ES2646132T3 - Un procedimiento para aumentar la tolerancia a sequía en una planta - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para aumentar la tolerancia a sequía en una planta que comprende aplicar una composición a la planta en una cantidad efectiva para aumentar la tolerancia a sequía en la planta, en el que la composición comprende un cultivo aislado de Enterobacter sp. 638.

Description

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DESCRIPCION

Un procedimiento para aumentar la tolerancia a seqma en una planta

Se realiza la presente invencion con apoyo gubernamental bajo el contrato numero DE-AC02-98CH10886, otorgado por el Departamento de Ene^a de los Estados Unidos. El Gobierno tiene determinados derechos en la invencion.

Antecedentes de la invencion

La presente invencion se refiere al uso de una especie novedosa de Enterobacter en relacion con el aumento de la tolerancia y/o resistencia a seqma en una planta.

Se puede esperar que los cambios climaticos de la Tierra tengan un fuerte efecto sobre la productividad agncola. Por ejemplo, se considera que en aumento de las emisiones de combustion de combustibles fosiles han afectado el clima de la Tierra, lo que ha hecho que sea mas deseable la produccion de biocombustibles a partir de recursos renovables. Otra forma en que se espera que el cambio climatico afecte la productividad agncola es la aumentar las temperaturas y afectar los patrones de lluvia.

Aunque es deseable una mayor demanda de recursos agncolas en la produccion de materias primas para la produccion de biocombustibles, esta mayor demanda se equilibra con un aumento simultaneo de la demanda de alimentos para sustentar una poblacion mundial aun en crecimiento.

Por lo tanto, subsiste la necesidad de practicas sostenibles que se puedan utilizar para optimizar la produccion de alimentos y materias primas para biocombustibles. Dichas practicas aumentanan de forma optima la productividad general de las plantas de forma sostenible, aumentanan la tolerancia a la seqma en las plantas de tal manera que los cultivos y materias primas puedan soportar las principales fluctuaciones en los patrones de lluvia y aumentar la tolerancia a infecciones de patogenos en las plantas.

Weyens et al. (Trends in Biotechnology, Elsevier Publications, Cambridge, GB, 27(10): 591-598 (2009) se refiere a los efectos beneficiosos de las bacterias asociadas a plantas para aumentar la produccion de biomasa y mejorar las medidas correctivas.

Taghavi et al. (Applied y Environmental Microbiology, American Society for Microbiology, US, 75(3): 748-757 (2009) divulga la capacidad de las bacterias endoffticas para promover el crecimiento y el desarrollo de arboles populares.

Taghavi et al. (PLOS Genetics, 6(5)) identifica y caracteriza la secuencia de genomas de la bacteria endofftica que promueve el crecimiento de la planta Enterobacter sp. 638.

Sumario de la invencion

La presente invencion se refiere a un procedimiento para aumentar la tolerancia a seqma en una planta. El procedimiento incluye aplicar una composicion a la planta en una cantidad efectiva para aumentar la tolerancia a enfermedades en la planta. La composicion incluye un cultivo aislado de Enterobacter sp. 638.

En una realizacion preferida, el procedimiento comprende aplicar la composicion a una rafz, un brote, una hoja, y/o una semilla de la planta.

En otra realizacion preferida, la planta es una angiosperma especialmente tomate, alamo, soja, mafz, pepino, guisante, rabano, brocoli o espinaca.

Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1 es un analisis filogenetico 16S de la cepa de Enterobacter sp. 638.

La Figura 2 es una representacion circular del cromosoma de Enterobacter sp. 638. Los drculos muestran (desde el exterior): la desviacion en porcentaje de GC (ventana de GC-GC media) en una ventana de 1000 bp, las CDS predichas transcritas en la direccion horaria, las CDS predichas transcritas en la direccion contrahoraria, CDS en direccion horaria y direccion contrahoraria en color de acuerdo con sus clases COG, la posicion de todas las repeticiones palindromicas, la posicion de las 100 repeticiones palindromicas (CCCTCTCCCXX(X)GGGAGAGGG) (SEQ ID NO: 1), asimetna GC (G+C/G-C) en una ventana de 1000 bp, y coordenadas en pares de kilo bases. Las regiones sinteticas comparadas K12 de E. coli se muestran con genes exhibidos en naranja, mientras que los genes exhibidos en purpura corresponden a una region no sintetica. Las flechas indican funciones putativas de genes ubicados en regiones que no estan en sintenia con K12 de E. coli (para detalles adicionales sobre el contenido de genes para cada una de las regiones vease Tabla 1). Una region sintenica se define por un mmimo de tres genes consecutivos que estan presentes en una secuencia del genoma bacteriano, y que muestran una organizacion genetica similar a la de los mismos genes en otros genomas bacterianos.

La Figura 3 es una representacion circular del pENT638-1 de Enterobacter sp. 638. Los drculos muestran desde el exterior: la subdivision del grupo pENT-01 de la funcion, anotacion de gen, la desviacion en porcentaje de GC

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(ventana de GC-GC media) en una ventana de 1000 bp, las CDS predichas (rojo) transcritas en la direccion horaria, las CDS predichas (azul) transcritas en la direccion contrahoraria, asimetna GC (G+C/G-C) en una ventana de 1000 bp, elementos transponibles a partir de elementos IS (rosado) y pseudogenes (gris). Los sistemas de toxina/anti- toxina T (TA) se muestran con un asterisco (*).

La Figura 4 representa los indices de crecimiento de esquejes de alamo inoculados con diferentes bacterias endoffticas. Se determinan los indices de crecimiento 10 semanas despues de la inoculacion y plantacion de los esquejes en suelo arenoso. Por condicion, se utilizan siete plantas. Las plantas se cultivaron en el invernadero. Se utilizaron plantas no inoculadas como referencias. Las barras indican errores estandar. Se calcularon los indices de crecimiento como (Mt-M0)/M0 despues de 10 semanas de crecimiento de plantas inoculadas y no inoculadas. M0, peso de la planta (g) en la semana 0; Mt, peso de la planta (g) despues de 10 semanas. La significancia estadfstica del aumento de produccion de biomasa de plantas inpculadas, en comparacion con aquella de plantas de control no inoculadas, se confirmo en el nivel de 5 % (**) utilizando la prueba de Dunnet.

La Figura 5 muestra los efectos de Enterobacter sp. 638 sobre la formacion de brote y rafz del alamo DN-34. Las plantas se incubaron hidroponicamente en solucion de Hoagland a media concentracion en la ausencia (Control) o presencia (638) de la cepa 638. Se presenta el desarrollo de rafz y brote despues de 1 (A) y 10 (B) semanas.

La Figura 6 muestra el peso total de los tomates cosechados durante un penodo de crecimiento de 4 meses. Las plantas inoculadas con Enterobacter sp. 638 uvieron un rendimiento mayor del 10 % en comparacion con plantas de control no inoculadas.

La Figura 7 presenta una reduccion en el tiempo de floracion luego de la inoculacion de la planta de girasol inoculada con Enterobacter sp. 638 en comparacion con plantas de girasol no inoculadas como controles.

La Figura 8 muestra una comparacion de cromatografos de extractos de Enterobacter sp. 638 que crecen en la ausencia (cromatografo superior) o presencia (cromatografo inferior) de los extractos de planta. Observe la produccion de Acetoma y 2,3-Butanodiol en la presencia de los extractos de planta. Este resultado se confirmo en un medio definido que contema sacarosa.

La Figura 9 muestra el porcentaje de genes de una clase de COG particular que depende de su localizacion genetica: cromosoma o plasmido pENT638-1. Leyenda de la clase Cog: D: Control de ciclo celular, division celular, particionamiento de cromosoma; M Biogenesis de pared/membrana/envoltura de celula; N Motilidad celular; O Modificacion postraduccional, recambio de protemas, chaperones; T Mecanismos de transduccion de senal; U Trafico intracelular, secrecion, y transporte vesicular; V Mecanismos de defensa; W Estructuras extracelulares; J Traduccion, estructura ribosomica y biogenesis; K Transcripcion; L Replicacion, recombinacion y reparacion; C Produccion y conversion de energfa; E Transporte y metabolismo de aminoacidos; F Transporte y metabolismo de nucleotidos; G Transporte y metabolismo de carbohidratos; H Transporte y metabolismo de coenzimas; I Transporte y metabolismo de lfpidos; P Transporte y metabolismo de iones inorganicos; Q Biosmtesis, transporte y catabolismo de metabolitos secundarios; R Solo prediccion de funcion general; S Funcion desconocida.

La Figura 10 muestra la distribucion de las repeticiones palindromicas sobre el cromosoma de Enterobacter sp. 638. Los drculos exhiben (desde el exterior): las CDS predichas transcritas en la direccion horaria y contrahoraria, la posicion de todas las repeticiones palindromicas y de la repeticion palindromica “CCCTCTCCCXX(X)GGGAGAGGG” (SEQ ID NO: 1) encontrada en el genoma de Enterobacter sp. 638, la desviacion en porcentaje de GC, sesgo de GC. La Tabla en el lado muestra la variacion de secuencias de nucleotidos XX(X) y sus numeros acumulativos.

La Figura 11 muestra en aumento de produccion de biomasa de tabaco cuando se inocula con Enterobacter sp. 638. Para comparacion, se incluyen las plantas de control no inoculadas y las plantas inoculadas con Pseudomonas putida W619. Para el tabaco, no solo las plantas inoculadas con Enterobacter sp. 638 mostraron el mayor aumento de crecimiento, pero tambien un inicio mas temprano de floracion como se vio con el girasol.

Descripcion detallada de la invencion

Un deposito biologico del Enterobacter sp. 638 se acuerdo con la invencion se realizo el 4 de marzo de 2011 con el Depositario de Patentes ATCC, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110.

A. Cultivo de Enterobacter sp. 638

La Enterobacter sp. 638 es una cepa bacterial no fitopatogenica. La cepa de Enterobacter sp. 638 se aislo bajo condiciones aerobicas de las muestras de rafz y tallo esterilizadas en la superficie tomadas de arboles de alamo hnbrido H11-11 que se cultivaron en un suelo franco limoso con agua subterranea debajo de aquel que estaba contaminada con tetracloruro de carbono o tricloroetileno.

La cepa de Enterobacter sp. 638 incluye un unico cromosoma circular de 4,518,712 bp con un contenido de G+C total de 52,98 %, e incluye de forma estable un plasmido pENT638-1 de 157,749 bp, que tiene un contenido de G+C total de 50,57 %. El plasmido pENT638-1 exhibe, con base en el contenido de GC, por lo menos cuatro regiones distintas (Figura 3). El plasmido pENT638-1 se refiere a plasmidos F encontrados en otra Enterobacteriaceae. Los

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plasmidos de esta familia estan involucrados en la interaccion y virulencia del anfitrion, tal como el plasmido pFra del microbio de la peste Yersinia pestis. Sin embargo, en pENT638-1, la isla de patogenicidad pFra se reemplaza por una unica isla genomica putativa de 23-kb (flanqueada por un gen integrasa y que tiene un contenido de GC que es significativamente diferente que aquel del resto del plasmido).

Un “cultivo aislado” se refiere a un cultivo del microorganismo que no incluye otros materiales (i) que se encuentra normalmente en el suelo en el que el microorganismo crece, y/o (ii) a partir del cual se afsla el microorganismo. Adicionalmente, dicho cultivo puede ser un cultivo que no contiene ninguna otra especie biologica, microorganismo, y/o especie bacteriana en cantidades suficientes para interferir con la replicacion del cultivo o para ser detectados por tecnicas bacteriologicas, de biologfa molecular, y/o qmmicas normales.

B. Inoculante para una planta

Se divulga un inoculante para una planta. El inoculante incluye un cultivo aislado del Enterobacter sp. 638 y un medio biologicamente aceptable. Los terminos “inoculante microbiano” o “inoculante” se refieren a una preparacion que incluye un cultivo aislado de Enterobacter sp. 638.

