis(dimetilditiocarbamato) de níquel, OCH, dime- tilditiocarbamato de fenilmercúrio, nitrato de fenilmercúrio, fosforil, pico- linamida UK-2A e derivados dos mesmos, protiocarbe; cloridrato de protiocarbe, piracarbólido, piridinitril, piroxicloro, piraxivro, quinacetol; sulfato de quinacetol, quinazamida, quinconazol, rabazazol, salicilanili- da, SSF-109, sultôfeno, tecoram, tiadifluor, tiofeno, tioclorfenfeno, tio- fanato, tioquinox, tioxímido, triamifos, triarimol, triazbutil, triclamida, urbano, XRD-563 e zarilamida, IK- 1140. Em ainda uma outra modalidade, um endófito que é compatível com um composto antibacteriano é usado para os métodos aqui descritos. Por exemplo, o endófito é compatível com pelo menos um dos antibióticos selecionados do grupo que consiste em: Amicacina, Gentamicina, Canamicina, Neomicina, Netilmicina, Tobramicina, Paromomicina, Espectinomicina, Geldanami- cina, Herbimicina, Rifaximina, Estreptomicina, Loracarbefe, Ertape- nem, Doripenem, Imipenem/Cilastatina, Meropenem, Cefadroxil, Cefa- zolina, Cefalotina ou Cefalotina, Cefalexina, Cefaclor, Cefamandol, Ce- foxitina, Cefprozil, Cefuroxima, Cefixima, Cefdinir, Cefditoreno, Cefope- razona, Cefotaxima, Cefpodoxima, Ceftazidima, Ceftibuteno, Cefti- zoxima, Ceftriaxona, Cefepima, Ceftarolina fosamil, Ceftobiprol, Teico- planina, Vancomicina, Telavancina, Clindamicina, Lincomicina, Dap- tomicina, Azitromicina, Claritromicina, Diritromicina, Eritromicina, Roxi- tromicina, Troleandomicina, Telitromicina, Espiramicina, Aztreonam, Furazolidona, Nitrofurantoína, Linezolida, Posizolida, Radezolida, To- rezolida, Amoxicilina, Ampicilina, Azlocilina, Carbenicilina, Cloxacilina, Dicloxacilina, Flucloxacilina, Mezlocilina, Meticilina, Nafcilina, Oxacili- na, Penicilina G, Penicilina V, Piperacilina, Penicilina G, Temocilina, Ticarcilina, Amoxicilina/Clavulanato, Ampicilina/sulbactam, Piperacili- na/tazobactam, Ticarcilina/Clavulanato, Bacitracina, Colistina, Polimixi- na B, Ciprofloxacino, Enoxacino, Gatifloxacino, Levofloxacino, Lome- floxacino, Moxifloxacino, Ácido nalidíxico, Norfloxacina, Ofloxacina, Trovafloxacino, Grepafloxacino, Esparfloxacino, Temafloxacino, Mafe- nida, Sulfacetamida, Sulfadiazina, Sulfadiazina de prata, Sulfadimeto- xina, Sulfametizol, Sulfametoxazol, Sulfanilamida (arcaica), Sulfasala- zina, Sulfisoxazol, Trimetoprim-Sulfametoxazol (Cotrimoxazol) (TMP- SMX), Sulfanilamidocrisoidina (arcaica), Demeclociclina, Doxiciclina, Minociclina, Oxitetraciclina, Tetraciclina, Clofazimina, Dapsona, Capre- omicina, Cicloserina, Etambutol, Etionamida, Isoniazida, Pirazinamida, Rifampicina (Rifampina nos EU), Rifabutina, Rifapentina, Estreptomici- na, Arsefenamina, Cloranfenicol, Fosfomicina, Ácido fusídico, Metroni- dazol, Mupirocina, Platensimicina, Quinupristina/Dalfopristina, Tianfe- nicol, Tigeciclina, Tinidazol e Trimetoprim.

[0403] Um fungicida pode ser um agente de controle biológico, como uma bactéria ou fungo. Tais organismos podem ser parasitas aos fungos patogênicos, ou secretam toxinas ou outras substâncias que podem matar ou evitar o crescimento de fungos. Qualquer tipo de fungicida, particularmente aqueles que são comumente usados em plantas, pode ser usado como agente de controle em uma composição de sementes. Agentes Antibacterianos

[0404] Em alguns casos, a composição de revestimento de semente compreende um agente de controle que possui propriedades antibacterianas. Em algumas modalidades, o agente de controle com propriedades antibacterianas é selecionado a partir dos compostos aqui descritos em outro lugar. Em outras modalidades, o composto é Estreptomicina, oxitetraciclina, ácido oxolínico ou gentamicina. Reguladores de crescimento para plantas

[0405] A composição de revestimento de semente pode ainda compreender um regulador de crescimento de plantas. Em algumas modalidades, o regulador de crescimento da planta é selecionado do grupo que consiste em: Ácido abscísico, amidocloreto, ancimidol, 6- benzilaminopurina, brassinolida, butralina, clormequat (cloreto de clormequato), cloreto de colina, ciclanilida, daminozida, dikegulac, di- metinina, 2,6-dimetilpuridina, etefon, flumetralina, flurprimidol, flutiace- to, forclorfenurão, ácido giberélico, ácido inabenfido, ácido indol-3- acético, hidrazida maleica, mefluidida, mepiquat (cloreto de mepiquat), ácido naftalenoacético, N-6-benziladenina, paclobutrazol, prohexadi- ona (prohexadiona-cálcio), pro-hidrojossona, tidiazurão, triapentenol, tributilfosforotriitrilato, 2, ácido 3,5-tri-iodobenzoico, trinexapac-etil e uniconazol. Outros exemplos de compostos antibacterianos que podem ser utilizados como parte de uma composição de revestimento de semente incluem aqueles baseados em diclorofeno e hemi formal de álcool benzílico (Proxel® da ICI ou Acticide® RS da Thor Chemie e Kathon® MK de Rohm & Haas) e derivados de isotiazolinona, tais como alquilisotiazolinonas e benzisotiazolinonas (Acticide® MBS da Thor Chemie). Outros reguladores de crescimento de plantas que podem ser composições de revestimento de sementes incorporadas são descritos em US 2012/0108431, que é incorporado por referência na sua totalidade. Nematicidas

[0406] Os agentes de biocontrole antagonistas de nemátodos preferidos incluem ARF18; Arthrobotrys spp.; Chaetomium spp.; Cylindro- carpon spp.; Exophilia spp.; Fusarium spp.; Gliocladium spp.; Hirsutella spp.; Lecanicillium spp.; Monacrosporium spp.; Myrothecium spp.; Ne- ocosmospora spp.; Paecilomyces spp.; Pochonia spp.; Stagonospora spp.; fungos vesiculares-arbusculares micorrízicos, Burkholderia spp.; Pasteuria spp., Brevibacillus spp.; Pseudomonas spp.; e Rhizobacté- rias. Os agentes de biocontrole antagonistas de nemátodos particu-larmente preferidos incluem ARF18, Arthrobotrys oligospora, dactyloi- des Arthrobotrys, Chaetomium globosum, Cylindrocarpon heteronema, Exophilia jeanselmei, Exophilia pisciphila, Fusarium Aspergillus, Fusa-rium solani, Gliocladium catenulatum, Gliocladium roseum, Gliocladium virens, Hirsutella rhossiliensis, Hirsutella minnesotensis, Lecanicillium lecanii, Monacrosporium drechsleri, Monacrosporium gephyropagum, Myrotehcium verrucaria, Neocosmospora vasinfecta, Paecilomyces lilacinus, Pochonia chlamydosporia, Stagonospora heteroderae, Sta- gonospora phaseoli, fungos vesicentro-arbusculares micorrízicos- Burkholderia cepacia, Pasteuria penetrans, Pasteuria thornei, Pasteu- ria nishizawae, Pasteuria ramosa, uso de Pastrueia, Brevibacillus late- rosporus cepa G4, Pseudomonas fluorescens e Rhizobactérias. Nutrientes

[0407] Em outras modalidades, a composição de revestimento de semente pode compreender um nutriente. O nutriente pode ser seleci-onado do grupo que consiste em um fertilizante de nitrogênio incluindo, mas não limitado a ureia, nitrato de amônio, sulfato de amônio, soluções de nitrogênio sem pressão, amônia aqua, amônia anidra, tios- sulfato de amônio, ureia revestida de enxofre, ureia-formaldeídos, IB- DU, ureia revestida de polímero, nitrato de cálcio, ureia e ureia de me- tileno, fertilizantes fosforosos como fosfato de diamônio, fosfato de monoamônio, polifosfato de amônio, superfosfato concentrado e su- perfosfato triplo e adubos de potássio como cloreto de potássio, sulfato de potássio, sulfato de potássio-magnésio, nitrato de potássio. Tais composições podem existir como sais ou íons livres dentro da compo-sição da camada de semente. Alternativamente, os nutrien- tes/fertilizantes podem ser complexados ou quelados para proporcionar uma liberação prolongada ao longo do tempo. Rodenticidas

[0408] Os roedores, como camundongos e ratos, causam danos econômicos consideráveis ao comer e sujar sementes plantadas ou armazenadas. Além disso, camundongos e ratos transmitem um grande número de doenças infecciosas como a peste, a febre tifoidea, a leptospirose, a triquinose e a salmonelose. Anticoagulantes, como de-rivados de cumarina e indandiona, desempenham um papel importante no controle de roedores. Esses ingredientes ativos são simples de manipular, relativamente inofensivos para os seres humanos e têm a vantagem de que, como resultado do atraso no início da atividade, os animais que estão sendo controlados não identificam conexão com a isca que ingeriram, portanto, não os evite. Este é um aspecto importante em particular nos animais sociais, como os ratos, onde os indivíduos atuam como provadores. Em algumas modalidades, a composição de revestimento de semente compreende um rodenticida selecionado do grupo de substâncias que consiste em 2-isovalerilindan-1,3- diona, 4- (quinoxalin-2-ilamino) benzenossulfonamida, alfa-cloridrina, fosforeto de alumínio, antu, óxido arsenoso, carbonato de bário, bistió- semi, brodifacoum, bromadiolona, brometalina, cianeto de cálcio, clo- ralose, clorofacinona, colecalciferol, coumacloro, coumafuril, coumate- tralil, crimidina, difenacoum, diftalona, difacinona, ergocalciferol, flo- coumafeno, fluoroacetamida, flupropadina, cloridrato de flupropadina, cianeto de hidrogênio, iodometano, lindano, fosfeto de magnésio, brometo de metil, norbormida, fosceto, fosfina, fósforo, pindona, arsenito de potássio, pirinurão, escilirosídeo, arsenito de sódio, cianeto de sódio, fluoroacetato de sódio, estricina, sulfato de tálio, varfarina e fosfo- reto de zinco.

Compatibilidade

[0409] Em algumas modalidades, uma cepa de endófito único ou uma pluralidade de endófitos que são compatíveis com produtos agroquímicos podem ser utilizadas para inocular as plantas de acordo com os métodos aqui descritos. Em cada caso abaixo, cada cepa de endó- fito único ou cada tipo de endófito usado em uma pluralidade de endó- fitos podem ser testados para compatibilidade por conta própria ou como a pluralidade. Os endófitos que são compatíveis com agentes anticomplexo empregados em agricultura podem ser isolados colocando uma cultura de endófitos em uma placa de Petri compreendendo uma concentração eficaz do agente anticomplexo e isolando colônias de endófitos que são compatíveis com o agente anticomplexo. Em outras modalidades, uma pluralidade de endófitos que são compatíveis com um agente anticomplexo são utilizados para os métodos aqui descritos.

[0410] Em algumas modalidades, os endófitos da presente invenção exibem tolerância a um agente agroquímico selecionado do grupo que consiste em: Aeris®, Avicta® DuoCot 202, Cruiser®, Syntenta CCB® (A), Clariva®, Albaugh, Dynasty®, Apron®, Maxim®, Gaucho®, Provoke® ST, Syngenta CCB®, Trilex®, WG Roxo, WG Prata, Azoxis- trobina, Carboxina, Difenoconazol, Fludioxonil, fluxaproxad, Ipconazol, Mefenoxam, Metalaxil, Miclobutanil, Penflufeno, Piraclostrobina, Seda- xano, TCMTB, Tebuconazol, Tiram, Triadimenol (Baytan®), Trifloxis- trobina, Triticonazol, Tolclofos-Metil, PCNB, Abamectina, Clorpirifos, Clotianidina, Imidacloprid, Tiametoxam e Tiodicarbe.

[0411] Os endófitos compatíveis com fungos podem também ser isolados por seleção em meio líquido. A cultura dos endófitos pode ser banhada em pratos de Petri sem qualquer forma de mutagênese; alternativamente, os endófitos podem ser mutagenizados usando qualquer meio conhecido na técnica. Por exemplo, as culturas de endófitos podem ser expostas a luz UV, irradiação gama ou mutagênicos químicos, tais como etilmetanossulfonato (EMS), diclovos de brometo de etídio (EtBr) (DDVP, metil metano sulfato (MMS), fosfato de trietil (TEP), trimetilfosfato (TMP), ácido nitroso ou análogos da base de DNA, antes da seleção em meios que incluem fungicida. Finalmente, onde o mecanismo de ação de um bactericida particular é conhecido, o gene alvo pode ser mutado especificamente (seja por deleção de gene, substituição de gene, mutagênese dirigida ao local, etc.) para gerar uma pluralidade de endófitos que seja resiliente contra esse químico particular. Note-se que os métodos acima descritos podem ser usados para isolar endófitos que são compatíveis com compostos bac- teriostáticos e bactericidas.

[0412] Será também apreciado por um versado na técnica que uma planta pode ser exposta a múltiplos tipos de compostos anticom- plexo, simultaneamente ou sucessivamente, por exemplo, em diferentes fases do crescimento da planta. Onde a planta alvo é suscetível de ser exposta a múltiplos agentes anticomplexo, uma pluralidade de en- dófitos que são compatíveis com muitos ou todos estes produtos agroquímicos podem ser utilizados para inocular a planta. Os endófitos que são compatíveis com vários agentes podem ser isolados, por exemplo, por seleção em série. Os endófitos que são compatíveis com o primeiro agente podem ser isolados como descrito acima (com ou sem mu- tagênese prévia). Uma cultura dos endófitos resultantes pode então ser selecionada pela capacidade de crescer em meios líquidos ou sólidos compreendendo o segundo agente (novamente, com ou sem mu- tagênese prévia). As colônias isoladas da segunda seleção são então testadas para confirmar sua compatibilidade com ambos os agentes.

[0413] Da mesma forma, endófitos que são compatíveis com bio- cidas (incluindo herbicidas, tais como glifosato ou compostos anticom- plexo, bacteriostáticos ou bactericidas) que são empregados em agricultura podem ser isolados usando métodos semelhantes aos descritos para isolar endófitos compatíveis. Em algumas modalidades, a mu- tagênese dos endófitos pode ser realizada antes da seleção com um agente anticomplexo. Em outras modalidades, a seleção é realizada nos endófitos sem mutagênese prévia. Em ainda uma outra modalidade, a seleção em série é realizada em endófitos:Os endófitos são primeiro selecionados pela compatibilidade com um primeiro agente anti- complexo. Os endófitos compatíveis isolados são então cultivados e selecionados pela compatibilidade com o segundo agente anticomple- xo. Qualquer colônia assim isolada é testada quanto à compatibilidade para cada um, ou ambos os agentes anticomplexo para confirmar a compatibilidade com esses dois agentes.

[0414] A compatibilidade com um agente antimicrobiano pode ser determinada por uma série de meios conhecidos na técnica, incluindo a comparação da concentração inibitória mínima (MIC) dos endófitos não modificados e modificados. Portanto, em algumas modalidades, a presente invenção descreve endófitos modificados, em que os endófi- tos são modificados de modo que exibem pelo menos 3 vezes mais, por exemplo, pelo menos 5 vezes mais, entre 5 e 10 vezes mais, pelo menos 10 vezes mais, entre 10 e 20 vezes mais, pelo menos 20 vezes mais, entre 20 e 30 vezes mais, pelo menos 30 vezes mais ou mais MIC para um agente antimicrobiano quando comparado com os endó- fitos não modificados.

[0415] Em algumas modalidades, são divulgados aqui endófitos com compatibilidade aumentada com o herbicida glifosato. Em algumas modalidades, os endófitos têm um tempo de duplicação em meio de crescimento compreendendo menos 1 mM de glifosato, por exemplo, entre 1 mM e 2 mM de glifosato, pelo menos 2 mM de glifosato, entre 2 mM e 5 mM de glifosato, pelo menos 5 mM de glifosato, entre 5 mM e 10 mM de glifosato, pelo menos 10 mM de glifosato, entre 10 mM e 15 mM de glifosato, pelo menos 15 mM de glifosato ou mais, que não é superior a 250%, entre 250% e 100%, por exemplo, não mais de 200% entre 200% e 175%, não mais de 175%, entre 175% e 150%, não mais de 150%, entre 150% e 125%, ou não mais de 125%, do tempo de duplicação dos endófitos no mesmo meio de crescimento que não inclui glifosato. Em algumas modalidades, os endófitos têm um tempo de duplicação em meio de crescimento compreendendo gli- fosato 5 mM que não é mais de 150% do tempo de duplicação dos en- dófitos no mesmo meio de crescimento que não inclui glifosato.

[0416] Em outras modalidades, os endófitos têm um tempo de duplicação em um tecido vegetal compreendendo pelo menos 10 ppm de glifosato, por exemplo, entre 10 e 15 ppm, pelo menos 15 ppm de gli- fosato, entre 15 e 10 ppm, pelo menos 20 ppm de glifosato, entre 20 e 30 ppm, pelo menos 30 ppm de glifosato, entre 30 e 40 ppm, pelo menos 40 ppm de glifosato ou mais, não superior a 250%, entre 250% e 200%, por exemplo, não mais que 200%, entre 200% e 175%, não mais que 175%, entre 175% e 150%, não mais que 150%, entre 150% e 125%, do tempo de duplicação dos endófitos em um tecido vegetal de referência que não inclui glifosato. Em algumas modalidades, os endófitos têm um tempo de duplicação em um tecido vegetal compreendendo 40 ppm de glifosato que não é mais que 150% do tempo de duplicação dos endófitos em um tecido vegetal de referência que não inclui glifosato.

[0417] O processo de seleção descrito acima pode ser repetido para identificar isolados de endófitos compatíveis com uma infinidade de agentes.

[0418] Os isolados de candidatos podem ser testados para garantir que a seleção de compatibilidade agroquímica não resultou na perda de uma bioatividade desejada. Os isolados de endófitos que são compatíveis com agentes comumente empregados podem ser selecionados como descrito acima. Os endófitos compatíveis resultantes podem ser comparados com os endófitos parentais nas plantas em sua capacidade de promover a germinação.

[0419] Os endófitos agroquímicos compatíveis gerados como descrito acima podem ser detectados em amostras. Por exemplo, onde um transgene foi introduzido para tornar os endófitos compatíveis com o(s) agroquímico(s), o transgene pode ser usado como gene alvo para am-plificação e detecção por PCR. Além disso, quando mutações pontuais ou deleções para uma porção de um gene específico ou uma série de genes resultam em compatibilidade com o(s) agroquímico(s), as muta-ções pontuais únicas também podem ser detectadas por PCR ou outros meios conhecidos na técnica. Tais métodos permitem a detecção dos endófitos, mesmo que já não seja viável. Assim, os produtos vegetais de base produzidos usando os endófitos compatíveis com agroquímicos aqui descritos podem ser facilmente identificados empregando estes e métodos relacionados de detecção de ácido nucleico. Populações de elementos de planta

[0420] As combinações sintéticas da presente invenção podem ser confinadas dentro de um objeto selecionado do grupo que consiste em: garrafa, jarra, ampola, embalagem, vasilha, bolsa, caixa, compartimento, caixa de papelão, recipiente, silo, recipiente de transporte, cama de caminhão e caixa. Em uma modalidade particular, a população de elementos de planta é embalada em uma bolsa ou recipiente adequado para venda comercial. Por exemplo, uma bolsa contém um peso unitário ou contagem dos elementos de planta compreendendo uma pluralidade de endófitos como aqui descrito e, além disso, compreende um marcador. Em uma modalidade, a bolsa ou recipiente contém pelo menos 100 elementos de planta, entre 100 e 1.000 elementos de planta, 1.000 elementos de planta, entre 1.000 e 5.000 elementos de planta, por exemplo, pelo menos 5.000 elementos de planta, entre 5.000 e 10.000 elementos de planta, pelo menos, 10.000 elementos de planta, entre 10.000 e 20.000 elementos de planta, pelo menos 20.000 elementos da planta, entre 20.000 e 30.000 elementos de planta, pelo menos 30.000 elementos de planta, entre 30.000 e 50.000 elementos de planta, pelo menos 50.000 elementos de planta, entre 50.000 e 70.000 elementos de planta, pelo menos 70.000 elementos de planta, entre 70.000 e 80.000 elementos de planta, pelo menos 80.000 elementos de planta, entre 80.000 e 90.000, pelo menos 90.000 elementos de planta ou mais. Em uma outra modalidade, a bolsa ou recipiente pode compreender um peso discreto de elementos de planta, por exemplo, pelo menos 1 lb, entre 1 e 2 lbs, pelo menos 2 lbs, entre 2 e 5 lbs, pelo menos 5 lbs, entre 5 e 10 lbs, pelo menos 10 lbs, entre 10 e 30 lbs, pelo menos 30 lbs, entre 30 e 50 lbs, pelo menos 50 lbs, entre 50 e 70 lmbs, pelo menos 70 lbs ou mais. O marcador pode conter informações adicionais, por exemplo, as informações selecionadas do grupo que consiste em: peso líquido, número de lote, origem geográfica dos elementos da planta, data do teste, taxa de germinação, conteúdo de matéria inerte e a quantidade de ervas dani-nhas nocivas, se houver. Os recipientes ou pacotes adequados incluem os tradicionalmente utilizados na comercialização de elementos de planta. A invenção também contempla outros recipientes com capacidades de armazenamento mais sofisticadas (por exemplo, com embalagens microbiologicamente apertadas ou com contenções à prova de gás ou à prova d'água).

[0421] Em alguns casos, uma subpopulação de elementos de planta que compreende uma pluralidade de endófitos é ainda selecionada com base em uma maior uniformidade, por exemplo, com base na uniformidade da população microbiana. Por exemplo, elementos de plantas individuais de conjuntos coletados de espigas individuais, plantas individuais, parcelas individuais (representando plantas inoculadas no mesmo dia) ou campos individuais podem ser testados quanto à uniformidade de densidade microbiana, e apenas aqueles conjuntos que atendem às especificações (por exemplo, pelo menos 80% dos elementos de planta testados têm densidade mínima, conforme determinado por métodos quantitativos descritos em outro lugar) são combinados para fornecer a subpopulação do elemento de planta agrícola.

[0422] Os métodos aqui descritos podem também compreender uma etapa de validação. A etapa de validação pode envolver, por exemplo, cultivar alguns elementos de planta coletados de plantas inoculadas em plantas agrícolas maduras e testar essas plantas individuais para uniformidade. Essa etapa de validação pode ser realizada em elementos de planta individuais coletados de espigas, plantas individuais, parcelas individuais (representando plantas inoculadas no mesmo dia) ou campos individuais e testadas como descrito acima para identificar conjuntos que atendam às especificações exigidas.

[0423] Em algumas modalidades, os métodos aqui descritos incluem o plantio de uma composição sintética aqui descrita. Os plantadores adequados incluem uma máquina semeadora de ar e/ou adubo utilizados em operações agrícolas para aplicar materiais particulados, incluindos um ou mais dos seguintes, semente, fertilizante e/ou inocu- lantes, no solo durante a operação de plantio. Os dispositivos semea- dores/fertilizantes podem incluir uma barra de ferramentas com abridores acoplados ao solo, atrás do qual é rebocado um carrinho de rodas que inclui um ou mais tanques de contenção ou caixas e meios de medição associados para conter e medir a partir deles materiais parti- culados.

[0424] Em certas modalidades, uma composição aqui descrita pode estar na forma de um líquido, uma pasta, um sólido ou um pó (pó umectável ou pó seco). Em uma outra modalidade, uma composição pode estar na forma de um revestimento de semente. As composições em líquido, suspensão ou pó (por exemplo, pó umectável) podem ser adequadas para revestir elementos de planta. Quando usado para revestir os elementos de planta, a composição pode ser aplicada aos elementos de planta e deixada secar. Em modalidades nais quais a composição é um pó (por exemplo, um pó umectável), um líquido, tal como água, pode precisar ser adicionado ao pó antes da aplicação a uma semente.

[0425] Em ainda uma outra modalidade, os métodos podem incluir a introdução no solo de um inóculo de uma ou mais das populações de endófitos aqui descritas. Tais métodos podem incluir itroduzir no solo uma ou mais das composições aqui descritas. O(s) inóculo(s) ou com- posições podem ser introduzidos no solo de acordo com métodos co-nhecidos pelos versados na técnica. Exemplos não limitativos incluem introdução no sulco, pulverização, revestimento de sementes, introdução foliar, etc. Em uma modalidade particular, a etapa de introdução compreende a introdução no sulco do inóculo ou das composições aqui descritas.

[0426] Em uma modalidade, os elementos de planta podem ser tratados com a(s) composição(ões) descrita(s) aqui de várias maneiras, mas preferencialmente por meio de pulverização ou gotejamento. O tratamento por pulverização e gotejamento pode ser conduzido através da formulação das composições aqui descritas e pulverização ou gotejamento da(s) composição(ões) em uma semente(s) através de um sistema de tratamento contínuo (que é calibrado para aplicar o tra-tamento a uma taxa predefinida em proporção ao fluxo contínuo de semente), tal como um tratador do tipo tambor. Sistemas de lote, nos quais um tamanho de lote predeterminado de semente e composi- ção(ões) como aqui descritas são distribuídas para um misturador, também pode ser empregados.

[0427] Em uma outra modalidade, o tratamento envolve os elementos de planta de revestimento. Um desses processos envolve o revestimento da parede interna de um recipiente redondo com a(s) composição(ões) aqui descrita(s), adicionando elementos de planta e, em seguida, girando o recipiente para fazer com que os elementos de planta entrem em contato com a parede e a composição(ões), um processo conhecido na técnica como "revestimento de recipiente". Os elementos de planta podem ser revestidos por combinações de métodos de revestimento. A remoção tipicamente envolve o uso de formas líquidas das composições descritas. Por exemplo, os elementos de planta podem ser embebidos durante cerca de 1 minuto a cerca de 24 horas (por exemplo, durante pelo menos 1 min, entre 1 e 5 min, 5 min, entre 5 e 10 min, 10 min, entre 10 e 20 min, 20 min, entre 20 e 40 min, 40 min, entre 40 e 80 min, 80 min, entre 80 min e 3 h, 3 h, entre 3 h e 6 h, 6 h, entre 6 h e 12 h, 12 h, entre 12 horas e 24 horas, ou pelo menos 24 horas).

