ES2550210T3 - Método de uso de enterobacter sp. 638 - Google Patents

Abstract

Un método para aumentar la masa o el número de frutas y/o semillas, o disminuir el tiempo hasta la floración o el tiempo hasta la maduración de los frutos, de una planta, el método comprende aplicar una composición a la planta en una cantidad eficaz para aumentar la masa o el número de frutos y/o semillas, o disminuir el tiempo hasta la floración o el tiempo hasta la maduración de los frutos, en donde la composición comprende un cultivo aislado de Enterobacter sp. 638, y en donde la planta es una angiosperma.

Description

Método de uso de enterobacter sp. 638

5 Esta invención se realizó con el apoyo del gobierno bajo el número de contrato DE-AC02-98CH10886, otorgado por el Departamento de Energía de los EE.UU. El gobierno tiene determinados derechos sobre la invención.

Antecedentes de la invención

10 La presente invención se relaciona con el uso de Enterobacter sp. 638 en relación con el aumento de la masa o el número de frutos y/o semillas, o la disminución del tiempo hasta la floración o del tiempo hasta la maduración de los frutos, de una angiosperma.

Puede preverse que los cambios en el clima de la Tierra tengan un fuerte efecto sobre la productividad agrícola. Por

15 ejemplo, se considera que el aumento de las emisiones procedentes de la combustión de combustibles fósiles ha afectado el clima de la Tierra, lo que ha hecho más deseable la producción de biocombustibles a partir de recursos renovables. Otra manera en la que se prevé que el cambio climático afecte la productividad agrícola es por el aumento de la temperatura y por la afectación de los patrones de precipitaciones. Aunque es deseable un aumento de la demanda de recursos agrícolas en la producción de materias primas para la producción de biocombustibles, este

20 aumento de la demanda se compensa con un aumento simultáneo en la demanda de alimentos para el suministro a la aún creciente población mundial.

Por lo tanto, existe una necesidad de prácticas sostenibles que puedan usarse para optimizar la producción de alimentos y materias primas para los biocombustibles. Tales prácticas podrían aumentar de forma óptima la 25 productividad general de las plantas de una manera sostenible, aumentar la tolerancia a la sequía en las plantas de manera que los cultivos y materias primas puedan soportar fluctuaciones importantes en los patrones de precipitaciones, y aumentar la tolerancia a las infecciones por patógenos en las plantas, Weyens y otros, Trends in Biotechnology, publicaciones Elsevier, Cambridge GB, Vol. 27, núm. 10 (2009) proporciona una reseña concerniente a los efectos beneficiosos de las bacterias asociadas a las plantas para aumentar la producción de biomasa. Se discuten

30 varios mecanismos de promoción directa e indirecta del crecimiento vegetal.

Taghavi y otros (2009, Vol. 75, núm. 3, p. 748-757, Applied and environmental Microbiology) describe la capacidad del Enterobacter sp. 636 para promover el crecimiento de los árboles de álamos.

35 Breve descripción de la invención

En un aspecto, la invención se relaciona con un método para aumentar la masa o el número de frutos y/o semillas, o disminuir el tiempo hasta la floración o el tiempo hasta la maduración de los frutos, de una planta, el método comprende aplicar una composición a la planta en una cantidad eficaz para aumentar la masa o el número de frutos y/o semillas, o

40 disminuir el tiempo hasta la floración o el tiempo hasta la maduración de los frutos, en donde la composición comprende un cultivo aislado de Enterobacter sp. 638, en donde la planta es una angiosperma.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método de la invención, el método comprende aplicar la composición a una raíz, un brote, una hoja, y/o una semilla de la planta.

En aún otro aspecto, la invención se relaciona con un método de la invención, en donde la angiosperma es tomate.

En un aspecto adicional, la invención se relaciona con un método de la invención, en donde la angiosperma es girasol.

50 En aún un aspecto adicional, la invención se relaciona con un método de la invención, en donde la angiosperma es tabaco.

Breve descripción de las figuras

55 La Fig. 1 es un análisis filogenético 16S del la cepa 638 de Enterobacter sp. .

La Fig. 2 es una representación circular del cromosoma 638 de Enterobacter sp. . Los círculos muestran (desde la parte exterior): la desviación del porcentaje de GC (ventana GC -media GC) en una ventana de 1000 pb, las CDS predichas transcritas en la dirección en el sentido de las manecillas del reloj, las CDS predichas transcritas en la dirección 60 contraria al sentido de las manecillas del reloj, las CDS en la dirección en el sentido de las manecillas del reloj y contraria al sentido de las manecillas del reloj coloreadas de acuerdo con sus clases COG, la posición de todas las repeticiones palindrómicas, la posición de las 100 repeticiones palindrómicas (CCCTCTCCCXX(X)GGGAGAGGG) (sec. con núm. de ident.: 1), el sesgo GC (G+C/G-C) en una ventana de 1000 pb, y las coordenadas en pares de kilo bases. Las regiones sinténicas en comparación con E. coli KI2 se muestran con genes que aparecen en naranja, mientras que 65 los genes que aparecen en morado corresponden a la región no sinténica. Las flechas indican las funciones putativas de

genes ubicados en regiones que no están en sintenia con E. coli K12 (para detalles adicionales del contenido génico de cada una de las regiones ver la Tabla I). Una región sinténica se define por un mínimo de tres genes consecutivos que están presentes en una secuencia de genoma bacteriano, y que muestran una organización genética similar a la de esos mismos genes en otros genomas bacterianos.

La Fig. 3 es una representación circular del plásmido pENT638-1 de Enterobacter sp. 638. Los círculos muestran desde la parte exterior: la subdivisión de pENT -01 en grupos de funciones, la anotación de los genes, la desviación del porcentaje de GC (ventana GC -media GC) en una ventana de 1000 pb, las CDS predichas (rojo) transcritas en la dirección en el sentido de las manecillas del reloj, las CDS predichas (azul) transcritas en la dirección contraria al sentido de las manecillas del reloj, el sesgo GC (G+C/G-C) en una ventana de 1000 pb, los elementos de transposición de elementos IS (rosa) y pseudogenes (gris). Los sistemas toxina/antitoxina T (TA) se muestran con un asterisco (*).

La Fig. 4 representa los índices de crecimiento de esquejes de álamo inoculados con diferentes bacterias endofíticas. Los índices de crecimiento se determinaron 10 semanas después de la inoculación y la siembra de los esquejes en suelo arenoso. Se usaron siete plantas, por condición. Las plantas se cultivaron en el invernadero. Se usaron plantas no inoculadas como referencias. Las barras indican los errores estándar. Los índices de crecimiento se calcularon como (Mt -M0)M0 después de 10 semanas de crecimiento de las plantas inoculadas y las no inoculadas. M0, peso de la planta (g) en la semana 0; Mt, peso de la planta (g) después de 10 semanas. La significación estadística del aumento de la producción de biomasa de las plantas inoculadas, en comparación con la de las plantas no inoculadas de control, se confirmó al nivel de 5 % (**) mediante el uso de la prueba de Dunnett.

La Fig. 5 muestra los efectos de Enterobacter sp. 638 sobre la formación de brotes y raíces de álamo DN-34. Las plantas se incubaron hidropónicamente en solución de Hoagland de fortaleza media en ausencia (Control) o presencia

(638) de la cepa 638. El desarrollo de las raíces y los brotes se presenta después de (A) y 10 (B) semanas.

La Fig. 6 muestra el peso total de tomates cosechados después de un período de crecimiento de 4 meses. Las plantas inoculadas con Enterobacter sp. 638 tenían un rendimiento 10 % superior en comparación con las plantas no inoculadas de control.

La Fig. 7 presenta una disminución del tiempo hasta la floración después de la inoculación de plantas de girasol inoculadas con Enterobacter sp. 638 en comparación con plantas de girasol no inoculadas como controles.

La Fig. 8 muestra una comparación de cromatografías de extractos de Enterobacter sp. 638 cultivados en ausencia (cromatografía en la parte superior) o presencia (cromatografía en la parte inferior) de extractos vegetales. Nótese la producción de Acetoína y 2,3-Butanodiol en presencia de extractos vegetales. Este resultado se confirmó en un medio definido que contiene sacarosa.

La Fig. 9 muestra el porcentaje de genes de una clase COG particular en dependencia de su localización genética: cromosoma o plásmido pENT638-1. Leyenda de la clase Cog: D: control del ciclo celular, división celular, división de cromosomas; M biogénesis de pared celular/membrana/envoltura; N motilidad celular; 0 modificación postraduccional, recambio de proteínas, chaperonas; T mecanismos de transducción de señales; U tráfico intracelular, secreción, y transporte vesicular; V mecanismos de defensa; W estructuras extracelulares; J traducción, estructura ribosomal y biogénesis; K transcripción; L replicación, recombinación y reparación; C producción y conversión de energía; E transporte y metabolismo de aminoácidos; F transporte y metabolismo de nucleótidos; G transporte y metabolismo de carbohidratos; H transporte y metabolismo de coenzimas; I transporte y metabolismo de lípidos; P transporte y metabolismo de iones inorgánicos; Q biosíntesis, transporte y catabolismo de metabolitos secundarios; R predicción sólo de la función general; S función desconocida.

La Fig. 10 muestra la distribución de las repeticiones palindrómicas en el cromosoma de Enterobacter sp. 638. Los círculos muestran (desde la parte exterior): las CDS predichas transcritas en la dirección en el sentido de las manecillas del reloj y contraria al sentido de las manecillas del reloj, la posición de todas las repeticiones palindrómicas y de la repetición palindrómica "CCCTCTCCCXX(X)GGGAGAGGG" (sec. con núm. de ident.: I) que se encuentra en el genoma de Enterobacter sp. 638, la desviación del porcentaje de GC, el sesgo GC. La tabla al lado muestra la variación de las secuencias de nucleótidos XX(X) y sus números acumulativos.

La Fig. II muestra el aumento de la producción de biomasa de tabaco cuando se inocula con Enterobacter sp. 638. Para la comparación, se incluyeron las plantas no inoculadas de control y las plantas inoculadas con Pseudomonas putida W619. Para tabaco, las plantas inoculadas con Enterobacter sp. 638 no sólo mostraron el mayor aumento del crecimiento, sino, además, la aparición más temprana de la floración como se observó con girasol.

Descripción detallada de la invención

El 4 de marzo de 2011 se realizó un depósito biológico de Enterobacter sp. 638 de acuerdo con la invención con la Depositaria de Patentes ATCC, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110.

A. Cultivo de Enterobacter sp. 638

Enterobacter sp. 638 es una cepa bacteriana no fitopatógena. La cepa 638 de Enterobacter sp. se aisló en condiciones aerobias a partir de muestras de raíces y tallos con superficie estéril tomadas de árboles de álamo híbrido H11-11 que se cultivaron en un suelo franco limoso con agua subterránea por debajo contaminada con tetracloruro de carbono o tricloroetileno.

La cepa 638 del Enterobacter sp. incluye un solo cromosoma circular de 4,518,712 pb con un contenido general G+C de

52.98 %, e incluye establemente un plásmido pENT638-1 de 157,749 pb, que tiene un contenido general G+C de 50.57 %. El plásmido pENT638-1 muestra, basado en el contenido de GC, al menos cuatro regiones distintas (Fig. 3). El plásmido pENT638-1 está relacionado con los plásmidos F encontrados en otras Enterobacteriaceae. Los plásmidos de esta familia están involucrados en la interacción con el huésped y la virulencia, tales como el plásmido pFra del microbio plaga Yersinia pestis. En pENT638-1, sin embargo, la isla de patogenicidad de pFra se sustituye por una isla genómica putativa única de 23 kb (flanqueda por un gen de integrasa y que tiene un contenido de GC que es significativamente diferente al del resto del plásmido).

Un "cultivo aislado" se refiere a un cultivo del microorganismo que no incluye otros materiales (i) que se encuentran normalmente en el suelo en el que crece el microorganismo, y/o (ii) a partir del cual se aísla el microorganismo. Además, dicho cultivo puede ser un cultivo que no contiene ninguna otra especie biológica, de microorganismo, y/o bacteriana en cantidades suficientes para interferir con la replicación del cultivo o para ser detectadas mediante técnicas bacteriológicas, de biología molecular, y/o químicas normales.

B. Inoculante para una planta

Para facilitar el cultivo de la Enterobacter sp. 638, el cultivo puede diluirse, por ejemplo, con un medio o portador adecuado. Un "medio biológicamente aceptable" se refiere a un medio que no interfiere con la eficacia de la actividad biológica de Enterobactersp. 638 y que no es tóxico para Enterobacter sp. 638.

Los ejemplos de un medio biológicamente aceptable incluyen un medio mínimo de sales con gluconato y un medio rico diluido (LB 1/100). El medio biológicamente aceptable puede incluir fuentes de carbono, tales como los siguientes compuestos ilustrativos: D-manitol, lactosa, sacarosa, arbutina, salicina, trehalosa, D-manosa, L-arabinosa, maltosa, celobiosa, xilosa, gluconato y glucosa. Preferentemente, el medio incluye glucosa, sacarosa, otros azúcares derivados de plantas, y/o extracto de álamo para inducir la inducción de fitohormonas promotoras del crecimiento vegetal (acetoína, 2,3-butanodiol, ver Fig. 8).

En una modalidad, el inoculante incluye, además, un microorganismo promotor del crecimiento vegetal, que incluye, por ejemplo, una bacteria endofítica, un hongo, una bacteria de la rizosfera y/o un hongo micorrizal promotor del crecimiento vegetal. Los microorganismos promotores del crecimiento vegetal ilustrativos incluyen pero no se limitan a los miembros de los géneros Actinobacter, Alcaligenes, Bacillus, Burkholderia, Buttiauxella, Enterobacter, Klebsiella, Kluyvera, Pseudomonas, Rahnella, Ralstonia, Rhizobium, Serratia, y Stenotrophomonas.

C. Método para aumentar el crecimiento (descripción)

Una "planta" como se usa en la presente descripción se refiere a cualquier tipo de planta, tal como un árbol, arbusto, flor, hierba, vid, o pasto. El término "planta" se refiere, además, a cualquier parte de la planta, por ejemplo, a una planta completa, una parte de la planta, una célula vegetal, o un grupo de células vegetales, tales como tejido vegetal, o progenie de estas. Las plántulas también se incluyen dentro del significado de "planta." Las plantas incluyen cualquiera de las angiospermas, tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas, y árboles de angiospermas. La invención se limita a las angiospermas.