Para facilitar el cultivo de Enterobacter sp. 638, el cultivo se puede diluir, por ejemplo, con un medio o portador adecuado. Un “medio biologicamente aceptable” se refiere a un medio que no interfiere con la efectividad de la actividad biologica de Enterobacter sp. 638 y que no es toxico para Enterobacter sp. 638.

Los ejemplos de un medio biologicamente aceptable incluyen un medio de sal mmimo con gluconato y un medio rico diluido (1/100 LB). El medio biologicamente aceptable puede incluir fuentes de carbono, tales como los siguientes compuestos de ejemplo: D-manitol, lactosa, sacarosa, arbutina, salicina, trehalosa, D-manosa, L-arabinosa, maltosa, celobiosa, xilosa, gluconato y glucosa. Preferiblemente, el medio incluye glucosa, sacarosa, otros azucares derivados de plantas, y/o extracto de alamo para provocar la induccion de fitohormonas promotoras del crecimiento de plantas (acetoma, 2,3-butanodiol, vease Figura 8).

En una divulgacion, el inoculante adicional incluye un microorganismo que promueve el crecimiento de planta, que incluye, por ejemplo, una bacteria endofftica, hongo, bacteria rizosfera y/o un hongo micorriza que promueven el crecimiento de planta. Ejemplos espedficos de microorganismos que promueven el crecimiento de planta incluyen, pero no se limitan a miembros de los generos Actinobacter, Alcaligenes, Bacillus, Burkholderia, Buttiauxella, Enterobacter, Klebsiella, Kluyvera, Pseudomonas, Rahnella, Ralstonia, Rhizobium, Serratia, y Stenotrophomonas.

C. Procedimiento para aumentar el crecimiento

En otra divulgacion, se presenta un procedimiento para aumentar el crecimiento en una planta. El procedimiento incluye aplicar una cantidad efectiva de una composicion que incluye un cultivo aislado de Enterobacter sp. 638 a la planta.

Una “planta” como se utiliza aqrn se refiere a cualquier tipo de planta, tal como un arbol, arbusto, flor, hierba, vid, o cesped. El termino “planta” tambien se refiere a cualquier parte de la planta, por ejemplo, a una planta entera, una parte de planta, una celula vegetal, o un grupo de celulas vegetales, tales como tejido vegetal, o progenie de las mismas. Las plantulas tambien se incluyen dentro del significado de “planta”. Las plantas incluyen, por ejemplo, gimnospermas y angiospermas, tanto en monocotiledoneas como dicotiledoneas, y arboles.

Ejemplos de angiospermas monocotiledoneas incluyen, pero no se limitan a, esparrago, mafz de campo y dulce, cebada, trigo, arroz, sorgo, cebolla, mijo perla, centeno y avena y otros granos de cereales, cana de azucar, hierba de elefante, pasto aguja y miscantus.

Ejemplos de angiospermas dicotiledoneas incluyen, pero no se limitan a tomate, tabaco, algodon, colza, habas, soja, pimientos, lechugas, guisantes, alfalfa, trebol, cultivos de col o Brassica oleracea (por ejemplo, col, brocoli, coliflor, coles de Bruselas), rabano, zanahoria, remolacha, berenjena, espinacas, pepino, calabaza, melon, melon cantalupo, girasol y diversas plantas ornamentales. En una divulgacion preferida, planta es tomate. En otra divulgacion preferida, la planta es girasol. En aun otra divulgacion preferida, la planta es tabaco.

Ejemplos de especies lenosas de plantas incluyen alamo, pino, secoya, cedro, roble, etc. Las especies de arboles incluyen adicionalmente, por ejemplo, abeto, pino, picea, alerce, cedro, cicuta, acacia, aliso, alamo, haya, abedul, liquidambar, sicomoro, alamo, sauce, y similares. En una divulgacion preferida, la planta es un alamo.

Como se utiliza aqrn, el termino “aumentar” crecimiento se refiere a un aumento en una caractenstica de crecimiento de una planta tratada con un procedimiento o una composicion divulgada, en la que el aumento de la caractenstica de crecimiento es mayor que el crecimiento de una planta de control correspondiente cuando se cultivan bajo condiciones identicas sin la aplicacion del procedimiento o composicion divulgada. Una planta de control “correspondiente” se refiere a una planta de tipo silvestre que es del mismo tipo o especie como la planta tratada con un procedimiento o una composicion divulgada.

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El aumento en el crecimiento puede ser un aumento en el crecimiento de una parte particular de la planta, tal como rames, brotes, hojas, flores, frutos, y/o semillas, o el crecimiento se puede distribuir a traves de toda la planta. Los medios para medir el crecimiento son conocidos en la tecnica.

El aumento del crecimiento puede incluir, por ejemplo, un aumento en por lo menos una, o una combinacion de, las siguientes caractensticas en la planta y/o una parte de la planta: altura, anchura, masa, una acumulacion de carbono radiactivo, un aumento de peso seco, un aumento en el peso fresco y/o un aumento en la tasa de dichos aumentos durante un penodo de tiempo espedfico.

El aumento de crecimiento tambien puede incluir, por ejemplo, un aumento en la cantidad de fruto producido, una disminucion en el tiempo de floracion, y/o un aumento en la masa de las partes vegetativas que sirven a un proposito util, tales como rafces o tuberculos de plantas en las que estas partes son una fuente de alimento.

El aumento en el crecimiento puede ser un aumento que es 2, 4, 5, 6, 8, 10, 20 (o mas) - veces mayor en comparacion con el crecimiento de una planta de control correspondiente que crece bajo condiciones identicas sin la aplicacion del procedimiento o composicion divulgada. Por ejemplo, una planta que tiene un mayor crecimiento en comparacion con la planta de control puede tener 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 % 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 100 % o mas crecimiento que la planta de control correspondiente que crece bajo condiciones identicas sin la aplicacion del procedimiento o composicion divulgada.

D. Procedimiento para aumentar la biomasa

Se divulga adicionalmente un procedimiento para aumentar la biomasa en una planta. El procedimiento incluye aplicar una cantidad efectiva de una composicion que incluye un cultivo aislado de Enterobacter sp. 638 a la planta.

El termino “biomasa” se refiere al peso seco o peso fresco de la planta. La biomasa incluye, por ejemplo, todas las partes de la planta a menos que se estipule lo contrario, tales como en referencia a biomasa de brote (todas las partes de la planta por encima del suelo), biomasa de hoja, y biomasa de rafz. El termino “peso seco” se refiere al peso de una planta que se ha secado para eliminar la mayona del agua celular. El termino “peso fresco” se refiere al peso de una planta que no se ha secado para eliminar la mayor parte del agua celular. Los medios para medir la biomasa se conocen en la tecnica.

El termino “aumentar la biomasa” se refiere a un aumento en la biomasa de una planta tratada con un procedimiento o una composicion divulgada, en la que el aumento de la biomasa es una cantidad mayor que la cantidad de biomasa en una planta de control correspondiente que crece bajo condiciones identicas sin la aplicacion del procedimiento o composicion divulgada.

El aumento en la biomasa puede ser un aumento que es 2, 4, 5, 6, 8, 10, 20 (o mas) veces mayor en comparacion con la biomasa de una planta de control correspondiente que crece bajo condiciones identicas sin la aplicacion del procedimiento o composicion de la invencion. Por ejemplo, una planta que tiene un aumento de biomasa en comparacion con la planta tipo silvestre puede tener 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 % 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 100 % o mas biomasa que la planta de control correspondiente que crece bajo condiciones identicas sin la aplicacion del procedimiento o composicion de la invencion.

E. Procedimiento para aumentar tolerancia y/o resistencia a enfermedades

Sin embargo, se divulga adicionalmente un procedimiento para aumentar la tolerancia y/o resistencia a enfermedad en una planta. El procedimiento incluye aplicar una cantidad efectiva de una composicion que incluye un cultivo aislado de Enterobacter sp. 638 a la planta. Aunque no se limita a ninguna teona en particular, la Enterobacter sp. 638 puede aumentar la tolerancia y/o resistencia a enfermedad en una planta debido a una produccion de acetoma y 2,3-butanodiol por la Enterobacter sp. 638, o debido a una produccion de los compuestos antimicrobianos 2- feniletanol y 4-hidroxibenzoato, o a traves de la competicion directa por los nutrientes esenciales a traves de la smtesis de enterobactina de sideroforo, y/o a traves de la absorcion de complejos de sideroforos de hierro producidos de forma heterologa por Enterobacter sp. 638.

El termino “tolerancia a enfermedad” se refiere a la capacidad de una planta para soportar o resistir una enfermedad mientras que se mantiene la capacidad de funcionamiento y produccion a pesar de la enfermedad. Una enfermedad incluye, por ejemplo, la presencia de una patologfa que afecta adversamente la viabilidad de una planta, tal como, por ejemplo, una infeccion por un patogeno (por ejemplo, un hongo, virus, o bacterias) en y/o sobre la planta.

El termino “resistencia a enfermedad” se refiere a la capacidad de una planta para desarrollar un menor numero de smtomas de la enfermedad luego de exposicion a una enfermedad de la planta de control correspondiente que no presenta resistencia a enfermedad cuando se cultivan bajo condiciones y enfermedades identicas. La resistencia a enfermedad incluye la resistencia completa a la enfermedad y/o diversos grados de resistencia que se manifiestan como disminucion de los smtomas, mayor supervivencia, u otros parametros de enfermedad, tales como mayor rendimiento, aumento del crecimiento, aumento de la biomasa, maduracion acelerada del fruto, etc. Una enfermedad puede ser, por ejemplo, una infeccion por hongos tales como Septoria, Melampsora, o septotina, una infeccion por

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virus tal como el virus del mosaico del alamo, y/o una infeccion bacteriana, tal como una infeccion de Agrobacterium, Rickettsia, o Corynebacterium.

El termino “aumentar” tolerancia y/o resistencia a la enfermedad se refiere a un aumento de la tolerancia y/o resistencia de una planta enferma tratada con un procedimiento o composicion divulgada, en la que la tolerancia y/o resistencia a enfermedad es mayor que tolerancia y/o resistencia a enfermedad en una planta de control correspondiente que se cultiva bajo condiciones y enfermedades identicas.

El aumento de tolerancia y/o resistencia a enfermedad puede ser un aumento que es 2, 4, 5, 6, 8, 10, 20 (o mas) veces mayor en comparacion con la tolerancia y/o resistencia de una planta de control correspondiente que crece bajo exposicion a condiciones y enfermedad identicas. Por ejemplo, una planta que tiene aumento de tolerancia y/o resistencia a enfermedad en comparacion con la planta tipo silvestre puede tener 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 % 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 100 % o mas tolerancia y/o resistencia a enfermedad que la planta de control correspondiente que crece bajo condiciones identicas sin aplicacion del procedimiento o composicion divulgada.

Los procedimientos para evaluar la tolerancia y/o resistencia a las enfermedades se conocen en la tecnica. Por ejemplo, dichos procedimientos pueden incluir observaciones y valoraciones de manifestaciones ffsicas de los smtomas de la enfermedad, perdida del vigor de la planta, o muerte, y activacion de genes de respuesta a enfermedad espedficos, en comparacion con una planta de control.

F. Procedimiento para aumentar la Productividad de frutos y/o semillas

Incluso se divulga adicionalmente un procedimiento para aumentar la productividad de frutos y/o semillas en una planta. El procedimiento incluye aplicar una cantidad efectiva de una composicion que incluye un cultivo aislado de Enterobacter sp. 638 a la planta.

“Aumento de la productividad” se refiere al aumento de la masa o cantidad de frutos y/o semillas producidas por una planta tratada con un procedimiento o una composicion divulgada, en la que el aumento de la productividad es una cantidad mayor que la cantidad de la productividad en una planta de control correspondiente cuando se cultivan bajo condiciones identicas sin la aplicacion del procedimiento o composicion divulgada.