[0428] Ao longo deste relatório descritivo, a palavra "compreende", ou variações como "compreende" ou "compreendendo" serão entendidas por implicar a inclusão de um número inteiro declarado ou grupos de números inteiros, mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou grupo de números inteiros.

[0429] Embora a presente invenção tenha sido descrita em detalhes com referência aos exemplos abaixo, entende-se que podem ser feitas várias modificações sem se afastar do espírito da invenção. Por exemplo, enquanto os exemplos particulares abaixo podem ilustrar os métodos e modalidades aqui descritos usando uma planta específica, os princípios nestes exemplos podem ser aplicados a qualquer cultura agrícola. Portanto, será apreciado que o âmbito desta invenção seja abrangido pelas modalidades das invenções aqui citadas e pelo relatório descritivo em vez dos exemplos específicos que são exemplificados abaixo.

EXEMPLOS Exemplo 1:Análise independente de cultivo de taxa microbiana em comunidades de semente relevantes para agricultura, com base no sequenciamento de alto rendimento do gene marcador Exemplo/Descrição

[0430] As taxas microbianas encontradas em comunidades relevantes para a agricultura foram identificadas usando sequenciamento de alto rendimento do gene marcador em diversas culturas e numerosas variedades de sementes. Descrição experimental

[0431] Para identificar as taxas microbianas do núcleo (isto é, oni- presentes) através das sementes, foi utilizado o sequenciamento de alto rendimento de genes marcadores de bactérias, arqueias e fungos. Cereais

[0432] Foram obtidas 2 consanguíneas, 10 landraces, 4 sementes de milho teosinte e 4 sementes modernas e 4 sementes selvagens de trigo. As adesões foram categorizadas em variedades landrace, selvagens e consanguíneas com base na avaliação do estado de melhoria. Para extrair o DNA microbiano, as sementes foram primeiro esterilizadas em uma das quatro maneiras diferentes. Algumas das sementes foram esterilizadas na superfície usando etanol a 95% para reduzir os micróbios contaminantes superficiais, em seguida, enxaguadas em água. Outras foram primeiro embebidas em água estéril e sem DNA durante 48 horas para suavizá-las e foram esterilizadas à superfície usando etanol a 95% para reduzir os micróbios contami- nantes superficiais, em seguida, enxaguadas em água. Outras foram enxaguadas em água desionizada, imersas em etanol a 95% durante 5 segundos, 0,5% de NaOCl durante 2 minutos, etanol a 70% durante 2 minutos e depois lavadas três vezes em água desionizada durante 1 minuto cada. Pastagens

[0433] Para identificar as taxas microbianas a partir de sementes de plantas de pastagem selvagens, foi utilizado sequenciamento de alto rendimento de genes marcadores para bactérias, arqueias e fungos. Foram obtidas sementes das seguintes espécies de pastagens selvagens: Andropogon gerardi, Bouteloua curtipendula, Carex bi- cknellii, Carex brevior, Centeio selvagem do Canadá, Centeio selvagem da Virgínia, Koeleria macrantha, Leafy satin grass, Panicum virga- tum, Schizachyrium scoparium, Spartina pectinata, Sporobolus hetero- lepis, Allium cernuum, Anemone canadensis, Algodao bravo, Asclepias tuberosa, Asclepias verticillata, Symphyotrichum novae-angliae, Bri- ckellia eupatorioides, Coreopsis tripteris, Shooting star, Equinácea- roxo-pálido, Eryngium yuccifolium, Eupatorium altissimum,Eutrochium purpureu, Biennial gaure, Geum triflorum, Girassol falso, Liatris aspera, Monarda fistulosa, Spotted Beebalm, Oenothera biennis, Parthenium integrifolium, Penstemon, Echinacea paradoxa, Margarida-amarela, Rudbeckia subtomentosa, Silphium laciniatum, Silphium terebinthina- ceum, Solidago rigida, Solidago speciosa, Symphyotrichum pilosum, Verbena stricta, Veronicastrum virginicum, Veronicastrum virgini- cum,Zizia aurea, Helenium autumnale, Iris missouriensis, Carex scoparia, Scirpus atrovirens, e Verbena azul. Para extrair o DNA microbiano, as sementes foram primeiro embebidas em água esterilizada sem DNA durante 48 h para suavizá-las e foram esterilizadas na superfície usando etanol a 95% para reduzir os micróbios contaminantes superficiais, em seguida, enxaguados em água.

Frutas e Legumes

[0434] Foram obtidas sementes de 22 diferentes variedades de repolho, incluindo brócolis, couve-flor e couve galega. Além disso, sementes de 8 variedades diferentes de alface, 9 variedades de melão (incluindo cantaloupo e melão honeydew), 7 variedades de cebolas (incluindo cippolini, chalotas e vidalia), 4 variedades de tomates, uma variedade de toria, 4 variedades de nabo , 7 variedades de melancia e uma variedade de sarcon amarelo. Para os morangos, obtiveram-se as sementes ou o tecido vegetal predominante de 9 variedades. Para a esterilização, as sementes foram primeiro embebidas em água esterilizada sem DNA durante 48 h para suavizá-las, e foram esterilizadas na superfície usando etanol a 95% para reduzir os micróbios contaminan- tes superficiais, em seguida, enxaguados em água. O tecido de morango foi esterilizado à superfície usando etanol a 95%, depois enxaguado em água. Sementes Oleaginosas

[0435] Sementes de 1 cultivar selvagem e 3 modernas de Brassica Napus também foram obtidas. Para extrair o DNA microbiano, as se-mentes foram primeiro embebidas em água esterilizada sem DNA durante 48 h para suavizá-las e foram esterilizadas na superfície usando etanol a 95% para reduzir os micróbios contaminantes superficiais, em seguida, enxaguados em água.

[0436] As sementes ou tecidos de todas as plantas descritas acima foram então moídas usando uma argamassa e pilão tratados com 95% de etanol e RNAse Away (Life Technologies, Inc. ,Grand Island, NY) para remover o DNA contaminante. O DNA foi extraído das sementes de solo usando o kit de extração de DNA PowerPlant Pro (Mo Bio Laboratories, Inc. ,Carlsbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante. A lavagem superficial de certos tratamentos de esterilização de sementes de cereais também foi coletada e o DNA foi extraído como acima.

[0437] Os genes marcadores foram amplificados e sequenciados a partir do DNA extraído. Para as análises bacterianas e arcaicas, a região hipervariável de V4 do gene 16S rRNA foi direcionada (iniciadores 515f/806r) e para os fungos, a primeira região espaçadora transcrita interna (ITS1) do operão rRNA (iniciadores ITS1f/ITS2r) foi segmentada . Os dois genes marcadores foram amplificados por PCR separadamente utilizando 35 ciclos, e os iniciadores de codificação de barras de 12 pb corrigidos de erros específicos para cada amostra foram utilizados para facilitar a combinação de amostras. Para reduzir a amplificação do cloroplasto e do DNA mitocondrial, utilizaram-se grampos de PNA específicos para os genes de rRNA nestas organelas. As reações de PCR para amplificar os genes 16R rRNA seguiram o protocolo de (Lundberg et al. 2013), e aqueles para amplificar as regiões ITS segui-ram o protocolo de (Fierer et al. 2012). Os produtos de PCR foram quantificados utilizando o ensaio PicoGreen (Life Technologies, Inc. ,Grand Island, NY), agrupados em concentrações equimolares e limpos usando o kit UltraClean (Mo Bio Laboratories, Inc. ,Carlsbad, CA). Os conuntos de DNA limpos foram sequenciados em um instrumento Illumina MiSeq no Centro de Sequenciamento de Próxima Geração da Universidade de Colorado. Atribuição de OTU

[0438] Para ambas as sequências de 16S rRNA e ITS1, os dados da sequência bruta foram reatribuídos a amostras distintas utilizando um script personalizado de Python, e a filtragem de qualidade e o agrupamento de OTU (ou seja, unidade taxonômica operacional) foram conduzidos usando tubagem UPARSE (Edgar 2013). Em resumo, um banco de dados de sequencias de novo com sequências representativas para cada OTU foi criado usando um limite de similaridade de 97% e as leituras brutas foram mapeadas para este banco de dados para calcular as contagens de sequência por OTU por amostra. Antes de criar o banco de dados, as sequências foram filtradas pela qualidade usando um limite de frequência de erro esperado de 0,5 erros por sequência. Além disso, as sequências foram desreplicadas e os singletons foram removidos antes de criar o banco de dados. As OTUs receberam classificações taxonômicas usando o classificador RDP (Wang et al. 2007) treinados com os bancos de dados Greengenes (McDonald et al. 2012) e UNITE (Abarenkov et al. 2010) para as sequências 16S rRNA e ITS, respectivamente. Para ter em conta as diferenças no número variável de sequências por amostra, cada amostra foi rarefeita para 1000 sequências 16S rRNA e 1000 sequências ITS por amostra. As OTUs classificadas como cloroplastos ou mitocôndrias foram descartadas antes da rarefação.

[0439] As diferenças globais na composição da comunidade bacte- riana entre o controle e as plantas inoculadas foram avaliadas usando escalabilidade multidimensional não métrica baseada em dissimilari- dades de Bray-Curtis para visualizar diferenças em pares entre comu-nidades de amostras. A análise de variância permutativa (PERMANOVA) foi utilizada para testar estatisticamente o significado dessas diferenças. As análises foram realizadas usando o pacote vegano em R (R Core Team 2013). Para determinar as OTUs que contribuem para as diferenças gerais entre os tipos de culturas, as abundâncias relativas médias foram calculadas para cada OTU dentro de cada tipo de cultivo. Somente as OTUs com uma abundância relativa média de 0,1% em qualquer grupo foram incluídas nesta análise. Resultados

[0440] Através das sementes de todas as plantas aqui analisadas, foram detectados e avaliados um total de 144 OTU bacterianas e 145 OTUs fúngicas (Tabela 3 e Tabela 4) seguindo uma abordagem de filtragem de qualidade de sequência rigorosa. Entre todas as OTUs, 28 OTUs bacterianas e 20 OTUs fúngicas foram considerados taxa central em sementes entre plantas (Tabela 1 e Tabela 2).

Exemplo 2 - Identificação e caracterização de endófitos bacteria- nos e fúngicos cultiváveis pertencentes à OTUs do núcleo

[0441] Para entender melhor o papel desempenhado pelos micróbios endofíticos derivados da sementes do núcleo na melhoria do vigor, da saúde geral e da resiliência à tensão das plantas agrícolas, foi iniciada uma tela sistemática para isolar e caracterizar micróbios endo- fíticos de sementes e tecido vegetaiss agrícolas comercialmente significativas.

[0442] As sementes de diversos tipos de cereais, frutas, vegetais, gramas, sementes oleaginosas e outras sementes foram adquiridas e testadas para micróbios cultiváveis, conforme descrito abaixo. Micróbios cultiváveis (isto é,cepas SYM) pertencentes às mesmas OTUs que as OTUs do núcleo descritas em Tabela 1 e Tabela 2 foram isolados e identificados. Isolamento de bactérias e fungos do interior de sementes

[0443] O isolamento de fungos e bactérias (incluindo endófitos) do interior de sementes esterilizadas em superfície foi realizado utilizando técnicas conhecidas na técnica. As sementes esterilizadas em superfície foram moídas, diluídas em meio líquido e a suspensão utilizada para inocular placas de meios sólidos. Estes foram incubados sob diferentes condições à temperatura ambiente.

Descrição do experimento

[0444] Aproximadamente cinquenta sementes esterilizadas em superfície foram transferidas assepticamente para um liquidificador estéril e moído. As sementes moídas foram ressuspensas em 50 mL de caldo R2A estéril e incubadas durante 4 h à temperatura ambiente. Foram colhidas dez alíquotas de 1 mL dos homogeneizados de semente e centrifugadas, seus sobrenadantes foram descartados e os peletes suavemente ressuspensos em 1 mL de tampão de fosfato 0,05 esterilizado; 0,5 ml de 50% de glicerol é adicionado a cada um dos cinco tubos. Estes foram armazenados a -80°C para caracterização adicional. As alíquotas remanescentes foram diluídas duas vezes em 100 vezes as diluições para 10-4. 100 microlitros das diluições 1, 10-2e 10-4 foram utilizados para inocular três pratos de Petri contendo os seguintes meios para isolar bactérias e/ou fungos: 1. Ágar tríptico de soja 2. Ágar R2A 3. Ágar de dextrose de batata 4. Ágar Sabouraud 5. Outros meios que dependem de micro-organismo alvo

[0445] As placas foram divididas em três conjuntos compreendendo cada tipo de meio e incubadas em diferentes ambientes. O primeiro conjunto foi incubado aerobicamente, o segundo em condições anae- róbicas e o terceiro em condições microaerofílicas e todos foram inspecionados diariamente por até 5 dias. 1-2 colônias individuais por morfótipo foram isoladas e lisadas por pureza em placas frescas do mesmo meio/ambiente a partir do qual o micro-organismo foi isolado. As placas foram incubadas à temperatura ambiente durante 2-5 dias. Depois de um isolado crescer, ficaram estriadas mais uma vez em uma placa nova do mesmo meio para garantir a pureza e foram incubadas sob as mesmas condições ambientais.

[0446] A partir da segunda placa estriada, os isolados foram armazenados em caldo de soja Tryptic + 15% de glicerol a -80°C para caracterização adicional, primeiro raspando de 2-3 colônias (cerca de 10 μL) da placa em um tubo criogênico contendo 1,5 mL do meio mencionado acima e ressuspendendo suavemente as células. Alternativamente, os isolados foram propagados em meios especializados como recomendado para o táxon particular do micro-organismo. Os micróbios obtidos representam aqueles que vivem nas sementes da adesão à planta. Isolamento de bactérias e fungos dos tecidos internos da planta

[0447] O isolamento de fungos e bactérias (incluindo endófitos) a partir de tecido vegetais esterilizados em superfície foi realizada utilizando técnicas conhecidas na técnica. Os tecido vegetaiss esterilizados em superfície foram moídos, diluídos em meio líquido e, em seguida, esta suspensão foi utilizada para inocular placas de meios sólidos. Estes foram incubados sob diferentes condições de ambiente à temperatura ambiente.

Descrição do experimento

[0448] Aproximadamente cinquenta gramas de tecido vegetal esterilizado em superfície foram transferidas assepticamente para um liquidificador estéril e moído. As sementes moídas foram ressuspensas em 50 mL de caldo R2A estéril e incubadas durante 4 h à temperatura ambiente. Foram colhidas dez alíquotas de 1 mL dos homogeneizados de tecido vegetal e centrifugadas, seus sobrenadantes foram descartados e os peletes suavemente ressuspensos em 1 mL de tampão de fosfato 0,05 esterilizado. Foi adicionado 0,5 ml de 50% de glicerol a cada um dos cinco tubos. Estes foram armazenados em -80°C para uma possível caracterização adicional. As alíquotas remanescentes foram diluídas duas vezes em 100 vezes as diluições para 10-4. 100 microlitros das diluições 1, 10-2e 10-4 foram utilizados para inocular três pratos de Petri contendo os seguintes meios para isolar bactérias e/ou fungos: 1. Ágar tríptico de soja 2. Ágar R2A 3. Ágar de dextrose de batata 4. Ágar Sabouraud 5. Outros meios que dependem de micro-organismo alvo

[0449] As placas foram divididas em três conjuntos compreendendo cada tipo de meio e incubadas em diferentes ambientes. O primeiro conjunto foi incubado aerobicamente, o segundo em condições anae- róbicas e o terceiro em condições microaerofílicas e todos foram ins-pecionados diariamente por até 5 dias. 1-2 colônias individuais por morfótipo foram isoladas e lisadas por pureza em placas frescas do mesmo meio/ambiente a partir do qual o micro-organismo foi isolado. As placas foram incubadas à temperatura ambiente durante 2-5 dias. Depois de um isolado crescer, ficaram estriadas mais uma vez em uma placa nova do mesmo meio para garantir a pureza e foram incubadas sob as mesmas condições ambientais.

[0450] A partir da segunda placa estriada, os isolados foram armazenados em caldo de soja Tryptic + 15% de glicerol a -80oC para caracterização adicional, primeiro raspando de 2-3 colônias (cerca de 10 μL) da placa em um tubo criogênico contendo 1,5 mL do meio mencionado acima e ressuspendendo suavemente as células. Alternativamente, os isolados foram propagados em meios especializados como recomendado para o táxon particular do micro-organismo. Isolamento de bactérias e fungos de plantas ou superfícies de sementes

[0451] Para coletar material de filosfera, rizósfera ou espermos- fera para cultivo de micróbios, rebentos, raízes ou sementes não lavados foram removidos/limpos de qualquer solo vinculado e colocados em tubos estéril de Falcon de 50 mL. A estes, foram adicionados e balançados 10 mL de tampão esterilizado de fosfato de sódio 0,1 M, seguidos por 5 minutos de sonicação para remover os micróbios das superfícies das plantas, com a resultante lavagem turva ou lamacenta coletada em um tubo separado de Falcon de 15 mL. 100 μL desta lavagem com micróbios foram distribuídos diretamente em placas de ágar ou caldo de nutrientes para cultura e enriquecimento, ou foram ainda diluídos com tampão esterilizado de fosfato de sódio 0,1 M em 10X, 100X, 1000X, 10.000 X e até 100.000 X, antes da cultura microbiana em placas de ágar ou caldo de nutrientes. As preparações de estoque de glicerol da solução de lavagem superficial da planta foram preparadas neste ponto, misturando 1 mL da solução de lavagem do solo e 0,5 mL de glicerol estéril a 80%, congelando a preparação em um criotubo mergulhado em nitrogênio líquido e armazenando em -80oC. O caldo de nutrientes inoculado com uma mistura de bactérias da superfície da planta forma uma comunidade estável e mista de micróbios que foi utilizada em experiências de inoculação de plantas aqui descritas, subcultivada em incubações de caldo subsequentes ou espalhada em placas de ágar e separada em colônias individuais que foram testadas através dos métodos descritos aqui. Caracterização de isolados de fungos e bactérias

[0452] A caracterização de fungos e bactérias isoladas a partir de tecido vegetais ou de sementes esterilizados em superfície ou não esterilizados foi realizada utilizando técnicas conhecidas na técnica. Essas técnicas aproveitam a coloração diferencial de micro-organismos, características morfológicas de células, esporos ou colônias, reações bioquímicas que fornecem caracterização diferencial e amplificação e sequenciamento de DNA de regiões diagnósticas de genes, entre outros métodos. Descrição experimental

[0453] Isolados de bactérias e/ou fungos isolados como aqui descrito (incluindo bactérias endofíticas e fungos) foram categorizados em três tipos:Isolados bacterianos, isolados fúngicos e isolados desconhecidos (uma vez que as colônias de leveduras podem se assemelhar a colônias bacterianas em alguns casos) com base na morfologia das colônias, na formação de micélio visível e/ou na formação de esporos. Para determinar se um isolado desconhecido era bacte- riano ou fúngico, a análise microscópica dos isolados foi realizada. Algumas das análises conhecidas na técnica para diferenciar micro-organismos incluem, mas não se limitam a:O teste de 10% de KOH, coloração positiva com algodão azul Lactophenol, coloração de Gram e crescimento em meios com agentes seletivos. As características distintivas observadas por estes testes são o tamanho relativo da célula (o tamanho da levedura é muito maior que o tamanho bacteria- no), a formação de hifas e esporos (as bactérias filamentosas formam hifas menores que os fungos e não formam estruturas que contêm esporos) ou o crescimento sob agentes de seleção (a maioria das bactérias pode crescer na presença de compostos antifúngicos como a nistatina, enquanto a maioria dos fungos não pode; da mesma forma, a maioria dos fungos não são afetados pela presença de antibióticos de amplo espectro como cloranfenicol e espectinomicina.

[0454] Para identificar os isolados, realizou-se a análise da sequência de DNA de regiões genômicas conservadas, como os loci do DNA ribossômico. Para obter DNA para realizar amplificações de PCR, certo crescimento celular a partir de meios sólidos (aproximadamente 5-10 μL) foi ressuspenso em 30 μL de tampão Tris/EDTA estéril (pH 8,0). As amostras foram aquecidas a 98°C durante 10 minutos seguidas por resfriamento até 4°C durante 1 minuto em um termociclador. Este ciclo foi repetido duas vezes. As amostras foram então centrifugadas a ~ 13.000 RCF durante 1-5 minutos e utilizadas como modelo de DNA para reações de PCR. Abaixo está uma série de combinações de iniciadores exemplificativos usados para identificar isolados para um nível de gênero. Tabela 5: Exemplos de combinações de iniciadores para identificação de isolados a um nível de gênero

[0455] Para diminuir o ruído de fundo devido à ligação não específica dos iniciadores ao DNA, o termociclador foi programado para uma PCR de aterramento, o que aumentou a especificidade da reação a temperaturas mais altas e aumentou a eficácia ao final, baixando a temperatura de anelamento. Condições exemplificativas para a realização de PCR Touchdown são mostradas na Tabela 6. Tabela 6: Condições exemplificativas para a realização de PCR Touchdown

* ou a temperatura especificada pelo fabricante da DNA polimerase para esta etapa.

[0456] As reações de PCR foram purificadas para remover iniciadores, dNTPs e outros componentes por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, utilizando kits de limpeza de PCR comercialmente disponíveis.

[0457] As sequências resultantes foram alinhagemdas como se- quências de consulta com os bancos de dados GenBank, RDP, UNITE e PlutoF disponíveis publicamente. O RDP foi especificamente compilado e usado para a classificação de 16s bacteriano. UNITE e PlutoF foram especificamente compilados e utilizados para identificação de fungos. Em todos os casos, as cepas foram identificadas ao nível da espécie se as suas sequências fossem mais de 95% semelhantes a qualquer adesão identificada de todos os bancos de dados analisados. Quando a percentagem de similaridade estava entre 90-97%, a cepa foi classificada em nível de gênero, família, ordem, classe, subdivisão ou filo, dependendo da informação exibida nos bancos de dados usados. Isolados com valores de similaridade mais baixos (de 30 a 90%) foram classificados como "desconhecidos" ou "não cultivados" dependendo da informação exibida após a análise BLAST. Para complementar a identificação molecular, as taxas de fungos foram confirmadas induzindo esporulação em placas de ágar PDA ou V8 e utilizando critérios morfológicos relatados para identificação da estrutura e forma dos corpos frutíferos. As taxas bacterianas foram confirmadas pelo uso de critérios morfológicos relatados em meios diferenciais especializados para o táxon particular, ou por testes de diferenciação bioquímica, conforme descrito pelo Manual Bergey de Microbiologia Sistemática (Whitman, William B. et al. , Eds. Bergey's manual® de bacteriologia sistemática. Vols. 1 a 5. Springer, 2012). Caracterização independente da cultura de comunidades fúngicas e bacterianas em sementes ou plantas

[0458] Para compreender a diversidade das taxas microbianas cultiváveis e não cultiváveis (por exemplo, bacterianos e fúngicos) que residem dentro de sementes ou plantas de cultivares agrícolas, variedades autárquicas e variedades selvagens ancestrais, o DNA microbiano foi extraído de sementes ou partes de planta esterilizadas em superfície, tal como aqui descrito, seguido da amplificação de regiões genômicas conservadas, por exemplo, os loci de DNA ribossômico. O DNA amplificado representou um "instantâneo" da comunidade microbiana completa dentro de sementes ou plantas.

Descrição experimental

[0459] Para obter o DNA microbiano a partir de sementes, plantas ou partes de planta, as sementes, plantas ou partes de planta foram esterilizadas em superfície sob condições assépticas como aqui des-critas. O DNA microbiano de sementes, plantas ou partes de planta foi extraído usando métodos conhecidos na técnica, por exemplo, usando kits de extração de DNA de Sementes ou DNA de plantas comercialmente disponíveis, ou o seguinte método. 1. Uma amostra de cada tipo de semente ou tecido vegetal é colocada em um recipiente resistente ao frio e aplicam-se 10-50 mL de nitrogênio líquido. As sementes ou os tecido vegetais são então macerados em pó. 2. O DNA genômico é extraído de cada preparação de se-mente ou tecido vegetal, seguindo um protocolo de clorofórmio: álcool isoamílico 24: 1 (Sambrook et al. 1989).

[0460] Os iniciadores específicos de fúngicos foram utilizados para amplificar a região ITS (Internal Transcribed Spacer) do DNA do ribos- somo nuclear. Os iniciadores bacterianos específicos foram utilizados para amplificar a região do gene 16s rDNA do genoma bacteriano. As sequências obtidas através das plataformas NGS foram analisadas em bancos de dados, como os aqui mencionados.

[0461] Os exemplos de pares de iniciadores utilizados para esta análise estão listados na Tabela 5.

[0462] Como alternativa ao sequenciamento de próxima geração, o Polimorfismo do comprimento do fragmento de restrição do terminal (TRFLP) pode ser executado. Os iniciadores marcados com fluorescência específicos do grupo são usados para amplificar Regiões diag- nósticas de genes na população microbiana. Este produto de PCR marcado de forma fluorescente é cortado por uma enzima de restrição escolhida para distribuição heterogênea na população de produtos de PCR. A mistura de corte enzimático de fragmentos de DNA marcados de forma fluorescente e não marcados é então submetida para análise de sequência em uma plataforma de sequência de Sanger, como o Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer.