Los ejemplos de angiospermas monocotiledóneas incluyen, pero no se limitan a, espárrago, maíz dulce y de campo, cebada, trigo, arroz, sorgo, cebolla, mijo perla, centeno y avena y otros cereales, caña de azúcar, pasto elefante, pasto varilla y miscanthus.

Los ejemplos de angiospermas dicotiledóneas incluyen, pero no se limitan a tomate, tabaco, algodón, semilla de colza, habas, soja, pimientos, lechugas, guisantes, alfalfa, trébol, cultivos de coles o Brassica oleracea (p. ej., repollo, brócoli, coliflor, coles de Bruselas), rábano, zanahoria, remolacha, berenjena, espinaca, pepino, calabacín, melón, melón cantalupo, girasol y varias plantas ornamentales. En una modalidad preferida, la planta es un tomate. En otra modalidad preferida, la planta es girasol. En aún otra modalidad preferida, la planta es tabaco.

Los ejemplos de especies leñosas de angiospermas incluyen álamo, secoya, roble, etc. Las especies de árboles angioespermas incluyen, además, por ejemplo, acacia, aliso, álamo temblón, haya, abedul, goma dulce, sicómoro, álamo, sauce, y lo similar. En una modalidad preferida, la angiosperma es un álamo.

Como se usa en la presente descripción, el término "aumento" del crecimiento se refiere a un aumento en una

característica de crecimiento de una planta tratada con un método o composición de la descripción, en la que el aumento de la característica de crecimiento es mayor que el crecimiento en una planta de control correspondiente cuando se cultiva en condiciones idénticas sin la aplicación del método o composición. Una planta de control "correspondiente" se refiere a una planta silvestre que es del mismo tipo o especie que la planta tratada con un método

o composición de la descripción.

El aumento del crecimiento puede ser un aumento del crecimiento de una parte particular de la planta, tal como las raíces, los brotes, las hojas, las flores, los frutos, y/o las semillas, o el crecimiento puede estar distribuido por toda la planta. Los medios para medir el crecimiento se conocen en la técnica.

El aumento del crecimiento puede incluir, por ejemplo, un aumento en al menos una, o una combinación de, las siguientes características en la planta y/o una parte de la planta: altura, ancho, masa, una acumulación de carbono radioactivo, un aumento del peso seco, un aumento del peso fresco y/o un aumento de la velocidad de dichos aumentos en un período de tiempo específico.

El aumento del crecimiento puede ser un aumento que es 2, 4, 5, 6, 8,10, 20 (o más) veces mayor en comparación con el crecimiento de una planta de control correspondiente cultivada en condiciones idénticas sin aplicación del método o composición. Por ejemplo, una planta que tiene aumento del crecimiento en comparación con la planta de control puede tener 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %,100 % o más crecimiento que la planta de control correspondiente cultivada en condiciones idénticas sin aplicación del método o composición.

D. Método para aumentar la biomasa (descripción)

El término "biomasa" se refiere al peso seco o al peso fresco de la planta. La biomasa incluye, por ejemplo, todas las partes de la planta a menos que se estipule de cualquier otra manera, tal como en referencia a la biomasa de los brotes (todas las partes de la planta por encima del suelo), la biomasa de las hojas, y la biomasa de las raíces. El término "peso seco" se refiere al peso de una planta que se ha secado para eliminar la mayor parte del agua celular. El término "peso fresco" se refiere al peso de una planta que no se ha secado para eliminar la mayor parte del agua celular. Los medios para medir la biomasa se conocen en la materia.

El término "aumento de la biomasa" se refiere a un aumento de la biomasa de una planta tratada con un método o composición de la descripción, en la que el aumento de la biomasa es una cantidad mayor que la cantidad de biomasa en una planta de control correspondiente cultivada en condiciones idénticas sin aplicación del método o composición.

El aumento de la biomasa puede ser un aumento que es 2, 4, 5, 6, 8, 10, 20 (o más) veces mayor en comparación con la biomasa de una planta de control correspondiente cultivada en condiciones idénticas sin aplicación del método o composición. Por ejemplo, una planta que tiene aumento de la biomasa en comparación con la planta silvestre puede tener 10 %,15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %,100 % o más biomasa que la planta de control correspondiente cultivada en condiciones idénticas sin aplicación del método o composición.

E. Método para aumentar la tolerancia y/o resistencia a la enfermedad (descripción)

El término "tolerancia a la enfermedad" se refiere a la capacidad de una planta para soportar o resistir una enfermedad a la vez que mantiene la capacidad de funcionar y producir a pesar de la enfermedad. Una enfermedad incluye, por ejemplo, la presencia de una patología que afecta negativamente la viabilidad de una planta, tal como, por ejemplo, una infección por un patógeno (p. ej., un hongo, un virus, o una bacteria) en y/o sobre la planta.

El término "resistencia a la enfermedad" se refiere a la capacidad de una planta para desarrollar menos síntomas de enfermedad después de la exposición a una enfermedad que la planta de control correspondiente que no exhibe resistencia a la enfermedad cuando se cultiva en condiciones y con enfermedad idénticas. La resistencia a la enfermedad incluye resistencia completa a la enfermedad y/o grados variables de resistencia manifestados como disminución de los síntomas, mayor supervivencia, u otros parámetros de la enfermedad, tales como mayor rendimiento, aumento del crecimiento, aumento de la biomasa, maduración acelerada de los frutos, etc. Una enfermedad puede ser, por ejemplo, una infección fúngica tal como Septoria, Melampsora, o septotina, una infección viral tal como el virus del mosaico del álamo, y/o una infección bacteriana, tal como una infección de Agrobacteria, Rickettsia, o Corinobacteria.

El término "aumentar" la tolerancia y/o resistencia a la enfermedad se refiere a un aumento de la tolerancia y/o resistencia a la enfermedad de una planta enferma tratada con un método o composición de la descripción, en la que la tolerancia y/o resistencia a la enfermedad es mayor que la tolerancia y/o resistencia a la enfermedad en una planta de control correspondiente cultivada en condiciones y con enfermedad idénticas.

El aumento de la tolerancia y/o resistencia a la enfermedad puede ser un aumento que es 2, 4, 5, 6, 8, 10, 20 (o más) veces mayor en comparación con la tolerancia y/o resistencia de una planta de control correspondiente cultivada en condiciones y exposición a la enfermedad idénticas. Por ejemplo, una planta que tiene aumento de la tolerancia y/o resistencia a la enfermedad en comparación con la planta silvestre puede tener 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %,

50 %, 60 %,70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 100 % o más tolerancia y/o resistencia a la enfermedad que la planta de control correspondiente cultivada en condiciones idénticas sin aplicación del método o composición.

Los métodos para evaluar la tolerancia y/o resistencia a la enfermedad se conocen en la materia. Por ejemplo, dichos métodos pueden incluir observaciones y calificación de las manifestaciones físicas de los síntomas de la enfermedad, pérdida del vigor de la planta, o muerte, y activación de genes específicos de respuesta a la enfermedad, en comparación con una planta de control.

F. Método para aumentar la productividad de frutos y/o semillas (invención)

La invención se relaciona con un método para aumentar la productividad de frutos y/o semillas en una planta, en donde la planta es una angiosperma. El método incluye aplicar una cantidad eficaz de una composición que incluye un cultivo aislado de Enterobacter sp. 638 a la planta.

"Aumentar la productividad" se refiere a aumentar la masa o número de frutos y/o semillas producidos por una planta tratada con un método de la invención, en la que el aumento de la productividad es una cantidad mayor que la cantidad de productividad en una planta de control correspondiente cuando se cultiva en condiciones idénticas sin aplicación del método.

Los métodos para evaluar un aumento de la productividad pueden incluir, por ejemplo, determinar el número de frutos producidos por la planta, el peso de los frutos individuales producidos por la planta, el tiempo hasta la floración en la planta, el tiempo hasta la maduración de los frutos en la planta, y/o el número de semillas producidas por un fruto o flor individual de la planta.

La productividad aumenta en una planta si, por ejemplo, el número de frutos producidos por la planta aumenta, el peso de los frutos individuales producidos por la planta aumenta, el tiempo hasta la floración en la planta disminuye, el tiempo hasta la maduración de los frutos en la planta disminuye, y/o el número de semillas producidas por un fruto o flor individual de la planta aumenta en comparación con una planta de control correspondiente cuando se cultiva en condiciones idénticas sin aplicación del método o composición.

El aumento o disminución de la productividad puede ser un aumento o disminución respectivo que es 2, 4, 5, 6, 8, 10, 20 (o más) veces mayor o menor que la productividad de una planta de control correspondiente cultivada en condiciones idénticas sin aplicación del método o composición. Por ejemplo, una planta que tiene aumento de la productividad en comparación con la planta de control puede tener 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 100 % o más productividad que la planta de control correspondiente cultivada en condiciones idénticas sin aplicación del método o composición.

G. Método para aumentar la tolerancia y/o resistencia a la sequía (descripción)

El término "tolerancia a la sequía" se refiere a la capacidad de una planta para soportar o resistir condiciones de sequía. "Sequía" se refiere a una condición en la que una planta está sometida a estrés osmótico o reducción del potencial de agua. Por ejemplo, la sequía puede ser provocada por la falta de agua disponible durante un período de tiempo. Las condiciones de sequía pueden evaluarse mediante la comparación de la cantidad de agua necesaria para el crecimiento

o maduración de una planta con la cantidad de agua disponible para la planta. Las condiciones de sequía pueden ser provocadas, por ejemplo, por la falta de precipitaciones o de irrigación, con relación a la cantidad de agua usada internamente o transpirada por una planta.

El término "resistencia a la sequía" se refiere a la capacidad de una planta para desarrollar menos síntomas de estrés hídrico (p. ej., menor productividad, pérdida de las hojas, muerte) que la planta de control correspondiente cuando se cultiva en condiciones idénticas de estrés hídrico. La resistencia a la sequía incluye la resistencia completa a los efectos de la sequía (sin pérdida de la productividad) o grados variables de resistencia manifestada como la disminución de los síntomas o mayor supervivencia.

La evaluación fenotípica de los síntomas puede usarse para determinar si, y en qué medida, una planta padece la sequía. Por ejemplo, la tolerancia y/o resistencia a la sequía puede evaluarse mediante la observación y calificación del marchitamiento, la detención del crecimiento, la muerte, la productividad, la pérdida de las hojas (p. ej., enrollamiento de las hojas, distorsión de las hojas, caída de las hojas, quemadura de las hojas), la muerte regresiva de tallos o ramas, la eficiencia fotosintética, la floración, y el nivel de rendimiento en una planta. Además, la tolerancia y/o resistencia a la sequía de una planta puede evaluarse, por ejemplo, mediante ensayos bioquímicos o basados en ácidos nucleicos para medir la expresión o activación de genes de respuesta específicos en la planta.

La tolerancia y/o resistencia a la sequía aumenta en una planta si la planta demuestra síntomas menos severos de estrés provocado por la sequía. Por ejemplo, la tolerancia y/o resistencia a la sequía aumenta si disminuyen el marchitamiento, la detención del crecimiento, la muerte, la pérdida de las hojas (p. ej., enrollamiento de las hojas, distorsión de las hojas, caída de las hojas, quemadura de las hojas), y/o la muerte regresiva de tallos o ramas en

comparación con una planta de control correspondiente cuando se cultiva en condiciones idénticas sin aplicación del método o composición. Otros ejemplos de un aumento de la tolerancia y/o resistencia a la sequía incluyen un aumento de la productividad, el vigor de la planta, la eficiencia fotosintética, la floración, y/o el nivel de rendimiento de una planta en comparación con una planta de control correspondiente cuando se cultiva en condiciones idénticas sin aplicación del método o composición.

En consecuencia, el término "aumentar" la tolerancia y/o resistencia a la sequía se refiere a un aumento de la tolerancia y/o resistencia a la sequía de una planta afectada tratada con un método o composición de la invención, en la que la tolerancia y/o resistencia es mayor que la tolerancia y/o resistencia a la sequía en una planta de control correspondiente cultivada en condiciones y con estrés hídrico idénticos.

El aumento de la tolerancia y/o resistencia a la sequía puede ser un aumento que es 2, 4, 5, 6, 8, 10, 20 (o más) veces mayor en comparación con la tolerancia y/o resistencia de una planta de control correspondiente cultivada en condiciones y con estrés hídrico idénticos. Por ejemplo, una planta que tiene aumento de la tolerancia y/o resistencia a la sequía en comparación con la planta de control puede tener 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 100 % o más tolerancia y/o resistencia a la sequía que la planta de control correspondiente cultivada en condiciones idénticas sin aplicación del método o composición.

H. Métodos Generales

Cualquier método para aplicar una composición a una planta puede usarse en los métodos de la presente invención. Los métodos para aplicar una composición sobre y/o en una planta se conocen en la materia. En una modalidad, la composición puede inocularse en el suelo con la planta. En otra modalidad, la composición puede introducirse a las raíces de las plantas a través del crecimiento en un medio hidropónico o la pulverización sobre las hojas de una planta.

La composición puede aplicarse a cualquier parte de la planta, que incluye las semillas a través del uso de un mecanismo o aglutinante de revestimiento adecuado. La composición puede aplicarse sobre las plantas antes de la siembra o introducirse en los surcos de las plantas durante la siembra. Como otro ejemplo, la composición puede aplicarse a las raíces de la planta. La composición puede prepararse con o sin un portador y venderse como un inoculante separado para insertarlo directamente en los surcos en los que se siembra la planta.

De acuerdo con los métodos de la invención, una cantidad eficaz de la composición es aquella cantidad suficiente para establecer suficiente crecimiento bacteriano de tal manera que se logre el resultado deseado en la planta tratada. Una cantidad eficaz de la composición puede determinarse por medios conocidos en la materia para una especie vegetal particular. Por ejemplo, la inoculación con la composición puede realizarse en solución hidropónica durante seis días, y la suspensión bacteriana puede renovarse a los tres días después de la inoculación.