Los procedimientos para evaluar el aumento en la productividad puede incluir, por ejemplo, determinar la cantidad de frutos producidos por la planta, el peso de los frutos individuales producidos por la planta, el tiempo de floracion en la planta, el tiempo de maduracion de fruto en la planta, y/o la cantidad de semillas producidas por un fruto o flor individual de la planta.

La productividad se aumenta en una planta si, por ejemplo, se aumenta la cantidad de frutos producidos por la planta, se aumenta el peso de los frutos individuales producidos por la planta, se reduce el tiempo de floracion de la planta, se reduce el tiempo para maduracion del fruto de la planta, y/o se aumenta el numero de semillas producidas por un fruto o una flor de la planta individual cuando se compara con una planta de control correspondiente cuando se cultiva bajo condiciones identicas sin la aplicacion del procedimiento o composicion divulgada.

El aumento o reduccion en la productividad puede ser un aumento o reduccion respectiva que es 2, 4, 5, 6, 8, 10, 20 (o mas) veces mayor o menor que la productividad de una planta de control correspondiente que crece bajo condiciones identicas sin aplicacion del procedimiento o composicion divulgada. Por ejemplo, una planta que tiene aumento de productividad en comparacion con la planta control puede tener 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 % 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 100 % o mas productividad que la planta de control correspondiente que crece bajo condiciones identicas sin aplicacion del procedimiento o composicion divulgada.

G. Procedimiento para aumentar tolerancia y/o resistencia a seqrna

La invencion se refiere a un procedimiento para aumentar la tolerancia y/o resistencia a seqrna en una planta. El procedimiento incluye tratar la planta con una composicion que incluye un cultivo aislado de Enterobacter sp. 638. Aunque no se limita a ninguna teoria particular, la Enterobacter sp. 638 puede aumentar la tolerancia y/o resistencia a seqrna en una planta debido a una produccion de acetoma y 2,3-butanodiol por la Enterobacter sp. 638.

El termino “tolerancia a la seqrna” se refiere a la capacidad de una planta para soportar o resistir las condiciones de seqrna. “Seqrna” se refiere a una condicion en la que una planta se somete a estres osmotico o potencial reducido de agua. Por ejemplo, la seqrna puede ser provocada por la falta de agua disponible por un periodo de tiempo. Las condiciones de seqrna se pueden evaluar al comparar la cantidad de agua requerida para el crecimiento o la maduracion de una planta con la cantidad de agua disponible para la planta. Las condiciones de seqrna pueden ser provocadas, por ejemplo, por falta de lluvia o riego, en relacion con la cantidad de agua utilizada internamente o transpirada por una planta.

El termino “resistencia a la seqrna” se refiere a la capacidad de una planta para desarrollar menos smtomas de estres tndrico (por ejemplo, una menor productividad, perdida de hojas, muerte) que la planta de control correspondiente cuando se cultiva bajo condiciones identicas a estres tndrico. La resistencia a la seqrna incluye

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resistencia completa a los efectos de la seqma (sin perdida de productividad) o diversos grados de resistencia manifestados como disminucion de los smtomas o una supervivencia mas larga.

Se puede utilizar la evaluacion fenotfpica de los smtomas para determinar si, y en que medida, una planta esta sufriendo de seqma. Por ejemplo, la tolerancia y/o resistencia a la seqma se puede evaluar al observar y calificar el marchitamiento, detencion del crecimiento, muerte, productividad, perdida de hojas (por ejemplo, laminacion de la hoja, distorsion de la hoja, ca^da de hojas, quema de hoja), muerte regresiva de tallos o ramas, eficiencia fotosintetica, floracion, y nivel de rendimiento en una planta. Adicionalmente, la tolerancia y/o resistencia a la seqma de una planta se puede determinar, por ejemplo, mediante ensayos basados en acidos nucleicos o bioqmmicos para medir la expresion o activacion de genes de respuesta espedficos en la planta.

La tolerancia y/o resistencia a la seqma se aumenta en una planta si la planta demuestra menos smtomas graves de estres provocado por la seqma. Por ejemplo, la tolerancia y/o resistencia a la seqma se aumenta si se reduce el marchitamiento, detencion del crecimiento, muerte, perdida de hojas (por ejemplo, laminacion de hoja, distorsion de hoja, cafda de hojas, quema de hoja), y/o o muerte regresiva de tallos o ramitas cuando se compara con una planta de control correspondiente cuando se cultiva bajo condiciones identicas sin la aplicacion del procedimiento o composicion de la invencion. Otros ejemplos de una mayor tolerancia y/o resistencia a la seqma incluyen un aumento en la productividad, vigor de la planta, eficiencia fotosintetica, floracion, y/o nivel de rendimiento en una planta en comparacion con una planta de control correspondiente cuando se cultiva bajo condiciones identicas sin la aplicacion del procedimiento o composicion de la invencion.

De acuerdo con lo anterior, el termino “aumentar” la tolerancia y/o resistencia a seqma se refiere a un aumento en la tolerancia y/o resistencia a seqma de una planta impactada tratada con un procedimiento o composicion de la invencion, en la que la tolerancia y/o resistencia es mayor que la tolerancia y/o resistencia a seqma en una planta de control correspondiente que crece bajo condiciones y estres hndrico identicos.

El aumento de tolerancia y/o resistencia a seqma puede ser un aumento que es 2, 4, 5, 6, 8, 10, 20 (o mas) veces mayor en comparacion con la tolerancia y/o resistencia de una planta de control correspondiente que crece bajo condiciones identicas y estres hndrico. Por ejemplo, una planta que tiene aumento de tolerancia y/o resistencia a seqma en comparacion con la planta control puede tener 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 % 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 100 % o mas tolerancia y/o resistencia a seqma que la planta de control correspondiente que crece bajo condiciones identicas sin aplicacion del procedimiento o composicion de la invencion.

H. Procedimientos generales

Se puede utilizar cualquier procedimiento para aplicar una composicion a una planta en el procedimiento de la presente invencion. Los procedimientos para aplicar una composicion sobre y/o en una planta se conocen en la tecnica. En una divulgacion, la composicion se puede inocular en el suelo con la planta. En otra realizacion, la composicion de la invencion se puede introducir en las rames de las plantas a traves del crecimiento en un medio hidroponico o rociar sobre las hojas de una planta.

La composicion de la invencion se puede aplicar a cualquier parte de la planta, incluyendo las semillas a traves del uso de un mecanismo de recubrimiento o aglutinante adecuado. La composicion de la invencion se puede aplicar en las plantas antes de la siembra o se introduce en los surcos para las plantas durante la siembra. Como otro ejemplo, la composicion de la invencion se puede aplicar a las rafces de la planta. La composicion de la invencion se puede preparar con o sin un portador y vender como un inoculante independiente que se inserta directamente en los surcos en el que se siembran las plantas.

De acuerdo con el procedimiento de la invencion, una cantidad efectiva de la composicion de la invencion es esa cantidad suficiente para establecer suficiente crecimiento bacteriano de tal manera que el resultado deseado se consigue en la planta tratada. Una cantidad efectiva de la composicion de la invencion se puede determinar por medios conocidos en la tecnica para una especie vegetal particular. Por ejemplo, la inoculacion con la composicion de la invencion se puede llevar a cabo en el cultivo hidroponico durante seis dfas, y la suspension bacteriana se puede renovar despues de tres dfas luego de inoculacion.

En una realizacion, la cantidad efectiva puede, por ejemplo, ser cualquier cantidad desde aproximadamente 101 hasta aproximadamente 1012 celulas por planta. En otra realizacion, la cantidad efectiva es una concentracion celular desde aproximadamente 105 hasta aproximadamente 1010 CFU/ml de inoculo, mas preferiblemente desde aproximadamente 106 hasta 108 CFU/ml, y aun mas preferiblemente aproximadamente 108 CFU/ml. En todavfa otra realizacion, la composicion de la invencion se puede mezclar con el suelo en una cantidad desde aproximadamente 105 hasta 1010 celulas por gramo de suelo.

Ejemplos

Ejemplo 1: Aislamiento y caracterizacion de Enterobacter sp. 638

Se recolectaron muestras de rafz y brote del arbol de alamo H11-11 hnbrido de 10 anos de edad (Populus trichocarpa _P. deltoides) que habfa estado creciendo en presencia de tetracloruro de carbono (12 ppm de forma

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homogenea) durante 8 anos en un sitio experimental en el estado de Washington. Adicionalmente, se recogio material de sauce nativo (Salix gooddingii) de 5 anos de edad, las plantas nativas habfan estado creciendo en presencia de tricloroetileno (18 ppm) y tetracloruro de carbono (12 ppm) durante 5 anos. Se retiraron los esquejes de las plantas con maquinas de cortar que se lavaron con etanol entre los cortes y se colocaron en frascos de analisis organicos volatiles enjuagados con acetona que se colocaron en hielo para su envfo desde el campo. Las rafces y brotes se trataron por separado. Las muestras de rafces y brotes frescas se lavaron vigorosamente en agua destilada durante 5 min, la superficie se esterilizo durante 5 min en una solucion que contema 1 % (peso/vol) de cloruro activo (agregado como una solucion de hipoclorito de sodio [NaOCl)) suplementada con 1 gota de Tween 80 por 100 ml de solucion, y se enjuagaron tres veces en agua destilada esteril. Una muestra de 100 pl del agua del tercer enjuague se sembro en medio 869 (25) para verificar la eficiencia de la esterilizacion. Despues de la esterilizacion, las rafces y los brotes se maceraron en 10 ml de MgSO4 10 mM utilizando un mezclador Polytron PT1200 (Kinematica A6). Se hicieron diluciones en serie, y las muestras de 100 pl se colocaron en placas en medios no selectivos con el fin de probar la presencia de los endofitos y sus caractensticas.

Se aislo Enterobacter sp. 638 bajo condiciones aerobias a partir de muestras de rafz y tallo esterilizadas en superficie tomadas de arbol de alamo H11-11 fftbrido y sauce nativo (Salix gooddingii) que se hicieron crecer en un suelo franco limoso con aguas subterraneas por debajo de estos que estaba contaminada con tetracloruro de carbono o tricloroetileno y tetracloruro de carbono, respectivamente. Su ADN genomico total se extrajo y se utilizo para amplificar el gen rARN 16. Los genes rARN 16S se amplificaron mediante PCR utilizando el grupo de cebadores 26F-1392R estandar (Amann, 1995)

Ejemplo 2: Cribado de bacterias endoffticas para propiedades que promueven el crecimiento de plantas en alamo.

Se prepararon los inoculos (cultivo de 250 ml) al hacer crecer bacterias endoffticas en un medio 869 en concentracion de 1/10 (25) a 30°C sobre un agitador rotatorio hasta que se alcanzo una concentracion celular de 109 CFU/ml (densidad optica a 660 nm [DO660) de 1]. Las celulas se recolectaron mediante centrifugacion, se lavaron dos veces en MgSO4 10 mM, y se suspendieron en 1/10 del volumen original (en MgSO4 10 mM) para obtener un inoculo con una concentracion celular de 1010 CFU/ml. Por cepa microbiana probada, se pesaron siete esquejes de alamo (Populus deltoides x P. nigra) DN-34 de aproximadamente 30 cm y se colocaron en un vaso de precipitados de 1 litro que contema 0,5 litros de una solucion nutritiva de Hoagland esteril de resistencia media (5), que se refresca cada 3 dfas. Se permitieron esquejes en la rafz durante aproximadamente 4 semanas hasta que comenzo la formacion de rafces. Posteriormente, se agrego un inoculo bacteriano a cada frasco a una concentracion final de 108 CFU/ml en solucion de Hoagland de fuerza media. Despues de 3 dfas de incubacion, los esquejes se pesaron y se plantaron en suelo arenoso no esteril y se colocaron en el invernadero con una temperatura constante de 22°C y ciclo de 10 h de luz-14 h de oscuridad con radiacion activa fotosintetica de 165 mmol/m25. Despues de 10 semanas, se recolectaron las plantas, y se determinaron su biomasa total, su aumento de la biomasa, y la biomasa de diferentes tejidos de la planta. Tambien se recogieron datos de las plantas de control no inoculadas. Se calcularon los indices de crecimiento como (Mt-M0)/M0 despues de 10 semanas de crecimiento en presencia o ausencia de inoculo endofftico, donde M0 es el peso de la planta (g) en la semana 0 y Mt es el peso de la planta (g) despues de 10 semanas. El significado estadfstico de los resultados se confirmo en el nivel de 5 % mediante la prueba de Dunnett. Para determinar los efectos de las bacterias endoffticas en el enraizamiento de alamo DN-34, los esquejes se trataron como se describio anteriormente, excepto que se agrego el inoculo endofftico desde el dfa 1.