Determinação do potencial patogênico da planta de isolados mi-crobianos

[0463] Uma vez que um micróbio que confere traços positivos a uma cultivar pode ser um agente patogênico em uma espécie de planta diferente, um ensaio geral foi utilizado para determinar o potencial pato-gênico de isolados microbianos. As sementes esterilizadas em superfície e internas são germinadas em ágar de água e, uma vez que a planta desenvolve seu primeiro conjunto de folhas, são inoculadas com o iso-lado. Alternativamente, as plantas são inoculadas como sementes. Para inoculação, o isolado microbiano é cultivado em meio sólido e inoculado em uma planta ou em uma semente através de qualquer dos métodos aqui descritos. As plantas podem crescer sob condições ideais durante 2-3 semanas e qualquer efeito patogênico do micróbio introduzido é avaliado contra plantas de controle não inoculadas. Identificação de isolados microbianos cultiváveis que correspondem à OTUs principais

[0464] Para caracterizar com precisão os endófitos microbianos isolados, as colônias foram submetidas à sequenciamento de genes marcadores e as sequencias foram analisadas para fornecer classificações taxonômicas. Entre os micróbios cultivados (cepas de SYM), aqueles com pelo menos 97% de similaridade de sequência 16S ou ITS para OTUs da Tabela 1 e da Tabela 2 foram identificados. Exemplos de micróbios isolados que correspondem à OTUs essenciais es- tão listados Na Tabela 7 (bactérias) e na Tabela 8 (fungos). Tabela 7: Endófitos bacterianos exemplificativos

Exemplo 2:Composições sintéticas compreendendo sementes de plantas e uma cepa de endófito único ou uma pluralidade de en- dófitos conferem benefícios a plantas agrícolas

[0465] Este exemplo descreve a capacidade de composições sintéticas compreendendo sementes de plantas e uma cepa de endófito único ou uma pluralidade de cepas de endófitos aqui descritas, de conferir um ou mais benefícios a uma planta hospedeira. Entre outras coisas, este Exemplo descreve a capacidade dos endófitos (por exemplo, endófitos bacterianos e fúngicos aqui descritos) de conferir traços benéficos em uma variedade de plantas hospedeiras, incluindo, mas não limitado a, dicotiledôneas (por exemplo, soja, amendoim) e monocoti- ledôneas (por exemplo, milho, soja, trigo, algodão, sorgo) e combinações dos mesmos. As sementes inoculadas com endófitos (por exemplo, sementes aqui descritas) foram testadas em condições limitadas em água (por exemplo, tensão por seca) em ensaios de germinação de sementes e ensaios de vigor de raízes de mudas para testar se um ou mais endófitos conferem aumento na tolerância a esses estresses. Estes testes de crescimento foram realizados utilizando ensaios de crescimento (por exemplo, ensaios de germinação e ensaios de vigor de raízes de mudas) em papéis de filtro estéril. As sementes foram tratadas com uma única cepa bacteriana ou fúngica, ou com uma combinação de duas cepas bacterianas e duas fúngicas. Em algumas modalidades, as sementes foram tratadas com uma combinação de pelo menos uma cepa bacteriana e pelo menos uma cepa fúngica. Descrição experimental Crescimento e aumento das bactérias para inoculação

[0466] Cada endófito bacteriano foi estirado em 20% de Ágar tríptico de soja, formando um gramado em pratos de Petri regulares (9 cm de diâmetro). Uma vez que a bactéria cresceu para alta densidade, o que aconteceu após um ou dois dias, dependendo da taxa de crescimento bacteriano, uma placa por cepa bacteriana foi raspada com o auxílio de uma alça estéril (preenchendo todo o furo da alça e produ- zindo uma gota de biomassa bacteriana de cerca de 20 mg). As bactérias recolhidas desta forma foram transferidas para 1 ml de solução salina de tampão de fosfato 50 mM (PBS) em um tubo de microcentrí- fuga e totalmente ressuspensas por vórtex durante ~20 segundos à velocidade máxima. Este método atinge uma densidade óptica altamente concentrada (~ 0,5-1, correspondente a cerca de 108 CFU/mL) e bactérias viáveis pré-adaptadas ao revestimento vivo de uma superfície. Crescimento e aumento de fungos para inoculação

[0467] Os isolados de fungos foram cultivados a partir de um estoque congelado em pratos de Petri contendo ágar de dextrose de batata e as placas foram incubadas à temperatura ambiente durante cerca de uma semana. Após o desenvolvimento de micélios e esporos, foram utilizados quatro tampões de ágar (1 cm de diâmetro) para inocular erlenmeyers contendo 150 ml de caldo de dextrose de batata. As culturas líquidas foram cultivadas à temperatura ambiente e agitação em um balançador orbital a 115 rpm durante 4 dias. Em seguida, as culturas foram transferidas para tubos de teste estéril de 50 ml com fundos cônicos. As camadas de micélio foram interrompidas por ultrassom de pulso a uma configuração de 75% e 3 pulsos de 20 segundos cada, usando um sônico Fisher Scientific (modelo FB120) com uma sonda manual (CL-18). As culturas sonicadas foram utilizadas da mesma maneira que as suspensões bacterianas para inoculação de sementes.

Esterilização superficial de sementes

[0468] As sementes não tratadas (por exemplo, sementes de soja ou sementes de trigo) foram esterilizadas durante a noite com gás cloro da seguinte forma:Foram pesados 200 g de sementes e colocados em uma garrafa de vidro de 250 ml. A garrafa aberta e sua tampa foram colocadas em um recipiente de dessecador em uma exaustão. Um copo contendo 100 mL de alvejante comercial (8,25% de hipoclorito de sódio) foi colocado no recipiente de dessecador. Imediatamente antes de selar o frasco, 3 mL de ácido clorídrico concentrado (34-37,5%) foram cuidadosamente adicionados ao alvejante. A esterilização foi deixada para prosseguir por 17-24h. Após a esterilização, o frasco foi fechado com a tampa esterilizada e reaberto em uma capa de fluxo estéril. A garrafa aberta foi deixada na capa estéril por algumas horas para arejar as sementes e remover o resíduo de gás de cloro. A garrafa foi então fechada e as sementes armazenadas à temperatura ambiente no escuro até o uso. Preparação de composições sintéticas compreendendo sementes de plantas e endófitos

[0469] O procedimento seguinte foi usado para revestir sementes com uma pluralidade de inóculos de endófitos fúngicos para plantação em estufa e ensaios de campo. Primeiro, 3% de alginato de sódio (SA) foram preparados e autoclavados da seguinte maneira. Os frascos de Erlenmeyer foram preenchidos com a quantidade apropriada de água desionizada e aquecidos a cerca de 50 graus C em uma placa de calor com agitação usando uma barra de agitação. O pó de SA foi derramado lentamente na água até dissolver tudo. A solução foi autoclavada (121°C a 15PSI por 30 minutos). O pó de talco foi autoclavado em ciclo seco (121°C a 15PSI por 30 minutos) e aliquotado em sacos Ziploc ou tubos falcon de 50 ml com uma proporção de 15 g por kg de semente a ser tratada para controles de formulação e 10g por kg de semente para tratamentos reais.

[0470] No dia seguinte, as sementes foram tratadas com formulações em pó ou líquidas.

[0471] Para formulações em pó, foram atribuídas 10 g por kg de semente às sementes a serem tratadas, de acordo com o procedimento a seguir. As sementes foram colocadas em um grande recipiente de plástico. 16,6 ml de 2% de SA por Kg de sementes a serem tratadas foram vertidos nas sementes. O recipiente foi coberto e balançado len-tamente em movimento orbital por cerca de 20 segundos para dispersar o SA. O pó de endófito foi misturado com uma quantidade igual de talco em pó. A mistura de endófitos e talco foi adicionada no topo das sementes, tentando dispersá-lo uniformemente. O recipiente foi coberto e as sementes foram balançadas lentamente em movimento orbital por cerca de 20 segundos. 13,3 ml de Flo-rite por kg de semente a ser tratada foram vertidos nas sementes. As sementes foram balançadas de novo, lentamente e em movimento orbital.

[0472] Para formulações líquidas, foram atribuídos 8,5 mL por semente às sementes a serem tratadas, de acordo com o procedimento a seguir. As sementes foram colocadas em um grande recipiente de plástico. 8,3 ml de 2% de SA por kg de semente e a mesma quantidade de cultura bacteriana (8,3 ml por kg de semente) foram vertidos nas sementes. O recipiente foi coberto e balançado lentamente em movimento orbital por cerca de 20 segundos para dispersar o SA. Foram adicionados 15 g de talco por kg de semente, tentando dispersá-lo uniformemente. O recipiente foi coberto e as sementes foram balançadas lentamente em movimento orbital por cerca de 20 segundos. 13,3 ml de Flo-rite por kg de semente a ser tratada foram vertidos nas sementes. As sementes foram balançadas de novo, lentamente e em movimento orbital. Para as sementes de soja, foram aplicados 10 μL de al- ginato de sódio e inóculo para cada grama de sementes. Para as sementes de trigo, a quantidade de SA e suspensão bacteriana ou inócu- lo fúngico foi ajustada para 15 ml/kg para explicar a razão superfície- volume maior dessas pequenas sementes. Testes para melhoria da germinação sob tensão por seca

[0473] O polietileno glicol (PEG) é um polímero inerte e de ligação à água com uma cadeia longa não iônica e praticamente impermeável que simula com precisão a tensão por seca em condições de solo seco. Quanto maior a concentração de PEG, menor o potencial de água alcançado, induzindo maior tensão hídrica em um meio aquoso. Para determinar o aumento da germinação em sementes, cujos interiores são colonizados por cepas microbianas, o efeito do potencial osmótico na germinação é testado em uma variedade de potencial de água re-presentativa das condições de seca de acordo com Perez-Fernandez et al. [J. Environ. Biol. 27:669-685 (2006)]. A variedade de potenciais de água simula aqueles que são conhecidos por causar tensão por seca em uma variedade de cultivares e plantas selvagens, (-0,05 MPa a -5 MPa). A concentração apropriada de polietilenoglicol (6000) necessária para atingir um determinado potencial de água foi determinada seguindo Michel e Kaufmann (Plant Physiol., 51:914-916 (1973)) e outras modificações feitas por Hardegree e Emmerich (Plant Physiol. ,92, 462-466 (1990)). A equação final usada para determinar quantidades de PEG é: Φ = 0,130 [PEG]2 T - 13,7 [PEG] 2; onde o potencial osmótico (Φ) é uma função da temperatura (T). Ensaio de germinação de mudas de soja em condições de seca

[0474] Para cada SYM testado no ensaio de germinação, dez (10) sementes de soja revestidas com SYM foram colocadas em uma placa de Petri de 150 mm que continha um único papel de germinação pesado (papel de germinação de semente de peso pesado SD5-1/4 76 # Anchor Paper Co. ,St. Paul, MN). Para cada placa de petri, adicionou- se 10 mL de polietilenoglicol a 8% (PEG 6000) para ensaios de ras- treio de germinação em condições de seca. As placas foram cobertas e incubadas no escuro a 22° Celcius e 60% de umidade relativa por quatro dias para cepas de SYM bacterianas) ou cinco dias para cepas de SYM fúngicas. Todas as experiências foram realizadas em triplicado sob condições estéreis. As mudas foram avaliadas com base na percentagem de germinação em relação apenas à formulação e con- troles de semeadura não tratados no final do período de incubação. Resultados exemplificativos da germinação da soja em condições de seca são mostrados na Tabela A. Tabela A: Resultados do ensaio de germinação da soja

Ensaio de vigor de raízes de mudas de soja em condições de seca

[0475] Para cada SYM testado no ensaio de vigor de raiz, dez (10) sementes de soja foram colocadas equidistantes entre si em sanduíches de papel de germinação de peso pesado umedecido. Cada camada do papel de germinação foi pré-embebida em 25 mL de água destilada estéril. O sanduíche de papel de germinação foi enrolado, gravado com fita cirúrgica, colocado em garrafas de vidro e incubado a 22° Celsius com 60% de umidade relativa no escuro por quatro (4) dias para permitir a germinação das sementes. No dia cinco (5), as tampas da garrafa foram removidas e as amostras de sementes foram colocadas em uma câmara de crescimento ajustada para 25° Celsius, 70% RH, 250-300 luz microEinsten por 12 horas e 18° Celsius, 60% HR escuro 12 horas por cinco (5) dias. A colocação de garrafas foi randomizada diariamente para reduzir qualquer efeito de posição ao longo do período de incubação. No final do experimento, cada planta de soja foi medida pelo comprimento total da raiz e comparada apenas com a formulação e controles de semeadura não tratados. Resultados exemplificativos de vigor de raízes de soja em condições de seca são mostrados na Tabela B. Tabela B: Resultados do ensaio de vigor da raiz da soja

Ensaio de germinação de mudas de trigo em condições de seca

[0476] Para cada SYM testado, adicionou-se 25 uL de cultura so- nicada de fungos de 7 dias ou culturas de bactérias de 3 dias em 15 mL de solução semissólida [12,5% de polietileno glicol (PEG 6000) e 0,3% de ágar] pré- aliquotadas em uma prato de Petri de 90 mm de profundidade. Depois de adicionar a biomassa de SYM, os pratos de Petri foram balançados horizontalmente para distribuição uniforme da biomassa de SYM. Foram colocadas quinze (15) sementes de trigo esterilizadas em superfície em cada prato de Petri. As placas foram cobertas e incubadas no escuro a 24° Celsius e 60% de umidade relativa durante três dias em uma câmara Conviron. Todas as experiências foram realizadas em triplicado sob condições estéreis. As mudas foram marcadas contando o número de mudas germinadas por prato e o desempenho de cada SYM normalizado como percentagem de germinação em relação apenas à formulação e controles de semeadura não tratados no final do período de incubação. Resultados exemplificativos da germinação do trigo em condições de seca são mostrados na Tabela C.

Ensaio de vigor de raízes de mudas de trigo em condições de seca

[0477] Para cada teste SYM, doze (12) sementes de trigo revestidas com SYM foram colocadas sobre um papel de filtro de 125 mm pré-umedecido com 5 mL de 12,5% de polietileno glicol (PEG 6000). As sementes foram dispostas em uma formação circular e com embrião virado para o centro do papel de filtro. As placas foram cobertas e incubadas no escuro a 24° Celsius e 60% de umidade relativa durante três dias em uma câmara Conviron. Todas as experiências foram realizadas em triplicado sob condições estéreis. No final do período de incubação, as imagens foram tomadas para cada placa e o comprimento da raiz foi medido (em pixel) nas imagens usando ImageJ e o pixel foi finalmente convertido em cm com base em um padrão interno. O desempenho de cada SYM foi normalizado como percentagem do comprimento da raiz em relação apenas à formulação e controles de semeadura não tratados. Resultados exemplificativos de vigor de raízes de trigo em condições de seca são mostrados na Tabela D.

Discussão

[0478] O vigor da planta e a melhor resistência à tensão são componentes importantes para proporcionar fitness a uma planta em um ambiente agrícola. Estes foram medidos em ensaios de germinação e ensaios de vigor de raízes de mudas para testar a melhoria no fenótipo da planta como conferido por inoculação microbiana. A coleta de endó- fitos derivados de sementes produziu uma resposta mensurável em soja e trigo quando inoculadas em comparação com controles não inoculados, como mostrado na Tabela A, Tabela B, Tabela C e Tabela D. Por exemplo, a maioria das cepas testadas produziu um fenótipo favorável em qualquer dos parâmetros múltiplos medidos, como eficiência de germinação, comprimento da raiz ou comprimento do rebento, sugerindo que as cepas desempenham um papel íntimo, modulando e melhorando o vigor da planta e conferindo resiliência à tensão à planta hospedeira. As respostas de tensão na coleta de cepa podem ser vistas pela capacidade de um subgrupo conferir uma resposta benéfica em diferentes condições, como a tensão hídrica. Estes podem ser aplicáveis a produtos para terras áridas e marginais. Em uma grande proporção de casos para as cepas testadas, o efeito benéfico foi mensurável em várias culturas. Em um aspecto da invenção, entende-se que cepas benéficas aqui descritas são capazes de colonizar múltiplas variedades e espécies de plantas.

Exemplo 3:Composições sintéticas compreendendo sementes de plantas e uma cepa de endófito único ou uma pluralidade de cepas de endófitos conferem benefícios para plantas agrícolas

[0479] Este exemplo descreve a capacidade de composições sintéticas compreendendo sementes de plantas e uma cepa de endófito único ou uma pluralidade de cepas de endófitos aqui descritas, de conferir características benéficas a uma planta hospedeira. Entre outras coisas, este Exemplo descreve a capacidade dos endófitos (por exemplo, endófitos bacterianos e fúngicos aqui descritos) de conferir traços benéficos em uma variedade de plantas hospedeiras, incluindo, mas não limitado a, dicotiledôneas (por exemplo, soja, amendoim) e mono- cotiledôneas (por exemplo, milho, soja, trigo, algodão, sorgo) e combi-nações dos mesmos. As sementes inoculadas com endófitos (por exemplo, as sementes aqui descritas) são testadas em condições normais, tensão biótica, tensão por calor, tensão por frio, alta tensão salino, solo com alto teor de metal e combinações dos mesmos, ensaios de germinação de sementes e ensaios de vigor de raízes de mudas para testar se um ou mais endófitos conferem um aumento na tolerância a um ou mais estresses. Estes testes de crescimento são realizados utilizando ensaios de crescimento (por exemplo, ensaios de germinação e ensaios de vigor de raízes de mudas) em papéis de filtro estéril. Em algumas modalidades, as sementes são tratadas com uma única cepa bacteriana ou fúngica, ou com uma combinação de duas cepas bacterianas e duas fúngicas. Em algumas modalidades, as sementes são tratadas com duas ou mais cepas bacterianas ou fúngicas. Em algumas modalidades, as sementes são tratadas com uma combinação de pelo menos uma cepa bacteriana e pelo menos uma cepa fúngica.

[0480] O crescimento e a ampliação de bactérias e fungos para inoculação, esterilização superficial de sementes e revestimento de sementes são realizados como aqui descrito. Testes para melhoria da germinação em condições normais

[0481] Os testes de germinação padrão são utilizados para avaliar a capacidade do endófito de melhorar a germinação das sementes e o crescimento precoce. Resumidamente, 400 sementes (por exemplo, sementes aqui descritas) são revestidas com um ou mais endófi- tos aqui descritos e são colocadas entre toalhas de papel marrom molhado (8 repetições com 50 sementes cada). Um número igual de sementes é tratado apenas com formulação. As toalhas de papel são colocadas em cima de bandejas de plástico de 1 x 2 pés e mantidas em uma câmara de crescimento ajustada a 25°C e 70% de umidade por 7 dias. As mudas são pontuadas com base na percentagem de germinação em relação apenas à formulação e controles de semeadura não tratados Testes para melhoria da germinação sob tensão biótica

[0482] Uma modificação do método desenvolvido por Hodgson [Am. Potato. J. 38:259-264 (1961)] é usada para testar a melhoria da germinação em sementes microcomolares sob tensão biótica. A tensão biótica é entendida como uma concentração de inóculos na forma de células (bactérias) ou suspensões de esporos (fungos) de um pató- geno conhecido por uma cultura particular (por exemplo,Pantoea ste- wartii ou Fusarium graminearum para Zea mays L.). Resumidamente, para cada nível de tensão biótica, 400 sementes (por exemplo, sementes aqui descritas), cujos interiores são colonizados por cepas microbianas e 400 controles de sementes (sem as cepas microbianas), são colocados entre toalhas de papel marrom: 8 repetições com 50 sementes para cada tratamento (colonizado com micróbios e controle). Cada uma das repetições é colocada dentro de um grande prato de Petri (150 mm de diâmetro). As toalhas são então embebidas com 10 mL de células patogênicas ou suspensão de esporos a uma concentração de 104 para 108 células/esporos por mL. Cada nível corresponde a um incremento de magnitude de ordem de magnitude (assim, 5 níveis). O pratos de Petri são mantidos em uma câmara de crescimento ajustada à 25°C e 70% de umidade por 7 dias. A proporção de sementes que germinam com sucesso é comparada entre as sementes provenientes de plantas colonizadas com micróbios com as provenientes de controles para cada nível de tensão biótica. Testes para melhoria da germinação em condições de calor

[0483] Os testes de germinação padrão são usados para determinar se um micróbio que coloniza o interior de uma semente protege o milho contra a tensão por calor durante a germinação. Resumidamente, 400 sementes (por exemplo, sementes aqui descritas), cujos interiores são colonizados por cepas microbianas são colocadas entre toalhas de papel marrom úmidas (8 repetições com 50 sementes cada). Um número igual de sementes obtidas a partir de plantas de controle que não possuem micróbio é tratado da mesma maneira. As toalhas de papel são colocadas em cima de bandejas de plástico de 1 x 2 pés e mantidas em uma câmara de crescimento ajustada em 16:8 horas de luz:ciclo escuro, 70% de umidade e pelo menos 120 μE/m2/s de intensidade de luz por 7 dias. Uma variedade de temperaturas altas (de 35°C a 45 °C, com incrementos de 2 graus por ensaio) é testada para avaliar a germinação de sementes colonizadas com micróbios a cada temperatura. A proporção de sementes que germinam com sucesso é comparada entre as sementes provenientes de plantas colonizadas com micróbios e as provenientes de controles. Testes para melhoria da germinação em condições de frio

[0484] Os testes de germinação padrão são usados para determinar se um micróbio que coloniza o interior de uma semente protege o milho contra a tensão por frio durante a germinação. Resumidamente, 400 sementes (por exemplo, sementes aqui descritas), cujos interiores são colonizados por cepas microbianas são colocadas entre toalhas de papel marrom úmidas (8 repetições com 50 sementes cada). Um número igual de sementes obtidas a partir de plantas de controle que não possuem micróbio é tratado da mesma maneira. As toalhas de papel são colocadas em cima de bandejas de plástico de 1 x 2 pés e mantidas em uma câmara de crescimento ajustada em 16:8 horas de luz:ciclo escuro, 70% de umidade e pelo menos 120 μE/m2/s de intensidade de luz por 7 dias. Uma variedade de temperaturas baixas (de 0 °C a 10 °C, com incrementos de 2 graus por ensaio) é testada para avaliar a germinação de sementes colonizadas com micróbios a cada temperatura. A proporção de sementes que germinam com sucesso é comparada entre as sementes provenientes de plantas colonizadas com micróbios e as provenientes de controles. Testes para melhoria da germinação em altas concentrações de sal

[0485] Experimentos de germinação são conduzidos em pratos de Petri de 90 mm de diâmetro. As réplicas consistem em um prato de Petri, regado com 10 mL da solução apropriada e 20 sementes flutuando na solução. 400 sementes (por exemplo, sementes aqui descritas), cujos interiores são colonizados por cepas microbianas e 400 controles de sementes (sem as cepas microbianas) são testados desta forma (40 pratos de Petri no total). Para evitar grandes variações na concentração de sal devido à evaporação, os pratos são selados com parafilme e as soluções salinas são renovadas semanalmente, despe-jando a solução salina existente no prato de Petri e adicionando a mesma quantidade de solução fresca. Uma variedade de soluções salinas (NaCl 100-500 mM) é testada para avaliar a germinação de sementes microcomolares em diferentes níveis de sal. Os pratos de Petri são mantidos em uma câmara de crescimento ajustada em 25 ° C16:8 horas de luz:ciclo escuro, 70% de umidade, e pelo menos 120 μE/m2/s de intensidade de luz. A proporção de sementes que germina com sucesso após duas semanas é comparada entre as sementes provenientes de plantas inoculadas e as provenientes de controles. Testes para melhoria da germinação em solos com alto teor de metal

[0486] Os testes de germinação padrão são usados para determinar se um micróbio que coloniza o interior de uma semente protege o milho contra a tensão devido ao alto teor de metal do solo durante a germinação. Resumidamente, 400 sementes (por exemplo, sementes aqui descritas), cujos interiores são colonizados por cepas microbianas são colocadas entre toalhas de papel marrom úmidas (8 repetições com 50 sementes cada). Um número igual de sementes obtidas a partir de plantas de controle que não possuem micróbio (livres de micróbio) é tratado da mesma maneira. As toalhas de papel são colocadas em cima de bandejas de plástico de 1 x 2 pés com furos para permitir a drenagem da água. As toalhas de papel são cobertas com uma polegada de areia estéril. Para cada metal a ser testado, a areia precisa ser tratada adequadamente para garantir a liberação e biodisponibili- dade do metal. Por exemplo, no caso do alumínio, a areia é irrigada com pH 4,0 + ~ 1 g/Kg solo Al+3 (-621 uM). As bandejas são mantidas em uma câmara de crescimento ajustada à 25°C e 70% de umidade por 7 dias. A proporção de sementes que germinam com sucesso é comparada entre as sementes provenientes de plantas colonizadas com micróbios e as provenientes de controles. Testes para a promoção do crescimento na câmara de crescimento em condições normais

[0487] O solo é feito de uma mistura de 60% Sunshine Mix #5 (Sun Gro; Bellevue, Wash., EUA) e 40% de vermiculita. Para determinar se um micróbio particular que coloniza o interior das sementes é capaz de promover o crescimento da planta em condições normais, 24 potes são preparados em duas bandejas planas sem buracos de 12 potes com 28 gramas de solo seco em cada pote e 2 L de água filtrada são adicionados a cada bandeja. A água pode mergulhar no solo e a superfície do solo é batida antes da semeadura. Para cada combinação de semente e micróbio, 12 potes são semeados com 3-5 sementes colonizadas pelo micróbio e 12 potes são semeados com 3-5 sementes sem micróbios (plantas sem micróbio). Os potes semeados são cobertos com uma cúpula de umidade e mantidos no escuro por 3 dias, depois os potes são transferidos para uma câmara de crescimento ajustada a 25°C, luz 16:8 horas:ciclo escuro, 70% de umidade e pelo menos 120 μE/m2/s de intensidade de luz. As cúpulas de umidade são removidas no dia 5, ou quando os cotilédones estão totalmente expandidos. Após a remoção das cúpulas, cada pote é irrigado até a saturação com solução de Hoagland 0,5 X e, em seguida, deixando escorrer o excesso de solução. As mudas são diluídas em 1 por pote. Nos dias seguintes, os potes são irrigados até saturação com água filtrada, permitindo que o excesso de água escorra após cerca de 30 minutos de imersão, e o peso de cada bandeja plana de 12 potes é gravado semanalmente. A área da cobertura é medida em intervalos semanais. A altura da planta terminal, a área foliar média e o comprimento médio da folha são medidos no final da fase de floração. As plantas são autorizadas a secar e o peso da semente é medido. A sig- nificância da diferença de crescimento entre as plantas colonizadas por micróbios e os controles sem o micróbio são avaliadas com o teste estatístico apropriado, dependendo da distribuição dos dados em p <0,05. Testes para promoção do crescimento na câmara de crescimento sob tensão biótica

[0488] O solo é feito de uma mistura de 60% Sunshine Mix #5 (Sun Gro; Bellevue, Wash., EUA) e 40% de vermiculita. Para determinar se um micróbio particular que coloniza o interior das sementes é capaz de promover o crescimento da planta na presença de tensão biótica, 24 potes são preparados em duas bandejas planas sem buracos de 12 potes com 28 gramas de solo seco em cada pote e 2 L de água filtrada são adicionados a cada bandeja. A água pode penetrar no solo antes do plantio. Para cada combinação de semente e micróbio, 12 potes são semeados com 3-5 sementes colonizadas pelo micróbio e 12 potes são semeados com 3-5 sementes sem micróbios (plantas sem micróbio). Os potes semeados são cobertos com uma cúpula de umidade e mantidos no escuro por 3 dias, depois os potes são transferidos para uma câmara de crescimento ajustada a 25°C, luz 16:8 horas:ciclo escuro, 70% de umidade e pelo menos 120 μE/m2/s de intensidade de luz. As cúpulas de umidade são removidas no dia 5, ou quando os cotilédones estão totalmente expandidos. Após a remoção das cúpulas, cada pote é irrigado até a saturação com solução de Hoagland 0,5 X e, em seguida, permitindo que o excesso de solução escorra. As mudas são diluídas em 1 por pote. Nos dias seguintes, os potes são irrigados até saturação com água filtrada, permitindo que o excesso de água escorra após cerca de 30 minutos de imersão.