En una modalidad, la cantidad eficaz puede ser, por ejemplo, cualquier cantidad de aproximadamente 101 a aproximadamente 1012 células por planta. En otra modalidad, la cantidad eficaz es una concentración celular de aproximadamente 105a aproximadamente 1010 UFC/ml de inóculo, con mayor preferencia de aproximadamente 106 a 108UFC/ml, y con la máxima preferencia aproximadamente 108 UFC/ml. En aún otra modalidad, la composición puede mezclarse con el suelo en una cantidad de aproximadamente 105 a 1010 células por gramo de suelo.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Aislamiento y caracterización de Enterobacter sp. 638

Se recogieron muestras de raíces y brotes de árbol de álamo híbrido HII-II (Populus trichocarpa _P. deltoides) de 1O años de edad que creció en presencia de tetracloruro de carbono (12 ppm homogéneamente) durante 8 años en un sitio experimental en el Estado de Washington. Además, se recogió material de sauce nativo (Salix gooddingii) a partir de plantas nativas de 5 años de edad cultivadas en presencia de tricloroetileno (18 ppm) y tetracloruro de carbono (12 ppm) durante 5 años. Los esquejes se retiraron de las plantas con tijeras podadoras que se lavaron con etanol entre cortes y se colocaron en frascos de análisis orgánicos volátiles enjuagados con acetona que se colocaron en hielo para el traslado desde el campo. Las raíces y los brotes se trataron por separado. Las muestras frescas de raíces y brotes se lavaron vigorosamente en agua destilada durante 5 min, la superficie se esterilizó durante 5 min en una solución que contenía 1 % (p/vol) de cloruro activo (añadido como una solución de hipoclorito sódico [NaOCl)) complementado con I gotita de Tween 80 por 100 ml de solución, y se enjuagó tres veces en agua destilada estéril. Una muestra 100-1-11 del agua del tercer enjuague se sembró en placa en medio 869 (25) para verificar la eficiencia de la esterilización. Después de la esterilización, las raíces y los brotes se maceraron en 10 ml de MgS04 a 10 mM mediante el uso de un mezclador Polytron PT1200 (Kinematica A6). Se hicieron diluciones seriadas, y las muestras 100-J1I se sembraron en placa en medio no selectivo para probarlas para la presencia de los endófitos y sus características.

El Enterobacter sp. 638 se aisló en condiciones aerobias a partir de muestras de raíces y tallos con superficie estéril tomadas de árbol de álamo híbrido HII-II y sauce nativo (Salix gooddingii) que se cultivaron en un suelo franco limoso con agua subterránea por debajo contaminada con tetracloruro de carbono o tricloroetileno y tetracloruro de carbono,

respectivamente. Se extrajo el ADN genómico total y se usó para amplificar el gen del ARNr 16S. Los genes de ARNr 16S se amplificaron por PCR mediante el uso del conjunto de cebadores estándar 26F-1392R (Amann, 1995)

Ejemplo 2: Tamizaje de bacterias endofíticas para las propiedades promotoras del crecimiento vegetal en álamo.

Los inóculos (250 ml de cultivo) se prepararon mediante el cultivo de bacterias endofíticas en medio 869 de fortaleza 1110 (25) a 30 °C en un agitador rotatorio hasta que se alcanzó una concentración celular de 109 UFC/ml (densidad óptica a 660 nm (00660) de I). Las células se recogieron por centrifugación, se lavaron dos veces en MgS04 a 10 mM, y se resuspendieron en 1110 del volumen original (en MgS04 a 10 mM) para obtener un inóculo con una concentración celular de 101O UFC/ml. Por cepa microbiana probada, se pesaron siete esquejes de álamo (Populus deltoides x P. nigra) DN-34 de aproximadamente 30 cm y se colocaron en un vaso de precipitado de I litro que contenía 0.5 litros de una solución nutriente de Hoagland estéril de fortaleza media (5), que se renovó cada 3 días. Los esquejes se dejaron enraizar durante aproximadamente 4 semanas hasta que comenzó la formación de las raíces. Posteriormente, se añadió un inóculo bacteriano a cada vasija a una concentración final de 108 UFC/ml en solución de Hoagland de fortaleza media. Después de 3 días de incubación, los esquejes se pesaron y se sembraron en suelo arenoso no estéril y se colocaron en el invernadero con una temperatura constante de 22 °C y un ciclo de 14 h de luz I 0 h de oscuridad con radiación fotosintética activa de 165 mmoVm2s. Después de 10 semanas, las plantas se cosecharon, y se determinó su biomasa total, su aumento de biomasa, y la biomasa de diferentes tejidos vegetales. Se recogieron, además, los datos de las plantas no inoculadas de control. Los índices de crecimiento se calcularon como (Mt MO)/MO después de 10 semanas de crecimiento en presencia o ausencia de inóculo de bacterias endofíticas, donde MO es el peso de la planta (g) en la semana 0 y Mt es el peso de la planta (g) después de 10 semanas. La significación estadística de los resultados se confirmó al nivel de 5 % mediante el uso de la prueba de Dunnett. Para determinar los efectos de las bacterias endofíticas sobre el enraizamiento del álamo DN-34, los esquejes se trataron como se describió anteriormente, salvo que el inóculo de bacterias endofíticas se añadió a partir del día 1.

El Enterobacter sp. 638 aislado de álamo se probó para su capacidad de mejorar el crecimiento de sus plantas huéspedes, junto con otras gammaproteobacterias endofíticas que se encuentran en árboles de álamo. Burkholderia cepacia Bu72, un endófito aislado originalmente de altramuz amarillo el cual se encontró que tiene efectos promotores del crecimiento vegetal sobre árboles de álamo, y Cupriavidus metallidurans CH34 (referido también como Ralstonia metallidurans CH34), una bacteria típica del suelo sin efectos promotores del crecimiento vegetal, se incluyeron como controles positivos y negativos, respectivamente. Además, se usaron esquejes no inoculados como controles.

Después de la formación de las raíces en condiciones hidropónicas y la posterior inoculación de bacterias endofíticas, los esquejes de álamo DN-34 se sembraron en un suelo arenoso marginal y se dejaron crecer durante 10 semanas, después de las cuales las plantas se cosecharon y se determinaron sus biomasas. Después de 10 semanas de crecimiento, los árboles de álamo inoculados con M. populi BJ001 tenían menor biomasa nueva que los controles (Fig. 4) (P<0.05). Los esquejes de álamo inoculados con Enterobacter sp. 638 (P=0.018) y B. cepacia BU72 (P=0.042) mostraron estadísticamente mejor crecimiento que las plantas de control (Fig. 4), como se refleja por sus índices de crecimiento. Los efectos promotores del crecimiento vegetal de Enterobacter sp. 638 y B. cepacia BU72 fueron reproducibles en experimentos realizados independientemente.

En las condiciones de invernadero probadas, no se encontraron diferencias en los índices de crecimiento entre los de las plantas no inoculadas de control y los de las plantas inoculadas con S. maltophilia R551-3, P. putida W619, y S. proteamaculans 568; su crecimiento fue comparable al observado en plantas inoculadas con C. metallidurans CH34. Además, las plantas de control y las plantas inoculadas con las bacterias endofíticas tenían apariencia saludable, salvo por las plantas inoculadas con M. populi BJ001, las que mostraron signos de estrés, que incluyen clorosis de las hojas.

Ejemplo 3: Tamizaje de bacterias endofíticas para las propiedades promotoras del crecimiento vegetal en tabaco.

Debido a que las especies de Nicotiana se usan en el laboratorio como modelos de plantas grandes para estudios de transformación y de metabolitos, sería útil poder usar dicha planta para el estudio, incluso si no es útil para las aplicaciones de campo. Se dio inicio a plántulas de Nicotiana xanthi en medio de crecimiento sin suelo, y después del desarrollo de las hojas primarias, se transfirieron a soluciones hidropónicas. Después de una semana, las plantas se colocaron en soluciones que contenían 108 UFC de Enterobacter sp. 638. Después de 3 días, los inóculos se renovaron, y después de tres días adicionales, las plantas se colocaron en macetas en el invernadero.

El crecimiento vegetal se controló semanalmente, y se registró el tiempo hasta la aparición de la floración. Las plantas alcanzaron su tamaño completo más rápidamente que las plantas no inoculadas, y la mayor parte de las plantas estaban en flor un mes antes que el mismo número de plantas no inoculadas estuvieran en flor.

Ejemplo 4: Efectos de las bacterias endofíticas sobre el desarrollo de raíces de álamo

Para probar, además, los efectos de las bacterias endofíticas sobre el desarrollo de las raíces, se realizaron experimentos de enraizamiento en presencia y ausencia de derivados de Enterobacter sp. etiquetados con gfp 638. La formación de las raíces fue muy lenta para las plantas no inoculadas. En contraste, para los esquejes que se dejaron

enraizar en presencia de los endófitos seleccionados, la formación de las raíces comenzó dentro de 1 semana, y la formación de los brotes fue más pronunciada en comparación con la de las plantas no inoculadas (Fig. 5A). Después de 10 semanas, la formación de las raíces en los controles no inoculados era todavía pobre; sin embargo, en las plantas inoculadas con Enterobactersp. 638, las raíces y los brotes estaban bien desarrollados (Fig. 5B). La microscopía de fluorescencia se usó para visualizar la colonización interna de las raíces de las plantas mediante las cepas etiquetadas con gfp, lo que confirmó su comportamiento endofítico. La formación de microcolonias sobre la superficie de las raíces, como se observó para P. putida W619, estuvo ausente en las plantas inoculadas con Enterobacter sp. 638, donde sólo se observó colonización interna. No se detectó expresión de gfp para las raíces de las plantas no inoculadas de control.

Ejemplo 5: Efecto de las bacterias endofíticas sobre la productividad de la formación de frutos y de la floración

Para probar el efecto de las bacterias endofíticas de masa de producción de frutos, se dio inicio a semillas de tomate (variedad tradicional Brandywine, Park Seed) en una matriz de perlita/agua, y después se transfirieron a una solución hidropónica de solución de Hoagland de fortaleza 1/2. Cuando las plantas alcanzaron aproximadamente 3 pulgadas de alto, se transfirieron a soluciones que contenían 108 UFC por ml de bacterias endofíticas como se describió anteriormente. Tres días después de la inoculación, las plántulas se sembraron en el invernadero en ProMix, una mezcla comercial para macetas. Las fechas de la primera aparición de frutos y la masa total de tomates se registraron durante tres meses. Las plantas de tomate inoculadas con Enterobacter 638 tenían un 10 % de aumento de la productividad de frutos respecto a las plantas no inoculadas. Las plantas no inoculadas produjeron 82 frutos con una masa total de 22.374 kg, mientras que las plantas inoculadas produjeron 90 frutos con una masa combinada de 24.909 kg (Figura 6).

Se dio inicio a plántulas de girasol (Mammoth, Park Seed) mediante el uso del método descrito, y se registró el tiempo hasta la floración. En condiciones de invernadero, los girasoles inoculados comenzaron a florecer 5 días más temprano que las plantas no inoculadas, y 50 % estaban en flor mientras que sólo el 10 % de las plantas no inoculadas estaban en floración; 100 % de las plantas inoculadas estaban en floración mientras que sólo el 70 % de las plantas no inoculadas estaban en floración (Figura 7).

Ejemplo 6: Resistencia a la sequía

Esquejes de álamo híbrido de madera dura (OP-367 Populus deltoides x P. nigra) se colocaron en agua durante tres días para iniciar la formación de las raíces, y después se trasladaron a una solución de Hoagland de fortaleza 1/2 que contenía 108UFC por ml de bacterias endofíticas durante tres días. Después los esquejes se sembraron en macetas que contenían suelo de jardín y se cultivaron en el invernadero durante tres meses con suministro de agua en exceso. Después de tres meses, se suspendió el riego de las plantas, y se controló el tiempo hasta la senescencia. Las plantas inoculadas mostraron como promedio 20 % de retraso en la aparición de los síntomas de sequía, en comparación con las plantas no inoculadas.

Ejemplo 7: Resistencia a la enfermedad

Debido al aumento del vigor de la plantas, así como a los elementos genéticos presentes en las bacterias endofíticas, las plantas inoculadas probarán ser más resistentes a la colonización por patógenos y los síntomas serán menos evidentes en las plantas inoculadas.

Esquejes de álamo híbrido, tanto H11-11 (muy susceptible a enfermedades fúngicas) como OP-367 (resistente a enfermedades fúngicas) se inocularán como se describe. Las plantas se sembrarán en mezcla estéril para macetas, y se cultivarán hasta que estén presentes de seis a ocho hojas. Después las plantas se expondrán a patógenos fúngicos, y se controlarán tanto para el tiempo de aparición como para la severidad de los síntomas físicos de la infección. Las plantas pueden analizarse, además, para determinar la actividad de genes conocidos de respuesta a la enfermedad.

Ejemplo 8: Estructura y características generales del genoma

El genoma de la gammaproteobacteria Enterobacter sp. 638 (Fig. 2) incluye un solo cromosoma circular de 4,518,712 pb con un contenido general de G+C de 52.98 %, e incluye un plásmido pENT638-1 de 157,749 pb, que tiene un contenido general de G+C de 50.57 % (Tabla I). El cromosoma deEnterobacter sp. 638 muestra una transición del sesgo GC, que corresponde con su origen (oriC) y término de la replicación (Fig. 2). El sitio oriC contiene una caja perfecta de unión a DnaA (TTATCCACA) (sec. con núm. de ident.: 2), la cual se ubica 31,985 pb corriente arriba del codón de iniciación ATG de dnaA (en la coordenada 4,487,245 pb).

El plásmido pENT638-1 muestra, basado en el contenido de GC, al menos cuatro regiones distintas (Fig. 3). El plásmido incluye una cadena principal ancestral, que es común para los plásmidos de la familia F y contiene las funciones básicas del plásmido para la transferencia y la replicación, y de regiones que son propensas a adquirirse por medio de la transferencia horizontal de genes. Estas regiones en el plásmido pENT638-1 muestran una matriz de uso de codones diferente del resto de las especies de Enterobacteriaceae. Además, estas regiones no tienen sintenia con cromosomas

o plásmidos secuenciados de cepas estrechamente relacionadas, y curiosamente estas regiones codifican genes

relacionados con la adhesión a la planta y su colonización. El mantenimiento estable en Enterobacter sp. 638 de pENT638-1 y estas regiones, que probablemente juegan un papel en la interacción exitosa entre Enterobacter sp. 638 y su planta huésped, parece importante si se tiene en cuenta la presencia de seis sistemas toxina/antitoxina (TA) relBE.