Se probo la Enterobacter sp. 638 aislada de alamo para determinar su capacidad para mejorar el crecimiento de sus plantas anfitrionas, junto con otras gammaproteobacterias endoffticas encontradas en alamos. Burkholderia Bu72 cepacia, un endofito originalmente aislado de altramuz amarillo que se encontro tema efectos que promueven el crecimiento de plantas en los arboles de alamo, y Cupriavidus metallidurans CH34 (tambien denominada como Ralstonia metallidurans CH34), una bacteria tfpica del suelo sin efectos que promueven el crecimiento de las plantas conocidos se incluyo como controles positivos y negativos, respectivamente. Adicionalmente, se utilizaron esquejes no inoculados como controles.

Despues de la formacion de rafces en condiciones hidroponicas y posterior inoculacion de endofitos, los esquejes de alamo DN-34 se plantaron en un suelo arenoso marginal y se dejaron crecer durante 10 semanas, despues de lo cual se recolectaron las plantas y se determinaron sus biomasas. Despues de 10 semanas de crecimiento, los alamos inoculados con M. populi BJ001 teman menos nueva biomasa que los controles (Figura 4) (P <0,05). Los esquejes de alamo inoculados con Enterobacter sp. 638 (P = 0,018) y B. cepacia BU72 (P = 0,042) mostraron estadfsticamente mejor crecimiento que las plantas de control (Figura 4), como se refleja en sus indices de crecimiento. Los efectos que promueven el crecimiento de plantas de Enterobacter sp. 638 y B. cepacia BU72 fueron reproducibles en experimentos realizados independientemente.

Bajo las condiciones de invernadero probadas, no se encontraron diferencias en los indices de crecimiento entre aquellos de las plantas no inoculadas de control y aquellos de las plantas inoculadas con S. maltophilia R551-3, P. putida W619, y S. proteamaculans 568; su crecimiento fue comparable con aquel observado para plantas inoculadas con C. metallidurans CH34. Tambien, las plantas de control y las plantas inoculadas con las bacterias endofitas paredan sanas, a excepcion de las plantas inoculadas con M. populi BJ001, que mostraron signos de estres, que incluyen clorosis de las hojas.

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Ejemplo 3: Cribado de bacterias endofiticas para propiedades promotoras de crecimiento de plantas en el tabaco.

Dado que las especies de Nicotiana se utilizan en el laboratorio como modelos de plantas grandes para estudios de transformacion y metabolites, sena util ser capaz de utilizar dicha planta para el estudio, incluso si no es util para aplicaciones de campo. Las plantulas de Nicotiana Xanthi se iniciaron en medio de crecimiento sin suelo, y despues del desarrollo de las hojas primarias, se transfirieron a soluciones hidroponicas. Despues de una semana, las plantas se colocaron en soluciones con 108 CFU de Enterobacter sp. 638. Despues de 3 dfas, se refrescaron los inoculos, y despues de un pertedo adicional de tres dfas, las plantas se colocaron en macetas en el invernadero.

Se monitorizo el crecimiento de las plantas semanalmente y se registro el tiempo hasta el inicio de la floracion. Las plantas alcanzaron tamano completo mas rapidamente que las plantas no inoculadas, y la mayona de las plantas estaban en flor un mes antes de que el mismo numero de plantas no inoculadas estuvieran en flor.

Ejemplo 4: Efectos de bacterias endofiticas sobre el desarrollo de la raiz del alamo

Para probar adicionalmente los efectos de bacterias endofiticas sobre el desarrollo de la rafz, se realizaron experimentos de enraizamiento en presencia y ausencia de los derivados marcados con gfp de Enterobacter sp. 638. La formacion de rafz era muy lenta para las plantas no inoculadas. Por el contrario, para los esquejes que se permitieron en la rafz en la presencia de los endofitos seleccionados, la formacion de ratees se inicio dentro de 1 semana, y la formacion de brotes fue mas pronunciada en comparacion con aquella de las plantas no inoculadas (Figura 5A). Despues de 10 semanas, la formacion de ratees para los controles no inoculados era todavfa pobre; sin embargo, en las plantas inoculadas con Enterobacter sp. 638, las ratees y brotes estaban bien desarrollados (Figura 5B). La microscopia de fluorescencia se utiliza para visualizar la colonizacion interna de las ratees de las plantas por las cepas marcadas con gfp, lo que confirma su comportamiento endofito. La formacion de microcolonias sobre la superficie de la rafz, como se observa para P. putida W619, estaba ausente sobre las plantas inoculadas con Enterobacter sp. 638, donde solo se observo colonizacion interna. No se detecto la expresion de gfp para las ratees de las plantas de control no inoculadas.

Ejemplo 5: Efecto de la bacteria endofita sobre fructificacion y productividad de floracion

Para probar el efecto de las bacterias endofiticas de masa de produccion de frutos, semillas de tomate (variedad tradicional Brandywine, Park Seed) se inicio en una matriz de perlita/agua, y luego se transfirio a una solucion hidroponica de solucion de Hoagland de 1/2 resistencia. Cuando las plantas teman aproximadamente 3 pulgadas de altura, se transfirieron a soluciones que conteman 108 CFU por mL de bacterias endofiticas como se describio anteriormente. Tres dfas despues de inoculacion, las plantulas se plantaron en el invernadero en ProMix, una mezcla comercial para macetas. Las fechas de la primera produccion de frutos y la masa total de los tomates se registraron durante tres meses. Las plantas de tomate inoculadas con Enterobacter 638 tuvieron un aumento de 10 % en la productividad del fruto sobre las plantas no inoculadas. Las plantas no inoculadas produjeron 82 frutos con una masa total de 22,374 kg, mientras que las plantas inoculadas produjeron 90 frutos con una masa combinada de 24,909 kg (Figura 6).

Las plantulas de girasol (Mammoth, Park Seed) se iniciaron utilizando el procedimiento descrito, y se registro el tiempo de la floracion. Bajo condiciones de invernadero, los girasoles inoculados comenzaron floracion 5 dfas antes de las plantas no inoculadas, y el 50 % estaban en la flor, mientras que solo florecieron el 10 % de las plantas no inoculadas; 100 % de las plantas inoculadas florecieron mientras que solo florecieron el 70 % de las plantas no inoculadas (Figura 7).

Ejemplo 6: Resistencia a la seqma

Se colocaron esquejes de madera de alamo hterido (Populus deltoides x P. nigra OP-367) en agua durante tres dfas para iniciar la formacion de rafz, y despues se traslado a una solucion de Hoagland de 1/2 resistencia que contema 108 CFU por mL de bacterias endofiticas durante tres dfas. Los esquejes luego se plantaron en macetas que conteman tierra de jardm y se hicieron crecer en el invernadero durante tres meses con agua suministrada excedente. Despues de tres meses, se suspendio el riego de las plantas, y se monitorizo el tiempo para senescencia. Las plantas inoculadas en promedio mostraron un retraso del 20 % en el inicio de los smtomas de seqrna, en comparacion con las plantas no inoculadas.

Ejemplo 7: Resistencia a enfermedades

Debido a que el aumento de vigor de las plantas, asf como los elementos geneticos presentes en las bacterias endofiticas, esas plantas inoculadas demostraran ser mas resistente a la colonizacion de patogenos y esos smtomas seran menos evidentes en las plantas inoculadas.

Los esquejes de alamo hterido, tanto H11-11 (altamente susceptibles a enfermedad fungica) como OP-367 (resistentes a las enfermedades por hongos) ambos seran inoculados como se describe. Las plantas se sierran en mezcla para macetas esteril, y se hicieron crecer hasta que estuvieron presentes seis a ocho hojas. Las plantas se expondran despues a patogenos fungicos, y por lo tanto se monitorizara el tiempo de inicio y gravedad de los

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smtomas ffsicos de la infeccion. Las plantas tambien se pueden analizar para determinar la actividad de genes responsables de la enfermedad conocida.

Ejemplo 8: Estructura del genoma y caracteristicas generales

El genoma de la Enterobacter sp gamma-proteobacteria. 638 (Figura 2) incluye un unico cromosoma circular de 4,518,712 pb con un contenido de G+C total de 52,98 %, e incluye un plasmido pENT638-1 de 157,749 bp, que tiene un contenido de G+C total de 50,57 % (Tabla I). El cromosoma de Enterobacter sp. 638 muestra una transicion de sesgo de GC, que corresponde con su origen de replicacion (oriC) y terminal (Figura 2). El sitio oriC contiene un cuadro perfecto de union a DnaA-(TTATCCACA) (sEq ID NO: 2), que se encuentra 31,985 pb en direccion 5' del codon de inicio ATG dnaA (en la coordenada 4,487,245 bp).

El plasmido exhibe pENT638-1, basado en el contenido de GC, por lo menos cuatro regiones distintas (Figura 3). El plasmido incluye una cadena principal ancestral, que es comun a los plasmidos de la familia F y contiene las funciones basicas del plasmido para la transferencia y replicacion de las regiones que probablemente fueron adquiridas a traves de transferencia de genes horizontal. Estas regiones en el plasmido pENT638-1 muestran una matriz de uso de codon diferente del resto de las especies de Enterobacteriaceae. Adicionalmente, estas regiones no tienen sintenia a los cromosomas secuenciados o plasmidos de cepas estrechamente relacionadas, y estas regiones interesantes codifican genes relacionados con la adhesion y colonizacion a planta. El mantenimiento estable en Enterobacter sp. 638 de pENT638-1 y estas regiones, que presumiblemente desempenan un papel en la interaccion exitosa entre Enterobacter sp. 638 y su planta anfitriona, parece importante con respecto a la presencia de sistemas de seis toxinas relBE/anti-toxina (TA).

Por el contrario, el cromosoma de Enterobacter sp. 638 codifica solo tres parejas de toxina/anti-toxina (Ent638_0434-0435, Ent638_0476-0477, y Ent638_2066-2067). Este numero bajo es representativo de organismos asociados a anfitrion.

El cromosoma codifica 4395 secuencias de codificacion putativas (CDS) que representan una densidad de codificacion de 87,9 %, y el plasmido pENT638-1 codifica 153 CDS putativas que tienen una densidad de codificacion de 80,4 %. Despues de su anotacion manual, 3562 CDS (78,3 %) se podna asignar a una funcion biologica putativa, mientras que 835 CDS (18,4 %) se anotaron como protemas hipoteticas de funcion desconocida. Las protemas hipoteticas conservadas se representan por 684 CDS (15,0 %), mientras que 151 CDS (3,3 %) no teman homologfa con ninguna secuencia previamente reportada. Utilizando el modulo de COGnitor desde el sistema de MAGE, 3597 CDS (79,1 %) se podnan asignar a una o mas clases funcionales (vease Figura 9). El reparto de CDS de Enterobacter sp. 638 entre las diferentes clases COG es muy similar a lo que se observa para E. coli K12. Las tres clases mas abundantes son transporte y metabolismo de aminoacidos (E), hidratos de carbono (G) y hierro inorganico (P) y representan mas del 37 % de todas las CDS, apuntando a los estilos de vida simbioticos de Enterobacter sp. 638 y E. coli K12 que requieren absorcion eficiente de los nutrientes del anfitrion proporcionados. Se encontraron siete conjuntos de 5S, 16S, genes 23S rARN y un gen adicional 5S rARN. Se identifico un total de 83 genes de tARN con especificidades para los 20 aminoacidos, y un unico tARN para selenocistema.