[0489] Vários métodos de inoculação são usados de acordo com o estilo de vida do patógeno. Para os agentes patogênicos das folhas (por exemplo, Pseudomonas syringeae ou Colletotrichum graminicola), uma suspensão de células para bactérias (108 célula/mL) ou esporos para fungos (107 esporos/mL) é aplicada com um aplicador na superfície adaxial de cada uma das folhas mais jovens totalmente expandidas. Alternativamente, para os patógenos fúngicos que não formam conídios facilmente, duas pastilhas de ágar contendo micélio (~ 4 mm de diâmetro) são anexados à superfície adaxial de cada uma das folhas mais jovens de cada lado do veio central. Para os agentes patogênicos vasculares (por exemplo,Pantoea stewartii ou Fusarium monili- forme), a suspensão de células ou esporos é introduzida diretamente na vasculatura (5-10 μL) através de uma lesão menor inflexa com uma lâmina estéril. Alternativamente, as mudas podem ser cultivadas hidro- ponicamente na suspensão de células/esporos ou micélio. Para testar a resiliência da combinação planta-micróbio contra os estresses dos insetos, tais como tripes ou pulgões, as plantas são transferidas para uma câmara de crescimento especialmente designada contendo os insetos. Os agentes patogênicos de insetos ou nemátopos transmitidos pelo solo são misturados ou aplicados topicamente no solo do pote. Em todos os casos, toma-se cuidado para conter o fungo, inseto, ne- mátodos ou outro patógeno e evitar a liberação fora da área de teste imediata.

[0490] O peso de cada bandeja plana de 12 potes é gravado se-manalmente. A área da cobertura é medida em intervalos semanais. A altura da planta terminal, a área foliar média e o comprimento médio da folha são medidos no encerramento da floração. As plantas são au-torizadas a secar e o peso da semente é medido. A significância da diferença de crescimento entre as plantas colonizadas por micróbios e os controles sem o micróbio são avaliadas com o teste estatístico apropriado, dependendo da distribuição dos dados em p <0,05.

Exemplo 4 - Caracterização funcional de endófitos Ensaio de produção de auxina

[0491] A auxina é um importante hormônio vegetal, que pode promover a ampliação celular e inibir o desenvolvimento de ramos (atividade de meristema) em tecido vegetaiss acima do solo, enquanto abaixo do solo tem o efeito oposto, promovendo a ramificação e o crescimento radicular. Curiosamente, a auxina da planta é fabricada acima do solo e transportada para as raízes. Desta forma, essa planta, e especialmente os micróbios que habitam raízes que produzem quantidades significativas de auxina, poderão promover a ramificação e o desenvolvimento radicular mesmo em condições em que a planta reduz sua própria produção de auxina. Tais condições podem existir, por exemplo, quando o solo é inundado e as raízes encontram um ambiente anóxico.

[0492] O indol contendo IAA é capaz de gerar um cromóforo rosado sob condições ácidas na presença de cloreto férrico. Para medição de auxina, foram inoculados 1 μl de culturas cultivadas durante a noite de cepas bacterianas endofíticas em 750 μl de caldo R2A suplementado com L-TRP (5 mM) em placas de cultura de 96 de 2 mL. As placas foram seladas com uma membrana respirável e incubadas às 230C com agitação constante a 200 rpm durante 4 dias. Para medir a produção de auxina por cepas de fungos, inoculou-se 3 μl de culturas fúngicas líquidas de 5 dias em 1 ml de caldo R2A suplementado com L-TRP (5 mM) em placas de cultura de 24 poços. As placas foram seladas com fita respirável e incubadas às 230C balançando constante a 130 rpm durante 4 dias. Após 4 dias, transferiram-se 100 μL de cada cultura para uma placa de 96 poços. Foram adicionados 25 μL de reagente de Salkowski (1 mL de solução de FeCl3 0,5 M a 50 mL de HClO4 a 35%) em cada poço e as placas foram incubadas no escuro durante 30 minutos antes de fotografar e medir 540 nm de absorção utilizando o leito de placa SpectraMax M5 (Molecular Devices). Os halos rosa escuro em torno das colônias são visualizados na membrana por meio de iluminação de fundo usando uma mesa de luz.

[0493] Os endófitos foram testados quanto à sua capacidade de produzir auxinas como possíveis agentes promotores do crescimento radicular. Foram realizadas quatro repetições para cada cepa testada. Resultados exemplificativos da produção de auxina para endófitos pertencentes à OTUs de núcleo são apresentados abaixo na Tabela E, Tabela F, e Tabela G. Ensaio de produção de acetoína e diacetil

[0494] Para medições de acetoína, as cepas microbianas foram cultivadas como descrito acima em caldo R2A suplementado com 5% de glicose. Após 4 dias, transferiram-se 100 μL de cada cultura para uma placa de 96 poços e misturaram-se com 25 μL de Reagentes de Barritt A e B e 525 nm de absorção. Os Reagentes de Barritt A e B foram preparados misturando 5 g/L de creatina misturada 3:1 (v/v) com alfa-naftol recém-preparado (75 g/L em hidróxido de sódio 2,5 M). Após 15 minutos, as placas são marcadas para coloração vermelha ou rosa contra um controle negativo de cobre. Foram realizadas quatro repetições para cada cepa testada. Resultados exemplificativos da produção de acetoína para endófitos pertencentes à OTUs de núcleo são apresentados abaixo na Tabela E, Tabela F e Tabela G. Ensaio de produção de sideróforo

[0495] Para garantir que nenhum ferro contaminante seja transferido de experiências anteriores, todos os produtos de vidro são diferidos com HCl 6 M e água antes da preparação do meio. Para medições de sideróforos, as cepas microbianas foram cultivadas como descrito acima no caldo R2A. Após 3 dias de incubação a 25°C, as placas são sobrepostas com sobreposição de O-CAS. Mais uma vez usando o vidro limpo, 1 litro de sobreposição de O-CAS é preparado misturando 60,5 mg de cromo azurol S (CAS), 72,9 mg de brometo de hexadecil- trimetil amônio (HDTMA), 30,24 g de Piperazina-1,4-bis-ácido 2- etanossulfônico (PIPES) com 10 mL de FeCh»6H2O 1 mM em solvente de HCl 10 mM. O PIPES teve que ser finamente pulverizado e misturado suavemente com agitação (sem balançar) para evitar a produção de bolhas, até que uma cor azul escuro foi alcançada. Adicionou-se então 1% de agarose fundido a O-CAS pré-aquecido apenas antes de verter a sobreposição em uma proporção de 1:3 (v/v). Após 15 minutos, a mudança de cor é avaliada procurando por halos roxos (sideró- foros de tipo catecol) ou colônias laranjas (Hydroxamate Siderophores). Foram realizadas quatro repetições para cada cepa testada.

[0496] Em muitos ambientes, o ferro é um nutriente limitante para o crescimento. Um mecanismo de enfrentamento que muitos micróbios desenvolveram é produzir e secretar compostos quelantes de ferro chamados sideróforos, que muitas vezes apenas aquela espécie ou cepa particular tem os meios para reabsorver e interagir com a liberação do ferro unido, tornando-o disponível para o metabolismo. Um efeito marginal da produção e secreção do sideróforo é que um microorganismo secretor de sideróforos pode remover todo o ferro biodispo- nível em seu ambiente, dificultando a invasão de uma espécie concorrente nesse microambiente.

[0497] A produção de sideróforo por micróbios em uma superfície de planta ou dentro de uma planta pode mostrar que um micróbio está preparado para crescer em um ambiente limitado em nutrientes e, talvez, proteger o ambiente da planta de invasão por outros micróbios, talvez não desejáveis. Resultados exemplificativos da produção de si- deróforo para endófitos pertencentes à OTUs de núcleo são apresentados abaixo na Tabela E, Tabela F e Tabela G. Tabela E: Produção de auxina, sideróforo e acetoína por endófitos bacterianos pertencentes às OTUs de núcleo; Legenda:0 = sem produção; 1 = baixa produção; 2 = produção média; 3 = alta produção

Tabela F: Produção de auxina, sideróforo e acetoína por endófitos fúngicos pertencentes às OTUs de núcleo; Legenda:0 = sem produção; 1 = baixa produção; 2 = produção média; 3 = alta produção

Tabela G: Produção de sideróforo, auxina e acetoínas exemplifica- tivas de endófitos microbianos pertencentes às OTUs de núcleo; Legenda:0 = sem produção; 1 = baixa produção; 2 = produção média; 3 = alta produção

Ensaio para o crescimento em meio LGI livre de nitrogênio

[0498] Todos os produtos de vidro são limpos com HCl 6 M antes da preparação do meio. Uma nova placa de 96 poços profundos (volume de poço de 2 mL) é preenchida com 250 ul/poço de caldo LGI estéril [por L, 50 g de Sacarose, 0,01 g de FeCh»6H2O, 0,8 g K3PO4, 0,2 g de MgSO4-7H2O, 0,002 g Na2MoO4-2H2O, pH 7,5]. Os micróbios são inoculados nos 96 poços simultaneamente com um replicador de 96 pinos esterilizado por chama. A placa é selada com uma membrana respirável, incubada a 28°C sem agitação durante 3 dias e leituras de OD600 feitas com um leitor de placas de 96 poços.

[0499] Uma bactéria associada à planta de fixação de nitrogênio é capaz, teoricamente, de se adicionar ao metabolismo do nitrogênio do hospedeiro, e a mais famosa bactéria associada às plantas benéficas, a rizóbia, são capazes de fazer isso dentro de órgãos especialmente adaptados que as plantas leguminosas desenvolvem para que possam fazer isso. Em algumas modalidades, os micróbios associados à semente aqui descritos são capazes de fixar nitrogênio em associação com o desenvolvimento de muda, independentemente de colonizarem as superfícies ou o interior da planta e, assim, adicionar à nutrição do nitrogênio da planta. Ensaio de atividade de ACC desaminase

[0500] Os micróbios são testados quanto ao crescimento com ACC como única fonte de nitrogênio. Antes da preparação do meio, todos os produtos de vidro são limpos com HCl 6 M. Uma solução esterilizada com filtro de 2 M de ACC (# 1373A, Research Organics, EUA) é preparada em água. 1 μl/mL dela é adicionado ao caldo LGI autoclavado (ver acima) e alíquotas de 1 mL são colocadas em uma nova placa de 96 poços. A placa é selada com uma membrana respirável, incubada a 25°C com agitação suave durante 5 dias e medições de OD600 são feitas. Apenas os poços que são significativamente mais turvos do que os respectivos poços de LGI livres de nitrogênio são considerados como exibindo atividade de ACC deaminase.

[0501] As reações de tensão das plantas são fortemente impactadas pela própria produção da planta e pela superprodução do hormônio gasoso etileno. O etileno é metabolizado a partir do seu 1- aminociclopropano-1-carboxilato (ACC) precursor que pode ser desviado do metabolismo de etileno por enzimas microbianas e vegetais com atividade de ACC deaminase. Como o nome indica, a ACC dea-minase remove o nitrogênio molecular do precursor de etileno, remo-vendo-o como substrato para a produção de hormônio da tensão da planta e fornecendo ao micróbio uma fonte de nutrição valiosa no nitrogênio. Ensaio de solubilização de fosfato mineral

[0502] Os micróbios são plaqueados em meios de fosfato tricálci- co. É preparado da seguinte forma:10 g/L de glicose, 0,373 g/L de NH4NO3, 0,41 g/L de MgSO4, 0,295 g/l de NaCl, 0,003 de FeCl3, 0,7 g/L Ca3HPO4 e Ágar de 20 g/L, pH 6, depois autoclavados e vertidos em placas de 150 mm. Após 3 dias de crescimento a 25°C no escuro, os halos claros são medidos em torno das colônias capazes de solubi- lizar o fosfato tricálcico. Ensaio de atividade de RNAse

[0503] 1,5 g de RNA de levedura de torula (# R6625, Sigma) são dissolvidos em 1 mL de Na2HPO4 0,1 M a pH 8, esterilizado por filtração e adicionado a 250 mL de meio de ágar R2A autoclavado que é vertido em placas de 150 mm. As bactérias de uma placa de estoque de glicerol são inoculadas usando um replicador de 96 pinos esterilizado por chama e incubadas a 25°C durante 3 dias. No dia três, as placas são inundadas com 70% de ácido perclórico (# 311421, Sigma) por 15 minutos e marcadas para a produção de halo transparente em torno das colônias.

Ensaio de atividade de pectinase

[0504] Adaptando um protocolo anterior, 0,2% (p/v) de pectina cítrica (# 76280, Sigma) e 0,1% triton X-100 são adicionados aos meios R2A, autoclavados e vertidos em placas de 150 mm. As bactérias são inoculadas usando um replicador de placas de 96 pinos. Após 3 dias de cultura no escuro a 25°C, a atividade de pectinase é visualizada inundando a placa com iodo de Gram. As colônias positivas são cer- cadas por halos claros. Ensaio de atividade de celulase

[0505] Adaptando um protocolo anterior, 0,2% de sal de sódio de carboximetilcelulose (CMC) (# C5678, Sigma) e 0,1% de triton X-100 são adicionados aos meios de R2A, autoclavados e vertidos em placas de 150 mm. As bactérias são inoculadas usando um replicador de placas de 96 pinos. Após 3 dias de cultura no escuro a 25°C, a atividade de celulose é visualizada inundando a placa com iodo de Gram. As colônias positivas são cercadas por halos claros. Ensaio de antibiose

[0506] As bactérias ou os fungos são inoculados usando um repli- cador de placa de 96 pinos em placas de Petri de 150 mm contendo ágar R2A, depois cultivadas durante 3 dias a 25°C. Neste momento, colônias de E. coli DH5α (teste gram negativo), Bacillus subtillus Ssp. Subtilis (teste gram positivo) ou cepa de levedura AH109 (teste de fungos) são ressuspensas em 1 mL de tampao de Na2HPO4 50mM a um OD600 de 0,2 e 30 μl deste é misturado com 30 mL de ágar LB quente. Isto é rapidamente vertido completamente sobre uma placa de matriz de micróbios, deixado solidificar e incubar a 37°C durante 16 horas. A antibiose é avaliada procurando por halos claros em torno das colônias microbianas. Caracterização de BIOLOG do metabolismo do substrato do en- dófito

[0507] Além dos ensaios de auxina, acetoína e sideróforo descritos acima, os endófitos aqui descritos foram caracterizados pela sua capacidade de metabolizar uma variedade de substratos de carbono. As culturas líquidas de micróbios foram primeiro sonicadas para alcançar a homogeneidade. 1 mL de cultura de cada cepa foi colhido por centrifugação durante 10 minutos a 4500 RPM e subsequentemente lavado três vezes com água destilada estéril para remover quaisquer vestígios de meios residuais. As amostras microbianas foram ressus- pensas em água destilada estéril para uma OD590 final de 0,2. As me-dições da absorbância foram realizadas utilizando um leitor de micro- placas SpectraMax M (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

[0508] Os ensaios de substratos de carbono único foram realizados utilizando BIOLOG Phenotype MicroArray (PM) 1 e 2A MicroPlates (Hayward, CA). Uma alíquota de cada cultura de células bacteri- anas (2,32 mL) foi inoculada em 20 mL de líquido de inoculação de base de IF/0a GN/GP esterilizado (IF-0), 0,24 mL de Dye F 100X obtido na BIOLOG e levado para um volume final de 24 mL com água destilada estéril. Os ensaios de controle negativo PM1 e PM2A também foram feitos de forma semelhante menos células bacteria- nas para detectar reações abióticas. Uma alíquota de cultura de fungos (0,05 mL) de cada cepa foi inoculada em 23,95 mL de meio FF-IF obtido na BIOLOG. As suspensões de células microbianas foram agitadas de modo a obter uniformidade. Cem microlitros da suspensão de células microbianas foram adicionados por poço usando um pipetador multicanal às microplacas BIOLOG PM1 e PM2A de 96 poços que cada uma continha 95 fontes de carbono e um único poço de água (controle negativo).

[0509] As microplacas foram seladas em fita cirúrgica de papel (Dynarex, Orangeburg, NY) para evitar efeitos de borda da placa e incubados imóveis a 24°C em um recipiente fechado por 70 horas. A ab- sorbância a 590 nm foi medida para todas as microplacas no final do período de incubação para determinar a utilização do substrato de carbono para cada cepa e normalizada em relação ao poço de controle negativo (somente água) de cada placa (Garland and Mills, 1991; Barua et al., 2010; Siemens et al., 2012; Blumenstein et al., 2015). Os ensaios bacterianos também foram calibrados contra os dados de mi- croplacas de controle negativo (sem células) PM1 e PM2A para corrigir quaisquer viés introduzidos por meio na análise colorimétrica (Borglin et al., 2012). Os valores de absorbância corrigidos que foram negativos foram considerados como zero para posterior análise (Garland e Mills, 1991; Blumenstein et al., 2015) e um valor limiar de 0,1 e acima foi usado para indicar a capacidade de uma determinada deformação microbiana para usar um dado substrato de carbono (Barua et al., 2010; Blumenstein et al., 2015). Além disso, microplacas bacterianas foram examinadas visualmente para a formação irreversível de cor violeta em poços, indicando a redução do corante redox de tetrazolium para formazan que resulta da respiração celular (Garland e Mills, 1991). Os testes fúngicos de PM foram medidos como ensaios de crescimento e a observação visual do crescimento micelial em cada poço foi feita. A utilização exemplificativa do substrato BIOLOG por endófitos aqui descritos é apresentada na Tabela H, Tabela I, Tabela J, Tabela K, Tabela L, Tabela M, Tabela N, Tabela O, Tabela P, Tabela Q, Tabela R, Tabela S, Tabela T, e Tabela U. Tabela H:Utilização do substrato, conforme determinado por mi- croplacas BIOLOG PM1 por endófitos bacterianos pertencentes à OTUs presentes em sementes de milho e de milho selvagem e de trigo que estão presentes em níveis mais baixos em sementes modernas de milho e trigo.

Tabela I: Utilização do substrato conforme determinado por mi- croplacas BIOLOG PM2A por endófitos bacterianos pertencentes à OTUs presentes em sementes de trigo e milho landrace e selvagem que estão presentes em níveis mais baixos em sementes modernas de milho e trigo.

[0510] Foram testadas duzentas cepas de bactérias cultiváveis pertencentes à OTUs presentes em sementes de trigo e milho landrace e selvagem presentes em níveis mais baixos em sementes modernas de milho e trigo, para análise de utilização de substrato de carbono único utilizando microplacas BIOLOG PM1 e PM2A. Os substratos mais utilizados por essas cepas são L-alanina, L-galactônico-ácido-Y- lactona, maltose, maltotriose, D-celobiose, gentiobiose e D- glucosamina. Os substratos menos utilizados por estas cepas são L- asparagina, L-glutamina, ácido D-aspártico, ácido tricarbálico, L-serina, L-fucose, 1,2-propanodiol, D-treonina, L-treonina, ácido succínico, ácido fumárico, ácido bromo succínico, fosfato de D-La-glicerol, ácido a- cetobutírico, ácido a-hidróxi butírico, ácido acetoacético, glucuronami- da, ácido glicólico, monometil succinato, ácido glioxílico, feniletil-amina e ácido L-málico.

[0511] Os substratos mais utilizados por um grande número de bactérias cultiváveis pertencentes à OTUs de núcleo são ácido múcico, L-arabinose, ácido-galactônico—Y—lactona, N-acetil-D-glucosamina, mal-tose, maltotriose e D-celobiose. Estas bactérias do núcleo não utilizaram sedoheptulosan, ácido oxálico, ácido 2-hidróxi benzoico, ácido quínico, mannan, L-metionina, N-acetil-D-glucosaminitol, ácido sorbico, 2,3-butanona, ácido succínico, feniletil-amina, e 3-hidróxi-2-butanona como únicas fontes de carbono. Os resultados para os fungos cultiváveis pertencentes às OTUs de núcleo indicam que D-sorbitol, L- arabinose, N-acetil-D-glucosamina, glicerol, tween 40, tween 80, ácido D-glucônico, L-prolina, a-D-glicose, D-trealose, maltose, lactulose, D- manose, D-manitol, sacarose, D-celobiose, ácido L-glutâmico, L- ornitina e ácido L-piroglutâmico são substratos de carbono que são utilizados por um grande número de cepas de endófitos examinadas aqui . O substrato de carbono que pareceu não ser utilizado por fungos nestes ensaios é 2-deóxi-D-ribose. Todos os outros substratos podem ser utilizados como único nutriente de carbono por pelo menos uma cepa de SYM fúngica. Tabela J:Utilização do substrato, conforme determinado por mi- croplacas BIOLOG PM1 por endófitos bacterianos pertencentes às OTUs de núcleo.

Caracterização de micróbios cultiváveis: utilização de substrato

[0512] Foram realizadas análises BIOLOG adicionais. Para análises biológicas adicionais, os micróbios foram cultivados em três repetições biológicas para cada cepa. Cada bactéria foi inicialmente estirada no ágar 2A (R2A) de Reasoner, CFUs selecionadas e cultivadas em 6 mL de caldo R2A durante 4 dias. As cepas de fungos foram estiradas em ágar de dextrose de batata (PD) e tampas individuais contendo esporos e os tecidos de micélio foram utilizados para iniciar o crescimento em 6 mL de caldo de PD por 6 dias. Todas as cepas foram cultivadas com agitação à temperatura ambiente. As culturas líquidas de um ml de cada amostra foram colhidas por centrifugação durante 15 minutos a 4500 RPM e subsequentemente lavadas pelo menos quatro vezes com água destilada estéril para remover quaisquer vestígios de meio residual. Além disso, as culturas fúngicas foram primeiro sonica- das para alcançar a homogeneidade após o período de crescimento. Os micróbios foram ressuspensos em 500 μL de água destilada estéril e as medidas de absorbância foram tomadas utilizando um leitor de microplacas SpectraMax M (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

[0513] Os ensaios de substratos de carbono único foram realizados utilizando BIOLOG Phenotype MicroArray (PM) 1 e 2A MicroPlates (Hayward, CA). Uma alíquota de cada cultura de células bacterianas correspondente a uma absorbância final de 0,2 foi inoculada em 20 mL de líquido de inoculação de base de IF/0a GN/GP esterilizado (IF-0), 0,24 mL de corante 100X B obtido na BIOLOG e trazido para um volume final de 24 mL com água destilada estéril em tubos Falcon de 50 mL. Os ensaios de controle negativo PM1 e PM2A também foram feitos de forma semelhante menos células bacterianas para detectar reações abióticas. A cultura fúngica de cada cepa com uma absorbância final de 0,2 (~ 63% de turbidez) foi trazida para um volume final de 24 mL com o meio FF-IF (BIOLOG). As suspensões de células microbia- nas nos tubos foram suavemente balançadas para alcançar a unifor-midade. Cem microlitros da suspensão de células microbianas foram adicionados por poço usando um pipetador multicanal às microplacas BIOLOG PM1 e PM2A de 96 poços que cada uma continha 95 fontes de carbono e um único poço de água (controle negativo). Todas as etapas foram realizadas em condições estéreis usando armários de biossegurança.

[0514] As microplacas foram seladas em fita cirúrgica de papel (Dynarex, Orangeburg, NY) para minimizar os efeitos de borda da placa e incubadas imóveis a 24°C em um recipiente fechado por um mínimo de 72 horas. A absorbância a 590 nm foi medida para todos os as microplacas pelo menos a cada 24 horas ou em um intervalo definido (72 horas pós-ensaio) para determinar a utilização do substrato de carbono para cada cepa. As medidas foram normalizadas em relação ao poço de controle negativo (somente água) de cada placa (Garland and Mills, 1991; Barua et al., 2010; Siemens et al., 2012; Blumenstein et al., 2015). As microplacas bacterianas também foram examinadas visualmente para a formação irreversível de cor violeta em poços, indicando a redução do corante redox tetrazolium para formazan que resulta da respiração celular (Garland e Mills, 1991) e avaliada contra as microplacas de controle negativo (sem células) PM1 e PM2A para detectar alterações de cor abióticas potencialmente introduzidas pelo meio e/ou corantes (Borglin et al., 2012). Os valores de absorbância normalizados que foram negativos foram considerados como zero para posterior análise (Garland e Mills, 1991; Blumenstein et al., 2015) e um valor limiar de 0,1 e acima foi usado para indicar a capacidade de uma determinada deformação microbiana para usar um dado substrato de carbono (Barua et al. ,2010; Blumenstein et al., 2015). Os testes fúngicos de PM foram medidos como ensaios de crescimento e a observação visual do crescimento micelial em cada poço foi feita.

[0515] Dezessete (17) cepas de SYM bacterianas e dezesseis (16) cepas de SYM fúngicas foram testadas em triplicado biológico para utilização de um único substrato de carboneto usando microplacas BIOLOG PM1 e PM2A. Os substratos mais utilizados em geral por essas cepas são a-D-Glicose, Arbutina, b-Metil-D-Galactosídeo, b-Metil-D- Glucosídeo, D-Arabitol, D-Celobiose, Dextrina, D-Frutose, D- Galactose, D-Ácido glucônico, D-Glucosamina, Di-hidroxiacetona, Ácido D-L-Málico, D-Manitol, D-Manose, D-Melezitose, D-Melibiose, D- Rafinose, D-Ribose, D-Trealose, D-Xilose, Ácido g-amino-N-butírico, g- Ciclodextrina, Gelatina, Gentiobiose, Glicogênio, i-Eritritol, L-alanina, L- arabinose, Ácido L-galactônico-g-lactona, L-histidina, L-prolina, L- Ramnose, Maltitol Maltose, Maltotriose, N-Acetil-D-Glucosamina, Pala- tinose, Pectina, Salicina, Estaquiose, Sacarose e Turanose. Em geral, essas cepas não utilizaram 2,3-butanodiol, 2,3-butanodiona, Ácido b- Metil-D-Glucurônico, b-Metil-D-xilosídeo, Ácido caprílico, D,L-Carnitina, Glucuronamida, Ácido Itacônico, L-Metionina, N-Acetil-D- Glucosaminitol, Ácido N-acetil-Neuramínico, Feniletilamina ou sec- Butilamina como únicas fontes de carbono.