En contraste, el cromosoma de Enterobacter sp. 638 codifica sólo tres parejas de toxina/antitoxina (Ent638_0434-0435, Ent638_0476-0477, y Ent638_2066-2067). Este bajo número es representativo para organismos asociados a huéspedes.

El cromosoma codifica 4395 secuencias codificantes (CDS) putativas que representan una densidad de codificación de

87.9 %, y el plásmido pENT638-1 codifica 153 CDS putativas que tienen una densidad de codificación de 80.4 %. Después de su anotación manual, 3562 CDS (78.3 %) pudieron asignarse a una función biológica putativa, mientras que 835 CDS (18.4 %) se anotaron como proteínas hipotéticas de función desconocida. Las proteínas hipotéticas conservadas están representadas por 684 CDS (15.0 %), mientras que 151 CDS (3.3 %) no tuvieron homología con ninguna secuencia reportada anteriormente. Mediante el uso del módulo COGnitor del sistema MaGe, 3597 CDS (79.1 %) pudieron asignarse a una o más clases COG funcionales (ver Fig. 9). La repartición de 638 CDS de Enterobacter sp. entre las diferentes clases COG es muy similar a la que se observa para E. coli K12. Las tres clases más abundantes son el transporte y metabolismo de aminoácidos (E), carbohidratos (G) y hierro inorgánico (P) y representan más del 37 % de todas las CDS, lo que apunta a los estilos de vida simbióticos de Enterobacter sp. 638 y E. coli K12 que requieren la captación eficiente de los nutrientes proporcionados por el huésped. Se encontraron siete conjuntos de genes de ARNr 5S, 16S, 23S y un gen de ARNr 5S adicional. Se identificó un total de 83 genes de ARNt con especificidades para los 20 aminoácidos, y un solo ARNt para selenocisteína.

El genoma de Enterobacter sp. 638 codifica 8 factores Sigma: fliA (Ent638 _ 2509; Sigma 28), tres similares a rpoE Sigma 24 (Ent638 _3060, Ent638 _3117 y Ent638 _3389), rpoS (Ent638 _3212, Sigma 38), rpoD (Ent638 _3473, Sigma 70), rpoN (Ent638 _3638, Sigma 54) y rpoH (Ent638 _3865, Sigma 32).

El Enterobacter sp. 638 codifica una dam metilasa activa involucrada en la metilación de la adenina en los sitios GATC, como se confirmó por digestión MboI y Sau3AI del ADN, la primera enzima es incapaz de digerir el ADN metilado de Enterobacter sp. 638.

En el genoma de Enterobacter sp. 638 se encontraron cien repeticiones palindrómicas (CCCTCTCCCXX(X)GGGAGAGGG) distribuidas de manera no uniforme en el cromosoma (ver Fig. 10). Estas repeticiones que forman bucles en horquilla (con XX(X) que son principalmente TGT/ACA o AC/TG) frecuentemente se ubican por duplicado o triplicado en el extremo 3' de los genes y probablemente juegan un papel en la terminación de la transcripción.

Se encontraron ocho elementos de secuencia de inserción (IS) en el genoma de Enterobacter sp. 638: dos de la familia IS3/IS51 (uno compuesto de tres ORF con un desplazamiento del marco (Ent638 _0739, Ent638 _ 0740, Ent638 _ 0741) y uno compuesto de un solo ORF (Ent638_0060)),.un elemento IS de la familia IS110 (Ent638_1530), y tres elementos IS de la familia IS481 (Ent638_2980, Ent638_3160 y Ent638_3288). Algunos de estos elementos IS delimitan islas genómicas (ver la sección más abajo).

El plásmido pENT638-1 tiene dos elementos IS completos, uno de la familia Tn3 compuesto de un ORF (Ent638 _4224) y uno de la familia IS3/IS407 compuesto de dos ORF (Ent638_ 4320 y Ent638_ 4321), así como dos transposasas truncadas de esta última familia. La IS completa y la transposasa truncada de las familias IS3/S407 flanquean una gran región que codifica genes involucrados en el mantenimiento y la replicación del plásmido (sopAB, repA) y genes involucrados en la transferencia del plásmido por conjugación (tra). Esta región de 75 kb puede considerarse como la cadena principal de pENT638-1.

Cuando se comparó el genoma de Enterobacter sp. 638 con el de las cepas estrechamente relacionadas, se determinó que el genoma de Enterobacter cancerogenus ATCC 35316 es el más cercano con 80.4 % de las CDS en sintenia con Enterobacter sp. 638, después Klebsiella pneumoniae 342 y MGH 78578 (ambas con 74 % de las CDS en sintenia), seguido por Citrobacter koseri ATCC BAA-895 (73 %) y después las especies de Escherichia coli (entre 63 a 73 %)

La adaptación específica de Enterobacter sp. 638 a su planta huésped se analizó a través de la comparación del genoma con otros microbios asociados a plantas y con la bacteria gastrointestinal E. coli K12 (MGI655). Esta cepa, seleccionada como un organismo de referencia debido a que es el genoma bacteriano mejor anotado, compartía (criterio 80 % de identidad en 80 % de la longitud de la proteína) 2938 CDS sinténicas (69.2 % de su genoma) con Enterobactersp. 638. Las regiones sinténicas se agrupan en 304 sintones con un número promedio de 10.5 CDS por sinton.

Se identificaron cincuenta y seis regiones en el genoma de Enterobacter sp. 638, que no estaban en sintenia con los genomas de bacterias estrechamente relacionadas. Entre ellas, dieciocho regiones cumplen los criterios para islas genómicas putativas (destacadas en gris en la tabla 2). Estas islas genómicas contienen genes que codifican proteínas involucradas en el transporte de azúcares (sistema PTS), la adhesión, la utilización de pectato, la captación de hierro a

través de receptores de sideróforos, la reducción de nitrato, la biosíntesis del pilus, así como muchos otros transportadores y reguladores. La región número 47 es un ejemplo ilustrativo de la adquisición de una isla genómica que contiene genes involucrados en la adaptación a un estilo de vida endofítico. Esta región codifica un transportador y proteínas de degradación de pectato putativos, lo que puede permitir que la cepa 638 crezca en pectato (un compuesto importante sintetizado por las plantas) como fuente de carbono. Esta isla genómica está flanqueada por un gen de integrasa y está insertada en un sitio de ARNt-Gli.

Se encontraron ocho fagos y un plásmido putativo integrado en el cromosoma. Un total de 302 proteínas de fagos, que incluyen 18 genes putativos de integrasa, se identificaron.

Además, el cromosoma de Enterobacter sp. 638 contiene una región con repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (CRISPR) ubicada próxima a seis genes (Ent638_1401-1406) que codifican secuencias asociadas a CRISPR (Cas). Las CRISPR son propensas a proporcionar tolerancia adquirida contra bacteriófagos. Seis de los ocho profagos están flanqueados por regiones, que carecen de sintenia con las regiones correspondientes en bacterias estrechamente relacionadas tales como E. coli K12, 0157-H7 y UTI89, Klebsiella pneumoniae MGH 78578 o Citrobacter koseri BAA-895, y que pueden haberse adquirido a través de la transducción de fagos. Estas regiones contienen genes importantes en las interacciones bacteria/planta tales como transportadores de aminoácidos y hierro/sideróforo, hemolisina (HCP), y una proteína y transportador de hemaglutinina (Tabla 2, Fig. 2). Hasta ahora, la movilidad intercelular o extracelular, de las islas genómicas, los fagos y los elementos IS no se demostraron experimentalmente.

Ejemplo 9: Supervivencia en la rizosfera de la planta: visión general de las capacidades metabólicas de Enterobacter sp. 638

Generalmente, el álamo se multiplica por esquejes, y dado que el número de endófitos en los esquejes es muy bajo, muchas especies de bacterias endofíticas deben sobrevivir en el suelo antes de colonizar al álamo. Enterobacter sp. 638 está bien adaptada para sobrevivir en la rizosfera de la planta porque codifica muchos transportadores involucrados en la captación de carbohidratos, aminoácidos y hierro, así como algunos genes de resistencia a metales pesados. La mayoría de las rutas metabólicas que se describen más abajo se confirmaron mediante el cultivo de la cepa 638 en condiciones de crecimiento selectivo (Taghavi y otros, 2009).

Metabolismo de carbohidratos

El genoma de Enterobacter sp. 638 codifica todas las rutas del metabolismo central, que incluyen las rutas del ciclo del ácido tricarboxílico, de Entner-Doudoroff, de EmbdenMeyerhof-Pamas y de las pentosas fosfato. La cepa no es capaz de crecer autotróficamente, pero puede usar una gran variedad de compuestos como fuentes de carbono: D-manitol, lactosa, sacarosa, arbutina, salicina, trehalosa, D-manosa, L-arabinosa, maltosa, celobiosa, xilosa, gluconato y glucosa (Taghavi y otros 2009). ElEnterobacter sp. 638 tiene una lactasa (lacZ, Ent638_0928), una xilosa isomerasa (Ent638_0156) y una xilulocinasa (Ent638_0157). La utilización de lactosa como una única fuente de carbono es una característica de las Enterobacteriaceae. Enterobacter sp. 638 tiene la capacidad genética de crecer en malonato, su genoma contiene un agregado de nueve genes (mdcABCDEFGHR, Ent638 _3779-Ent638 _3772) involucrados en la descarboxilación de malonato que cataliza la conversión de malonato en acetato.

La diversidad de utilización de azúcares podría estar relacionada con la diversidad de glicósido hidrolasas. El genoma de Enterobacter sp. 638 porta los 55 genes que codifican las glicósido hidrolasas putativas, que representan 24 familias diferentes (base de datos de CAZy). En contraste, debe mencionarse que el patógeno Enterobacter sakazakii de humanos tiene 63 glicósido hidrolasas (base de datos de CAZy).

Las bacterias y hongos patógenos de las plantas ganan acceso mediante la degradación activa de los compuestos de la pared celular vegetal mediante el uso de las glicósido hidrolasas que incluyen las celulasas/endoglucanasas (que incluyen los miembros de las familias GH5, GH9, GH44, GH48 y GH74 de la glicósido hidrolasa), liquenasas (GH16) y xilanasas (GH10, GH11). Las hidrolasas no glicosídicas que representan los miembros putativos de las familias de las endo, exo, celulasas y hemicelulasas usadas comúnmente para romper los polímeros de la pared celular vegetal se codificaron en el genoma de Enterobacter sp. 638. Esta observación es consistente con el comportamiento no fitopatogénico de Enterobacter sp. 638. Sin embargo, debe notarse que se encontraron dos endo-I,4-D-gluconasas (GH8) (bcsZ: Ent638_3928, Ent638 _3936) como parte de un locus bacteriano de síntesis de celulosa.

Captación de nutrientes vegetales

Los organismos que viven en asociación simbiótica, como Enterobacter sp. 638 y su álamo huésped, por ejemplo, necesitan compartir recursos, por lo tanto, se espera que el genoma de Enterobacter sp. 638 codifique una gran diversidad de transportadores que le permitirán captar los nutrientes liberados por las plantas. Un total de 631 ORF codificaron las proteínas transportadoras putativas: entre ellas 295 codificaron los transportadores ABC (que incluyen un transportador fosfato), 81 codificaron los transportadores de la superfamilia principal facilitadora (MFS), 41 codificaron los transportadores de la familia del sistema de fosfotransferasas (PTS) y 14 codificaron los transportadores de la familia

de nodulación, resistencia y división celular (RNO) (ver la lista completa de los transportadores putativos y sus sustratos en SOM). Esta observación es consistente con el estilo de vida asociado a plantas de Enterobacter sp. 638, que requiere la captación eficiente de los nutrientes sintetizados en las plantas, que incluyen los liberados en la rizosfera.

El genoma de Enterobacter sp. 638 codifica muchos transportadores PTS. El análisis fitogenético se usó para asignar la especificidad por el sustrato a los transportadores de PTS de Enterobacter sp. 638: 7 pertenecieron a los a-glicósidos (para la captación de glucosa, N-acetilglucosamina, maltosa, glucosamina y α-glicósidos), 7 a los β-glicósidos (para la captación de sacarosa, trehalosa, ácido N-acetilmurámico y β -glicósidos), 2 fueron transportadores PTS de fructosa (para la captación de fructosa, manitol, manosa y 2-O-α-manosil D-glicerato) y 6 fueron transportadores PTS de lactosa (para la captación de lactosa, celobiosa y β-glicósidos aromáticos).

Resistencia a metales pesados

El genoma de Enterobacter sp. 638 porta los genes putativos involucrados en la resistencia al cobre, que incluyen una ATPasa CopA tipo P (Ent638 _ 0962) cuya expresión se regula por CueR (Ent638 _09630), el operón de eflujo de cobre cusABCF (Ent638 _1157-1154), la cobre oxidasa múltiple CueO (Ent638_0671), y un operón que codifica las proteínas putativas de resistencia a cobre CopC y CopO (Ent638 _ 2411-12). De manera interesante, la cepa no creció en medio mínimo de glucosa 284 en presencia de 100 11M CU(N03)2.

El genoma de Enterobacter sp. 638 codifica, además, un agregado de resistencia a arsénico/arsenato que se encontró próximo al origen de replicación del plásmido pENT638-1 (arsHRBC, Ent638_4254-Ent638 _4257), y se encontró que la cepa 638 crece exitosamente en medio mínimo de glucosa 284 en presencia de 200 µM de arsenato (como Na2HAsO4).

La presencia de arsenato y genes putativos de resistencia a cobre no es inesperada, ya que Enterobacter sp. 638 se aisló de álamos cultivados en el área que fue afectada por las emisiones del fundidor ASARCO en Tacoma, WA, un fundidor de cobre que durante las operaciones desde 1905 hasta 1982 se consideró una de las fuentes más grandes de emisión de arsénico en los EE. UU.