El genoma de Enterobacter sp. 638 codifica 8 factores sigma: fliA (Ent638_2509; Sigma 28), tres Sigma 24 similares a rpoE (Ent638_3060, Ent638_3117 y Ent638_3389), rpoS (Ent638 _3212, Sigma 38), rpoD (Ent638_3473, Sigma 70), rpoN (Ent638 _3638, Sigma 54) y rpoH (Ent638_3865, Sigma 32).

La Enterobacter sp. 638 codifica una metilasa dam activa implicada en la metilacion de adenina en los sitios GATC, como se confirmo por digestion de Mbol y Sau3AI del ADN, la primera enzima es incapaz de digerir el ADN de Enterobacter sp. 638 metilada.

Sobre el genoma de Enterobacter sp. 638 se encontraron cien repeticiones palindromicas (CCCTCTCCCXX(X)GGGAGAGGG) distribuidas de forma desigual sobre el cromosoma (vease Figura 10). Estos bucles de horquilla que forman repeticiones (con XX(X) principalmente son TGT/ACA o AC/TG) a menudo se encuentra en duplicado o triplicado en el extremo 3' de los genes y el papel presumiblemente cumple una funcion en la terminacion de transcripcion.

Ocho elementos de insercion de secuencia (IS) se encontraron en el genoma de Enterobacter sp. 638: dos de la familia IS3/IS51 (un compuesto de tres ORFs con un desplazamiento de marco (Ent638_0739, Ent638 _ 0740, Ent638_0741) y un compuesto de un unico ORF (Ent638_0060)), un elemento IS de la familia IS110 (Ent638_1530), y tres elementos IS de la familia IS481 (Ent638_2980, Ent638_3160 y Ent638_3288). Algunos de estos elementos iS delimitan islas genomicas putativas (vease la seccion a continuacion).

El plasmido pENT638-1 posee dos elementos IS completos, uno de la familia Tn3 compuesto por un ORF (Ent638 _4224) y uno de la familia IS3/IS407 compuesto de dos ORFs (Ent638_4320 y Ent638_4321), asf como dos transposasas truncadas de la ultima familia. El IS completo y la transposasa truncada de las familias IS3/S407 estan flanqueando una gran region que codifica los genes implicados en mantenimiento y replicacion del plasmido (sopAB, repA) y genes implicados en la transferencia de plasmido mediante conjugacion (tra). Esta region de 75 kb puede se puede considerar como la estructura principal pENT638-1.

Al comparar el genoma de Enterobacter sp. 638 con aquellas cepas estrechamente relacionadas, Enterobacter cancerogenus ATCC 35316 se determino que era el genoma mas cercano con 80,4 % de las CDS en sintenia con Enterobacter sp. 638, a continuacion, Klebsiella pneumoniae 342 y MGH 78578 (ambos con 74 % de los CDS en sintenia), seguido por Citrobacter koseri ATCC bAA-895 (73 %) y luego la especie Escherichia coli (entre 63 a 73 %)

5 La adaptacion espedfica de Enterobacter sp. 638 a su planta anfitriona se examino a traves de la comparacion del genoma con otros microbios asociados de la planta y la bacteria gastrointestinal E. coli K12 (MGI655). Esta cepa, elegida como un organismo de referencia, ya que es el mejor genoma bacteriano anotado, compartido (criterios de 80 % de identidad sobre el 80 % de la longitud de la protema) 2938 CDS sintenicas (69,2 % de su genoma) con Enterobacter sp. 638. Las regiones sintenicas se agrupan en 304 sintones con un numero promedio de 10,5 CDS 10 por sinton.

Se identificaron cincuenta y seis regiones en el genoma de Enterobacter sp. 638, que no estaban en sintenia con los genomas de bacterias estrechamente relacionados. Entre ellos, dieciocho regiones cumplen los criterios de islas genomicas putativas (destacadas en gris en el cuadro 2). Estas islas genomicas llevan genes que codifican las protemas implicadas en el transporte de azucar (sistema PTS), adhesion, utilizacion de pectato, receptores de la 15 absorcion a traves de sideroforos de hierro, reduccion de nitrato, biosmtesis de pilus, asf como muchos otros transportadores y reguladores. El numero de region 47 es un ejemplo ilustrativo de la adquisicion de una isla genomica que contiene genes implicados en la adaptacion de un estilo de vida endofito. Esta region codifica un transportador de pectato putativo y protemas de degradacion, lo que puede permitir que la cepa 638 crezca en pectato (un compuesto sintetizado de planta importante) como fuente de carbono. Esta isla genomica esta 20 flanqueada por un gen de integrasa y se inserta en un sitio tARN-Gly.

Se encontraron ocho fagos y un plasmido integrado putativo en el cromosoma. Se encontro un total de 302 protemas de fagos, que incluyen 18 genes de la integrasa putativos.

Adicionalmente, el cromosoma de Enterobacter sp. 638 contiene una region con Repeticiones Palindromicas Cortas Agrupadas y Regularmente Interespaciadas (CRISPR) situada junto a seis genes (Ent638_1401-1406) que codifican 25 secuencias asociadas a CRISPR (CAS). Es probable que la CRISPR proporcione tolerancia adquirida contra los bacteriofagos. Seis de los ocho profagos se flanquean por regiones, que carecen de sintenia con las regiones correspondientes de bacterias estrechamente relacionadas, tales como E. coli K12, 0157-H7 y UTI89, Klebsiella pneumoniae MGH 78578 o Citrobacter koseri BAA-895, y que pueden haber sido adquiridas a traves de transduccion del fago. Estas regiones contienen genes importantes en interacciones de bacterias/plantas tales como 30 aminoacidos y transportadores de hierro/sideroforos, hemolisina (HCP), y una protema y transportador de hemaglutinina (Tabla 2, Figura 2). Hasta ahora, no se demostro experimentalmente la movilidad inter o extracelular de las islas genomicas, fagos y elementos IS.

Ejemplo 9: Supervivencia en la rizosfera de la planta: vista general de las capacidades metabolicas de Enterobacter sp. 638

35 En general, el alamo se multiplica por esquejes, y puesto que el numero de endofitos en esquejes es muy bajo, muchas especies de bacterias endofitas tienen que sobrevivir en el suelo antes de la colonizacion de alamo. La Enterobacter sp. 638 se adapta bien para sobrevivir en la rizosfera de plantas, ya que codifica muchos transportadores implicados en carbohidratos de, aminoacidos y la absorcion de hierro, asf como algunos genes de resistencia a metales pesados. La mayona de las rutas metabolicas descritas a continuacion fueron confirmadas por 40 el cultivo de la cepa 638 en condiciones de crecimiento selectivas (Taghavi et al. 2009).

Metabolismo de carbohidratos

El genoma de Enterobacter sp. 638 codifica todas las vfas de metabolismo central, que incluyen el ciclo del acido tricarboxflico, las rutas Entner-Doudoroff, EmbdenMeyerhof-Pamas y pentosa-fosfato. La cepa es incapaz de crecer fr forma autotrofica, pero puede utilizar una gran variedad de compuestos como fuentes de carbono: D-manitol, 45 lactosa, sacarosa, arbutina, salicina, trehalosa, D-manosa, L-arabinosa, maltosa, celobiosa, xilosa, gluconato y glucosa (Taghavi et al. 2009). La Enterobacter sp. 638 posee una lactasa (lacZ, Ent638_0928), una isomerasa de xilosa (Ent638_0156) y una xiluloquinasa (Ent638_0157). La utilizacion de lactosa como unica fuente de carbono es una caractenstica de la Enterobacteriaceae. La Enterobacter sp. 638 tiene la capacidad genetica de crecer en malonato, su genoma contiene un grupo de nueve genes (mdcABCDEFGHR, Ent638_3779-Ent638_3772) que 50 participan en la descarboxilacion del malonato que cataliza la conversion de malonato en acetato.

La diversidad de utilizacion de azucar podna estar relacionada con la diversidad de glicosido hidrolasas. El genoma de Enterobacter sp. 638 lleva 55 genes que codifican glicosido hidrolasas putativas, que representan 24 familias diferentes (base de datos CAZy). Por el contrario, tambien se debe mencionar que el patogeno Enterobacter sakazakii humano posee 63 glicosido hidrolasas (base de datos CAZy).

55 Las bacterias patogenas de plantas y la ganancia hongos acceden al degradar activamente los compuestos de pared celular de planta utilizando glicosido hidrolasas, que incluyen celulasas/endoglucanasas (que incluyen miembros de las familias de glicosido hidrolasa GH5, GH9, GH44, GH48 y GH74), lichenases (GH16) y xilanasas (GH10, GH11). Las hidrolasas sin glicosido que representan a los miembros putativos de las familias endo, exo,

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celulasa y hemicelulasa comunmente utilizadas para descomponer poUmeros de la pared celular de plantas se codificaron en el genoma de Enterobacter sp. 638. Esta observacion es consistente con el comportamiento no fitopatogeno de Enterobacter sp. 638. Sin embargo, hay que senalar que dos endo-1,4-D-gluconasas (GH8) (bcsZ: Ent638_3928, Ent638_3936) se encontraron como parte de un locus de smtesis de celulosa bacteriana.

Absorcion de nutrientes de plantas

Los organismos que viven en asociacion simbiotica, como Enterobacter sp. 638 y su anfitrion alamo, por ejemplo, necesitan compartir recursos, por lo tanto, se espera que el genoma de Enterobacter sp. 638 codifique una gran diversidad de transportadores que le permitan tomar los nutrientes liberados de las plantas. Un total de 631 ORFs codifican las protemas transportadoras putativas: entre ellas 295 transportadores ABC codificados (que incluyen un transportador de fosfato), 81 transportadores codificados de la principal superfamilia facilitadora (MFS), 41 transportadores codificados de la familia de sistemas de fosfo transferasa (PTS) y 14 transportadores codificados de la familia de nodulacion resistente y division celular (RNO) (vease la lista completa de los transportadores putativos y sus sustratos en SOM). Esta observacion es consistente con el estilo de vida asociado a planta de Enterobacter sp. 638, que requiere absorcion eficiente de los nutrientes sintetizados de plantas, que incluyen aquellos liberados en la rizosfera.

El genoma de Enterobacter sp. 638 codifica muchos transportistas PTS. Se utilizo el analisis filogenetico para asignar la especificidad de sustrato a los transportadores PTS de Enterobacter sp. 638: 7 pertenedan a los a- glicosidos (para absorcion de glucosa, N-acetilglucosamina, maltosa, glucosamina y a-glicosidos), 7 a los p- glicosidos (para absorcion de sacarosa, trehalosa, acido N-acetilmuramico y p -glicosidos), 2 eran transportadores PTS de fructosa (para absorcion de l fructosa, manitol, manosa y D-glicerato de 2-O-a- manosilo) y 6 eran transportadores PTS de lactosa (para absorcion de lactosa, celobiosa y beta-glicosidos aromaticos).

Resistencia a metales pesados

El genoma de Enterobacter sp. 638 lleva genes supuestamente implicados en la resistencia de cobre, que incluyen una ATPasa CopA de tipo P (Ent638_0962) cuya expresion esta regulada por CueR (Ent638_09630), el operon de eflujo de cobre cusABCF (Ent638_1157-1154), el CueO de oxidasa de cobre multiple (went638_0671) y un operon que codifica las protemas putativas de resistencia de cobre COPC y EPOC (Ent638_2411-12). Curiosamente, la cepa no logro crecer en medio mmimo de glucosa 284en presencia de 100 |jM de CU(NO3)2.