[0516] Os substratos mais utilizados por estes dezessete endófitos bacterianos são 2-Deóxi-D-Ribose, a-D-Glicose, a-Metil-D- Galactosídeo, Arbutina, b-Metil-D-Galactosídeo, b-Metil-D-Glucosídeo, D-Arabitol, D-Celobiose, Dextrina, D- Frutose, D-Galactose, ácido D- Galacturônico, ácido D-Glucônico, D-Glucosamina, Dihidroxiacetona, ácido DL-Malico, D-Manitol, D-Manose, D-Melibiose, D-Rafinose, D- Ribose, D-Trealose, D-Xilose, Gelatina, Gentiobiose, L-Arabinose, ácido L-Aspártico, ácido L-Galactônico-g-Lactona, ácido L-Glutamico, L- Glutamina, L-Histidina, L-Ornitina, L-Prolina, Maltose, Maltotriose, N- Acetil-D-Glucosamina, Ácido piruvico, Salicina, Sacarose e Turanose. Estes endófitos bacterianos não utilizaram 1,2-propanodiol, 2,3- Butanodiol, 2,3-Butanodiona, 2-Aminoetanol, ácido 2-Hidroxibenzóico, 3-Hidróxi-2-butanona, 3-Metilglicose, ácido 4-Hidroxibenzóico, Aceta- mida, ácido Acetoacético, a-Hidroxibutírico, a-ácido Hidroxiglutárquico- g-lactona, ácido a-Cetobutírico, a-ácido Ceto-Valérico, a-Metil-D- Glucosídeo, a-Metil-D-Manosídeo, b-D-Alose, Ácido b-Metil-D- Glucurônico, b-Metil-D-Xilosídeo, Ácido caprílico, Ácido caproico, Ácido citracônico, Ácido citramalico, D,L-Carnitina, D, L-Octopamina, ácido d-Amino Valérico, ácido D-aspártico, D-Melezitose, D-Serina, D- Tagatose, D-Tartárico, D-Treonina, g-Ciclodextrina, Ácido g- Hidroxibutírico, Glucuronamida, Glicina, Ácido glicólico, Ácido glioxí- lico, Hidróxi-L-Prolina, i-Eritritol, Inulina, Ácido Itacônico, L-Arabitol, L- Fucose, L-Glicose, L-Homosserina, L-Metionina, L-Sorbose, L- Treonina, L-Valina, Ácido m-Tartárico, N-Acetil- D-Glucosaminitol, N- Acetil-D-Manosamina, Ácido N-Acetil-Neuramínico, Ácido Oxálico, Fe- niletilamina, Ácido sebácico, sec-Butilamina, Sedoheptulosano, Esta- quiose, Ácido tricarbálico, Tiramina ou Xilitol como únicas fontes de carbono.

[0517] Os substratos mais utilizados por estes dezesseis endófitos fúngicos são a-D-Glicose, a-Metil-D-Glucosídeo, Amigalina, Arbutina, B-Metil-D-Galactosídeo, b-Metil-D-Glucósídeo, D-Arabitol, D- Celobiose, Dextrina, D-Frutose, D-Galactose, D-Manitol, D-Manose, D- Melezitose, D-Melibiose, D-Rafinose, D-Trealose, D-Xilose, Ácido g- Amino-N-Butírico, g-Ciclodextrina, Gentiobiose, Glicogênio, i-Eritritol, L-Alanina, L-Arabinose, L-Arginina, L-Ornitina, L-Ramnose, Maltitol, Maltose, Maltotriose, N-Acetil-D-Glucosamina, Palatinose, Pectina, Pu- trescina, Ácido quínico, Salicina, Estaquiose, Sacarose e Turanose. Estes endófitos fúngicos não utilizaram 2,3-Butanodiol, 2,3- Butanodiona, 2-Deóxi-D-Ribose, Ácido b-Metil-D-Glucurônico, b-Metil- D-Xilosídeo, Ácido cáprico, D,L-Carnitina, ácido D-Galactônico-g- Lactona, D-Glicose-1-Fosfato, Glucuronamida, Ácido itacônico, L- Metionina, N-Acetil-D-Galactosamina, N-Acetil-D-Glucosaminitol, Ácido N-Acetil-L-Glutâmico, Ácido N-Acetil-Neuramínico, Feniletilamina ou sec-Butilamina como únicas fontes de carbono.

Exemplo 5:Caracterização transcriptômica da resposta da planta hospedeira a composições sintéticas compreendendo sementes de plantas e um endófito (Experiências de RNA-SEQ de soja)

[0518] Este exemplo descreve a capacidade de composições sintéticas compreendendo sementes de plantas e uma cepa de endófito único ou uma pluralidade de cepas de endófitos aqui descritas, de conferir características benéficas a uma planta hospedeira. Entre outras coisas, este exemplo descreve a capacidade dos endófitos (por exemplo, endófitos aqui descritos) para conferir traços benéficos em uma variedade de plantas hospedeiras modulando o transcriptoma da planta hospedeira. Em algumas modalidades, as plantas hospedeiras incluem, mas não estão limitadas a, dicotiledôneas (por exemplo, soja, amendoim) e monocotiledôneas (por exemplo, plantas aqui descritas, por exemplo, milho, soja, trigo, algodão, sorgo) e combinações dos mesmos.

[0519] Entre outras coisas, este Exemplo descreve modulações surpreendentes e inesperadas no transcriptoma de uma planta hospedeira em resposta a composições sintéticas compreendendo sementes de plantas e uma cepa de endófito fúngica benéfica, em comparação com uma cepa fúngica neutra do mesmo gênero. Mudas de plantas

[0520] Sementes de soja não tratadas foram esterilizadas em superfície usando fumos de cloro. Resumidamente, os frascos de Erlen- myer contendo sementes e uma garrafa com 100 ml de solução de alvejante fresca foram colocados em um recipiente de dessecação localizado em uma exaustão. Imediatamente antes de fechar a tampa do frasco de dessecação, 3 ml de ácido clorídrico foram cuidadosamente pipetados no alvejante. A esterilização foi feita por 17 horas e, após a conclusão, os frascos com sementes foram removidos, selados em papel alumínio estéril e abertos em um armário de biossegurança estéril ou capa de fluxo laminar para trabalhos subsequentes. Ensaio de mudas de soja

[0521] As sementes foram primeiro revestidas com alginato de sódio a 3% e balançadas suavemente para obter uma cobertura homogênea. O inóculo de fungos da cepa SYM cultivado como descrito anteriormente foi adicionado às sementes revestidas com alginato de sódio e misturado suavemente. Para cada grama de sementes, foram aplicados 10 μL de alginato de sódio e inóculo. Sementes de soja apenas com formulação foram revestidas com 3% de alginato de sódio e APB fresco.

[0522] Foram colocadas dez sementes em uma placa de Petri de 150mm que continha um único papel de germinação pesado (papel de germinação de sementes de peso pesado SD5-1/4 76 # Anchor Paper Co. ,St. Paul, MN) adicionou-se com 10 mL de polietilenoglicol a 8% (PEG 6000). As placas foram incubadas a 22°C no escuro e 60% de umidade relativa durante cinco dias. As mudas foram colhidas no final do período de incubação e armazenadas em -80°C até o isolamento total de RNA usando o método de extração padrão usando TriReagent (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) e purificação com RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha). Todas as experiências (benéficas, neurais, formulação) foram feitas em triplicado em condições estéreis resultando em um total de nove amostras. RNA-SEQ de soja

[0523] O controle inicial da qualidade foi realizado usando Agilent Bioanalyzer and Tapestation. Preparação de polyA cDNA

[0524] Para cada um dos 9 RNAs de soja, polyA cDNA foi preparado usando um kit de síntese de cDNA da Clontech. Resumidamente, após o QC inicial, aproximadamente 500ng de RNA total foram utilizados para gerar 1-2ug de cDNA usando o kit de cDNA PCR Clontech SMARTer (Clontech Laboratories, Inc. ,Mountain View, CA EUA, catálogo # 634925). As instruções do fabricante foram rigorosamente seguidas para realizar a construção de polyA cDNA; foram realizados 14 ciclos de PCR.

Fragmentação

[0525] Resumidamente, o cDNA foi fragmentado usando Bioruptor (Diagenode, Inc. ,Denville, NJ EUA). Os cDNAs fragmentados foram testados para distribuição e concentração de tamanho usando um Agilent Bioanalyzer 2100 ou Tapestation 2200 e Nanodrop. Construção da biblioteca de DNA

[0526] Para cada uma das 9 amostras de soja, as bibliotecas de Illumina foram feitas de cDNA fragmentado qualificado usando o Kit Reagente HTR de Beckman Coulter SPRIworks (Beckman Coulter, Inc. Indianapolis, IN USA, catálogo # B06938) no manipulador de líquidos Biomek FXp.

[0527] A estação de trabalho totalmente automática da Beckman Biomek FXp (Biomek 6000, Beckman Coulter) e um kit de biblioteca Beckman HT foram usados para gerar bibliotecas de fragmentos. As instruções foram rigorosamente seguidas para realizar a construção da biblioteca. Resumidamente, após a fragmentação, as extremidades foram reparadas e as bases "A" foram adicionadas à extremidade 3' dos fragmentos. Os adaptadores foram então ligados a ambas as extremidades. Os modelos adaptados aos adaptadores foram ainda purificados usando grânulos Agencourt AMPure SPRI. A biblioteca ligada por adaptador foi amplificada por PCR mediada por ligação, que consistiu em 10 ciclos de amplificação, e o produto de PCR foi purificado usando grânulos de Agencourt AMPure SPRI novamente. Depois que o procedimento de construção da biblioteca foi concluído, o QC foi rea- lizado usando Nanodrop e Agilent Bioanalyzer para garantir a qualidade e a quantidade da biblioteca. Sequenciamento de RNA

[0528] O sequenciamento foi realizadaoem um Illumina HiSeq 2500, usando a química Rapid Run v2. 0, que gerou leituras de extremidades pareadas de 106 nucleotídeos (nt) de acordo com as instruções do fabricante Illumina. A análise inicial de dados foi iniciada diretamente no HiSeq 2500 System durante a execução. O HiSeq Control Software 2. 2. 58 em combinação com o RTA 1. 18. 64 (análise em tempo real) realizou a análise de imagem inicial e a chamada de base. Além disso, bcl2fastq1. 8. 4 gerou e reportou as estatísticas de execução. Os dados foram analisados utilizando o FASTQC (Babraham Institute, Cambridge, Reino Unido), que inclui a informação da sequência que foi utilizada para todas as análises subsequentes da bioinformática. As sequências foram desmultiplexadas de acordo com o código de índice 6bp com 1 incompatibilidade permitida.

Análise

[0529] A análise diferencial do transcriptoma de soja na presença de fungos neutros versus benéficos foi realizada utilizando métodos de análise padrão de RNA-seq. Resumidamente, as respostas mapeadas sobrepostas com os recursos do éxon foram contadas e agregadas por gene. Estas contagens de nível de gene foram analisadas com o pacote DESeq2 R, disponível através do repositório de software Bioconductor. Todas as possíveis comparações dos três grupos (controle, neutro, benéfico) foram realizadas e o método da taxa de descoberta falsa foi utilizado para ajustar valores de p para múltiplos testes. As listas de genes diferenciais de alta e baixa confiança foram criadas usando limiares de taxa de descoberta falsa de 0,1 e 0,05 e limiares de Mudança em vezes log2 de 1 e 2, respectivamente. As diferenças de conjunto foram extraídas, por exemplo, genes diferencialmente ex- pressos em benefício versus controle, mas não em neutro versus con-trole. A análise de enriquecimento de Ontologia de Gene (GO) foi rea-lizada para todas as listas de genes diferenciais. Tabela 500: Esta tabela mostra os genes que são supraregulados (log FC negativao ou infrarregulados (log FC positivo) na soja como resultado do tratamento com um endófito benéfico, em comparação com o controle da formulação. Os genes descritos nesta tabela mostram diferenças significativas (valor corrigido de fdr <= 0,05) na expressão em mudas de soja tratadas com um Acremonium zea Sp. com efeitos benéficos sobre o crescimento da soja e as mudas de soja tratadas com uma formulação ("Benefício v Formulação). "Benefício de expressão mediana"e "Formulação de expressão mediana"representa o valor da expressão mediana em cpm em repetições biológicas de mudas de soja tratadas com o benefício Acremonium e a formulação, respectivamente. "Log FC" representa a estimativa da Mudança em vezes log2 do contraste. “Valor p ajustado” representa a taxa de descoberta falsa (Benjamini & Hochberg, 1995).

Tabela 501: Esta tabela mostra os genes que são suprarregulados (log FC positivo) ou infrarregulados (log FC negativo) na soja como resultado do tratamento com um endófito benéfico, em comparação com uma soja tratada com um micro-organismo de referência.

[0530] Esta tabela descreve genes de soja diferencialmente expressos em mudas de soja tratadas com uma Acremo- nium zea sp. com efeitos neutros no crescimento da soja e mudas de soja tratadas com uma Acremonium zea sp. com efeitos benéficos no crescimento da soja. Neutro da expressãomediana "e" Benefício da expressãomediana" representam o valor da expressão mediana em cpm em repetições biológicas de mudas de soja tratadas com a Acremonium neutra e Acremonium benéfico, respectivamente. "Log FC" representa a estimativa da Mudança em vezes log2 do contraste. “Valor p ajustado” representa a taxa de descoberta falsa (Benjamini & Hochberg, 1995).

Tabela 502: Esta tabela descreve termos de ontologia do gene que são significativamente enriquecidos ou esgo-tados no conjunto de genes expressos de forma diferente entre mudas de soja tratadas com uma Acremonium zea sp. com efeitos neutros no crescimento da soja e mudas de soja tratadas com uma Acremonium zea sp. com efeitos benéficos no crescimento da soja.

[0531] "Contagem de genoma" representa o número de genes associados ao termo GO que foram encontrados no genoma da soja. "Contagem de DEG observada" representa o número de genes associados ao termo GO que foram dife-rencialmente expressos no contraste Neutro V Benéfico "Contagem de DEG esperada" representa o número de genes associados ao termo de GO que se espera que sejam encontrados por acaso em uma seleção de conjunto aleatório desse número de genes. "Estado" representa se os genes com o termo GO estão sobre ou sub-representados no conjunto de DEGs. “Valor p ajustado” representa a taxa de descoberta falsa (Benjamini & Hochberg, 1995.

[0532] Os genes que são modulados na soja em resposta ao tratamento com endófito benéfico incluem os envolvidos em uma variedade de processos de plantas, como a defesa da planta (incluindo respostas à quitina e enrolamentos), respostas à tensão (incluinda tensão salino, privação de água, frio, ozônio, calor, osmótico), defesa contra a tensão oxidativa (processo de oxidação-redução, atividade de mono-oxigenase, processo de oxidação-redução, ligação de íons, óxido nítrico). Por exemplo, a expressão de genes envolvidos nos seguintes processos foi modulada:modificação da parede celular, resposta à defesa, processo de oxidação-redução, processo biológico, regulação da transcrição, processo metabólico, processo de biossintética do glu- cosinolato, resposta ao karrikin, fosforilação de proteína, dobramento de proteínas, resposta à quitina, proteólise, resposta ao estímulo de auxina, regulação de transcrição dependente de DNA, miristoilação de proteínas N-terminal, resposta à tensão oxidativa, componente celular, senescência foliar, via de sinalização de resposta de defesa dependente do gene de resistência, ligação de íons de zinco, resposta ao frio, processo metabólico de malato, transporte, atividade catalítica, resposta ao ozônio, motivo VQ, regulação da resistência adquirida sistêmica, transporte de íons de potássio, respiração anaeróbica, desenvolvimento organizacional multicelular, resposta ao calor, atividade de metiltransferase, resposta ao ferimento, processo de oxidação- redução, atividade de mono-oxigenase, processo de oxidação- redução, processo metabólico de carboidratos, exocitose, encurtamento de cauda de mRNA poli(A) transcrita nuclear, transporte de íons de sódio, processo metabólico de glicerol, resposta à privação de água, resposta à tensão salina e processo biossintético de clorofila.

Exemplo 6: Caracterização funcional de endófitos (Experimentos de RNA-SEQ de micróbios)

[0533] Este exemplo descreve a capacidade de composições sin- téticas compreendendo sementes de plantas e uma cepa de endófito único ou uma pluralidade de cepas de endófitos aqui descritas, de con-ferir características benéficas a uma planta hospedeira. Entre outras coisas, este Exemplo proporciona uma caracterização exemplificativa de modulações no transcriptoma de um endófito benéfico em resposta às interações da planta hospedeira, em comparação com as alterações transcriptômicas no transcriptoma de um micróbio neutro (por exemplo, não benéfico e não patogênico) do mesmo gênero.

[0534] A sequência de RNA foi utilizada para explorar diferenças na expressão de mRNA de genes comuns às duas cepas de Acremo- nium zeae.

[0535] Entre outras coisas, este Exemplo descreve a capacidade das plantas hospedeiras (por exemplo, plantas hospedeiras aqui descritas, por exemplo, dicotiledôneas, por exemplo, soja, amendoim e monocotiledose, por exemplo, milho, soja, trigo, algodão, sorgo) de modular diferencialmente o transcriptoma de um endófito benéfico em comparação com o transcriptoma de um micróbio neutro do mesmo gênero. Este exemplo descreve modulações surpreendentes e inespe-radas no transcriptoma de um endófito benéfico em resposta ao ho-mogeneizado de plantas inteiras, em comparação com uma cepa fúngica neutra do mesmo gênero.

[0536] Em particular, este Exemplo descreve uma comparação transcriptômica exemplificativa entre a capacidade funcional de um genoma de endófito fúngico benéfico e o genoma de um micróbio fúngico neutro do mesmo gênero. Resumidamente, cada conjunto de genes preditos microbianos foi anotado com informações de grupo de via e ortólogos a partir do banco de dados KEGG. Os grupos de via e ortó- logos que aparecem em um genoma, mas não o outro, foram extraídos e explorados manualmente para relevância biológica para as diferenças fenotípicas. Biomassa fúngica

[0537] Sintomas fúngicos benéficos (SYM00577) e neutros (SYM00300) de Acremonium zeae foram inicialmente estirados em ágar PD e incubados à temperatura ambiente até a formação da colônia. Foram utilizadas tampas distintas que consistes por esporos e micélios para inocular 125 mL de caldo de PD e cultivadas durante 5 dias à temperatura ambiente com agitação (200 RPM). Cada cepa foi cultivada em três repetições biológicas em duplicatas totalizando 12 frascos.

[0538] No dia 5 da cultura, adicionou-se ao fungo 1 mL de homo-geneizado de planta total obtido a partir de mudas de soja de 6 dias extraídas com solução salina tamponada com fosfato 50 mM (PBS) com uma proporção de 2 ml de tampão/grama de planta. A solução de homogeneizado de plantas foi preparada em três repetições e cada repetição foi aplicada às culturas fúngicas benéficas e neutras corres-pondentes. Um único ml de solução de PBS foi aplicado a cada replica biológica fúngica como o controle negativo.

[0539] A biomassa fúngica foi colhida 24 horas após a adição das soluções de homogeneizado de planta ou de PBS apenas por centrifu-gação a 4500 RPM durante 20 minutos em tubos Falcon de 50 mL para permitir a separação de cultura antes da remoção do sobrenadante. Os tecidos de fungos foram armazenados imediatamente em -80°C até o isolamento total de RNA usando o método de extração padrão usando TriReagent (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) e purificação com RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha). RNA-SEQ fúngico

[0540] O controle inicial da qualidade foi realizado usando Agilent Bioanalyzer and Tapestation. Depleção de rRNA

[0541] 1 μg de RNA total foi submetido à depleção de rRNA usando o kit RiboZero Yeast (Epicentre Biotechnologies, Illumina. com, catálogo # MRZY1306). As instruções do fabricante foram rigorosamente seguidas para realizar a depleção de rRNA. Preparação de cDNA filamentado

[0542] Após a depleção de rRNA, o RNA em depleção foi usado para gerar 1-2ug de cDNA usando:Kit LT de RNA Total com Filmanen- tos Illumina TruSeq (Illumina. com, catálogo # RS-122-2201). As instruções do fabricante foram rigorosamente seguidas para realizar a construção do cDNA; e a construção da biblioteca. Sequenciamento de RNA

[0543] O sequenciamento foi realizadao em um Illumina HiSeq 2500, usando a química Rapid Run v2. 0, que gerou leituras de extremidades pareadas de 106 nucleotídeos de acordo com as instruções do fabricante Illumina. A análise inicial de dados foi iniciada diretamente no HiSeq 2500 System durante a execução. O HiSeq Control Software 2. 2. 58 em combinação com o RTA 1. 18. 64 (análise em tempo real) realizou a análise de imagem inicial e a chamada de base. Além disso, bcl2fastq1. 8. 4 gerou e reportou as estatísticas de execução. Os dados foram analisados utilizando o FASTQC (Babraham Institute, Cambridge, Reino Unido), que inclui a informação da sequência que foi utilizada para todas as análises subsequentes da bioinformática. As sequências foram desmultiplexadas de acordo com o código de índice 6bp com 1 incompatibilidade permitida. Análise

[0544] Os níveis de expressão para cada gene foram quantificados como transcritos por milhão (TPM) usando abotoaduras. O método Blast Best Reciprocal Hits (BRH) foi utilizado para definir grupos ortó- logos para pares de genes semelhantes em diferentes espécies. A expressão foi mapeada diretamente para grupos BRH para criar uma matriz de expressão e o método de limma foi usado para descobrir ge- nes (1) diferencialmente expressos com vs sem homogeneizado de plantas dentro de cada espécie, (2) diferencialmente expresso em es-pécies dentro de cada condição homogeneizada de planta e (3) res-pondendo de forma diferente ao homogeneizado de plantas nas diferentes espécies. O método da taxa de descoberta falsa foi utilizado para ajustar valores p para teste múltiplo. Em cada caso, o significado foi definido como valor p ajustado inferior a 0,05 e mudança absoluta de dobramento log2 maior que 2. Genômica funcional e comparativa

[0545] Antes de aplicar a análise de expressão diferencial, as ca-pacidades funcionais de uma solução benéfica e neutra Acremonium zeae, isto é,SYM00577 (benéfico) e SYM00300 (neutro), foram con-trastados na função do gene (GO) e no nível da via. Um objetivo com-partilhado da comparação do genoma e das análises do transcriptoma foi a construção de grupos ortólogos. No caso da genômica comparativa, as anotações desses ortólogos forneceram uma visão geral das capacidades compartilhadas, enquanto que para RNA-seq forneceram âncoras para comparação de dados de expressão, ou seja, linhagens na matriz de expressão. Grupos de Ortologia de KEGG Diferenciais

[0546] Os termos de grupo de ortologia (OG) exclusivo e compartilho foram contados para SYM00577 e SYM00300. A maioria dos termos KO foram compartilhados por ambas as tensões, com 62 termos encontrados apenas em SYM00300, e 207 termos encontrados em SYM00577, com 2. 676 termos KO sobrepostos entre as duas cepas. Este processo foi repetido para vias KEGG, e o número total e compartilhado de vias foi novamente similar, com 324 das vias compartilhadas entre as cepas. Vias únicas em SYM00577 que não estavam presentes em SYM00300, incluem, mas não estão limitados a, biossín- tese de alcaloides de indol diterpeno, biossíntese de macrólidos de 12, 14 e 16 membros, biossíntese de peptidoglicano, biossíntese de gli- cosfingolipídeos - série lacto e neolacto, biossíntese de alcaloides de indol, estruturas de poliquetídeo do tipo I, biossíntese de peptídeos não tumorais de grupo sideróforo, resistência a beta-lactam, via de si-nalização de esfingolipídeos, ciclo patogênico de víbrio-cólera, meta-bolismo central de carbono em câncer, metabolismo de colina em câncer e metabolismo de nicotinato e nicotinamida. Diferenças de via KEGG para SYM00577 exemplificativas são ilustradas abaixo na Tabela 600. Tabela 600: Vias KEGG exemplificativas presentes em SYM0577, mas ausentes em SYM0300

[0547] No exemplo acima, a via de sinalização de esfingomielina incluiu 46 genes. Para determinar se todos os genes (ou seja, grupos ortólogos) na via eram únicos apenas para SYM00577, uma consulta foi realizada para determinar qual dos genes da via esfingomielina em SYM00577 não compartilham quaisquer termos KGG OG com os genes SYM00300.

[0548] Curiosamente, mesmo que a anotação da via de sinalização de esfingomielina esteja ligada a 46 genes em SYM00577, mas nenhum gene em SYM00300, apenas um grupo ortólogo dessa via (esfingomielina fosfodiésterase, anotando 4 genes) não está presente em SYM300.

[0549] Vias únicas em SYM00300 que não estavam presentes em SYM00577, incluem, mas não estão limitados a, resistência a beta-lactam, degradação de DDT, biossíntese de Flavone e Flavonol e inte-ração do receptor ECM. As diferenças de via KEGG exemplificativas para SYM00300 são ilustradas abaixo na Tabela 700. Tabela 601: Vias KEGG exemplificativas presentes em SYM0300, mas ausentes em SYM0577

[0550] O software NCBI Blast foi instalado e usado para criar bancos de dados BLAST de cada conjunto de sequências de aminoácidos, então cada transcriptoma foram transformados em blast contra o banco de dados criado a partir do outro. Os melhores hits recíprocos (BRH) foram calculados pela filtragem por percentagem de identidade elevada, reunindo os melhores resultados e juntando os alvos de um resultado com as consultas do outro. O resultado foi um trio consulta- alvo-recíproco, que foi filtrado para trios, onde a consulta foi a mesma que a recíproca. O e-value os bitscores das duas saídas de blast foram calculados em média (uma vez que são assimétricos) para os pares BRH e um identificador de grupo ortólogo foi criado. Cálculo de in-parálogos

[0551] In-parálogos são parálogos que são o resultado, primeira da especiação, depois da duplicação dos genes. Os in-parálogos são mais propensos a manter a mesma função que os ortólogos e out- ortólgos, que representam a duplicação, seguido de especificação. Considerando a alta proporção de genes SYM00300 que possuem or- tólgos BRH, juntamente com a constatação de que SYM00577 tem quase o dobro de transcrições, foi considerada a possibilidade de um grande evento de duplicação do genoma em algum momento na história filogenética do SYM00577 e foram estendidos os grupos ortólogos para incluir in-parólogos.