Otros genes de resistencia a metales pesados ubicados en el cromosoma incluyen una cromato reductasa putativa (YieF o ChrR, Ent638 _4144) y una ATPasa ZntA de eflujo de tipo P (Ent638 _3873) involucradas en la resistencia a zinc/cadmio/cobalto. La cepa 638 fue capaz de crecer en medio mínimo de glucosa 284 en presencia de 500 µM de ZnSO4, 500 µM de CdCl2, 100 µM de CdCl2, 50 µM de NiCl2. Aunque puede sugerirse que estos genes están presentes, además, en otras especies de E. coli, la presencia de estos puede ser suficiente para proporcionar una ventaja selectiva sobre otras bacterias para sobrevivir en la rizosfera, especialmente cuando están presentes estos metales.

Los metales pesados son, además, cofactores importantes, y el genoma de Enterobactersp. 638 codifica varios genes involucrados en la captación y eflujo de metales pesados. Se encontraron los genes de los transportadores ABC involucrados en la captación de zinc (znuACB, Ent638_2426-2428) y níquel (nikABCDE, Ent638_1834-Ent638_1838). El níquel es un cofactor esencial de la ureasa (Dosanjh y otros 2007), y a diferencia de E. coli KI2 y S. proteamaculans 568, Enterobacter sp. 638 es capaz de convertir urea en amonio (ureABC, Ent638 _3464-Ent638 _3466).

Estrés oxidativo, que contrarresta el mecanismo de defensa de las plantas

Las plantas emplean una variedad de mecanismos de defensa contra infecciones bacterianas, virales y fúngicas, que incluyen la producción de especies reactivas del oxígeno (ROS) (especies radicales de superóxido, radicales hidroperoxilo, peróxido de hidrógeno e hiroxilo), óxido nítrico y fitoalexinas. Antes de la colonización de las raíces, la cepa 638 tiene que sobrevivir en un medio ambiente oxidativo de la rizosfera. El cromosoma de Enterobacter sp. 638 codifica tres superóxido dismutasas: SodA, una superóxido de Mn dismutasa (Ent638 _4063); SodB una superóxido de Fe dismutasa (Ent638_1191); y SodC, una superóxido de Cu/Zn dismutasa (Ent638_1801). Contiene, además, tres catalasas, KatE (Ent638 _1712), KatN (Ent638 _3129) y KatG (Ent638_4032), tres hidroperóxido reductasas, ahpC (Ent638 _ 0872 y Ent638 _1145) y ahpF (Ent638 _1146), dos hidroperóxido reductasas adicionales (una ahpC Ent638 _3391 y Ent638 _ 0498 putativa que tiene un dominio AhpD), una cloroperoxidasa (Ent638 _1149), y dos tiol peroxidasas (Ent638_2151 y Ent638_2976).

Se identificó, además, una proteína de resistencia a peróxido orgánico (ohr, Ent638_0518) ubicada próxima a su sensor/regulador de peróxido orgánico (ohrR, Ent638_0519).

Enterobacter sp. 638 parece capaz de desintoxicar el radical libre de óxido nítrico por la presencia de una flavohemoproteína óxido nítrico dioxigenasa (Ent638_3037) y un operón de reducción de nitrato anaeróbico (norRVW, Ent638_3181-3183). La expresión de los sistemas de respuesta al estrés oxidativo se controla por medio de redes reguladoras complejas. Un regulador clave es el sensor OxyR de peróxido de hidrógeno (Ent638 _4025), que activa la expresión de un regulón de genes inducibles por peróxido de hidrógeno tales como katG, gor (glutatión reductasa, Ent638 _3913), ahpC, ahpF, oxyS (un ARN regulador, Ent638 _ mise_RNA_29), dpsA (una proteína de protección del ADN durante la inanición, Ent638 _1299), fur (un regulador doble transcripcional de unión al ADN de la biosíntesis y transporte de sideróforos, Ent638 _1198) y grxA (glutaredoxina, Ent638 _1364), todos presentes en Enterobacter sp.

638. Tres genes de la glutatión S transferasa (GST) (Ent638 _ 0139, Ent638 _ 0268 y Ent638 _1329), un transportador ABC de glutatión (GsiABCD, Ent638_1323-1326), dos glutatión peroxidasa (Ent638_1732 y Ent638_2699), una gammaglutamato-cisteína ligasa (GshA, Ent638_3168), glutatión sintetasa (GshB, Ent638 _3351) y gammaglutamiltranspeptidasa (GGT, Ent638 _3850) se encontraron en el genoma de Enterobacter sp. 638. Un locus AcrAB

5 (Ent638 _ 0943-0944), que pertenece a la familia RND de transportadores se identificó, además, en el genoma de Enterobacter sp. 638.

Ejemplo 10: Colonización y establecimiento endofítico en la planta huésped

10 La colonización endofítica de un huésped vegetal puede dividirse en un proceso de cuatro etapas (van der Lelie y otros 2009).

Etapa 1: Movimiento hacia las raíces de álamo: motilidad/quimiotaxis

15 El Enterobacter sp. 638 está bien preparada para moverse activamente hacia las raíces vegetales, el sitio preferido de colonización endofítica.Su genoma contiene tres operones de biosíntesis flagelar (flgNMABCDEFGHJJKL, flhEAB fimA yraJJ/pjD cheZYBR tap tar csuEDCAB int cheWA motBA flhCD fliYZA fliCDSTEFGHJKLMNOPQR, Ent638_2445-2541 yfliEFHJJKLMNOPQR).

20 Sin embargo, el operón flh de Enterobacter sp. 638 contiene dos inserciones de genes de biosíntesis de pili. Una de estas regiones (csu) está flanqueada por una integrasa, que apunta a una captación posterior. Enterobacter sp. 638 tiene, además, un gran número de genes de biosíntesis de pilus/fimbrias (al menos 60 genes). En Enterobacter sp. 638, los genes de biosíntesis de pilus/fimbrias se agrupan en 10 regiones diferentes. Los determinantes implicados en la quimiotaxis (che) se descubrieron, además, dentro del agregado de genes de biosíntesis flagelar.

Etapa 2 y 3: Adhesión y colonización de la superficie de las raíces

En Enterobacter sp. 638, se identificaron varios genes que codifican proteínas implicadas en la adhesión putativa a la raíz. Muchos se ubican en islas genómicas o en plásmidos pENT638-1, que apuntan hacia un papel específico de este

30 plásmido durante esta etapa de la colonización de las raíces de las plantas. En particular, pENT638-1 contiene una isla genómica putativa de 23kb (flanqueada por un gen de integrasa, y que tiene un % de GC de 56.2, que es significativamente superior que el resto del plásmido), así como un operón srfABC putativo. La función exacta del operón srfABC permanece confusa, pero se piensa que está involucrado en la colonización del huésped.

35 Muchos otros genes involucrados en la invasión a la planta están presentes en pENT638-1, e incluyen las proteínas putativas con un dominio autotransportador (secreción tipo V) y un dominio de virulencia/adhesión (hemaglutinina (Ent638 _4267), pertactina (Ent638 _4201 y Ent638 _ 4206) y adhesión (Ent638 _4317)) (Fig. 3).

Hemaglutinina: El cromosoma de Enterobacter sp. 638 codifica dos proteínas hemaglutininas putativas (Ent638 _ 0148,

40 Ent638 _3119), y un agregado compuesto de cinco genes que codifican la hemaglutinina filamentosa (Ent638 _00520057).

Además, se encontraron muchos genes en el cromosoma de Enterobacter sp. 638 que codifican proteínas autotransportadoras con un dominio de pectina liasa/pertactina (Ent638 _1775, Ent638_ 0318, Ent638 _0501), o un

45 dominio de adhesión (Ent638 _1867, Ent638 _3408).

Los dos genes yadA de Enterobacter sp. 638 (Ent638 _1867 and Ent638 _ 4317) codifican una proteína con un dominio autotransportador y un dominio de invasina/adhesión. La proteína YadA puede promover la colonización/invasión de la planta, pero podría representar, además, un remanente de un estilo de vida entérico antiguo.

50 El gen de hemaglutinina en pENT638-1 (Ent638_ 4267) está rodeado por dos sistemas ReIBIE toxina/antitoxina. Se hace la hipótesis de que el Ent638 _4267 de hemaglutinina puede jugar un papel importante en la adhesión a las raíces por estabilizarse de esta forma en el pENT638-1. Junto con el gen Ent638_ 4267 de hemaglutinina, se identificaron dos genes (Ent638_ 4265-4266) que codifican una proteína que contiene un dominio de repetición de tetratricopéptido (TPR

55 2), involucrados putativamente en la interacción proteína-proteína y el ensamblaje correcto del aparato de adhesión.

Pili tipo I y IV: Seis proteínas usher putativas se encontraron en el genoma de Enterobacter sp. 638 (Ent638 _0084, Ent638 _ 0403, Ent638 _ 0990, Ent638 _1071, Ent638 _ 2450, y Ent638 _ 2459). Este número es muy superior al número promedio de proteínas usher encontradas en otros géneros de bacterias asociadas con las plantas.

60 En el cromosoma de Enterobacter sp. 638, se identificaron 56 genes involucrados en la biosíntesis de pili/curli/fimbrias, que incluyen 6 agregados de los genes de biosíntesis de pili tipo I (Ent638_0074-0086, Ent638_0401-0409, Ent638_0987-0994, Ent638_1068-IOn, Ent638_2448-245I, Ent638_2458-2462). Los últimos dos agregados están flanqueados y separados por genes involucrados en la quimiotaxis y motilidad (biosíntesis flagelar) (ver sección de

65 motilidad), y están involucrados posiblemente en la formación de una película biológica sobre las superficies abióticas.

Esta región (Ent638 _ 2445-2541) representa un buen ejemplo de genes de agregación involucrados en diferentes aspectos de la colonización de las raíces de las plantas (quimiotaxis, motilidad, y adhesión).

Pili tipo IV. En el genoma de Enterobacter sp. 638, se identificaron dos agregados de genes de la biosíntesis de pili tipo 5 IV, (Ent638 _ 0650-0652, y Ent638_3266-3268), así como un agregado de genes putativos de la biosíntesis de pilus sin caracterizar (Ent638_3804 and Ent638 _3808) que están implicados posiblemente en la captación del ADN.

Fibras Curli. Estructuralmente y bioquímicamente, curli pertenece a una clase de crecimiento de las fibras conocidas como amiloides. En el genoma de Enterobacter sp. 638, se identificó un agregado para la biosíntesis de curli (Ent638

10 _1553-1559).

Biosíntesis de celulosa

Consistente con este comportamiento no patogénico el genoma de Enterobacter sp. 638 no codifica proteínas

15 involucradas en la degradación de celulosa. Sin embargo, se identificó un operón responsable de la biosíntesis de celulosa (Ent638 _3927-3940).

Virulencia

20 Estudios microscópicos mostraron que Enterobacter sp. 638 coloniza el xilema de las raíces entre el lumen de las lenticelas; no se observó colonización intracelular (Taghavi y otros 2009).

Aunque nunca se encontró que el Enterobacter sp. 638 actúa como un patógeno oportunista en los estudios de colonización vegetal, su genoma codifica varias proteínas involucradas putativamente en la virulencia. Debe notarse que

25 la virulencia puede requerir, además, la interacción cercana entre la bacteria y su huésped, similar a la que puede requerirse para la colonización endofítica. Un gen (yqfA, Ent638_33 I 7) que codifica para una hemolisina de membrana interna (familia III), una CDS parcial (Ent638_025I) que contiene un dominio putativo de hemolisina, y tres genes hcp que codifican para los factores de virulencia (Ent638 _ 0829, Ent638 _ 2912 y Ent638 _3004 se identificaron.

30 Otros factores putativos de virulencia incluyen pagC (Ent638 _3136) y msgA (Ent638 _1656), los que se requieren para la virulencia y la supervivencia dentro de macrófagos, y los genes virK putativos; (Ent638 _1394 y Ent638 _ 2409), cuyo producto se requiere para la expresión y la ubicación correcta en la membrana de VirG (Ent638 _3560) sobre la superficie celular bacteriana.

35 Sin embargo, no se identificaron los genes que codifican un sistema de secreción de tipo III, que es un prerrequisito para un estilo de vida virulento activo típico de patógenos tales como Erwinia y P. syringae, en el genoma de Enterobacter sp. 638.

Finalmente, similar al plásmido pENT638-1, se encontró un operón sifABC (Ent638_2108-Ent638 _ 2110) en los 40 cromosomas de Enterobacter sp. 638. La función de estos genes en el comportamiento endofítico permanece confuso.

Etapa 4: Invasión de la raíz y establecimiento en planta por medio de la colonización activa

El Enterobacter sp. 638 puede entrar en las raíces de las plantas en sitios de tejidos dañados debido a que su

45 secuencia genómica no codifica endo/exo-celulasas o hemicelulasas que permitirían la colonización endofítica por medio de la ruptura activa de las paredes de las células vegetales.

Degradación de Pectinlpectato

50 Aunque Enterobacter sp. 638 no es capaz de crecer en pectina (poli(1,4-alfa-D-galacturonato) como una única fuente de carbono, su genoma contiene una isla genómica que codifica los genes involucrados en la degradación de pectato, la cadena principal desmetilada de pectina y un constituyente de la pared celular vegetal. La capacidad de Enterobacter sp. 638 para degradar pectato podría jugar un papel en la colonización de la región interespacial entre las células vegetales.

55 Una pectato liasa secretada, PelB, involucrada en el clivaje de pectato en los oligosacáridos con grupos 4-desoxi-alfa-Dgalact-4-enuronosil en sus extremos no reductores se encontró próxima a una porina específica de oligogalacturonato, KdgM, implicada en la captación de oligogalacturónidos en el periplasma. Una pectinasa periplásmica, PelX, codificada por una región diferente del genoma, está involucrada en la degradación periplásmica del oligogalacturónido.