El genoma de Enterobacter sp. 638 tambien codifica un grupo de resistencia a arsenico/arseniato que se encontro contiguo al origen de replicacion del plasmido pENT638-1 (arsHRBC, Ent638_4254-Ent638_4257), y se encontro que la cepa 638 era crece con exito en medio mmimo de glucosa 284 en presencia de arseniato 200 jM (como Na2HAsO4).

La presencia de genes de resistencia a arseniato y cobre putativo no es inesperada, ya que la Enterobacter sp. 638 se aislo a partir del alamo que crece en la zona que fue afectada por las emisiones la fundicion ASARCo en Tacoma, WA, una fundicion de cobre que durante las operaciones de 1905 a 1982 fue considerada como una de las mayores fuentes de emision de arsenico en los EE.UU..

Otros genes de resistencia a metales pesados localizados en el cromosoma incluyen una reductasa cromato putativo (YieF o ChrR, Ent638_4144) y una ATPasa ZntA de eflujo tipo P (Ent638_3873) que participan en la resistencia de zinc/cadmio/cobalto. La cepa 638 fue capaz de crecer en medio mmimo de glucosa 284 en presencia de ZnSO4 500 jM, CdCh 500 jM, CoCl2 100 mM, y NiCh 50 mM. Aunque se podna argumentar que estos genes tambien estan presentes en otras especies de E. coli, su presencia puede ser suficiente para proporcionar una ventaja selectiva sobre otras bacterias para sobrevivir en la rizosfera, especialmente cuando estos metales estan presentes.

Los metales pesados tambien son cofactores importantes, y el genoma de Enterobacter sp. 638 codifica varios genes implicados en la absorcion y eflujo de metales pesados. Se encontraron genes para transportadores ABC que participan en la absorcion de zinc (znuACB, Ent638 _2426- 2428) y mquel (nikABCDE, Ent638_1834-Ent638_1838). El mquel es un cofactor esencial para la ureasa (Dosanjh et al. 2007), y a diferencia de E. coli KI2 y S. proteamaculans 568, Enterobacter sp. 638 es capaz de convertir la urea en amomaco (ureABC, Ent638_3464- Ent638_3466).

Estres oxidativo, que neutraliza el mecanismo de defensa de la planta

Las plantas utilizan una variedad de mecanismos de defensa contra infecciones bacterianas, vmicas y fungicas, que incluyen la produccion de especies de oxfgeno reactivas (ROS) (superoxido, radical de peroxido de hidrogeno hidroperoxilo y especies de radicales hidroxilo), oxido mtrico y fitoalexinas. Antes de la colonizacion de rafz, la cepa 638 tiene que sobrevivir en un ambiente de rizosfera oxidativo. El cromosoma de Enterobacter sp. 638 codifica tres superoxido dismutasas: SodC, una superoxido dismutasa de Mn (Ent6388_4063); SodB una superoxido dismutasa de Fe (Ent638_1191); y sodC, una superoxido dismutasa deCu/Zn (Ent638_1801). Tambien contiene tres catalasas, KatE (Ent638_1712), KatN (Ent638_3129) y KatG (Ent638_4032), tres hidroperoxido reductasas, ahpC (Ent638_0872 y Ent638_1145) y ahpF (Ent638 _1146), dos hidroperoxido reductasas adicionales (una ahpC

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Ent638_3391 y Ent638_0498 putativa que tiene un dominio AhpD), una cloroperoxidasa (Ent638_1149), y dos tiol peroxidasas (Ent638_2151 y Ent638_2976).

Tambien se identificaron una protema con resistencia a peroxido putativa organica (ohr, Ent638_0518) situada al lado de su sensor/regulador de peroxido organico (ohrR, Ent638_0519).

La Enterobacter sp. 638 parece capaz de desintoxicar oxido nftrico de radicales libres por la presencia dioxigenasa de oxido mtrico de flavohemoprotema (Ent638_3037) y un operon de reduccion de nitrato anaerobico (norRVW, Ent638_3181-3183). La expresion de los sistemas de respuesta a estres oxidativo se controla a traves de redes reguladoras complejas. Un regulador clave es sensor de peroxido de hidrogeno OxyR (Ent638_4025), que activa la expresion de un regulon de genes inducibles por peroxido de hidrogeno tales como katG, gor (glutation reductasa, Ent638 _3913), ahpC, ahpF, oxyS (un ARN regulador, Ent638 _mise ARN _29), dpsA (una proteccion del ADN durante protema de privacion, Ent638_1299), fur (un regulador transcripcional de union a ADN doble de la biosmtesis y transporte de sideroforo, Ent638_1198) y grxA (glutarredoxina, Ent638_1364), todos los cuales estan presentes en Enterobacter sp. 638. Tres genes de glutation S-transferasa (GST) (Ent638_0139, Ent638_0268 y Ent638_1329), una transportador ABC de glutation (GsiABCD, Ent638_1323-l326), dos glutation peroxidasas (Ent638_1732 y Ent638_2699), una ligasa gamma-glutamato-cistema (GshA, Ent638_3168), glutation sintetasa (GsHb, Ent638_3351) y gamma-glutamiltranspeptidasa (GGT, Ent638_3850) se encontraron en el genoma de Enterobacter sp. 638. Un locus AcrAB (Ent638_0943-0944), que pertenece a la familia RND de transportadores tambien fue identificado en el genoma de Enterobacter sp. 638.

Ejemplo 10: Colonizacion Endofitica y establecimiento en la planta anfitriona

La colonizacion endofftica de un anfitrion de planta se pueden dividir en un proceso de cuatro etapas (van der Lelie et al 2009.).

Etapa 1: Movimiento hacia las rames del alamo: motilidad/quimiotaxis

La Enterobacter sp. 638 esta bien equipado para moverse activamente hacia las rafces de las plantas, el sitio preferido de la colonizacion endofita. Su genoma contiene tres operones de biosmtesis flagelar (flgNMABCDEFGHJJKL, flhEAB fimA yraLJ/pjD cheZYBR tap tar csuEDCAB int cheWA motBAf IhCDf liYZA fliCDSTEFGHJKLMNOPQR, Ent638 _2445-2541 y fliEFHJJKLMNOPQR).

Sin embargo, el operon flh de Enterobacter sp. 638 contiene dos inserciones de genes de biosmtesis de pili. Una de estas regiones (csu) esta flanqueada por una integrasa, que apunta a la adquisicion posterior. La Enterobacter sp. 638 tambien tiene una gran cantidad de genes de biosmtesis de pilus/fimbrias (por lo menos 60 genes). En la Enterobacter sp. 638, los genes de biosmtesis de pilus/fimbrias se agrupan en 10 regiones distintas. Tambien se descubrieron determinantes implicados en la quimiotaxis (che) dentro del grupo de genes de biosmtesis flagelar.

Etapas 2 y 3: Adhesion y colonizacion de la superficie de las rames

En la Enterobacter sp. 638, se identificaron diversos genes que codifican las protemas implicadas en la adhesion putativa a la rafz. Muchos se encuentran en las islas genomicas o en el plasmido pENT638-1, que apunta hacia una funcion espedfica de este plasmido durante esta etapa de la colonizacion de las rafces de plantas. En particular, pENT638-1 contiene una isla putativa genomica de 23 kb (flanqueada por un gen de integrasa, y que tiene un % de GC de 56,2, que es significativamente mayor que el resto del plasmido), asf como un operon srfABC putativo. La funcion exacta del operon srfABC aun no es clara, pero se considera que esta involucrada en la colonizacion del anfitrion.

Muchos otros genes implicados en la invasion de plantas estan presentes en pENT638-1, e incluyen protemas putativas con un dominio autotransportador (tipo V de secrecion) y un dominio de virulencia/adherencia (hemaglutinina (Ent638 4267), pertactina (Ent638_4201 y Ent638 _4206) y adhesion (Ent638_4317)) (Figura 3).

Hemaglutinina: El cromosoma de Enterobacter sp. 638 codifica dos protemas de hemaglutinina putativas (Ent638_0148, Ent638_3119), y un grupo compuesto de cinco genes que codifican la hemaglutinina filamentosa (Ent638_0052-0057).

Adicionalmente, se encontraron varios genes sobre el cromosoma de Enterobacter sp. 638 que codifican las protemas autotransportadoras con un dominio de pectina liasa/pertactina (Ent638_1775, Ent638_0318, Ent638_0501), o un dominio de adhesion (Ent638_1867, Ent638_3408).

Los dos genes yadA de Enterobacter sp. 638 (Ent638 _1867 y Ent638 _4317) ambos codifican una protema con un dominio autotransportador y un dominio de invasina/adhesion. La protema YadA podna promover la colonizacion/invasion de plantas, pero tambien puede representar un remanente de un estilo de vida enterico antiguo.

El gen de hemaglutinina sobre pENT638-1 (Ent638_4267) esta rodeado por dos sistemas de toxina RelBIE/anti- toxina. La hipotesis es que la hemaglutinina Ent63 _4267 debe desempenar una funcion importante en la adhesion

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de ra^z para ser estabilizada de esta manera sobre pENT638-1. Junto con el gen de hemaglutinina Ent638_4267, se identificaron dos genes (Ent638_4265-4266) que codifican una protema que contiene un dominio de repeticion de tetratricopeptido (TPR-2), supuestamente implicados en la interaccion protema-protema y el montaje correcto del aparato de adhesion.

Pili Tipo I y IV: Seis protemas indicadoras putativas se encontraron en el genoma de Enterobacter sp. 638 (Ent638_0084, Ent638_0403, Ent638_0990, Ent638_1071, Ent638_2450, y Ent638_2459). Esta cantidad es mucho mayor que la cantidad promedio de protemas indicadoras encontradas en otros generos de bacterias vegetales asociados.

En el cromosoma de Enterobacter sp. 638 se identificaron 56 genes implicados en la biosmtesis de pili/curli/fimbrias, que incluyen 6 grupos de genes de la biosmtesis de pili tipo I (Ent638_0074-0086, Ent638_0401-0409, Ent638_0987-0994, Ent638_1068-1072, Ent638_2448-2451, Ent638_2458-2462). Los dos ultimos grupos se flanquean y separan por genes implicados en quimiotaxis y motilidad (biosmtesis flagelar) (vease seccion motilidad), y estan posiblemente involucrados en la formacion de biopelmulas sobre las superficies abioticas. Esta region (Ent638_2445-2541) representa un buen ejemplo de la agrupacion de genes implicados en diferentes aspectos de la colonizacion de rafces de planta (quimiotaxis, motilidad y adhesion).

Pili tipo IV. Sobre el genoma de Enterobacter sp. 638, se identificaron dos grupos de genes de biosmtesis de pili tipo IV, (Ent638_0650-0652, y Ent638_3266-3268), asf como un grupo de genes de biosmtesis de pilus no caracterizados putativos (Ent638_3804 y Ent638 _3808) que estan posiblemente involucrados en la absorcion de ADN.

Fibras Curli. Estructuralmente y bioqmmicamente, el curli pertenece a una clase creciente de fibras conocidas como amiloides. Sobre el genoma de Enterobacter sp. 638, se identifico un grupo para la biosmtesis de curli (Ent638_1553-1559).

Biosmtesis de celulosa

De acuerdo con su comportamiento no patogeno el genoma de Enterobacter sp. 638 no codifica las protemas implicadas en la degradacion de celulosa. Sin embargo, se identifico un operon responsable de la biosmtesis de celulosa (Ent638_3927-3940).

Virulencia

Los estudios microscopicos mostraron que la Enterobacter sp. 638 coloniza el xilema de rafz entre el lumen de las lenticelas; no se observo ninguna colonizacion intracelular (Taghavi et al. 2009).

A pesar de que no se encontro que la Enterobacter sp. 638 actuara como un patogeno oportunista en los estudios de colonizacion de planta, sus codigos de genoma para diversas protemas estan implicados en la virulencia. Cabe senalar que la virulencia tambien puede requerir una estrecha interaccion entre la bacteria y su anfitrion, similar a lo que puede ser necesario para la colonizacion endofita. Se identificaron un gen (yqfA, Ent638_3317) que codifica para una hemolisina de membrana interna (familia III), una CDS parcial (went638_0251) que contiene un dominio de hemolisina putativo, y tres genes hcp que codifican factores de virulencia (Ent638_0829, Ent638_2912 y Ent638_3004).