[0552] Um passo importante após BRH é, para cada par ortólogo, incluir os genes da mesma espécie mais parecidos com cada membro do par do que a semelhança ortóloga entre espécies. Isso foi realizado utilizando o Blast todos contra todos na mesma espécie, para expandir nossos grupos ortólogos.

[0553] Outra abordagem para a construção de grupos ortólogos foi aplicar um limite para os sucessos das mesmas espécies para cada membro dos pares ortólogos. Para encontrar o melhor limiar, explorou- se a distribuição das pontuações nessas tabelas BRH/mesmas espécies descritas acima, normalizando pelo escore ortólogo. Comparação de espécies cruzadas de RNA-SEQ

[0554] Os valores de FPKM de abotoaduras de RNA-seq foram gerados para duas espécies de fungos (Zeae de acremonium), com três repetições biológicas cada uma. Uma matriz de expressão foi construída usando grupos ortólogos, para explorar a estrutura dos dados, caracterizar a qualidade dos dados e elucidar as diferenças de expressão do nível de via entre SYM00577 e SYM00300. Tabela 602:

[0555] Esta tabela descreve genes ortólogos de Acremonium zea sp. com efeitos benéficos e neutros sobre o crescimento da soja, esses genes mostram mudanças significativas na expressão entre os dois genótipos quando cultivados em cultura com homogeneizado de soja. Neutro da expressão SYM00577" representa o valor de expressão mediana em log2 tpm em repetições biológicas do Acremonium benéfico cultivado em meio inoculado com homogeneizado de semente de soja extraído com PBS 50 mM. “Mediana Exp. SYM00300” representa o valor de expressão mediana em log2 tpm em repetições biológicas do Acremonium neutro cultivado em meio inoculado com homogeneizado de semente de soja extraí-do com PBS 50 mM. "Log FC" representa a estimativa da Mudança em vezes log2 do contraste. A "estatística B" repre-senta as probabilidades de logar que o gene é diferencialmente expresso. A "estatística T" representa a estatística t mode-rada. “Valor p ajustado” representa a taxa de descoberta falsa (Benjamini & Hochberg, 1995).

Tabela 603:

[0556] Esta tabela descreve genes ortólogos de Acremonium zea sp. com efeitos benéficos e neutros sobre o crescimento da soja, esses genes mostram mudanças significativas na expressão entre os dois genótipos quando cultivados em cultura sem homogeneizado de soja. Mediana Exp. SYM00577" representa o valor de expressão mediana em log2 tpm em repetições biológicas do Acremonium benéfico cultivado em meios inoculados com tampão PBS 50 mM. “Mediana Exp. SYM00300” representa o valor de expressão mediana em log2 tpm em repetições biológicas do Acremonium neutro cultivado em meios inoculados com tampão de PBS 50 mM. "Log FC" representa a estimativa da Mudança em vezes log2 do contraste. A "estatística B" representa as probabilidades de logar que o gene é diferencialmente expresso. A "estatística T" representa a estatística t moderada. “Valor p ajustado” representa a taxa de descoberta falsa (Benjamini & Hochberg, 1995).

Tabela 604:

[0557] Esta tabela descreve genes ortólogos de Acremonium zea sp. com efeitos benéficos e neutros sobre o crescimento da soja, estes genes mostram alterações específicas de genótipo significativas na expressão quando cultivadas em cultura com e sem homogeneizado de plantas. Mediana Exp. SYM00577 Planta" representa o valor de expressão mediana em log2 tpm em repetições biológicas do Acremonium benéfico cultivado em meio inoculado com homogeneizado de se-meadura de soja extraído com PBS 50 mM. “Mediana Exp. SYM00577 Imitação" representa o valor de expressão mediana em log2 tpm em repetições biológicas do Acremonium benéfico cultivado em meios inoculados com tampão PBS 50 mM. “Mediana Exp. SYM00300 Planta" homogeneizado de semente extraído com 50 mM de PBS. “Mediana Exp. SYM00300" representa o valor de expressão mediana em log2 tpm em repetições biológicas do Acremonium neutro cultivado em meio inoculado com homogeneizado de semente de soja extraído com PBS 50 mM. “Mediana Exp. SYM00300 Imitação” repre-senta o valor de expressão mediana em log2 tpm em repetições biológicas do Acremonium neutro cultivado em meios ino-culados com tampão de PBS 50 mM. "Log FC" representa a estimativa da Mudança em vezes log2 do contraste. A "estatística B" representa as probabilidades de logar que o gene é diferencialmente expresso. A "estatística T" representa a estatística t moderada. “Valor p ajustado” representa a taxa de descoberta falsa (Benjamini & Hochberg, 1995).

Tabela 605:

[0558] Esta tabela descreve genes de um Acremonium zea sp. com efeitos benéficos no crescimento da soja, estes genes mostram mudanças significativas na expressão quando cultivados em cultura com e sem homogeneizado de plantas. “Mediana Exp.Planta” representa o valor de expressão mediana em log2 tpm em repetições biológicas do cultivadas em meio inoculado com homogeneizado de semente de soja extraído com PBS 50 mM. “Mediana Exp. Imitação” representa o valor de expressão mediana em log2 tpm em repetições biológicas cultivadas em meios inoculados com tampão de PBS 50 mM. "Log FC" representa a estimativa da Mudança em vezes log2 do contraste. A "estatística B" representa as probabilidades de logar que o gene é diferencialmente expresso. A "estatística T" representa a estatística t moderada. “Valor p ajustado” representa a taxa de descoberta falsa (Benjamini & Hochberg, 1995).

Exemplo 7: Caracterização funcional de endófitos (Experiências de proteômica segregada)

[0559] Este exemplo descreve a capacidade de composições sintéticas compreendendo sementes de plantas e uma cepa de endófito único ou uma pluralidade de cepas de endófitos aqui descritas, de conferir características benéficas a uma planta hospedeira. Entre outras coisas, este exemplo fornece uma caracterização exemplificativa de modulações no secretoma de um endófito benéfico, em comparação com o secretoma de um micróbio neutro do mesmo gênero.

[0560] A espectrometria de massa foi utilizada para explorar diferenças nas proteínas segregadas entre endófitos benéficos e micróbios neutros. Foram selecionados quatro gêneros para análise pro- teômica segregada (dois fúngicos e dois bacterianos):Acremonium, Phoma, Stenotrophomonas, e Agrobacterium. Para cada gênero, foram selecionados um endófito benéfico e micróbio neutro:SYM00577 (SEQ ID NO:344) e SYM00300 (SEQ ID NO:449); SYM15774 (SEQ ID NO:447) e SYM01331 (SEQ ID NO:450); SYM00906 (SEQ ID NO:439) e SYM00865 (SEQ ID NO:451); e SYM01004 (SEQ ID NO:441) e SYM00091 (SEQ ID NO:427).

[0561] Os micróbios foram cultivados em três repetições biológicas para cada cepa. Resumidamente, cada bactéria foi inicialmente estirada no ágar 2A (R2A) do Reasoner, CFUs selecionados e cultivados em 10 mL de caldo R2A durante 4 dias. As cepas de fungos foram estiradas em ágar de dextrose de batata (PD) e tampas individuais contendo esporos e os tecidos de micélio foram utilizados para iniciar o crescimento em 10 mL de caldo de PD por 6 dias. Todas as cepas foram cultivadas com agitação à temperatura ambiente. O filtrado de cultura microbiana foi colhido por centrifugação a 4500 RPM durante 20 minutos em tubos de Falcon de 15 mL para permitir a separação da cultura e a remoção do sobrenadante. Foram utilizados cinco mL de sobrenadante de cultura para análise proteômica segregada. Todas as etapas foram realizadas em condições estéreis. Os filtrados de cultura foram mantidos em gelo seco após a colheita em todos os momentos para preservar a estabilidade proteica. As amostras apenas de meio consistindo em PDB e R2A foram testadas de forma independente para garantir a ausência de proteínas intactas que poderiam potencialmente interferir com os peptídeos microbianos secretados.

[0562] Antes da espectrometria de massa, as amostras foram con-centradas em uma coluna de rotação MicroSep MWCO de 3kD Pall (VWR Cat# 89132-006) e quantificadas a diluição 1:10 pela fluorome- tria Qubit (Life Technologies). 12 μg de cada amostra foram separados ~ 1,5 cm em um Mini-gel Bis-Tris Novex a 10% (Invitrogen) utilizando o sistema de amortecedor MES. O gel foi corado com coomassie e cada faixa foi excisada em dez segmentos igualmente dimensionados.

[0563] As peças de gel foram processadas usando um robô (Pro- Gest, DigiLab) com o seguinte protocolo: • Lavadas com bicarbonato de amônio 25 mM seguido de acetonitrila. • Reduzidas com ditiotreitol 10 mM a 60°C seguido por al- quilação com iodoacetamida 50 mM à TA. • Digeridas com tripsina (Promega) a 37°C durante 4 h. • Extintas com ácido fórmico e o sobrenadante foi analisado diretamente sem processamento posterior. Espectrometria de massa

[0564] As digestões foram analisadas por nano LC/MS/MS com um sistema Waters NanoAcquity HPLC conectado a um ThermoFisher Q Exactive. Os peptídeos foram carregados em uma coluna de captura e eluídos sobre uma coluna analítica de 75 μm a 350 nL/min; as duas colunas foram embaladas com resina Proteo Jupiter (Phenomenex). Um gradiente de 30 minutos foi empregado (5h total). O espectrômetro de massa foi operado em modo dependente de dados, com MS e MS/MS executado no Orbitrap em 70.000 FWHM e resolução de 17. 500 FWHM, respectivamente. Os quinze íons mais abundantes foram selecionados para MS/MS.

[0565] Os dados foram pesquisados usando uma cópia local da Mascot com os seguintes parâmetros:Modificação corrigi- da:Carbamidometil (C); Modificações variáveis:Oxidação (M), Acetil (N- termo da Proteína), Pyro-Glu (N-termo Q), Desamidação (NQ); Valores de massa:Monoisotópico; Tolerância de massa de peptídeo:10 ppm; To-lerância de massa de fragmento:0,02 Da; Máx de clivagens perdidas:2.

[0566] Os arquivos DAT Mascot foram analisados no software Scaffold para validação, filtração e para criar uma lista não redundante por amostra. Os dados foram filtrados com 1% de proteína e taxa de descoberta falsa de nível de peptídeo (FDR) e exigindo pelo menos dois péptidos únicos por proteína. Expressão de proteína secretada diferencial e Análise de enrique-cimento funcional A aquisição e o processamento de dados

[0567] da sequência de proteína, as anotações de KEGG e os dados correspondentes da contagem espectral da espectrometria de massa de proteínas foram fornecidos a um fornecedor. Os dados foram fornecidos para pares de espécies benéficas (A) e não benéficas (B) de dois gêneros de fungos e dois gêneros bacterianos. Todos os dados foram convertidos em formatos de arquivo e um banco de dados local adequado para posterior processamento, análise e paralelização. Identificação de ortólogo de proteína

[0568] Os pares/grupos de proteínas ortólogas foram identificados usando uma versão modificada do conduto OrthoMCL. Os ortólogos fo-ram identificados como melhores hits recíprocos de BLASTP e, em se-guida, aglomerações de proteínas ortólogas foram definidas usando o conduto OrthoMCL modificado. Este processo foi feito de forma indepen-dente para o gênero interno e as análises entre gêneros. O BLASTP foi executado em paralelo no ambiente Georgia Tech PACE HPC. Anotações funcionais de proteína

[0569] As anotações de KEGG para proteínas individuais foram fornecidas ao vendedor com base em anotações completas da sequência do genoma. O programa BLAST2GO foi usado para anotar proteínas com os termos da ontologia do gene (GO), com base na similaridade de sequência com proteínas anteriormente anotadas. Quantificação e Normalização de Expressão de Proteínas

[0570] Os níveis de expressão de proteína individual foram tomados como o número de espectros observados (isto é a contagem de espec-tros) correspondente a cada proteína. As contagens de espectros de pro-teínas foram recuperadas em três repetições para cada espécie. As con-tagens faltantes para qualquer ortólogo ou repetição receberam valores de 0. Os níveis individuais de expressão de proteína (contagem de es-pectros) foram então normalizados pelo número total de espectros ob-servados para cada repetição. Este processo foi feito de forma indepen-dente para as três repetições correspondentes a cada membro do par de AB de cada espécie. Os valores de Mudança em vezes (FC) para pa- res/grupos ortólogos foram computados como contagens de espectro log2 A/B com o objetivo de análise de enriquecimento funcional

Análise de expressão diferencial de proteína

[0571] A análise de expressão diferencial de proteína foi feita para a) pares de proteínas ortólogas a partir da análise dos gêneros e b) grupos de proteínas ortólogas a partir da análise dos gêneros. A expressão dife-rencial foi quantificada comparando a variação da contagem de espec-tros normalizados do grupo dentro da variação da contagem de espectro entre o grupo normalizado usando o teste T de Student. Um limiar de ta-xa de descoberta falsa de Benjamini-Hochberg de 0,2 foi usado para identificar proteínas ortólogas diferencialmente abundantes. Via e análise de enriquecimento funcional

[0572] A análise de enriquecimento foi feita em paralelo usando as anotações de KEGG e GO com o teste hipergeométrico e via Gene Set Enrichment Analysis (GSEA). Para o teste hipergeométrico, para qualquer categoria de anotação funcional determinada (i. e. via KEGG ou termo GO), o número de proteínas suprarreguladas no membro benéfico do par ortólogo (espécie A) foi comparado ao número total de proteínas suprarreguladas no conjunto completo de ortólogos. Para análise de GSEA, pares/grupos de proteínas ortólogas foram classificados por valores de FC e a distribuição de valores de FC foi avaliada para uma mudança usando o pacote de clusterprofiler R. Análise proteômica segregada de SYM00577 Tabela 700: 25 proteínas mais abundantes segregadas por SYM00577; "Abundância Mediana" representa o valor mediano em três repetições biológicas em unidades de espectros por cem es-pectros

Tabela 701:Abundância diferencial de proteína secretada entre SYM00577 e SYM00300.

[0573] Esta tabela descreve a expressão diferencial e proteína entre pares de proteínas ortólogas de um gênero, onde um membro do par tem um efeito benéfico no crescimento da planta e o outro tem um efeito neutro. "A. média" representa a contagem espectral normal normalizada entre repetições biológicas do membro benéfico do par. "B. média" representa a contagem espectral normal normalizada entre replicações biológicas do membro neutro do par. "Mudança em vezes" representa o diferencial de mudança em vezes entre os dois organismos. "Valor-q de FDR" representa o valor-q corrigido da taxa de descoberta falsa.

[0574] Um total de 892 proteínas foram detectadas em todas as amostras de Acremonium com dois ou mais peptídeos únicos nas taxas de descoberta falsas indicadas acima. Análise proteômica segregada de SYM15774 Tabela 702: 25 proteínas mais abundantes segregadas por SYM15774; "Abundância Mediana" representa o valor mediano em três repetições biológicas em unidades de espectros por cem espectros

Tabela 703: Abundância diferencial de proteína secretada entre SYM15774 e SYM01331.

[0575] Esta tabela descreve a expressão diferencial e proteína entre pares de proteínas ortólogas de um gênero, onde um membro do par tem um efeito benéfico no crescimento da planta e o outro tem um efeito neutro. "A. mediano" representa a contagem espectral normal normalizada entre repetições biológicas do membro benéfico do par. "B. mediano" representa a contagem espectral normal normalizada entre replicações biológicas do membro neutro do par. "Mudança em vezes" representa o diferencial de Mudança em vezes entre os dois organismos. "Valor-q de FDR" representa o valor-q corrigido da taxa de descoberta falsa.

[0576] Um total de 697 proteínas foram detectadas em todas as amostras de Phoma com dois ou mais peptídeos únicos nas taxas de descoberta falsas indicadas acima. Análise proteômica segregada de SYM01004 Tabela 704: 25 proteínas mais abundantes segregadas por SYM01004; "Abundância Mediana" representa o valor mediano em três repetições biológicas em unidades de espectros por cem espectros

Tabela 705: Abundância diferencial de proteína secretada entre SYM01004 e SYM00091.

[0577] Esta tabela descreve a expressão diferencial e proteína entre pares de proteínas ortólogas de um gênero, onde um membro do par tem um efeito benéfico no crescimento da planta e o outro tem um efeito neutro. "A. média" representa a contagem espectral normal normalizada entre repetições biológicas do membro benéfico do par. "B. média" representa a contagem espectral normal normalizada entre replicações biológicas do membro neutro do par. "Mudança em vezes" representa o diferencial de Mudança em vezes entre os dois organismos. "Valor-q de FDR" repre-

[0578] Um total de 1390 proteínas foram detectadas em todas as amostras de Agrobacterium com dois ou mais peptídeos únicos nas taxas de descoberta falsas indicadas acima. Enriquecimento da Via KEGG de fungos benéficos versus fungos neutros

Enriquecimento de ontologia de genes de fungos benéficos versus fungos neutros Tabela 707: Enriquecimento de GO de fungos benéficos versus fungos neutros

[0579] Esses dados sugerem que inúmeros processos biológicos são diferentes nos endófitos benéficos, por exemplo, em comparação com os endófitos neutros. Alguns desses processos incluem a degradação da parede celular, o metabolismo do amido e sacarose e a proteção contra a tensão oxidativa.

[0580] Um mecanismo de entrada de endófitos em tecido vegetal intacto é através de processos enzimáticos que envolvem a degradação das paredes celulares. Os endófitos benéficos utilizados neste exemplo mostram níveis aumentados de proteínas segregadas que podem estar envolvidas em tal degradação, por exemplo, aquelas que se enquadram nas seguintes anotações de ontologia do gene:GO:0005618 (parede ce-lular), GO:0000272 (processo catabólico de polissacarídeos), GO:0045490 (processo catabólico de pectina), GO:0030248 (ligação de celulose), GO:0004650 (atividade de poligalacturonase), GO:0008810 (atividade da celulase), GO:0071555 (organização da parede celular), GO:0004185 (atividade de carboxipeptidase de tipo serina), GO:0016798 (atividade da hidrolase, atuando sobre ligações glicosil) e GO:0030246 (ligação de carboidratos). Algumas das proteínas que se enquadram nes-tas anotações de ontologia de genes também podem estar envolvidas no metabolismo de amido e sacarose.

[0581] Endófitos benéficos das proteínas segregadas da invenção que podem proporcionar um benefício para a planta, tais como proteínas envolvidas na proteção contra a tensão oxidativa (GO:0016614 (atividade de oxidorredutase, atuando sobre o grupo de doadores de CH-OH); GO:0006979 (resposta à tensão oxidativa); GO:0005507 (ligação de íons de cobre) e GO:0004601 (atividade de peroxidase)).

Exemplo 8: Caracterização em estufa Configuração e condições de irrigação

[0582] Um substrato para crescimento de argila arenosa é misturado na estufa e consiste em 60% de arenito e 40% de argamassa (Northeast Nursery, Peabody, MA). Antes da mistura, a argila é peneirada através de uma tela de malha de aço quadrada de 3/8" para remover partículas maiores e detritos. A metade dos fertilizantes apropriados e os tratamen-tos do solo a serem aplicados durante a estação são adicionados à mis-tura do solo antes da semeadura. Os componentes restantes são forne-cidos dissolvidos em água de irrigação no início dos estágios reproduti-vos de desenvolvimento. A área de superfície do substrato por vaso é calculada com base no diâmetro do pote para aproximar a "área cultiva-da" dos potes individuais. Um volume equivalente de solo fertilizado é então adicionado suavemente a cada pote para minimizar a compactação do solo. O substrato é saturado com água 3-4 horas antes da semeadura.

[0583] Sementes comercialmente disponíveis (por exemplo, sementes aqui descritas) são revestidas com tratamentos microbianos utilizando a formulação utilizada para ensaios de campo e aqui descrita. Os trata-mentos incluíram revestimentos microbianos e dois controles (não trata-dos e formulação). Três sementes são semeadas uniformemente espa- çadas nos pontos de um triângulo. O solo é então sobreposto sobre as sementes e adicionou-se mais 200 mL de água para umedecer o subs-trato sobreposto. Medições e colheitas de meia temporada

[0584] A percentagem de emergência é observada. Além disso, em várias ocasiões durante a estação de crescimento, as plantas são avalia-das para o início e a recuperação dos sintomas de tensão, por exemplo, mas não limitado a:senescência da folha, intervalo de anestesia, índice de clorofila foliar, peso do grão e rendimento total.

[0585] Para comparar as plantas tratadas com os controles, é realizada um teste t sólido de Bayesiano robusto completo. Resumidamente, R (R Core Team, 2015) foi utilizado com o pacote BEST (Kruschke e Meredith, 2015) e JAGS (Plummer, 2003) para realizar uma estimativa de Monte Carlo da cadeia de Markov da distribuição posterior as diferenças prováveis entre os dois grupos experimentais. Um intervalo de densidade mais alta (HDI) de 95% é sobreposto nesta distribuição para auxiliar na interpretação de se os dois grupos biológicos diferem verdadeiramente. Coleta e processamento de tecidos para análise transcriptômica, hormo-nal e metabolômica

[0586] Para avaliar os efeitos do tratamento endófito no crescimento da planta nos níveis transcriptômico, fitohormônico e metabolômico, as plantas são colhidas. Três potes de cada tratamento são selecionados. Uma vez separados, os tecidos (raízes, caules, folhas, outros elementos da planta, conforme apropriado) dos três vasos de cada tratamento são agrupados. Para a coleta, primeiro todo o substrato livremente preso é removido das raízes, batendo suavemente e agitando as raízes. Qualquer substrato aderente é removido submergindo as raízes na água e descartando manualmente o solo e os detritos anexados. As raízes são então secas a seco antes de serem cortadas do tecido aéreo, seguindo separando pecíolos e folhas do caule. À medida que os tecidos são re- movidos da planta, eles são imediatamente empacotados e congelados em nitrogênio líquido. Todos os tecidos colhidos são mantidos em nitro-gênio líquido ou armazenados a -80°C até processamento posterior.

[0587] Para se preparar para análises, os tecidos são moídos com nitrogênio líquido usando uma argamassa pré-refrigerada e um pilão. Aproximadamente 100-200 microgramas de cada conjunto de amostras de solo são transferidos para um microtubo refrigerado de 1,5 mL para extração de RNA e análise posterior de transcriptoma, fitohormona e me- tabólitos. Para a análise proteômica, são utilizados 3 g de cada conjunto de amostras de solo. O tecido moído remanescente é então transferido para um tubo cônico de 50 mL refrigerado e armazenado em nitrogênio líquido ou a -80°C até o embarque para análises adicionais. Exemplo 9:Avaliação da colonização das plantas

[0588] Os protocolos descritos nesta seção permitem a confirmação da colonização bem sucedida de plantas pelos endófitos, por exemplo, por recuperação direta de colônias viáveis de vários tecidos da planta inoculada. Recuperação de colônias viáveis a partir de sementes

[0589] As sementes são esterilizadas na superfície, expondo-as ao gás cloro durante a noite, utilizando os métodos descritos em outros lugares. As sementes estéreis são então inoculadas com culturas de bactérias submersas em 0,5 OD de culturas durante a noite (Triyptic Soy Broth, TSB) e deixadas secar rapidamente. As sementes são então colocadas em tubos preenchidos parcialmente com uma mistura esterilizada de areia-vermiculita [(1:1 peso:peso)] e cobertas com 1 polegada da mis-tura, regadas com água estéril, seladas e incubadas em estufa por 7 di-as. Após a incubação, vários tecidos das plantas são colhidos e utilizados como doadores para isolar bactérias colocando a seção de tecido em um homogeneizador (TSB 20%) e mistura mecânica. A pasta é então diluída em série em etapas de 10 vezes até 10-3 e as diluições de 1 a 10-3 são plaqueadas em placas TSA 20% (1,3% de ágar). As placas são incuba-das durante a noite e são tiradas fotos das placas resultantes, bem como contagens de colônias para CFU. As bactérias são identificadas visual-mente por morfotipo de colônia e métodos moleculares aqui descritos. Os morfotipos de colônias representativos também são usados em PCR e sequenciação de colônias para identificação de isolados através de aná-lise de sequência de genes ribossômicos como aqui descrito. Esses en-saios são repetidos duas vezes por experiência, com 5 amostras biológi-cas por tratamento. Métodos independentes da cultura para confirmar a colonização da planta ou das sementes por bactérias ou fungos

[0590] Uma maneira de detectar a presença de endófitos nas plantas ou nas sementes é usar PCR quantitativa (qPCR). A colonização interna pelo endófito pode ser demonstrada usando tecido vegetals esterilizadas na superfície (incluindo sementes) para extrair DNA total, e as sondas MGB fluorescentes específicas de isolamento e os iniciadores de amplificação são usados em uma reação qPCR. Um aumento no produto visado pela sonda repórter em cada ciclo de PCR, portanto, causa um aumento proporcional na fluorescência devido à quebra da sonda e à liberação do repórter. A fluorescência é medida por um instrumento de PCR quantitativa e comparada a uma curva padrão para estimar o núme-ro de células fúngicas ou bacterianas dentro da planta.

Descrição experimental

[0591] O design de ambos os iniciadores de amplificação específicos de espécies e sondas fluorescentes específicas de isolamento são bem conhecidos na técnica. Os tecidos das plantas (sementes, caules, folhas, flores, etc.) são pré-enxaguados e esterilizados superficialmente usando os métodos aqui descritos.

[0592] O DNA total é extraído utilizando métodos conhecidos na técnica, por exemplo, utilizando kits de extração de DNA de Planta comerci- almente disponíveis ou o seguinte método. 1. O tecido é colocado em um recipiente resistente ao frio e aplicam-se 10-50 mL de nitrogênio líquido. Os tecidos são então mace-rados em pó. 2. O DNA genômico é extraído de cada preparação de tecido, seguindo um protocolo de clorofórmio: álcool isoamílico 24: 1 (Sambrook et al. 1989).

[0593] A PCR quantitativa é realizada essencialmente como descrito por Gao et al. (2010) com iniciadores e sondas específicas para o isolado desejado usando um instrumento de PCR quantitativa, e uma curva pa-drão é construída usando diluições em série de produtos de PCR clona- dos correspondentes ao amplicão de PCR específico da espécie produ-zido pelos iniciadores de amplificação. Os dados são analisados usando instruções do software fabricante do instrumento de PCR quantitativa.