60 En otra región, se identificaron un transportador ABC de captación de carbohidratos, TogMNAB, implicado en la translocación del oligogalacturónido entre la membrana interna y varias proteínas adicionales, Ogl, KduI y KduD, involucradas en la degradación de oligogalacturónido en 2-dehidro-3-desoxi-D-gluconato. KdgK y KdgA, involucradas en el metabolismo de D-glucuronato, degradan, además, 2-deshidro-3-desoxi-D-gluconato en piruvato y 3

65 fosfogliceraldehído, compuestos del metabolismo celular general. Esta región, que está flanqueada por una transposasa

de la familia IS481, podría haberse adquirido por medio de la transferencia génica horizontal. Las proteínas UxaA, UxaB, y UxaC, necesarias para la ruta alternativa para degradar galacturonato en 2-deshidro-3-desoxi-D-gluconato, se codifican, además, por el cromosoma de Enterobacter sp. 638. La degradación de pectato tiene que regularse bien para evitar un efecto patogénico.

El plásmido pENT638-1 porta dos genes vecinos (Ent638 _420 I, Ent638 _4206) que codifican proteínas autotransportadoras con un dominio pectina liasa. Estas proteínas pueden estar involucradas en la adhesión de Enterobacter sp. 638 a las raíces de álamo o como parte de un mecanismo de colonización que involucra la exportación de enzimas capaces de lisar las paredes celulares de las células de las raíces. Entre estos dos genes, se identificaron dos componentes reguladores transcripcionales, lo que sugiere una regulación fina, así como dos genes adicionales involucrados en la biosíntesis de polisacáridos capsulares (Ent638 _4207) y que codifican para una glicosiltransferasa (Ent638_ 4208). Se ha hecho la hipótesis de que los lipopolisacáridos de la superficie celular (LPS) están involucrados en la especificidad del huésped, y la proximidad de estos genes sugiere un papel colaborativo en la invasión a la planta por Enterobacter sp. 638.

La celobiosa fosforilasa del plásmido pENT638-1

(00134) En el plásmido pENT638-1, el gen ndvB (8532 pb) ubicado próximo al origen de replicación de los plásmidos codifica una proteína involucrada en la producción de f3-(1→2)-glucano. La proteína NdvB unida a membrana cataliza tres actividades enzimáticas: la iniciación (glicosilación proteica), elongación, y ciclización in situ de f3-(1→2)-glucano, que se libera después en el periplasma.

Ejemplo 11: Interacciones sinérgicas con la planta huésped: promoción del crecimiento y salud vegetal

Crecimiento indirecto de las plantas que promueve los efectos de fijación y metabolismo de nitrógeno

Enterobacter sp. 638 es incapaz de fijar nitrógeno y carece de los genes nif requeridos. Sin embargo, contiene los genes requeridos para las rutas asimilatorias y no asimilatorias de reducción de nitrato. Los genes de transporte de nitrato y de reducción de nitrato/nitrito están presentes dentro de dos operones (narIJHGKXL y nasAB ntrCBA nasR, Ent638_2312Ent638_2326) separados por una integrasa y un gen putativo de adhesión/invasión. Otras regiones involucradas en el transporte y reducción de nitrito (nirBDC, Ent638 _3793-3795), transporte y reducción de nitrato (narUZYWV, Ent638_2061-Ent638 _ 2065), y un transportador de captación de amonio (amtB, Ent638_0919) y su regulador (Ent638_0918), así como la proteína sensor de nitrato/nitrito (narQ, Ent638_2964) se encontraron, además, en su cromosoma.

Sideróforos

El Enterobacter sp. 638 desarrolló una solución intermedia para hacer frente a la captación de hierro. Su genoma contiene dos sistemas ferrosos de captación de hierro (FeoAB, EfeUOB) y nueve transportadores ABC de hierro.

El Enterobacter sp. 638 es capaz de sintetizar la enterobactina de los sideróforos (EntD, EntF, EntC, EntE, EntB y EntA), secretarla (EntS), recuperar el complejo hierro-enterobactina mediante el uso de un sistema férrico de captación de sideróforos (ExbDB), y extraer el hierro mediante el uso de una enterobactina esterasa (Fes) después de la internalización del complejo hierro-enterobactina. Los genes involucrados en la biosíntesis de enterobactina se agrupan junto con los genes que codifican dos transportadores ABC involucrados en la captación de hierro (sitABCD y fepCGDB) en un gran agregado de 17 genes (Ent638 _1111-1128). Además, Enterobacter sp. 638 tiene 12 receptores férricos de membrana interna y de sideróforos relacionados con hierro (dependientes de TonB), que es casi el doble del número encontrado en E. coli KI2 (que solo tiene 7 receptores de sideróforos). Esta observación es consistente para una bacteria que necesita competir por hierro. La presencia de un sistema eficiente de captación de hierro contribuye a proteger la planta huésped contra la infección fúngica.

Compuestos Antimicrobianos

El Enterobacter sp. 638 mostró que produce constitutivamente feniletilalcohol. Esta molécula, que se usa comúnmente en perfumería, da al Enterobacter sp. 638 un olor floral agradable, pero más interesantemente tiene propiedades antimicrobianas. Dos genes candidatos (Ent638 _1306 y Ent638_1876) codifican una enzima involucrada putativamente en la conversión de fenilacetaldehido en feniletilalcohol. Estos dos genes se ubican en regiones que no son sinténicas con otras cepas estrechamente relacionadas.

El 4-hidroxibenzoato es un precursor de la ubiquinona importante portadora de electrones, pero se conoce, además, que tiene actividad antimicrobiana. El Enterobactersp. 638 tiene el gen ubiC (Ent638 _ 0243) que codifica la proteína putativa capaz de realizar esta reacción.

El genoma del Enterobacter sp. 638 codifica una cloranfenicol acetil transferasa (cat, Ent638_1533) involucrada en la

resistencia a cloranfenicol y que puede ayudar a las bacterias a sobrevivir contra los compuestos antimicrobianos producidos por otros organismos endofíticos o rizosféricos.

Ejemplo 12: Promoción directa del crecimiento de las plantas por Enterobacter sp. 638

1-aminociclopropano-1-carboxilato desaminasa

La 1-aminociclopropano-1-carboxilato (ACC) desaminasa (acd), (EC: 3.5.99.7) está ausente del genoma de Enterobacter 638, lo que confirma los estudios previos de que la cepa es incapaz de metabolizar ACC (Taghavi y otros

10 2009). Sin embargo, se encontró la aminoácido desaminasa, pero todas carecen de los aminoácidos particulares E 296 y L 323 (reemplazados respectivamente por una T o S y una T) que acerca el átomo de nitrógeno de piridina de PLP en el sitio activo.

Producción de las hormonas acetoína, 2,3-butanodiol promotoras de crecimiento de las raíces

15 El genoma de Enterobacter sp. 638 porta el gen poxB (Ent638 _1387) que codifica una piruvato deshidrogenasa. Mientras la función principal de PoxB es convertir piruvato en acetaldehído, una fracción pequeña del piruvato se convierte a acetoína, como un subproducto de la reacción intermedia hidroxietilo-tiamina difosfato.

20 El genoma de Enterobacter sp. 638 codifica una acetolactato sintasa (budB, Ent638_2027) involucrada en la conversión de piruvato a acetolactato. La acetoína descarboxilasa (budA, Ent638_2026) cataliza la conversión de acetolactato en acetoína. La acetoína puede ser liberada por las bacterias o convertirse posteriormente en 2,3-butanodiol por la acetoína reductasa (budC, Ent638 _ 2028) ya sea por Enterobacter sp. 638 o por el álamo. Bajo condiciones aeróbicas, el acetolactato se convierte espontáneamente en diacetilo, que a su vez puede convertirse en acetoína por la proteína

25 acetoína deshidrogenasa (Ent638_2737).

La biosíntesis de compuestos volátiles por Enterobacter sp. 638 y su inducción mediante la adición de extractos de hoja de álamo se investigó a través de espectrometría de masa. La producción de 2,3-butandiol y acetoína se vio en muestras que contienen Enterobacter sp. 638 y extracto de hojas de álamo y comienza 12 horas después de la

30 inducción (Fig. 8). Debe notarse que podría no confirmarse la síntesis de diacetilo, pero es similar a lo que ocurre en base a la presencia de las rutas metabólicas completas para los tres compuestos. Los picos adicionales se vieron en las muestras experimentales y los controles (6:42, 9:45, y 14:01) y la identificación de estos compuestos se realiza actualmente.

35 El genoma de Enterobacter sp. 638 carece de los genes (acoABCX adh) involucrados en la conversión catabólica de acetoína y 2,3-butanodiol a metabolitos centrales. Por lo tanto no existe efecto antagonista entre la producción y la degradación de estas hormonas de crecimiento vegetal por Enterobacter sp. 638.

Producción de la hormona IAA de crecimiento vegetal

40 La producción de ácido indol acético (IAA) por Enterobacter sp. 638 se demostró experimentalmente (Taghavi y otros 2009). La biosíntesis de IAA es posiblemente a través de la producción de indolpiruvato como una molécula intermedia por la ruta VII de degradación de triptófano (aminoácido aromático aminotransferasa, Ent638_1447). La indolpiruvato descarboxilasa IpdC (Ent638 _ 2923) y las indol-3-acetaldehído deshidrogenasas putativas (Ent638_0143) catalizan,

45 además, la síntesis de IAA.

Tabla 1

Enterobacter sp. 638

rasgos

Cromosoma Plásmido

tamaño (pb)

4, 518, 712 157, 749

contenido G+C

52.98 50.57

números ORF

4406 152

Función asignada (e incluye la putativa)

3457 108

Biosíntesis de aminoácido

174 2

Familia de aminoácidos aromáticos

28 0

Familia del aspartato

44 0

Familia del glutamato

47 1

Familia del piruvato

35 1

Familia de la serina

21 0

Familia de la histidina

11 0

Porcentaje de proteínas transportadoras

14% 2%

Familia ABC

293 2

Familia MFS

79 2

Familia PTS

41 0

Familia RND

14 0

Aminoácido, péptidos y aminas

118 0

Aniones

20 0

Carbohidratos, alcoholes orgánicos, y ácidos

106 1

Cationes y compuestos que portan hierro

109 1

Nucleósidos, purinas y pirimidinas

9 0

Porinas

18 0

Sustratos o fármacos desconocidos

2 0

Metabolismo de ADN

152 4

Transcripción

281 4

Síntesis de proteína

177 0

Destino de las proteínas

188 1

Funciones reguladoras

515 6

sistema de dos componentes

65 3

Envoltura celular

279 3

Procesos Celulares

457 6

Procesos biológicos

276 0

RHS

2 0

Funciones de los plásmidos

7 42

plásmido putativo integrado

1 0

pareja de toxina/antitoxina

3 7

funciones de Prge

302 0

Regiones Fago

8

Tabla 2. Cont.

TABLA S1 (INICIADORES)

Locus

Gen Secuencia. Tm

Ent638 2025

budRf TATTCCCGCAGGAGATTGCT 58

Ent638 2025

budRr AAGCTGTGACGACTGCAACATATT 59

Ent638 2026

budAf GGCGAAATGATTGCCTTCAG 59

Ent638 2026

budAr CCAGGTCATTACTGCGAAAGGT 59

Ent638 2027

budBf ACAGCCCCGTTGAATACGAA 59

Ent638 2027

budBr GGGCACATAGTTGCGTTCTTC 58

Ent638 2028

budCf TTTGCGGCAGTGGAGAAAG 59

Ent638 2028

budCr TGGCGTGATCGACTCAATTG 59

Ent638 4249

repAf TAGCAAGAAAACAGGCGACAAGT 59

Ent638 4249

repAr GCAGTCGCTCATCAGCTTGA 59

Ent638 R0104

16Sf AGTGATTGACGTTACTCGCAGAAG 59

Ent638 R0104

16Sr TTTACGCCCAGTAATTCCGATT 59

TABLA S4 Microarreglos

SEQ_ID_s

Cambio en veces (Rico/Pobre) valor p (FDR) Estadística T Función COGclas sID Descripción de Clase

Ent638_0190

2.127 0.0263 10.447 factor EF-Tu de elongación de la cadena proteica (duplicado de tufA) j Traducción, estructura ribosomal y biogénesis

Ent638_0194

2.453 0.0257 11.518 proteína L1 de la subunidad ribosomal 50S j Traducción, estructura ribosomal y biogénesis

Ent638_0195

3.1 0.0837 3.807 proteína L10 de la subunidad ribosomal 50S j Traducción, estructura ribosomal y biogénesis

Ent638_0197

2.372 0.0269 10.192 ARN polimerasa, subunidad beta K Transcripción

Ent638_0200

2.687 0.0242 13.404 Sistema fosfotransferasa, subunidad IIB específica de lactosa/celobiosa G Transporte y metabolismo de carbohidratos

Ent638_0213

3.284 0.133 2.85 HU, regulador transcripcional de unión al ADN, subunidad alfa T Mecanismos de transducción de señales

Ent638_0238

2.351 0.0202 17.811 subunidad transportadora de maltosa; componente de unión periplásmica de la superfamilia de proteínas ABC G Transporte y metabolismo de carbohidratos

Ent638_0241

6.748 0.00954 58.758 porina de maltosa de membrana exterior (maltoporina) G Transporte y metabolismo de carbohidratos

Ent638_0285

2.719 0.0369 7.441 Fructosa-bisfosfato aldolasa 1 G Transporte y metabolismo de carbohidratos

Ent638_0286

2.061 0.0767 4.042 Sistema putativo de transporte de azúcares de tipo ABC, componente auxiliar R Sólo la predicción de la función general

Ent638_0287

4.625 0.0166 22.815 Proteína de unión a la ribosa periplásmica del sistema de transporte ABC G Transporte y metabolismo de carbohidratos

Ent638_0326

8.129 0.018 35.517 aspartato amonio liasa C; E Producción y conversión de energía; transporte y metabolismo de aminoácidos

Ent638_0449

3.34 0.066 4.515 Precursor portador anaeróbico putativo de C4-dicarboxilato R Sólo la predicción de la función general

Ent638_0450

3.464 0.0439 6.095 Ornitina carbamoiltransferasa 1 (OTCasa 1) F Transporte y metabolismo de nucleótidos