Otros factores de virulencia putativos incluyen pagC (Ent638_3136) y msgA (Ent638_1656), que son necesarios para la virulencia y supervivencia dentro de los macrofagos, y virK putativo; los genes (Ent638_1394 y Ent638_2409), cuyo producto es necesario para expresion y localizacion de la membrana correcta de VirG (Ent638_3560) sobre la superficie celular bacteriana.

Sin embargo, no se identificaron los genes que codifican un sistema de secrecion de tipo III, que es un requisito previo para un estilo de vida activo virulento tfpico para patogenos tales como Erwinia y P. syringae, sobre el genoma de Enterobacter sp. 638.

Por ultimo, similar al plasmido pENT638-1, un operon srfABC (Ent638_2108-Ent638_2110) fue encontrado en los cromosomas de Enterobacter sp. 638. La funcion de estos genes en el comportamiento endoftico sigue sin estar clara.

Etapa 4: Invasion de la rafz y establecimiento de planta a traves de colonizacion activa

La Enterobacter sp. 638 puede entrar en las rames de las plantas en los sitios de dano de tejidos porque su secuencia de genoma no codifica endo/exo-celulasas o hemicelulasas que permitinan la colonizacion endoftica a traves de la descomposicion activa de paredes celulares de la planta.

Degradacion de pectina/pectato

Aunque la Enterobacter sp. 638 no es capaz de crecer sobre pectina (poli(1,4-alfa-D-galacturonato) como unica fuente de carbono, su genoma contiene una isla genomica que codifica los genes implicados en la degradacion de

pectato, la estructura principal desmetilada de pectina y un constituyente de la pared celular de la planta. La capacidad de Enterobacter sp. 638 para degradar pectato podna desempenar una funcion en la colonizacion de la region interespacial entre celulas vegetales.

Una liasa pectato secretada, PelB, involucrada en la division de pectato en oligosacaridos con 4 grupos 4-desoxi- 5 alfa-D-galact-enuronosilo en sus extremos no reductores se encontro al lado de una porina espedfica a oligogalacturonato, KdgM, implicada en la absorcion de oligogalacturonidos en el periplasma. Una pectinasa periplasmica, PelX, codificada por una diferente region del genoma, esta implicada en la degradacion periplasmica de oligogalacturonidos.

En otra region, se identificaron un transportador ABC de absorcion de carbohidratos, TogMNAB, involucrado en la 10 translocacion de oligogalacturonidos a traves de la membrana interna y diversas protemas adicionales, Ogl, Kdul y KduD, involucradas en la degradacion de oligogalacturonidos en 2- deshidro-3-desoxi-D-gluconato. Los KdgK y KdgA implicados en el metabolismo de D-glucuronato, degradan adicionalmente 2-deshidro-3-desoxi-D-gluconato en piruvato y 3- fosfogliceraldehido, ambos compuestos del metabolismo celular general. Esta region, que esta flanqueado por una transposasa de la familia IS487, podna haber sido adquirida a traves de transferencia de genes 15 horizontal. Las protemas UxaA, UxaB, y UxaC, necesarias para la ruta alternativa para degradar galacturonato en 2- deshidro-3-desoxi-D-gluconato, tambien estan codificadas por el cromosoma de Enterobacter sp. 638. La degradacion de pectato tiene que estar bien regulada con el fin de evitar un efecto patogenico.

El plasmido pENT638-1 lleva dos genes vecinos (Ent638_4201, Ent638_4206) que codifican las protemas autrotransportadoras con un dominio de pectina liasa. Estas protemas pueden estar implicadas en la adhesion de 20 Enterobacter sp. 638 a las rames de alamo o como parte de un mecanismo de colonizacion que implica la exportacion de enzimas capaces de lisar las paredes celulares de las celulas de la rafz. Entre estos dos genes, se identificaron dos reguladores transcripcionales componentes, lo que sugiere una estrecha regulacion, asf como dos genes adicionales implicados en la biosmtesis de polisacarido capsular (Ent638_4207) y la codificacion de una glicosiltransferasa (Ent638_ 4208). Se ha planteado la hipotesis de que los lipopolisacaridos de la superficie celular 25 (LPS) estan involucrados en la especificidad del anfitrion, y la proximidad de estos genes sugiere un papel de colaboracion en la invasion de plantas por Enterobacter sp. 638.

La celobiosa fosforilasa del plasmido pENT638-1

Sobre el plasmido pENT638-1, el gen ndvB (8532 pb) situado proximo al origen del plasmido de replicacion codifica una protema implicada en la produccion de p- (1->2)-glucano. La protema NdvB unida a membrana cataliza tres 30 actividades enzimaticas: la iniciacion (protema de glicosilacion), alargamiento, y ciclacion in situ de p-(1->2)-glucano, que luego se libera en el periplasma.

Ejemplo 11: Interacciones sinergicas con la planta anfitriona: salud y promocion de crecimiento de la planta

Efectos indirectos que promueven el crecimiento de plantas Fijacion de nitrogeno y metabolismo

35 La Enterobacter sp. 638 es incapaz de fijar el nitrogeno y carece de los genes nif requeridos. Sin embargo, contiene los genes necesarios para rutas de reduccion de nitrato disimilatorias y asimilatorias. Los genes de transporte de nitrato y reduccion de nitrato/nitrito estan presentes dentro de los dos operones (narlJHGKXL y nasAB ntrCBA nasR, Ent638_2312-Ent638_2326) separados por una integrasa y un gen de adhesion/invasion putativo. Otras regiones implicadas en el transporte y reduccion de nitrito (nirBDC, Ent638_3793-3795), transporte y reduccion de nitrato 40 (narUZYWV, Ent638_2061-Ent638_2065), y un transportador de absorcion de amonio (amtB, Ent638_0919) y su

regulador (Ent638_0918), asf como la protema de sensor de nitrato/nitrito (narQ, Ent638_2964) en su cromosoma.

Sideroforos

La Enterobacter sp. 638 ha desarrollado una solucion intermedia para hacer frente a la absorcion de hierro. Su genoma contiene dos sistemas de absorcion de hierro ferroso (FeoAB, EfeUOB) y nueve transportadores ABC de 45 hierro.

La Enterobacter sp. 638 es capaz de sintetizar la enterobactina sideroforo ((EntD, EntF, EntC, EntE, EntB y EntA) para secretarla (EntS), para recuperar el complejo de hierro-enterobactina utilizando un sistema de absorcion de sideroforo ferrico (ExbDB), y extraer el hierro utilizando una esterasa enterobactina (Fes) despues de la internalizacion del complejo de hierro-enterobactina. Los genes implicados en esta biosmtesis de enterobactina se 50 agrupan junto con genes que codifican dos transportadores ABC implicados en la absorcion de hierro (sitABCD y fepCGDB) en un gran grupo de 17 genes (Ent638_1111-1128). Adicionalmente, la Enterobacter sp. 638 posee l2 receptores de sideroforos relacionados ferricos y relacionados con ferricos de la membrana externa (TonB dependiente), que es casi el doble de la cantidad encontrada en E. coli KI2 (que solo posee 7 receptores de sideroforos). Esta observacion es consistente para una bacteria que tiene que competir por el hierro. Por lo tanto, la 55 presencia de un sistema de absorcion de hierro eficiente puede contribuir a proteger a la planta anfitriona contra la infeccion fungica.

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Compuestos antimicrobianos

La Enterobacter sp. 638 mostro producir constitutivamente feniletilalcohol. Esta molecula, que se utiliza comunmente en perfumena, da un aroma floral agradable de Enterobacter sp. 638, pero mas interesante tiene propiedades antimicrobianas. Dos genes candidates (Ent638 _1306 y Ent638_1876) codifican una enzima supuestamente implicada en la conversion de fenilacetaldetedo en feniletflico. Estos dos genes se encuentran en las regiones no sintenicas con otras cepas estrechamente relacionadas.

El 4-hidroxibenzoato es un precursor de la ubiquinona portadora de electrones importante, pero tambien se conoce por tener actividad antimicrobiana. La Enterobacter sp. 638 posee el gen ubiC (Ent638_0243) que codifica la protema putativa capaz de realizar esta reaccion.

El genoma de Enterobacter sp. 638 codifica una cloranfenicol acetiltransferasa (cat, Ent638_1533) implicada en resistencia al cloranfenicol y pueden ayudar a las bacterias a sobrevivir contra los compuestos antimicrobianos producidos por otros organismos endofitos o rizosfericos.

Ejemplo 12: Promocion del crecimiento de planta directo de promocion mediante Enterobacter sp. 638

1-aminociclopropano 1-carboxilato desaminasa

El 1-aminociclopropano-1-carboxilato (ACC) desaminasa (acd), (EC: 3.5.99.7) esta ausente del genoma Enterobacter 638, lo que confirma los estudios anteriores de que la cepa es incapaz de metabolizar ACC (Taghavi et al. 2009). Sin embargo, se encontro que la desaminasa de aminoacidos, pero todos ellos carecen de aminoacidos particulares, E 296 y L 323 (sustituidos respectivamente por una T o S y una T) que se acercan al atomo de nitrogeno de piridina de PLP en el sitio activo.

Produccion de las hormonas que promueven crecimiento de las ratees acetoma y 2,3-butanodiol

El genoma de Enterobacter sp. 638 lleva el gen poxB (Ent638_1387) que codifica una piruvato deshidrogenasa. Mientras que la funcion principal de poxB es convertir el piruvato en acetaldetedo, una pequena fraccion del piruvato se convierte en acetoma, como un subproducto del intermedio de la reaccion de difosfato hidroxietil-tiamina.

El genoma de Enterobacter sp. 638 codifica una acetolactato sintasa (budB, Ent638_2027) implicada en la conversion de piruvato en acetolactato. La descarboxilasa acetoma (BudA, Ent638_2026) cataliza la conversion de acetolactato en acetoma. La acetoma se puede liberar por las bacterias o posteriormente se convierte en 2,3- butanodiol mediante la reductasa acetoma (budC, Ent638_2028) ya sea por Enterobacter sp. 638 o por el alamo. Bajo condiciones aerobicas, el acetolactato se convierte espontaneamente en diacetilo, que a su vez se puede convertir en acetoma por la protema deshidrogenasa acetoma (Ent638_2737).

La biosmtesis de compuestos volatiles mediante Enterobacter sp. 638 y su induccion mediante la adicion de extractos de hojas de alamo se investigo mediante espectrometna de masas. La produccion de 2,3-butanodiol y acetoma se observo en las muestras que conteman Enterobacter sp. 638 y extracto de hoja de alamo a partir de l2 horas despues de induccion (Figura 8). Cabe senalar que la smtesis de diacetilo no pudo ser confirmada, pero es probable que se produzca sobre la base de la presencia de las rutas metabolicas completas para los tres compuestos. Se observaron picos adicionales tanto en las muestras experimentales y de control (6:42, 9:45, y 14:01) y se realiza actualmente la identificacion de estos compuestos.

El genoma de Enterobacter sp. 638 carece de los genes (acoABCX adh) involucrados en la conversion catabolica de acetoma y 2,3-butanodiol a metabolitos centrales. Por lo tanto, no existe ningun efecto antagonico entre la produccion y degradacion de estas hormonas de crecimiento de plantas mediante Enterobacter sp. 638.

Produccion de la hormona 1AA de crecimiento de plantas

La produccion de acido indol acetico (IAA) por Enterobacter sp. 638 se demostro experimentalmente (Taghavi et al. 2009). La biosmtesis de IAA es probablemente a traves de la produccion de indolpiruvato como una molecula intermedia por la ruta de degradacion de triptofano VII (aminotransferasa de aminoacidos aromaticos, Ent638_1447). La descarboxilasa indolpiruvato PIDC (Ent638_2923) y las deshidrogenasas indol-3-acetaldehndo putativas (Ent638_0143) catalizan la smtesis adicional IAA.