[0594] Como alternativa à qPCR, o Polimorfismo do comprimento do fragmento de restrição terminal (TRFLP) pode ser realizado, essencial-mente como descrito em Johnston-Monje e Raizada (2011). Os iniciado-res marcados com fluorescência específicos do grupo são usados para amplificar um subconjunto da população microbiana, especialmente bac-térias, especialmente fungos, especialmente arqueias, especialmente vírus. Este produto de PCR marcado de forma fluorescente é cortado por uma enzima de restrição escolhida para distribuição heterogênea na po-pulação de produtos de PCR. A mistura de corte enzimático de fragmen-tos de DNA marcados de forma fluorescente e não marcados é então submetida para análise de sequência em uma plataforma de sequência de Sanger, como o Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer. Métodos imunológicos para detectar micróbios em sementes e tecidos vegetativos

[0595] Um anticorpo policlonal é elevado contra bactérias específicas X ou hastes de fungo Y por meio de métodos padrão. Um anticorpo policlonal também é criado contra proteínas GUS e GFP específicas através de métodos padrão. O ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) e a marcação imunocromatográfica também são conduzidos através de métodos padrão, resumidamente descritos abaixo.

[0596] Os procedimentos de microscopia de imunofluorescência en-volvem o uso de seções semifinas de elementos de planta ou tecidos adultos de plantas transferidas para lâminas objetivas de vidro e incuba-das com tampão de bloqueio (cloridrato de Tris 20 mM Tris (hidroxime- ti1)-aminometano (TBS) mais albumina de soro bovino a 2%, pH 7,4) du-rante 30 min à temperatura ambiente. As seções são primeiro revestidas por 30 min com uma solução de anticorpos primários e, em seguida, com uma solução de anticorpos secundários (anticorpos de cabra anti-coelho) acoplada com isotiocianato de fluoresceína (FITC) durante 30 min à tem-peratura ambiente. As amostras são mantidas no escuro para eliminar a degradação do FITC sensível à luz. Após duas lavagens de 5 min com tampão de fosfato de potássio estéril (PB) (pH 7,0) e uma com água de dupla destilação, as seções são seladas com tampão de montagem (100 mL de tampão de fosfato de sódio 0,1 M) (mais pH 7,6) e 50 mL de glice-rina duplamente destilada) e observadas sob um microscópio de luz equipado com luz ultravioleta e um filtro FITC Texas-vermelho.

[0597] As seções ultrafinas (50 a 70 nm) para microscopia TEM são coletadas em grades de níquel revestidas com pioloformas e são marca-das com anticorpo anti-coelho de cabra marcado com ouro de 15 nm. Depois de serem lavados, as lâminas são incubadas durante 1 h em uma diluição 1:50 de anticorpo anti-coelho de cabra marcado com ouro de 5 nm em tampão IGL. A marcação de ouro é então visualizada para mi- croscopia de luz usando um kit de aprimoramento de prata BioCell. O azul de toluidina (0,01%) é usado para contracoloração leve das seções marcadas com ouro. Em paralelo com as seções utilizadas para o apri-moramento de prata de imunocromatografia, as seções em série são co- letadas em lâminas não revestidas e coradas com 1% de azul de toluidi- na. As seções para microscopia de luz são vistas sob um microscópio óptico, e as seções ultrafinas são vistas por TEM.

Exemplo 10: Avaliação de características melhoradas da plan- ta:Hormônios regulados diferencialmente Métodos

[0598] Para análises hormonais, o tecido de 100 ± 10 mg é medido em microtubos (refrigerados com nitrogênio líquido) e enviado em gelo seco para um vendedor. A análise hormonal das plantas é realizada por Christiansen et al. (2014) com pequena modificação. Resumidamente, os hormônios são extraídos de 100 ± 10 mg de tecido congelado e os pesos de tecido são registrados para quantificação. Uma mistura contendo 10 microlitros de 2,5 padrões micro-moleculares internos e 500 microlitros de tampão de extração [1-propanol/H2O/HCl concentrado (2:1:0,002, vol/vol/vol) é adicionada a cada amostra e submetida a vórtice até des-congelar. As amostras são agitadas durante 30 min a 4°C, depois são adicionados 500 microlitros de diclorometano (CH2Cl2). As amostras são novamente agitadas por 30 min a 4°C e depois centrifugadas a 13.000 x g durante 5 min. na escuridão. A camada orgânica inferior é removida para dentro de um frasco de vidro e o solvente é evaporado por meio de amostras de secagem durante 30-40 minutos sob uma corrente de N2. As amostras são ressolubilizadas em 150 microlitros de MeOH, agitadas durante 1 min e centrifugadas a 14. 000 xg durante 2 min. Um sobrena- dante de 90 microlitros é transferido para o frasco de amostrador automá-tico e os hormônios são analisados por cromatografia líquida de ultrade- sempenho, acoplada à espectrometria de massa (UPLC-MS/MS). A co-luna Ascentis Express C-18 (3 cm x 2,1 mm, 2,7 cm) está conectada a uma API 3200 usando espectrometria de massa por ionização-tandem por eletronização (MS/MS) com monitoração de reação múltipla programada (SMRM). O volume de injeção é de 5 microlitros e tem uma fase móvel de 300 microlitros/min, consistindo na solução A (0,05% de ácido acético em água) e solução B (0,05% de ácido acético em acetonitrila) com um gradiente consistindo em (% tempo)0,3 - 1%, 2 - 45%, 5 - 100%, 8 - 100%, 9 - 1%, 11 - parar. A quantificação é realizada com o software Analyst (AB Sciex), utilizando os padrões internos como referência para recuperação de extração. A folha, a raiz e/ou outros tecidos são salvos em -62°C e salvos para a análise posterior da expressão gênica.

[0599] Os espectros de massa de hormônios vegetais são obtidos. As mudanças de dobra entre o controle e as amostras tratadas são cal-culadas dividindo o valor do espectro de massa da amostra tratada pelo valor da amostra de controle.

[0600] A modulação de hormônios relacionados ao crescimento, bem como a resistência a estresses abióticos e bióticos, são encontradas em plantas tratadas com endófitos em comparação com plantas de isolina que não possuem tal tratamento.

Exemplo 11: Avaliação de características melhoradas das plantas e metabolitos regulados diferencialmente Métodos

[0601] Para análise de metabólitos, 150 ± 10mg de cada amostra são transferidos para microtubos de 1,5mL (refrigerados em nitrogênio líquido) e enviados em gelo seco para a Proteomics and Metabolomics Facility na Colorado State University. A aquisição de dados de metabo- lomia é realizada pelos seguintes métodos fornecidos pelo Dr. Corey Broeckling na CSU. Para preparar as amostras para análise, os fitohor- mônios são extraídos do material vegetal do solo usando um protocolo bifásico. Adiciona-se 1 mL de uma mistura de metil terc-butil éter (MTBE):metanol:água (6:3:1) a cada amostra e depois agita-se durante 1 hora. Em seguida, são adicionados 250 μl de água fria e uma mistura de padrões internos para cada amostra para promover a separação de fa-ses. As amostras são agitadas novamente por 5 minutos. As amostras são então centrifugadas a 2,095 xg a 4°C durante 15 minutos. A fase su-perior orgânica é removida para análises hormonais, seca sob um ambi-ente de nitrogênio inerte e depois é suspensa novamente em 400 microli- tros de 50% de acetonitrila. Os extratos são então analisados diretamen-te por LC-MS.

[0602] Para GC-MS, o extrato polar (fase inferior) é seco usando um speedvac, ressuspenso em 50 microlitros de piridina contendo 50 mg/mL de cloridrato de metoxiamina, incubado a 60°C durante 45 minutos, sub-metido a sondagem durante 10 minutos e incubado por mais 45 min a 60°C. Em seguida, adiciona-se 25 microlitros de N-metil-N- trimetilsililtrifluoroacetamida com 1% de trimetilclorossilano (MSTFA 1% de TMCS, Thermo Scientific) e as amostras são incubadas novamente a 60°C durante 30 min, centrifugadas a 3000 xg durante 5 min, resfriadas até a temperatura ambiente e 80 microlitros do sobrenadante são transfe-ridos para uma inserção de vidro de 150 microlitros em um frasco de amostrador automático GC-MS. Os metabólitos são detectados utilizando um Trace GC Ultra acoplado a um espectrômetro de massa Thermo ISQ (Thermo Scientific). As amostras são injetadas em uma razão de divisão 1:10 duas vezes em blocos aleatórios discretos. A separação ocorre usando uma coluna TG-5MS de 30 m (Thermo Scientific, id de 0,25 mm,espessura de película de 0,25 micrômetros) com um taxa de fluxo de gás de hélio de 1,2 mL/min, e o programa consiste em 80°C por 30 se-gundos, uma rampa de 15°C por minuto a 330°C e uma retenção de 8 min. Massas entre 50-650 m/z são escaneadas em 5 varreduras/seg após a ionização por impacto de elétrons. A fonte de ionização é limpa e retomada e o forro de injeção substituído entre repetições de injeção. A análise para hormônios vegetais é realizada por UPLC-MS/MS da se-guinte forma.

[0603] Os metabolitos são detectados e os espectros de massa anotados comparando-se com bibliotecas de espectros conhecidos, incluindo um banco de dados interno na CSU (somente LC-MS), o Instituto Nacio-nal de Bancos de dados de Padrões e Tecnologia, banco de dados Mas-sbank MS e o banco de dados Golm Metabolite. A anotação inicial é au-tomatizada, seguida da validação manual das anotações. Após a anota-ção, os compostos são identificados. Após a remoção de artefatos técni-cos (por exemplo, siloxano) e anotações ambíguas ou vagas (por exem-plo, carboidrato ou sacarídeo), os compostos identificados permanecem para análise. Estes compostos são avaliados quanto à Mudança em ve-zes em relação às plantas de controle. Os metabolitos são agrupados por vias (por exemplo, metabolismo de carboidratos ou biossíntese de alca-loides) e o banco de dados e a literatura do KEGG são referenciados manualmente para identificar mudanças relevantes nos padrões metabó-licos em plantas tratadas com micróbios. Qualquer composto sem uma mudança apreciável em comparação com o observado nas plantas de controle é removido de uma análise posterior.

[0604] A modulação de metabolitos relacionados ao crescimento, bem como a resistência a estresses abióticos e bióticos, são encontradas em plantas tratadas com endófitos em comparação com plantas de isolina que não possuem tal tratamento.

Exemplo 12: Teste de eficácia de endófitos na produção de cultivo Método

[0605] Plantas inteiras ou elementos de plantas, tais como sementes, raízes ou folhas, de qualquer uma das culturas úteis na invenção são tratados com endófitos como descrito nos Exemplos 3, 4 ou 8. Eles são então semeados em uma variedade em diferentes regiões de crescimen-to para testes de eficácia. Os ensaios consistem em dez parcelas repli-cadas para cada tratamento e controle, respectivamente, dispostos em um projeto de bloco completo randomizado equilibrado espacialmente (Van Es et al. 2007). Além de medir o rendimento total, são avaliadas as métricas, como a emergência de plântulas, a diferença de normalização do índice de vegetação (NDVI) e o tempo de floração. Os endófitos são aplicados sozinhos como tratamento de sementes, bem como em combi-nação com outros endófitos. Resultados

[0606] As plantas de cultivo que foram tratadas com o(s) endófito(s) da presente invenção demonstram melhorias em uma ou mais caracte-rísticas agronomicamente importantes, por exemplo, mas não se limitan-do a:resistência à doença, tolerância à seca, tolerância ao calor, tolerân-cia ao frio, tolerância à salinidade, tolerância ao metal, tolerância a herbi-cidas, tolerância química, eficiência melhorada do uso da água, melhor aproveitamento do nitrogênio, fixação melhorada do nitrogênio, resistên-cia a pragas, resistência a herbívoros, resistência a patógenos, aumento do rendimento, aumento do rendimento em condições limitadas de água, melhoria da saúde, melhoria do vigor, melhoria do crescimento, melhoria da capacidade fotossintética, melhoria da nutrição, conteúdo de proteína alterada, conteúdo de óleo alterado, aumento da biomassa, aumento do comprimento do raio, aumento do comprimento da raiz, arquitetura de raiz aprimorada, aumento do peso do elemento de planta, composição alterada dos carboidratos do elemento de planta, composição alterada do óleo do elemento de planta, número de vagens, envelhecimento da se- nescência, permanência de verde e composição da proteína do elemento de planta alterada.

Exemplo 13: Gerando/isolando endófitos compatíveis com agro-químicos

[0607] A aplicação de pesticidas contra patógenos fúngicos de plantas relevantes para agricultura é uma prática comum na agricultura para garantir maiores rendimentos. Um método de distribuição de pesticidas é cobrir as sementes com um revestimento com pesticidas. Embora os pesticidas sejam destinados a dissuadir o crescimento e propagação de micro-organismos patogênicos, eles também podem afetar as popula- ções de endófitos que residem dentro da semente. Para este fim, conferir mecanismos de compatibilidade aos fungos endofíticos que proporcio-nam propriedades benéficas que são sensíveis a estes compostos é de-sejável para a manutenção de endófitos nas sementes.

[0608] A compatibilidade com pesticidas pode ser intrínseca (fungos naturalmente compatíveis com pesticidas, por exemplo) ou adquirida (devido a mutações no material genético do micro-organismo ou à intro-dução de DNA exógeno por transferência natural de DNA).

[0609] Os fungicidas utilizados como protetores são eficazes apenas na superfície da semente, proporcionando proteção contra os agentes patogênicos transmitidos pela superfície das sementes e proporcionando algum nível de controle de agentes patogênicos transmitidos pelo solo. Esses produtos geralmente têm um residual relativamente curto. Os fungicidas protetores, como captam, manebe, tiram ou fludioxonil, ajudam a controlar muitos tipos de agentes patogênicos transmitidos pelo solo, exceto os organismos com podridão das raízes. Os fungicidas sistêmicos são absorvidos nas plantas emergentes e inibem ou matam fungos sensíveis dentro dos tecidos das plantas hospedeiras. Os fungi-cidas sistêmicos utilizados para o tratamento de sementes incluem o seguinte: azoxistrobina, carboxina, mefenoxam, metalaxil, tiabendazol, trifloxistrobina e vários fungicidas de triazol, incluindo difenoconazol, ipconazol, tebuconazol e triticonazol. Mefenoxam e metalaxil são utiliza-dos principalmente para atingir os oomicetos, tais como espécies de Pythium e Phytophthora.

[0610] Os análogos da estrobilurina, como a azoxistrobina, inibem a respiração mitocondrial bloqueando a transferência de elétrons no com-plexo do citocromo bc1. As fenilamidas, incluindo o metalaxil, interferem na síntese de RNA nos fungos alvo. Os fungicidas sistêmicos de oxatina, como a carboxina, inibem a incorporação de fenilalanina na proteína e no uracil em RNA. Os fungicidas de azol BAS 480F, flusilazol e tebuconazol são inibidores da 14α-desmetilase de esterol e bloqueiam a biossíntese de esteróis. I. Determinação da resiliência intrínseca contra agroquímicos de bactérias cultivadas a partir de sementes

[0611] Para testar os pesticidas de resiliência intrínseca de bactérias isoladas como aqui descrito, os ensaios mínimos de concentração inibitória (MIC) são realizados em todas as bactérias de interesse isoladas, como descrito em Wiegand, Irith, Kai Hilpert e Robert EW Hancock. Nature protocols 3.2 (2008):163-175, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade. Resumidamente, as concentrações conhecidas de células bacterianas ou esporos são utilizadas para inocular placas contendo meios sólidos com diferentes concentrações do pesticida ou para inocular meios líquidos contendo diferentes concentrações do pesticida (em uma placa de 96 poços). Os pesticidas são utilizados na concentração recomendada pelo fabricante para o revestimento de sementes e diluições duplas até 0. 000125 (12 diluições duplas). O crescimento é avaliado após a incubação durante um período de tempo definido (16-20 h) e comparado com culturas cultivadas da mesma maneira sem nenhum pesticida como controle. O valor MIC é determinado como descrito em Wiegand, Irith, Kai Hilpert e Robert EW Hancock. Nature protocols 3.2 (2008):163-175. II. Determinação da resiliência intrínseca contra agroquímicos de fungos cultivados a partir de sementes

[0612] Para testar a resiliência intrínseca contra pesticidas dos fungos isolados como descrito neste pedido, os ensaios mínimos de concen-tração inibitória (MIC) são realizados em todos os fungos isolados de in-teresse, como descrito em Mohiddin, F. A. e M. R. Khan. African Journal of Agricultural Research 8. 43 (2013):5331-5334 (aqui incorporado como referência na sua totalidade), com as seguintes altera- ções:Resumidamente, prepara-se ágar de dextrose de batata de força dupla contendo diferentes concentrações de cada pesticida. Os pestici-das são aplicados na concentração recomendada pelo fabricante, e tam-bém em diluições de duas vezes para 0.000125X (12 diluições duplas). Posteriormente, as placas são semeadas centralmente com um disco de 3 mm de cultura de 4 dias de cada fungo que tinha sido centrifugado e enxaguado duas vezes em tampão de fosfato estéril. As placas PDA sem fungicida, mas inoculadas com os fungos servem como controle. As pla-cas inoculadas são incubadas a 25 ± 2°C durante 5 dias. O crescimento radial da colônia em cada tratamento é medido e a percentagem de inibi-ção do crescimento é calculada como descrito por Mohiddin, F. A. e M. R. Khan. African Journal of Agricultural Research 8. 43 (2013):5331-5334 (aqui incorporado por referência na sua totalidade). Os isolados de fun-gos são classificados como resiliência contra o pesticida em particular se sua concentração de tolerância máxima (MTC) for 2x ou acima da concentração de pesticidas recomendada para ser usada em revestimentos de sementes. III. Gerando espécies de fungos com compatibilidade com pesticidas comerciais revestidos em sementes

[0613] Quando uma cepa fúngica de interesse que proporciona uma propriedade benéfica ao seu hospedeiro vegetal é considerada sensível a um pesticida comercialmente relevante, as variantes compatíveis com pesticidas das cepas precisam ser geradas para uso nesta aplicação. A geração de compatibilidade com múltiplos pesticidas ou coquetéis de pesticidas é realizada selecionando sequencialmente variantes compatí-veis com cada pesticida individual e confirmando a compatibilidade com uma combinação dos pesticidas. Após cada rodada de seleção, os fun-gos são testados quanto à sua capacidade de formar relações simbióti-cas com as plantas e confirmar que proporcionam uma propriedade be-néfica na planta, assim como a tensão parental, com ou sem aplicação do produto pesticida conforme descrito aqui.

[0614] A geração e o isolamento de cepas compatíveis com pesticidas derivadas de cepas endofíticas isoladas de sementes e mostradas para fornecer características benéficas para plantas são realizadas conforme descrito por Shapiro-Ilan, David I. et al. Journal of invertebrate pathology 81.2 (2002):86-93 (aqui incorporado por referência na sua totalidade), com algumas mudanças. Resumidamente, os esporos dos fungos isolados são coletados e soluções contendo entre ~ 1x103 esporos são utilizadas para inocular placas de ágar de dextrose de batata (PDA) contendo 2,5 e 10 vezes o MTC da cepa particular. As placas são incu-badas durante 1-5 dias e uma única colônia da maior concentração de pesticida que permite o crescimento é inoculada em uma placa fresca com a mesma concentração de pesticida 7 vezes consecutivas. Após a compatibilidade ter sido estabelecida, a cepa é inoculada em placas PDA 3 vezes consecutivas e depois inoculada em uma placa PDA contendo o pesticida para confirmar que a característica de compatibilidade é per-manente.

[0615] Alternativamente, se este método não proporcionar uma tensão compatível, uma suspensão de esporos é tratada com metanossul- fonato de etil para gerar mutantes aleatórios, de forma semelhante à descrita por Leonard, Cory A. ,Stacy D. Brown e J. Russell Hayman. In-ternational journal of microbiology 2013 (2013), ID do artigo 901697 (aqui incorporado por referência na sua totalidade) e os esporos desta cultura são utilizados na experiência detalhada acima.

[0616] Para desenvolver endófitos fúngicos compatíveis com múltiplos pesticidas ou coquetéis de pesticidas, os esporos de uma cepa compatível com um ou mais pesticidas são utilizados para selecionar va-riantes para um novo pesticida como descrito acima. As cepas desenvol-vidas desta forma são testadas quanto à retenção dos traços de compa-tibilidade de pesticidas inoculando essas cepas em placas PDA contendo cada pesticida único ou combinações de pesticidas. IV. Gerando espécies bacterianas com compatibilidade com pestici-das comerciais revestidos em sementes

[0617] Quando uma cepa bacteriana de interesse é considerada sensível a um pesticida comercialmente relevante, a geração de variantes compatíveis com pesticidas das cepas pode ser gerada para uso nesta aplicação. A geração de compatível com múltiplos pesticidas ou coquetéis de pesticidas é realizada pela primeira seleção sequencial de variantes compatíveis com concentrações incrementalmente maiores de cada pesticida individual (como descrito por Thomas, Louise, et al. Journal of Hospital Infection 46.4 (2000):297-303, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade). Para desenvolver endófitos bacte- rianos compatíveis com múltiplos pesticidas ou coquetéis de pesticidas, as células bacterianas de uma cepa compatível com um ou mais pesti-cidas são utilizadas para selecionar variantes para um novo pesticida como descrito acima. As cepas desenvolvidas desta forma são testadas quanto à retenção dos traços de compatibilidade de pesticidas inoculando essas cepas em placas PDA contendo cada pesticida único ou combinações de pesticidas.

[0618] Após cada rodada de seleção, as bactérias são testadas quanto à sua capacidade de viver dentro das plantas e pela sua capacidade de fornecer a mesma propriedade benéfica para a planta, como fez a cepa parental, com ou sem aplicação do produto pesticida às plantas como aqui descrito. V. Geração de bactérias compatíveis com pesticidas por inserção de um plasmídeo de resistência

[0619] Muitos plasmídeos bacterianos que conferem pesticidas compatíveis foram descritos na literatura (Don, R. H. e J. M. Pemberton. Journal of Bacteriology 145.2 (1981):681-686; e Fisher, P. R., J. Apple-ton, e J. M. Pemberton. Journal of bacteriology 135.3 (1978):798-804, cada um dos quais é aqui incorporado por referência na sua totalidade)

[0620] Para os casos nos quais a obtenção de bactérias compatíveis com ocorrência natural não é viável, o uso destes plasmídeos é uma ma-neira possível de desenvolver cepas endofíticas compatíveis com múlti-plos pesticidas.

[0621] Por exemplo, uma cepa de Pseudomonas fluorescens que fornece propriedades antinemátodos às plantas, mas é sensível aos pesticidas, o ácido 2,4-diclorofenoxiacético e 4-cloro-2-metilfenoxiacético podem ser transformados com o plasmídeo pJP2 (isolado de Alcaligenes eutrophus) que proporciona compatibilidade transmissível com esses compostos, como descrito por Don e Pemberton, 1981. Resumidamente, os plasmídeos são transferidos por conjugação para Psudomonas, utilizando o método descrito em Haas, Dieter e Bruce W. Holloway. Molecular and General Genetics 144.3 (1976):243-251(aqui incorporado por referência na sua totalidade).

[0622] Após a geração de bactérias que transportam plasmídeos compatíveis com pesticidas, estes endófitos são testados quanto à sua capacidade de viver dentro dos tecidos das plantas e pela sua capacida-de de fornecer a mesma propriedade benéfica para a planta do que a cepa parental, com ou sem aplicação do poduto pesticida às plantas co-mo aqui descrito. VI. Crescimento e aumento das bactérias para inoculação em meios sólidos

[0623] Os isolados bacterianos são cultivados por inoculação em circuito de uma única colônia em caldo R2A (suplementado com antibióticos apropriados) em frascos de 100 mL. A cultura bacteriana é incubada a 30 ± 2 °C durante 2 dias a 180 rpm em uma incubadora de agitação (ou sob temperaturas variáveis e velocidades de agitação, conforme apropriado). Esta suspensão líquida é então utilizada para inocular o pó de vermiculite esterilizado por calor que é pré-misturado com caldo R2A estéril (sem antibióticos), resultando em uma mistura de partículas e lí- quidos como o solo. Este pó microbiano é então incubado durante mais alguns dias a 30 ± 2 °C com agitação manual diária para arejar o pó úmi-do e permitir o crescimento bacteriano. O pó de vermiculite inoculado de forma microbiana está pronto para se espalhar no solo ou nas partes da planta. Alternativamente, o caldo R2A é utilizado para inocular pratos de Petri contendo R2A ou outro ágar nutritivo apropriado em que gramados de bactérias são cultivados sob condições padrão e as colônias sólidas são raspadas, ressuspensas em líquido e aplicadas às plantas conforme desejado. VII. Crescimento e ampliação de fungos para inoculação em meios sólidos

[0624] Uma vez caracterizado um isolamento de fungos, as condições são otimizadas para o crescimento no laboratório e ampliadas para fornecer material suficiente para ensaios. Por exemplo, o meio utilizado para isolar o fungo é suplementado com nutrientes, vitaminas, cofatores, extratos de plantas e outros suplementos que podem diminuir o tempo necessário para cultivar o isolado de fungos ou aumentar o rendimento de micélios e/ou esporos. Ocorre isolamento de fungos. Esses suple-mentos podem ser encontrados na literatura ou através do rastreio de diferentes aditivos de meio conhecidos que promovem o crescimento de todos os fungos ou das taxas de fungos particulares.

[0625] Para ampliar o crescimento de isolados de fungos, os isolados são cultivados a partir de um estoque congelado em vários pratos de Petri contendo meios que promovem o crescimento do isolado de fungos particulares e as placas são incubadas em condições ambientais ideais (temperatura, atmosfera e luz). Após o desenvolvimento de micélios e esporos, a cultura fúngica é raspada e ressuspensa em tampão de fosfa-to 0,05 M (pH 7,2, 10 mL/placa). Pratos de Bioensaio de poliestireno descartáveis (500 cm2, Thermo Scientific Nunc UX-01929-00) são prepa-rados com 225 mL de meio autoclavado com quaisquer suplementos ne- cessários adicionados ao meio e permitidos solidificar. As placas são ar-mazenadas à temperatura ambiente durante 2-5 dias antes da inoculação para confirmar a esterilidade. 5mL da suspensão de fungos são es-palhado sobre a superfície do ágar na placas de Bioensaio em um gabi-nete de biossegurança, as placas são deixadas a secar durante 1h, e elas são então incubadas por 2-5 dias, ou até que os micélios e/ou os esporos tenham desenvolvido.