Ent638_0451

4.851 0.0779 4.01 Carbamato cinasa E Transporte y metabolismo de aminoácidos

Ent638_0452

4.792 0.0298 9.144 Arginina deiminasa (ADI) (Arginina dihidrolasa) (AD) E Transporte y metabolismo de aminoácidos

Ent638_0641

2.63 0.0294 9.327 proteína de la división celular similar a la tubulina de unión a GTP D Control del ciclo celular, división celular, división de cromosomas

Ent638_0660

3.804 0.0179 29.044 piruvato deshidrogenasa, componente descarboxilasa E1, unión a tiamina C; G Producción y conversión de energía; transporte y metabolismo de carbohidratos

Ent638_0662

4.208 0.000915 219.599 lipoamida deshidrogenasa, el componente E3 es parte de tres complejos de enzimas C Producción y conversión de energía

Ent638_0665

3.576 0.0247 13.073 aconitato hidratasa 2 y 2metilisocitrato deshidratasa bifuncionales C;E Producción y conversión de energía; transporte y metabolismo de aminoácidos

Ent638_0685

2.019 0.0799 3.932 regulador transcripcional de unión al ADN de la transcripción del ARNr, proteína supresora de DnaK T Mecanismos de transducción de señales

Ent638_0716

2.254 0.0262 10.425 chaperona periplásmica M Biogénesis de la pared celular/membrana/ envoltura

Ent638_0896

2.304 0.0289 9.511 subunidad IV de la citocromo o ubiquinol oxidasa C Producción y conversión de energía

Ent638_0897

3.49 0.0506 5.52 subunidad III de la citocromo o ubiquinol oxidasa C Producción y conversión de energía

Ent638_0898

2.487 0.103 3.372 subunidad I de la citocromo o ubiquinol oxidasa C Producción y conversión de energía

Ent638_0899

3.03 0.0151 27.174 subunidad II de la citocromo o ubiquinol oxidasa C Producción y conversión de energía

Ent638_0903

2.094 0.00815 50.908 peptidil-prolil cis/trans isomerasa (factor disparador) O Modificación postraduccional, recambio de proteínas, chaperonas

Ent638_0987

2.028 0.024 12.433 Proteína fimbrial de Tipo-1, precursor de la cadena A (pilina de Tipo-1A) N; U Motilidad celular; tráfico intracelular, secreción, y transporte vesicular

Ent638_1050

-2.041 0.0481 -5.699 proteína hipotética de función desconocida S Función desconocida

Ent638_1053

-2.279 0.0484 -5.665 Enzima lipolítica, precursor de la familia G-D-S-L R Sólo la predicción de la función general

Ent638_1182

3.201 0.0161 24.254 subunidad transportadora de glutamato y aspartato; componente de unión periplásmico de la superfamilia de proteínas ABC E; T Transporte y metabolismo de aminoácidos;mecanismos de transducción de señales

Ent638_1204

2.631 0.0184 20.459 simportador putrescina/proton: antiportador putrescina/ornitina E Transporte y metabolismo de aminoácidos

Ent638_1205

4.027 0.0258 10.764 isozima ornitina descarboxilasa, inducible E Transporte y metabolismo de aminoácidos

Ent638_1221

2.03 0.0244 12.635 citrato sintasa C Producción y conversión de energía

Ent638_1224

2.59 0.024 12.596 succinato deshidrogenasa, subunidad de flavoproteína C Producción y conversión de energía

Ent638_1226

5.448 0.0244 13.456 2-oxoglutarato descarboxilasa, que requiere tiamina C Producción y conversión de energía

Ent638_1227

4.206 0.0309 8.724 dihidrolipoiltranssuccinasa C; I Producción y conversión de energía;Transporte y metabolismo de lípidos

Ent638_1228

2.918 0.0417 6.508 succinil-CoA sintetasa, subunidad beta C Producción y conversión de energía

Ent638_1229

4.423 0.0171 23.421 succinil-CoA sintetasa, de unión a NAD(P), subunidad alfa C Producción y conversión de energía

Ent638_1231

2.735 0.0329 8.087 citocromo d terminal oxidasa, subunidad II C Producción y conversión de energía

Ent638_1263

3.27 0.116 3.114 Urocanato hidratasa (Urocanasa) (Imidazolonapropionato hidrolasa) C Producción y conversión de energía

Ent638_1298

2.106 0.0633 4.648 subunidad transportadora de glutamina; componente de unión periplásmica de la superfamilia de proteínas ABC E; T Transporte y metabolismo de aminoácidos; mecanismos de transducción de señales

Ent638_1338

-3.102 0.0533 -5.307 Fucosa 4-O-acetilasa putativa y acetiltransferasas relacionadas G Transporte y metabolismo de carbohidratos

Ent638_1341

-2.111 0.0583 -4.928 proteína hipotética conservada exportada de fago de función desconocida D; L; N; T Control del ciclo celular, división celular, división de cromosomas;Replicación, recombinación y reparación;Motilidad celular;Mecanismos de transducción de señales

Ent638_1430

2.324 0.0436 6.138 Proteína S1 de la subunidad ribosomal 3OS j Traducción, estructura ribosomal y biogénesis

Ent638_1469

2.039 0.0254 11.293 proteína A de membrana externa (3a;II*;G;d) M Biogénesis de la pared celular/membrana/envoltura

Ent638_1490

3.067 0.15 2.63 Oxidoreductasa putativa, familia deshidrogenasa/reductasa de cadena corta R Sólo la predicción general de la función

Ent638_1499

-2.164 0.0429 -6.238 Glicosiltransferasa G Transporte y metabolismo de carbohidratos

Ent638_1514

3.223 0.0191 19.678 glucosa-1-fosfato/inositol fosfatasa G Transporte y metabolismo de carbohidratos

Ent638_1526

-2.828 0.0203 -18.472 Proteína transportadora putativa (fragmento) u Tráfico intracelular, secreción y transporte vesicular

Ent638_1587

3.209 0.0163 22.337 componente flagelar o porción proximal celular del bastoncillo corporal basal N Motilidad celular

Ent638_1588

5.216 0.0263 10.4 componente flagelar o porción proximal celular de varilla de cuerpo basal N Motilidad celular

Ent638_1589

3.559 0.0167 24.377 proteína de ensamblaje del gancho flagelar N Motilidad celular

Ent638_1590

3.744 0.0255 11.515 proteína de gancho flagelar N Motilidad celular

Ent638_1591

2.479 0.0333 7.975 componente flagelar de porción proximal celular del bastoncillo corporal basal N Motilidad celular

Ent638_1596

2.019 0.149 2.64 proteína 1 de unión de gancho con filamento flagelar N; T Motilidad celular;Mecanismos de transducción de señales

Ent638_1597

2.902 0.0555 5.128 proteína de unión de gancho con filamento flagelar N Motilidad celular

Ent638_1656

-2.303 0.0245 -12.219 Proteína msgA de virulencia R Sólo la predicción general de la función

Ent638_1657

-2.183 0.0554 -5.161 Transductor sensorial de quimiotaxis aceptor de metilo N;T Motilidad celular;Mecanismos de transducción de señales

Ent638_1724

2.288 0.0974 3.474 treonil-ARNt sintetasa j Traducción, estructura ribosomal y biogénesis

Ent638_1725

2.256 0.111 3.214 Factor 3 de iniciación de la traducción bacteriana (BIF-3) j Traducción, estructura ribosomal y biogénesis

Ent638_1750

2.083 0.0467 5.875 Formato deshidrogenasa, inducible por nitrato, subunidad principal C Producción y conversión de energía

Ent638_1755

-2.084 0.0612 -4.785 Proteína hipotética de función desconocida S Función desconocida

Ent638_1773

-2.188 0.0251 -10.953 subunidad transportadora de DL-metionina; componente de unión periplásmica de la superfamilia de proteínas ABC P Transporte y metabolismo de iones inorgánicos

Ent638_1804

-2.004 0.0317 -8.356 proteína conservada de función desconocida S Función desconocida

End638_1841

-2.107 0.0415 -6.448 integrasa Rac putativa lambdoid de profago (fragmento) L Replicación, recombinación y reparación.

Ent638_1856

-2.048 0.0317 -8.405 fragmento de regulador transcripcional de unión al ADN (parte 2) T Mecanismos de transducción de señales

Ent638_1903

-2.118 0.0224 -15.399 Proteína hipotética de función desconocida S Función desconocida

Ent638_1915

-2.007 0.0294 -9.325 Precursor proteico de choque ácido R Sólo la predicción general de la función

Ent638_1941

-2.307 0.025 -13.516 Proteína exportada hipotética de función desconocida S Función desconocida

Ent638_2031

-2.058 0.0382 -7.016 Disulfuro isomerasa/tiol-disulfuro oxidasa periplásmica O Modificación postraduccional, recambio de proteínas, chaperonas

Ent638_2051

-2.094 0.0432 -6.201 Polifosfato cinasa putativa F Transporte y metabolismo de nucleótidos

Ent638_2057

2.542 0.0477 5.757 Proteína porina de la membrana externa M Biogénesis de la pared celular/membrana/ envoltura

Ent638_2166

-2.293 0.0395 -6.835 proteína de choque de fago de la membrana interna periférica R Sólo la predicción general de la función

Ent638_2210

-2.647 0.0248 -11.137 fragmento de proteína conservada de función desconocida (parte 2) S Función desconocida

Ent638_2218

-2.072 0.0248 -11.07 Proteína de fago - -

Ent638_2221

-2.12 0.0237 -14.041 Lipoproteína putativa de fago - -

Ent638_2243

-2.466 0.0268 -10.246 proteína conservada de función desconocida S Función desconocida

Ent638_2246

-2.359 0.0353 -7.673 Proteína hipotética de función desconocida S Función desconocida

Ent638_2250

-2.339 0.0879 -3.692 Proteína de dominio metilasa N-4/N-6 de ADN de fago L Replicación, recombinación y reparación

Ent638_2256

-3.509 0.0169 -23.668 proteína I inducible por el daño al ADN de fago - -

Ent638_2269

-2.086 0.0247 -13.482 Lambda integrasa de profago (Int(Lambda)) (Profago e14 integrasa) L Replicación, recombinación y reparación

Ent638_2281

-2.145 0.024 -12.802 Alcohol deshidrogenasa, proteína de dominio de unión a zinc C Producción y conversión de energía

Ent638_2282

-2.245 0.0189 -19.648 proteína conservada de membrana de función desconocida S Función desconocida

Ent638_2302

3.151 0.0753 4.113 subunidad transportadora de oligopéptidos; componente de unión periplásmica de la superfamilia de proteínas ABC E Transporte y metabolismo de aminoácidos

Ent638_2303

-2.254 0.0545 -5.217 proteína conservada de membrana de función desconocida S Función desconocida

Ent638_2306

-2.221 0.0312 -8.509 regulador H-NS doble transcripcional de unión al ácido nucleico general R Sólo la predicción general de la función

Ent638_2313

3.051 0.199 2.167 subunidad de la chaperona de ensamblaje de molibdeno con cofactor (subunidad delta) de la nitrato reductasa 1 O Modificación postraduccional, recambio de proteínas, chaperonas

Ent638_2314

6.367 0.0415 6.486 nitrato reductasa 1, subunidad beta (Fe-S) C Producción y conversión de energía

Ent638_2315

7.849 0.0258 11.405 nitrato reductasa 1, subunidad alfa C Producción y conversión de energía

Ent638_2387

2.074 0.0294 9.374 componente de PTS de la enzima IIC específica de manosa G Transporte y metabolismo de carbohidratos

Ent638_2465

2.693 0.0548 5.199 proteína de la quimiotaxis de unión a purina N; T Motilidad celular;Mecanismos de transducción de señales

Ent638_2466

3.068 0.13 2.89 histidina cinasa sensorial quimiotáctica fusionada en el sistema regulador de dos componentes con CheB y CheY T Mecanismos de transducción de señales

Ent638_2497

-2.021 0.0643 -4.597 proteína cspB similar al shock frío (CSP-B) K Transcripción

Ent638_2502

-2.125 0.0174 -28.928 proteína conservada de función desconocida S Función desconocida

Ent638_2508

2.655 0.0579 4.969 regulador putativo de la actividad FliA T Mecanismos de transducción de señales

Ent638_2509

2.86 0.13 2.882 ARN polimerasa, factor sigma 28 (sigma F) j Traducción, estructura ribosomal y biogénesis

Ent638_2522

6.843 0.0198 18.732 Proteína estructural flagelar de filamentos (flagelina) N; T Motilidad celular; Mecanismos de transducción de señales

Ent638_2523

5.717 0.0572 5.012 Proteína flagelar de cubierta de filamentos N Motilidad celular

Ent638_2524

3.188 0.0406 6.71 la proteína flagelar potencia la polimerización N; O; U Motilidad celular; Modificación postraduccional, recambio de proteínas, chaperonas; Tráfico intracelular, secreción, y transporte vesicular

Ent638_2533

2.468 0.0388 6.904 proteína flagelar N; O; U Motilidad celular; Modificación postraduccional, recambio de proteínas, chaperonas;tráfico intracelular, secreción, y transporte vesicular

Ent638_2534

2.802 0.0365 7.502 Proteína de control de la longitud del gancho flagelar C; N Producción y conversión de energía;Motilidad celular

Ent638_2542

-3.17 0.0476 -5.778 Activador transcripcional de unión al ADN, corregulador con RcsB K; T Transcripción; Mecanismos de transducción de señales

Ent638_2543

-2.171 0.0152 -27.401 proteína conservada de función desconocida S Función desconocida

Ent638_2579

-2.28 0.0234 -14.287 Colicina putativa N; T; U Motilidad celular; Mecanismos de transducción de señales; Tráfico intracelular, secreción, y transporte vesicular

Ent638_2610

-2.258 0.0263 -10.572 proteína putativa S de lisis; profago Qin - -

Ent638_2626

-2.122 0.068 -4.409 Proteína de la familia de las integrasa de fago L Replicación, recombinación y reparación

Ent638_2651

-2.429 0.0329 -8.064 dTDP-4-deoxiramnosa-3,5-epimerasa M Biogénesis de la pared celular/membrana/ envoltura

Ent638_2750

4.192 0.0223 16.152 subunidad transportadora de metil-galactósido; componente de unión periplásmica de la superfamilia de proteínas ABC G Transporte y metabolismo de carbohidratos