TABLA 1

Enterobacter sp. 638

Rasgos

Cromosomas Plasmido

tamano (bp)

4, 518, 712 157, 749

contenido G+C

52,98 50,57

Numeros ORF

4406 152

funcion asignada (incluyendo putativa)

3457 108

Enterobacter sp. 638

Rasgos

Cromosomas Plasmido

biosmtesis de aminoacidos

174 2

familia de aminoacidos aromaticos

28 0

Familia de aspartato

44 0

Familia de glutamato

47 1

Familia de piruvato

35 1

Familia de serina

21 0

Familia de histidina

11 0

Purinas, pirimidinas, nucleosidos y nucleotidos

93 0

acido graso y metabolismo de fosfolfpidos

71 0

Biosmtesis de cofactores, grupos prosteticos, y portadores

195 2

Metabolismo intermediario central

218 2

Metabolismo de energfa

553 2

Transporte y protemas de union

631 3

Porcentaje de protemas transportadoras

14 % 2 %

Familia ABC

293 2

Familia MFS

79 2

Familia PTS

41 0

Familia RND

14 0

Aminoacidos, peptidos y aminas

118 0

Aniones

20 0

Carbohidratos, alcoholes organicos, y acidos

106 1

Cationes y compuestos que llevan hierro

109 1

Nucleosidos, purinas y pirimidinas

9 0

Porinas

18 0

Sustrato o farmaco desconocido

2 0

Metabolismo del ADN

152 4

Transcripcion

281 4

Smtesis de protema

177 0

Destino de protema

188 1

Funciones reguladoras

515 6

Sistema de dos componentes

65 3

Envoltura celular

279 3

Procesos celulares

457 6

Procesos biologicos

276 0

RHS

2 0

Funciones de plasmido

7 42

plasmido integrado putativo

1 0

Pareja de toxina/antitoxina

3 7

Funciones de profago

302 0

Regiones de fago

8

Claims (9)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento para aumentar la tolerancia a seqma en una planta que comprende aplicar una composicion a la planta en una cantidad efectiva para aumentar la tolerancia a seqma en la planta, en el que la composicion comprende un cultivo aislado de Enterobacter sp. 638.

   5 2. El procedimiento de la reivindicacion 1, que comprende aplicar la composicion a una rafz, un brote, una hoja, y/o

   una semilla de la planta.
2. 3. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la planta es una angiosperma.
3. 4. El procedimiento de la reivindicacion 3, en el que la angiosperma es tomate.
4. 5. El procedimiento de la reivindicacion 3, en el que la angiosperma es un alamo.

   10 6. El procedimiento de la reivindicacion 3, en el que la angiosperma es soja.
5. 7. El procedimiento de la reivindicacion 3, en el que la angiosperma es mafz.
6. 8. El procedimiento de la reivindicacion 3, en el que la angiosperma es pepino.
7. 9. El procedimiento de la reivindicacion 3, en el que la angiosperma es guisante.
8. 10. El procedimiento de la reivindicacion 3, en el que la angiosperma es rabano.

   15 11. El procedimiento de la reivindicacion 3, en el que la angiosperma es brocoli.
9. 12. El procedimiento de la reivindicacion 3, en el que la angiosperma es espinaca.

   Fig. 1

   CT>

   —

   ;...........................................Klebsiella pneumoniae 342, genoma complete

   ...........................................................'ty :■■■fi? Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae MGH 78578, secuencia completa

   Klebsiella pneumoniae NTUH K2044 ++ADN, genoma completo _ ft gen Xde ARN ribosomico W721165 Klebsiella sp., secuencia parcial

   m Q -.............................* gen de ARN ribosomico F51-1-2 165 Klebsiella sp., secuencia completa

   ..................................................................................gen de ARN ribosomico TNT2 165 Klebsiella sp., secuencia parcial

   ■ .......................... v gen de ARN ribosomico rennanqilfyl8 165 Klebsiella sp., secuencia parcial

   ......

   '• ■■•■■■■■ftgen de ARN ribosomico 165 Klebsiella planticola, secuencia parcial

   ■•ftigen Raoutella omithinolytica para ARNr165, secuencia parcial

   .................gen ARNr parcial Klebsiella omithinolytica, cepa JCM6096T

   qgn ARN ribosomico TNT 165 Klebsiella sp., secuencia parcial 't' gen ARN ribosomico Hg407 165 KlebsieIIa sp., secuencia parcial

   ...............——ft.gen ARN ribosomico 165 Pantoeagglomerans, secuencia parcial

   ................................................................-ft gen ARN ribosomico NTG-01 165 cepa Enterobacter aeogenes, secuencia parcial

   ——3-gen ARNr 165 parcial Enterobacter aeogenes cepa NTC 10006T

   -•■ft gen ARN ribosomico 165 ZJS0+ cepa Enterobacter aeogenes, secuencia parcial

   .................Gen TUT101+ de Enterobacter aeogenes para ARNr 165, secuencia parcial

   .....................................................................................................^ Gen ARN ribosomico 165 cepa 5 de Klebsiella oxytoca, secuencia parcial

   .......................................................................................ARN ribosomico 165 pp9c Enterobacter aeogenes

   ...............................................................Gen ARN 165 Enterobacter cloacae, aislado 766

   ........................................................'ft Gen ARN ribosomico 165 J11 Enterobacter sp., secuencia parcial

   SGen ARNr 165 Enterobacter ludwigii,tipo cepa EN-119T

   :...........................................ft Gen ARN ribosomico 165 cepa B5 de Enterobacter cloacae, secuencia parcial

   v.’ Gen ARN ribosomico 165 MAC L08B Enterobacter sp. secuencia parcial £-"■...........gen ribosomico 165 Citrobacter braakii, secuencia parcial

   . ...............................................................................................................................-ft ARN ribosomico 165 cepa IITRL7 Citrobacter werkmanii

   ...............................................................ft Gen ARN ribosomico 165 TNT5 Citrobacter, secuencia parcial

   ■ft Gen ARN ribosomico 165 Citrobacter freundii, secuencia parcial

   ...................................................................................................'ft Gen ARN ribosomico 155 PIC15 Enterobacter sp., secuencia parcial

   .....................................................................................................Parcial 165. Kluyvera ascorbata

   5s .......................................................R ribosomico 165 cepa CDC 1058/74 Kluyvera ascorbata

   :...................................................................................... -ft Gen ARNr 165 parcial Kluyvera cryocrescens, aislado 169

   Gen de ARN ribosomico 165 TM1_3 Enterobacter sp., secuencia parcial

   ribosomico 165 LMG10245-T Enterobacter nimipressuralis ■•ft>Gen ARN ribosomico 165 TM1_4 Enterobacter sp., secuencia parcial

   .....................................................................................................ft Gen ARNr 165 Buttiauxella agrestis (cepa D5M4586)

   # 3 Enterobacter sp., 638 [NC_009436]-4

   ..............ft Gen de ARN ribosomico 165 cepa B1 Pantoea agglomerans, secuencia parcial

   ■ft Gen ARN 165 Enterobacter amnigenus, aislado p4l2

   ..................... .....................------. ...........---------------------------------------ft Gen ARN ribosomico 165 HG4Q2 Enterobacter sp., parcial

   ...ft!

   £

   %

   •■ft

   ft Gen 56bb de Enterobacter sp. para ARN ribosomico 165, secuencia parcial

   Fig. 2

   Biosintesis de celulosa

   Biosintesis de acidos grasos

   Fago, Sideroforo. protein a de choque termico

   Transporte de hierro y azucar, Sideroforo dependiente de TonB

   Autotransportador, antioxidante, transports ABC de molibdeno y hierro, autotransportador

   Transporte y degradation de peptina.

   PTS lactosa/celobiosa^,

   Transportador ABC de adhesion Fe^ ___ „

   Fago, protefna hemaglutinina/hemolisina y trasportador, protein a de membrana de virulencia

   Transportador silosilo PTS lactosa/celobiosa—

   Plasmido integrado

   Peroxidasa glutationa, Transportador ABC de aminoacidos, catabolismo diaminobutirato

   Fago p-ATPasa, RND

   Acil-CoA, Protefna Acil, trankectolasa, biosintesis de acidos grasos

   Transportador ABC de aminoacidos, trehalasa Sideroforo dependiente de TonB

   PTS fPGIucosido

   Transportador ABC de ribosa

   Origen

   imagen1

   Fi/amentos haemagg/utinin captacidn de azucar PTS

   Biosintesis de Fimbriae implicadas en adhesion y virulencia

   imagen2

   '

   Hidrolasa dependiente de metal, glicosiltransferasa Activacion/ Secrecion de hemolisina Union de peptidoglicanos

   Transportador de azucar ABC Quelacion de niquel, autotransportador de adhesina ^ ^Biosintesis de Fimbriae implicado en adhesidn/virulencia

   feai, e- - ^Citocromo, dihidroototasa (peptidasa), sintasa selenocisteina

   : Peptato liasa, oligogaractulonato porina, hemaglutinina

   filamentosa, secrecion de factor de virulencia

   ■ ■ ■

   ’ .Transportador ABC de aminoacidos ^£**-Fago, fimbriae, transportador de aminoacidos »: Hemolisina, transportador ABC de adhesion de hierro

   I WW<*$J \

   Degradation de lactosa, transportador BTS ^-Glucosido

   I

   -------Fago

   imagen3

   Sideroforo dependiente de TonB, absorcion de hierro, fimbriae, transportador ABC de aminoacidos. trasportadores

   ■A J A

   ' ^.^Transportador ABC de ribosa ^Degradation de histidina

   A

   ■fc ^ Transportador PTS de lactosa/ celobiosa Fago, Sideroforo dependiente de TonB

   Protein a asociada a Crispr (funcion desconocida)

   Reduction de nitratos

   Proteinas de virulencia (SRF), liasa, pectato (colonization Quimiotaxis (aerotaxi), Transportador ABC de aminoacidos/glut;

   RND, acetilesterasa peptina, transporte de sacarosa, production de acetoina y diacetilo

   Aminooxidasa, glicosiltransfersa, arilsulfatasa, hem an o glut ini na filamentosa, cloranfenicol, acetiltransferasa, ruta de degradacion de pirimidina alternativa

   Fago

   Sideroforo dependiente de TonB

   Autotransportador de adhesina, Transportador ABC de aminoacidos/ glutamina

   Autotransportador de proteinas si mil ares a adhesina invasin, sistema de eflujo RND, cuagulasa/ fibrolisina, respuesta SOS

   4^

   00

   Fig. 3

   Adhesion

   Plasmido F (region de transferencia de conjugacion)

   Respuesta de inhibicion SOS durante transferencia de plasmido durante conjugacion (psiAB)

   imagen4

   Varias fund ones y fund ones desconocidas

   (Biosintesis de polisacaridos, piridoxal-P, oxidoreductasa, deshidrogenasa, reguladores...)

   Isla implicada en colonizacion (srfABC)

   Adhesi

   Celobiosa fosforilasa(nc(v6)

   Resistencia de

   arsenita/arsenato (arsHRBC) Origen de replicacion (sopAB

   repA)

   4^

   CD

   imagen5

   imagen6

   Gramcs

   Fig. 6

   Peso total de tomates cosechados

   30000 ?...-........-........—........-............-.....—........-.....

   imagen7

   control —C.638

   Feehas

   imagen8

   imagen9

   imagen10

   imagen11

   J53HM

   ■mod no

   S50&5L50.

   ■13M069

   31=JJOO

   :7«J0W

   5QC0G

   Distribucion de XXiX)

   100

   1: Todas las repeticiones de palindromo

   2: CCCTCTCCCXX(X)GGGAGAGGG (SEQ ID NO: 1)

   Cambio total an aitura i ! Cambio total en aitura

   imagen12