[0626] Uma suspensão fúngica líquida é então criada através do se-guinte. O crescimento fúngico na superfície do ágar nas placas de Bioen- saio é então raspado e ressuspenso em tampão de fosfato 0,05 M (pH 7,2). Leituras OD600 são tomadas usando um espectrômetro e correlacio-nadas com contagens OD600/ CFU previmento estabelecidas para estimar densidades de população de fungos e o volume ajustado com tampão de fosfato de sódio adicional para resultar em alíquotas de 100 mL de fungos a uma densidade de aproximadamente 106-1011 esporos/mL. Esta suspensão pode ou não ser filtrada para remover micélios e pode ser usada para criar uma formulação microbiana líquida como aqui descrita para aplicar o isolado de fungos em uma planta, planta ou semente. VIII. Crescimento e aumento das bactérias para inoculação em meios líquidos

[0627] As cepas bacterianas são cultivadas por inoculação em circuito de uma única colônia em caldo R2A (alterado com os antibióticos apropriados) em frascos de 100 mL. A cultura bacteriana é incubada a 28 ± 2 °C durante 1 dia a 180 rpm em uma incubadora de agitação (ou sob temperaturas variáveis e velocidades de agitação, conforme apropriado). As bactérias são sedimentadas por centrifugação e ressuspensas em fosfato de sódio 0,1 M estéril. Leituras OD600 são tomadas usando um espectrômetro e correlacionadas com contagens OD600/CFU previamente estabelecidas para estimar densidades de população bacteriana e o vo-lume ajustado com tampão de fosfato de sódio adicional para resultar em alíquotas de 100 mL de bactérias com uma densidade de 1x108 célu- las/mL. Para ajudar a quebrar a tensão superficial, auxiliar a entrada de bactérias nas plantas e fornecer micróbios para alguma energia para o crescimento, adiciona-se 10 μL de tensoativo Silwet L-77 e 1 g de saca-rose a cada alíquota de 100 mL (resultando em concentrações 0,01% v/v e 1% v/v, respectivamente) de forma semelhante à do protocolo para transformação genética mediada por Agrobacteriumde semente de Ara- bidopsis thaliana [Clough, S., Bent, A. (1999) The Plant Journal 16 (6):735-743]. IX. Crescimento e aumento dos fungos para inoculação em meios líquidos

[0628] Uma vez caracterizado um isolamento de fungos, as condições são otimizadas para o crescimento no laboratório e ampliadas para fornecer material suficiente para ensaios. Por exemplo, o meio utilizado para isolar o fungo é suplementado com nutrientes, vitaminas, cofatores, extratos de plantas e/ou outros suplementos que podem diminuir o tempo necessário para cultivar o isolado de fungos e/ou aumentar o rendimento de micélios e/ou esporos. Ocorre isolamento de fungos. Esses suple-mentos podem ser encontrados na literatura ou através do rastreio de diferentes aditivos de meio conhecidos que promovem o crescimento de todos os fungos ou das taxas de fungos particulares.

[0629] Para ampliar o crescimento de isolados de fungos, os isolados são cultivados a partir de um estoque congelado em pratos de Petri contendo meios que promovem o crescimento do isolado de fungos particulares e as placas são incubadas em condições ambientais ideais (temperatura, atmosfera e luz). Após o desenvolvimento de micélios e esporos, a cultura fúngica é raspada e ressuspensa em tampão de fosfato 0,05 M (pH 7,2, 10 mL/placa). 1 litro de meio líquido selecionado para crescer a cultura fúngica é preparado em frascos de vidro de 2 L e autoclavado e quaisquer suplementos necessários adicionados ao meio. Estes são armazenados à temperatura ambiente durante 2-5 dias antes da inoculação para confirmar a esterilidade. 1 mL da suspensão fúngica é adicionado assepticamente ao frasco do meio, que é então incubado durante 2-5 dias, ou até o crescimento no meio líquido ter atingido saturação. As contagens de esporos são determinadas usando hemocitômetro e correlacionadas com contagens OD600/CFU previamente estabelecidas para estimar densidades de população de fungos e o volume ajustado com tampão adicional de fosfato de sódio para resultar em alíquotas de 100 mL de fungos a uma densidade de aproximadamente 106-1011 esporos/mL. Esta suspensão pode ou não ser filtrada para remover micélios e pode ser usada para criar uma formulação microbiana líquida como aqui descrita para aplicar o isolado de fungos em uma planta, planta ou semente. X. Criação de formulações ou preparações microbianas líquidas para a aplicação de micróbios a plantas

[0630] As células bacterianas ou fúngicas são cultivadas em meio líquido de nutrientes líquidos entre 102-1012 CFU/mL. As células são separadas do meio e suspensas em outro meio líquido, se desejado. A formulação microbiana pode conter uma ou mais cepas bacterianas ou fúngicas. A formulação resultante contém células vivas, células liofilizadas ou esporos das cepas bacterianas ou fúngicas. A formulação também pode conter água, nutrientes, polímeros e agentes de ligação, tensoati- vos ou polissacarídeos, tais como gomas, carboximetilcelulose e derivados de poliálcool. Os veículos e adjuvantes adequados podem ser sólidos ou líquidos e incluem substâncias minerais naturais, regeneradas, solventes, dispersantes, agentes umectantes, agentes de pegajosidade, espessantes, aglutinantes ou fertilizantes. As composições podem assu-mir a forma de soluções aquosas, emulsões óleo-em-água ou emulsões água-em-óleo. Podem estar presentes opcionalmente pequenas quanti-dades de material insolúvel, por exemplo, em suspensão no meio, mas é geralmente preferido minimizar a presença de tal material insolúvel. XI. Inoculação de plantas por revestimento de micróbios diretamente na semente

[0631] A semente é tratada por revestimento com uma formulação microbiana líquida (preparada como aqui descrita) compreendendo célu-las microbianas e outros componentes da formulação, diretamente na superfície da semente à razão de 102-108 CFU microbiano por semente. As sementes são embebidas em formulação microbiana líquida para 1, 2, 3, 5, 10, 12, 18 ou 24 horas ou 2, 3 ou 5 dias. Após a imersão na formu-lação microbiana, as sementes são plantadas em recipientes em cresci-mento ou em um campo ao ar livre. As sementes também podem ser revestidas com formulação microbiana líquida usando um sem-fim ou um tratamento de lote comercial. Uma ou mais formulações microbianas ou outros tratamentos de sementes são aplicados simultaneamente ou em sequência. O tratamento é aplicado às sementes utilizando uma varieda-de de técnicas de tratamento convencional e máquinas, tais como técni-cas de leito fluidizado, sem-fim, método do rolo, tratamentos de semente rotostática e revestimentos de tambor. Outros métodos, tais como leitos de jorro também podem ser úteis. As sementes são pré-dimensionadas antes do revestimento. Opcionalmente, a formulação microbiana é com-binada com uma quantidade de insecticida, herbicida, fungicida, bacteri- cida ou regulador de crescimento de plantas, ou micro ou macro nutriente de plantas antes ou durante o processo de revestimento. Após o revesti-mento, as sementes são normalmente secas e então transferidas para uma máquina de dimensionamento para classificação antes da plantação. Após a inoculação, a colonização das plantas ou sementes produzidas a partir da mesma é confirmada através de qualquer dos vários métodos aqui descritos. A promoção do crescimento ou os benefícios de resiliência à tensão para a planta são testados através de qualquer dos métodos de teste de crescimento da planta aqui descritos. XII. Inoculação de plantas com uma combinação de dois ou mais micróbios

[0632] As sementes podem ser revestidas com endófitos bacterianos ou fúngicos. Este método descreve o revestimento de sementes com duas ou mais cepas bacterianas ou fúngicas. O conceito aqui apresentado envolve o revestimento de semente simultâneo de dois micróbios (por exemplo, uma bactéria endofítica gram negativa Burkholderia phytofir-mans e uma bactéria endofítica gram positiva Bacillus mojavensis). Opci-onalmente, ambos os micróbios são geneticamente transformados pela integração cromossômica estável da seguinte forma. Bacillus mojavensis são transformados com uma construção com um promotor constitutivo que conduz a expressão de um operão sintético de GFPuv e genes de resistência à espectinomicina, enquanto Burkholderia phytofirmans são transformados com uma construção com uma expressão de condução do promotor constitutivo do operão lac com um gene de resistência à es- pectinomicina anexado. As sementes são revestidas com uma formula-ção líquida preparada dos dois micróbios, os vários métodos aqui descri-tos. Várias concentrações de cada endófito na formulação são aplicadas, de 102 CFU/semente aa cerca de 108 CFU/semente. Após a inoculação, a colonização das plantas ou sementes produzidas a partir da mesma pode ser confirmada através de qualquer dos vários métodos aqui descritos. A promoção do crescimento ou os benefícios de resiliência à tensão para a planta são testados através de qualquer dos métodos de teste de crescimento da planta aqui descritos. XIII. Cultivar para confirmar a colonização da planta por bactéria

[0633] A presença nas sementes ou plantas de endófitos marcados com GFPuv ou gusA pode ser detectada por contagens de colônias a partir de material de sementes trituradas e tecido de semente germinado usando placas de R2A alteradas com 5-Bromo-4-cloro-3-indolil β-D- glicuronídeo ( X-glcA, 50 μg/mL), IPTG (50 μg/mL) e o antibiótico com espectinomicina (100 μg/mL). Alternativamente, os endófitos bacterianos ou fúngicos que não receberam transgenes também podem ser detecta-dos isolando micróbios de plantas, tecidos vegetais ou homogeneizados de sementes (opcionalmente esterilizados na superfície) em meio isento de antibiótico e identificados visualmente por morfotipo de colônia e mé-todos moleculares aqui descritos. Os morfotipos de colônias representativos também são usados em PCR e sequenciação de colônias para identificação de isolados através de análise de sequência de genes ribossô- micos como aqui descrito. Esses ensaios são repetidos duas vezes por experiência, com 5 amostras biológicas por tratamento. XIV. Métodos independentes da cultura para confirmar a colonização da planta ou das sementes por bactérias ou fungos

[0634] Uma maneira de detectar a presença de endófitos nas plantas ou nas sementes é usar PCR quantitativa (qPCR). A colonização interna pelo endófito pode ser demonstrada usando tecido vegetals esterilizadas na superfície (incluindo sementes) para extrair DNA total, e as sondas MGB fluorescentes específicas de isolamento e os iniciadores de amplificação são usados em uma reação qPCR. Um aumento no produto visado pela sonda repórter em cada ciclo de PCR, portanto, causa um aumento proporcional na fluorescência devido à quebra da sonda e à liberação do repórter. A fluorescência é medida por um instrumento de PCR quantitativa e comparada a uma curva padrão para estimar o núme-ro de células fúngicas ou bacterianas dentro da planta. XV. Descrição experimental

[0635] O design de ambos os iniciadores de amplificação específicos de espécies e sondas fluorescentes específicas de isolamento são bem conhecidos na técnica. Os tecidos das plantas (sementes, caules, folhas, flores, etc.) são pré-enxaguados e esterilizados superficialmente usando os métodos aqui descritos.

[0636] O DNA total é extraído utilizando métodos conhecidos na téc- nica, por exemplo, utilizando kits de extração de DNA de Planta comerci-almente disponíveis ou o seguinte método. 1. O tecido é colocado em um recipiente resistente ao frio e aplicam-se 10-50 mL de nitrogênio líquido. Os tecidos são então mace-rados em pó. 2. O DNA genômico é extraído de cada preparação de tecido, seguindo um protocolo de clorofórmio: álcool isoamílico 24:1 (Sambrook, Joseph, Edward F. Fritsch e Thomas Maniatis. Molecular cloning. Vol. 2. New York:Cold spring harbor laboratory press, 1989.).

[0637] A PCR quantitativa é realizada essencialmente como descrito por Gao, Zhan, et al. Journal of clinical microbiology 48. 10 (2010):3575- 3581 com iniciadores e sondas específicas para o isolado desejado usando um instrumento de PCR quantitativa, e uma curva padrão é cons-truída usando diluições em série de produtos de PCR clonados corres-pondentes ao amplicão de PCR específico da espécie produzido pelos iniciadores de amplificação. Os dados são analisados usando instruções do software fabricante do instrumento de PCR quantitativa.

[0638] Como alternativa à qPCR, o Polimorfismo do comprimento do fragmento de restrição terminal (TRFLP) pode ser realizado, essencial-mente como descrito em Johnston-Monje D, Raizada MN (2011) PLoS ONE 6(6): e20396. Os iniciadores marcados com fluorescência específi-cos do grupo são usados para amplificar um subconjunto da população microbiana, especialmente bactérias, especialmente fungos, especial-mente arqueias, especialmente vírus. Este produto de PCR marcado de forma fluorescente é cortado por uma enzima de restrição escolhida para distribuição heterogênea na população de produtos de PCR. A mistura de corte enzimático de fragmentos de DNA marcados de forma fluorescente e não marcados é então submetida para análise de sequência em uma plataforma de sequência de Sanger, como o Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer. XVI. Métodos imunológicos para detectar micróbios em sementes e tecidos vegetativos

[0639] Um anticorpo policlonal é elevado contra bactérias específicas X ou hastes de fungo Y por meio de métodos padrão. Um anticorpo policlonal também é criado contra proteínas GUS e GFP específicas através de métodos padrão. O ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) e a marcação imunocromatográfica também são conduzidos através de métodos padrão, resumidamente descritos abaixo.

[0640] Os procedimentos de microscopia de imunofluorescência en-volvem o uso de seções semifinas de sementes ou plântulas ou tecidos adultos de plantas transferidas para lâminas objetivas de vidro e incuba-das com tampão de bloqueio (cloridrato de Tris 20 mM Tris (hidroxime- ti1)-aminometano (TBS) mais albumina de soro bovino a 2%, pH 7,4) du-rante 30 min à temperatura ambiente. As seções são primeiro revestidas por 30 min com uma solução de anticorpos primários e, em seguida, com uma solução de anticorpos secundários (anticorpos de cabra anticoelho) acoplada com isotiocianato de fluoresceína (FITC) durante 30 min à tem-peratura ambiente. As amostras são mantidas no escuro para eliminar a degradação do FITC sensível à luz. Após duas lavagens de 5 min com tampão de fosfato de potássio estéril (PB) (pH 7,0) e uma com água de dupla destilação, as seções são seladas com tampão de montagem (100 mL de tampão de fosfato de sódio 0,1 M) (mais pH 7,6) e 50 mL de glice-rina duplamente destilada) e observadas sob um microscópio de luz equipado com luz ultravioleta e um filtro FITC Texas-vermelho.

[0641] As seções ultrafinas (50 a 70 nm) para microscopia TEM são coletadas em grades de níquel revestidas com pioloformas e são marca-das com anticorpo anti-coelho de cabra marcado com ouro de 15 nm. Depois de serem lavados, as lâminas são incubadas durante 1 h em uma diluição 1:50 de anticorpo anti-coelho de cabra marcado com ouro de 5 nm em tampão IGL. A marcação de ouro é então visualizada para mi- croscopia de luz usando um kit de aprimoramento de prata BioCell. O azul de toluidina (0,01%) é usado para contracoloração leve das seções marcadas com ouro. Em paralelo com as seções utilizadas para o apri-moramento de prata de imunocromatografia, as seções em série são co-letadas em lâminas não revestidas e coradas com 1% de azul de toluidi- na. As seções para microscopia de luz são vistas sob um microscópio óptico, e as seções ultrafinas são vistas por TEM. XVII. Caracterização da uniformidade de endófitos em uma popula-ção de sementes

[0642] Para testar a homogeneidade dos endófitos na superfície ou colonizar os tecidos interiores em uma população de sementes, as se-mentes são testadas quanto à presença de micróbios por métodos de-pendentes da cultura e/ou independentes. As sementes são obtidas, es-terilizadas na superfície e pulverizadas, e o homogeneizado de sementes é dividido e utilizado para inocular meios de cultura ou para extrair DNA e realizar PCR quantitativa. A homogeneidade da colonização em uma po-pulação de sementes é avaliada através da detecção de cepas microbia-nas específicas através desses métodos e comparação dos resultados independentes da cultura e independentes da cultura em toda a população de sementes. A homogeneidade da colonização para uma cepa de interesse é avaliada com base no número total de sementes em uma po-pulação que contém um nível detectável de cepa, na uniformidade em toda a população do número de células ou CFU da cepa presente na semente, ou com base na ausência ou presença de outras cepas micro-bianas na semente. XVIII. Descrição experimental

[0643] As sementes esterilizadas em superfície são obtidas como aqui descrito. Para métodos dependentes da cultura de confirmação de presença microbiana, bactérias e fungos são obtidos a partir de semen-tes essencialmente como aqui descrito com a seguinte modificação. O homogeneizado de sementes é usado para inocular meios contendo adi-tivos seletivos e/ou diferenciais que permitirão a identificação de um mi-cróbio particular.

[0644] Para qPCR, o DNA total de cada semente é extraído usando métodos conhecidos na técnica, como aqui descrito. XIX. Caracterização da homogeneidade da colonização na população de plantas

[0645] Para testar a homogeneidade de micro-organismos (incluindo endófitos) que colonizam o interior em uma população de plantas, os te-cidos de cada planta são testados quanto à presença de micróbios por métodos dependentes da cultura e/ou independentes. Os tecidos são obtidos, esterilizadas na superfície e pulverizadas, e o material de tecido é dividido e utilizado para inocular meios de cultura ou para extrair DNA e realizar PCR quantitativa. A homogeneidade da colonização em uma po-pulação de plantas é avaliada através da detecção de cepas microbianas específicas através desses métodos e comparação dos resultados inde-pendentes da cultura e independentes da cultura em toda a população de plantas ou seus tecidos. A homogeneidade da colonização para uma cepa de interesse é avaliada com base no número total de plantas em uma população que contém um nível detectável de cepa, na uniformidade em toda a população do número de células ou CFU da cepa presente no te-cido da planta ou com base na ausência ou presença de outras cepas microbianas na planta. XX. Descrição experimental

[0646] Os tecido vegetaiss esterilizados na superfície são obtidos como aqui descrito. Para métodos dependentes da cultura de confirmação de presença microbiana, bactérias e fungos são obtidos a partir de tecido vegetais essencialmente como aqui descrito com a seguinte modi-ficação. O homogeneizado de tecido vegetal é usado para inocular meios contendo aditivos seletivos e/ou diferenciais que permitirão a identifica- ção de um micróbio particular.

[0647] Para qPCR, o DNA total de cada tecido vegetal é extraído usando métodos conhecidos na técnica, como aqui descrito.

[0648] Outras modalidades serão evidentes para os versados na técnica a partir de uma consideração do relatório descritivo ou prática das modalidades. Considere o relatório descritivo e os exemplos apenas co-mo exemplificativos, com um verdadeiro alcance e espírito sendo indica-do pelas seguintes reivindicações.

Claims

1. Método para preparar uma semente compreendendo uma população de endófitos, caracterizado pelo fato de que compreende a aplicação a uma superfície externa de uma semente de uma formulação que compreende uma população de endófitos compreendendo um endófito produtor de acetoína que compreende uma sequência de ácido nucleico ITS compreendedndo SEQ ID NO: 446, em que a formulação compreende 101-108 CFU microbiano por semente; e em que a semente ou a planta é selecionada dentre soja e trigo.

2. Método para modular uma característica de planta, caracterizado pelo fato de que compreende a aplicação a uma vegetação ou a uma área adjacente a uma semente uma formulação compreendendo uma população de endófitos compreendendo um endófito produtor de acetoína que compreende uma sequência de ácido nucleico ITS da SEQ ID NO: 446, em que a formulação é capaz de fornecer um benefício para a vegetação ou para uma colheita produzida a partir da vegetação e em que a formulação de sementes é selecionada dentre soja e trigo.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a formulação de sementes compreende uma população de endófitos que compreende um endófito que compreende uma sequência de ácido nucleico ITS da SEQ ID NO: 446.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o endófito é capaz de uma função ou atividade selecionada dentre o grupo que consiste em produção de auxina, fixação de nitrogênio, produção de um composto antimicrobiano, solubilização de fosfato mineral, produção de sideróforo, produção de celulase, produção de quitinase, e/ou produção de xilanase.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a formulação compreende um ou mais membros selecionados dentre o grupo que consiste em um veículo compatível com agricultura, um adesivo, um estabilizador microbiano, um fungicida, um agente antibacteriano, um herbicida, um nematicida, um inseticida, um regulador de crescimento de plantas, um rodenticida e um nutriente.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a planta, semente ou tecido é contatado com 10 UFC ou esporos, 100 UFC ou esporos, 300 UFC ou esporos, 1.000 UFC ou esporos, 3.000 UFC ou esporos, 10.000 UFC ou esporos, 30.000 UFC ou esporos, 100.000 UFC ou esporos, 300.000 UFC ou esporos, 1.000.000 UFC ou esporos, ou mais, do endófito.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a formulação compreende duas ou mais populações de endófitos, em que a população adicional compreende uma sequência de ácido nucleico 16S rRNA ou ITS que é uma sequência de ácido nucleico selecionada dentre o grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1-395 e 397-455, em que ambas as populações de endófitos estão presentes na formulação em 102-108 CFU microbiano por semente para colonizar a planta agrícola madura.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a planta é trigo.

9. Combinação sintética, caracterizada pelo fato de que compreende uma população microbiana purificada em associação com uma pluralidade de sementes ou mudas de uma planta agrícola, em que a população microbiana purificada compreende um primeiro endófito que é produtor de acetoína, em que o primeiro endófito compreende uma sequência de ácido nucleico ITS da SEQ ID NO: 446, em que a formulação é aplicada em 101-108 CFU microbiano por semente para proporcionar um benefício à semente ou à planta derivada da semente e em que o primeiro endófito é disposto heterologicamente na pluralidade de sementes ou mudas em 102-108 CFU microbiano por semente para proporcionar um benefício para as sementes ou mudas ou as plantas derivadas das sementes ou mudas, e em que o benefício é selecionado dentre o grupo que consiste em: comprimento da raíz aumentado, produtividade de grãos aumentada, e taxa de germinação da semente aumentada, em relação a sementes de referência ou plantas agrícolas derivadas de sementes de referência, e em que as sementes ou mudas são selecionadas dentre soja e trigo.

10. Combinação sintética, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a população microbiana compreende ainda um segundo endófito microbiano com uma sequência de ácido nucleico rRNA 16S ou ITS que é a do primeiro endófito microbiano e uma sequência de ácido nucleico selecionada dentre o grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1-395 e 397-455.

11. Combinação sintética, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizada pelo fato de que a população microbiana compreende ainda um segundo endófito e em que o primeiro e o segundo endófitos são independentemente capazes de produzir um ou mais dentre uma auxina, um sideróforo, acetoína, ou uma combinação de dois ou mais dentre os mesmos ou, em que o primeiro e o segundo endófitos são independentemente capazes de metabolizar um ou mais substratos selecionados dentre o grupo que consiste em: aD-glicose, arabinose, arbutina, b-metil-D-galactosídeo, b- metil-D-glicosídeo, D-alanina, D- arabitol, ácido D-aspártico, D-celobiose, dextrina, D-frutose, D- galactose, ácido D-glucônico, D-glucosamina, di-hidroxiacetona, ácido DL-málico, D-manitol, D-manose, D-melezitose, D-melibiose, D- rafinose, D-ribose, D-serina, D-treonina, D-trealose, D-xilose, ácido g- amino-N-butírico, g- ciclodextrina, gelatina, gentiobiose, glicogênio, ácido glicil-L-aspártico, ácido glicil-L-glutâmico, glicil-L-prolina, ácido glioxílico, i-eritritol, inosina, L-alanina, L-alanil-glicina, L-arabinose, L- asparagina, ácido L-aspártico, ácido-g-lactona L-galactônico, ácido L- glutâmico, L-glutamina, L-histidina, L-prolina, L - ramona, L-serina, L- treonina, maltitol, maltose, maltotriose, manose, N-acetil-D- glucosamina, ácido oxálico, palatinose, pectina, prolina, salicina, estaquiose, sacarose, trealose, turanose, tiramina, uridina, e xilose, ou uma combinação de dois ou mais dos mesmos.

12. Combinação sintética, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizada pelo fato de que compreende mudas e o primeiro endófito é contatado com as mudas como um spray aplicado a uma ou mais folhas e/ou uma ou mais raízes das mudas.

13. Combinação sintética, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, caracterizada pelo fato de os primeiros endófitos estão presentes em uma quantidade de 10 UFC ou esporos, 100 UFC ou esporos, 300 UFC ou esporos, 1.000 UFC ou esporos, 3.000 UFC ou esporos, 10.000 UFC ou esporos, 30.000 UFC ou esporos, 100.000 UFC ou esporos, 300.000 UFC ou esporos, ou 1.000.000 UFC ou esporos ou mais por semente.

14. Combinação sintética, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 13, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um ou mais dos seguintes: um estabilizador, ou um conservante, ou um veículo, ou um tensoativo, um agente anticomplexo, ou qualquer combinação dos mesmos.

15. Combinação sintética, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 14, caracterizada pelo fato de que compreende sementes e o primeiro endófito está presente na formulação em 102-108 CFU microbiano por semente para aumentar de maneira detectável a taxa de germinação da semente.

16. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a população de endófitos consiste em um endófito compreendendo uma sequência de ácido nucleico ITS da SEQ ID NO: 446.

17. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o endófito como definido na reivindicação 7 ou o primeiro endófito como definido na reivindicação 10 compreende uma sequência de ácido nucleico ITS que é a SEQ ID NO: 446, e em que a população adicional, como definida na reivindicação 7, ou o segundo endófito microbiano, como definido na reivindicação 10, compreende uma sequência de ácido nucleico ITS selecionada dentre o grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 381, 447 e 448.

18. Combinação sintética, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o endófito como definido na reivindicação 7 ou o primeiro endófito como definido na reivindicação 10 compreende uma sequência de ácido nucleico ITS que é a SEQ ID NO: 446, e em que a população adicional, como definida na reivindicação 7, ou o segundo endófito microbiano, como definido na reivindicação 10, compreende uma sequência de ácido nucleico ITS selecionada dentre o grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 381, 447 e 448.

19. Combinação sintética, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a população adicional ou o segundo endófito microbiano compreende uma sequência de ácido nucleico ITS que é a SEQ ID NO: 448.

20. Combinação sintética, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado(a) pelo fato de que a população adicional ou segundo endófito microbiano compreende uma sequência de ácido nucleico ITS que é SEQ ID NO: 448.

21. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a população de endófitos compreende um endófito compreendendo uma sequência de ácido nucleico ITS da SEQ ID NO: 446.