Ent638_2795

2.662 0.031 8.549 proteína C de porina de membrana externa M Biogénesis de la pared celular; membrana; envoltura

Ent638_2828

2.486 0.0284 9.737 NADH:ubiquinona oxidoreductasa, cadena F C Producción y conversión de energía

Ent638_2837

2.01 0.0286 9.639 fosfatasa putativa R Sólo la predicción general de la función

Ent638_2904

-2.736 0.0284 -9.812 Regulador transcripcional de fago, AlpA K Transcripción

Ent638_2958

3.828 0.0373 7.411 oxidoreductasa putativa de la enzima málica fusionada; fosfotransacetilasa C Producción y conversión de energía

Ent638_3059

4.692 0.0372 7.409 factor anti sigma T Mecanismos de transducción de señales

Ent638_3076

2.493 0.0411 6.566 proteína de shock frío asociada con la subunidad ribosomal 30S j Traducción, estructura ribosomal y biogénesis

Ent638_3088

3.12 0.0387 6.942 ARNt (guanina-1-)-metiltransferasa j Traducción, estructura ribosomal y biogénesis

Ent638_3112

-2.019 0.0814 -3.876 proteína conservada de función desconocida S Función desconocida

Ent638_3127

-2.428 0.0452 -5.987 proteína conservada de función desconocida S Función desconocida

Ent638_3133

-2.01 0.08 -3.929 proteína conservada de función desconocida S Función desconocida

Ent638_3249

2.827 0.043 6.214 transportador putativo de serina E Transporte y metabolismo de aminoácidos

Ent638_3322

2.185 0.0171 24.827 glicina descarboxilasa, dependiente de PLP, subunidad (proteína P) del complejo de clivaje de glicina E Transporte y metabolismo de aminoácidos

Ent638_3323

2.857 0.101 3.402 lipoilproteína del complejo de clivaje de glicina E Transporte y metabolismo de aminoácidos

Ent638_3324

2.681 0.0931 3.563 aminometiltransferasa, dependiente de tetrahidrofolato, subunidad (proteína T) del complejo de clivaje de glicina E Transporte y metabolismo de aminoácidos

Ent638_3338

3.036 0.0172 25.473 fructosa-bisfosfato aldolasa, clase II G Transporte y metabolismo de carbohidratos

Ent638_3339

3.055 0.0251 11.974 fosfoglicerato cinasa G Transporte y metabolismo de carbohidratos

Ent638_3532

2.017 0.0435 6.165 aldolasa putativa G Transporte y metabolismo de carbohidratos

Ent638_3561

2.706 0.0174 32.635 piruvato formato-liasa 4/2-cetobutirato formato-liasa C Producción y conversión de energía

Ent638_3562

2.214 0.0429 6.316 propionato cinasa/acetato cinasa C, anaeróbico C Producción y conversión de energía

Ent638_3563

4.426 0.00332 113.406 transportador de L-treonina/L-serina E Transporte y metabolismo de aminoácidos

Ent638_3564

2.11 0.0248 11.174 treonina deshidratasa catabólica, dependiente de PLP E Transporte y metabolismo de aminoácidos

Ent638_3666

2.499 0.0331 8.017 proteína L13 de la subunidad ribosomal 50S j Traducción, estructura ribosomal y biogénesis

Ent638_3671

3.291 0.0186 29.163 malato deshidrogenasa, de unión a NAD(P) C Producción y conversión de energía

Ent638_3679

-2.051 0.124 -2.996 proteína de membrana del sistema de eflujo M Biogénesis de la pared celular/membrana/ envoltura

Ent638_3686

2.015 0.025 11.894 componente MreC transmembrana del complejo estructural MreBCD de la pared celular M Biogénesis de la pared celular/membrana/ envoltura

Ent638_3701

-2.131 0.0253 -11.29 proteína conservada de función desconocida S Función desconocida

Ent638_3722

-2.133 0.048 -5.712 canal mecanosensible M Biogénesis de la pared celular/membrana/ envoltura

Ent638_3723

-2.564 0.0611 -4.795 proteína conservada de función desconocida S Función desconocida

Ent638_3726

3.616 0.0248 11.127 ARN polimerasa, subunidad alfa K Transcripción

Ent638_3729

2.758 0.0306 8.691 proteína S13 de la subunidad ribosomal 30S j Traducción, estructura ribosomal y biogénesis

Ent638_3730

4.562 0.0242 12.313 proteína L36 de la subunidad ribosomal SOS j Traducción, estructura ribosomal y biogénesis

Ent638_3731

2.315 0.066 4.512 subunidad de membrana de la preproteína translocasa u Tráfico intracelular, secreción, y transporte vesicular

Ent638_3732

2.484 0.0247 12.117 proteína L15 de la subunidad ribosomal 50S j Traducción, estructura ribosomal y biogénesis

Ent638_3733

2.832 0.0307 8.659 proteína L30 de la subunidad ribosomal 50S j Traducción, estructura ribosomal y biogénesis

Ent638_3735

2.087 0.0483 5.676 proteína L18 de la subunidad ribosomal 50S j Traducción, estructura ribosomal y biogénesis

Ent638_3736

2.371 0.0477 5.736 proteína L6 de la subunidad ribosomal 50S j Traducción, estructura ribosomal y biogénesis

Ent638_3737

2.068 0.129 2.923 proteína S8 de la subunidad ribosomal 30S j Traducción, estructura ribosomal y biogénesis

Ent638_3744

2.017 0.0632 4.657 proteína L16 de la subunidad ribosomal 50S j Traducción, estructura ribosomal y biogénesis

Ent638_3745

3.16 0.0219 15.304 proteína S3 de la subunidad ribosomal 30S J Traducción, estructura ribosomal y biogénesis

Ent638_3746

4.129 0.0198 17.793 proteína L22 de la subunidad ribosomal 50S J Traducción, estructura ribosomal y biogénesis

Ent638_3747

4.589 0.0316 8.444 proteína S19 de la subunidad ribosomal 30S J Traducción, estructura ribosomal y biogénesis

Ent638_3748

3.398 0.0248 13.648 proteína L2 de la subunidad ribosomal 50S J Traducción, estructura ribosomal y biogénesis

Ent638_3749

2.993 0.0225 15.415 proteína L23 de la subunidad ribosomal 50S J Traducción, estructura ribosomal y biogénesis

Ent638_3750

2.484 0.0316 8.39 proteína L4 de la subunidad ribosomal 50S J Traducción, estructura ribosomal y biogénesis

Ent638_3751

2 0.0386 6.918 proteína L3 de la subunidad ribosomal 50S J Traducción, estructura ribosomal y biogénesis

Ent638_3752

4.398 0.019 19.524 proteína S10 de la subunidad ribosomal 30S J Traducción, estructura ribosomal y biogénesis

Ent638_3756

2.017 0.00832 57.878 factor EF-Tu de elongación de la cadena de las proteínas (duplicado de tufA) j Traducción, estructura ribosomal y biogénesis

Ent638_3757

2.087 0.0324 8.231 factor EF-G de elongación de la cadena de las proteínas, de unión a GTP j Traducción, estructura ribosomal y biogénesis

Ent638_3816

5.186 0.0352 7.667 fosfoenolpiruvato carboxicinasa C Producción y conversión de energía

Ent638_3925

3.294 0.0696 4.326 transportador de ácido C4-dicarboxílico, orotato y citrato C Producción y conversión de energía

Ent638_4010

2.24 0.0202 17.884 regulador doble transcripcional de unión al ADN K Transcripción

Ent638_4063

-2.339 0.0436 -6.128 superóxido dismutasa, Mn P Transporte y metabolismo de iones inorgánicos

Ent638_4128

4.463 0.0247 11.192 sector F0 de la ATP sintasa unida a membrana, subunidad b C Producción y conversión de energía

Ent638_4129

3.599 0.0188 34.113 sector F1 de la ATP sintasa unida a membrana, subunidad delta C Producción y conversión de energía

Ent638_4130

3.583 0.0231 14.582 sector F1 de la ATP sintasa unida a membrana, subunidad alfa C Producción y conversión de energía

Ent638_4131

2.8 0.0306 8.832 sector F1 de la ATP sintasa unida a membrana, subunidad gamma C Producción y conversión de energía

Ent638_4132

4.856 0.0176 21.153 sector F1 de la ATP sintasa unida a membrana, subunidad beta C Producción y conversión de energía

Ent638_4133

3.713 0.0506 5.526 sector F1 de la ATP sintasa unida a membrana, subunidad epsilon C Producción y conversión de energía

Ent638_4202

-2.485 0.0305 -8.972 Regulador putativo de respuesta de dos componentes T Mecanismos de transducción de señales

Ent638_4204

-2.712 0.0382 -7.009 Regulador transcripcional de dos componentes, familia LuxR T Mecanismos de transducción de señales

Ent638_4205

-2.202 0.0516 -5.436 proteína conservada de función desconocida S Función desconocida

Ent638_4206

-2.27 0.047 -5.835 Precursor putativo del dominio barril del autotransportador de membrana externa u Tráfico intracelular, secreción, y transporte vesicular

Ent638_4214

-2.019 0.0762 -4.057 Proteína yfeJ similar a glutamina amidotransferasa E Transporte y metabolismo de aminoácidos

Ent638_4215

-2.55 0.0408 -6.676 Sistema de estabilización de plásmidos, sistema ParE de toxina de toxina-antitoxina (TA) D Control del ciclo celular, división celular, división de cromosomas

Ent638_4228

-2.516 0.0666 -4.487 fragmento de toxina del sistema toxina-antitoxina ReIE-ReIB; profago Qin (parte 2) D Control del ciclo celular, división celular, división de cromosomas

Ent638_4244

-2.09 0.0854 -3.762 proteína inducida por estrés, proteína de unión a ATP R Sólo la predicción general de la función

Ent638_4249

-2.253 0.0748 -4.131 Proteína repA de replicación L Replicación, recombinación y reparación

Ent638_4268

-3.098 0.0248 -11.941 antitoxina bifuncional del sistema toxina-antitoxina RelE-RelB y represor transcripcional; profago Qin D Control del ciclo celular, división celular, división de cromosomas

Ent638_4280

-2.424 0.0409 -6.625 Transglicosilasa lítica putativa, catalítica (factores de virulencia similares a lisozima) - -

Ent638_4281

-2.236 0.0533 -5.312 Transferencia conjugativa putativa: señal de unión (TraM) D Control del ciclo celular, división celular, división de cromosomas

Ent638_4282

-2 0.0323 -8.245 Proteína de función desconocida S Función desconocida

Ent638_4313

-2.362 0.0418 -6.422 Proteína de función desconocida S Función desconocida

Ent638_4319

-2.086 0.0736 -4.179 Transposasa truncada (Tn3) - -

ENT630192

-2.306 0.156 -2.566 Proteína exportada de función desconocida S Función desconocida

ENT630194

-2.286 0.0556 -5.129 Proteína exportada de función desconocida S Función desconocida

ENT631068

-2.732 0.0248 -11.061 Proteína de función desconocida S Función desconocida

ENT631584

-2.087 0.037 -7.431 Proteína putativa autotransportadora (fragmento) u Tráfico intracelular, secreción, y transporte vesicular

ENT631894

-2.007 0.0174 -21.346 Proteína de resistencia a beta-lactama R Sólo la predicción general de la función

ENT631979

-2.11 0.0229 -14.717 Elemento IS putativo (similar a IS600) - -

ENT632480

-2.222 0.0545 -5.219 proteína hipotética S Función desconocida

ENT632671

-2.25 0.0249 -11.071 Proteína hipotética de función desconocida S Función desconocida

ENT632695

-2.206 0.0523 -5.384 Proteína de función desconocida S Función desconocida

ENT633422

-2.194 0.0264 -10.451 Proteína de función desconocida S Función desconocida

ENT633863

2.227 0.068 4.407 proteína hipotética S Función desconocida

ENT63p0011

-2.333 0.0795 -3.948 Proteína de función desconocida S Función desconocida

ENT63p0054

-2.572 0.0796 -3.945 Proteína de función desconocida S Función desconocida

ENT63p0058

-2.469 0.0637 -4.628 Proteína de función desconocida S Función desconocida

ENT63p0066

-2.112 0.0251 -11.251 Proteína de función desconocida S Función desconocida

ENT63p0067

-2.132 0.0241 -12.455 Familia IS3/IS407 putativa de transposasa parcial - -

ENT63p0070

-2.3 0.0375 -7.358 Proteína de función desconocida S Función desconocida

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Brookhaven Science Associates, LLC

5

<120> Enterobacter sp. 638 y Métodos de uso del mismo

<130> 369-263 PCT (BSA 10-05)

10

<140> <141>

<150> US 61/313,415 <151> 2019-03-12

15

<160> 2

<170> PatentIn versión 3.1

20

<210> 1 <211> 21 <212> ADN <213> Enterobacter sp. 638

25

<220> <221> caract._misceláneas <222> (10)..(12) <223> "X" puede ser T,A,G o C o ausente

30

<400> 1 CCCTCTCCCX X(X)GGGAGAGG G 21

35

<210> 2 <211> 9 <212> ADN <213> Enterobacter sp. 638

<400> 2 TTATCCACA

9

40

Claims (5)

1. Reivindicaciones

   1. Un método para aumentar la masa o el número de frutas y/o semillas, o disminuir el tiempo hasta la floración o el tiempo hasta la maduración de los frutos, de una planta, el método comprende aplicar una composición a la

   5 planta en una cantidad eficaz para aumentar la masa o el número de frutos y/o semillas, o disminuir el tiempo hasta la floración o el tiempo hasta la maduración de los frutos, en donde la composición comprende un cultivo aislado de Enterobacter sp. 638, y en donde la planta es una angiosperma.
2. 2. El método de la reivindicación 1, el método comprende aplicar la composición a una raíz, un brote, una hoja, 10 y/o una semilla de la planta.

3. 3.

   El método de la reivindicación 1, en donde la angiosperma es tomate.

4. 4.

   El método de la reivindicación 1, en donde la angiosperma es girasol.

5. 5.

   El método de la reivindicación 1, en donde la angiosperma es tabaco.