KR20130086122A

KR20130086122A - 엔테로박터 에스피. 638 및 이의 사용방법

Info

Publication number: KR20130086122A
Application number: KR1020127026503A
Authority: KR
Inventors: 리 뉴먼; 더 렐리 다니엘 반; 타크하비
Original assignee: 브룩하벤 싸이언스 어쏘씨에이츠 엘엘씨
Priority date: 2010-03-12
Filing date: 2011-03-10
Publication date: 2013-07-31
Also published as: NZ620113A; US20130150240A1; AU2011224331B2; MX348318B; CN103237883A; AU2011224331B9; US10645934B2; WO2011112781A3; MX2012010597A; JP5897542B2; EP3000873B1; JP2013521803A; EP2545161A2; NZ602497A; CA2792933A1; JP2016073311A; AU2011224331C1; CN103237883B; ES2646132T3; EP2545161A4

Abstract

본 발명은 신규한 종의 엔테로박터, 엔테로박터 에스피. 638 및 그의 용도에 관한 것이고, 예를 들면, 본 발명의 방법 또는 조성물의 적용없이 동일한 조건하에서 성장된 대조군 또는 야생형 식물과 비교하여 식물에서 성장을 증가시키고, 식물에서 바이오매스를 증가시키고, 식물에서 열매 및/또는 씨앗을 증가시키고, 식물에서 내성 및/또는 저항성을 증가시키고, 식물에 가뭄 내성 및/또는 저항성을 증가시는 방법과 관련한 이들의 용도에 관한 것이다. 상기 방법은 엔테로박터 에스피.638의 단리된 배양물을 포함하는 유효량의 조성물을 식물에 적용하는 단계를 포함한다.

Description

엔테로박터 에스피. 638 및 이의 사용방법{ENTEROBACTER SP. 638 AND METHODS OF USE THEREOF}

이 출원은 2010년 3월 12일자로 제출된 미국 가출원 제61/313,415호의 이점을 주장하며, 이것은 그의 전체를 참조로서 본 명세서에 포함된다.

본 발명은 미국 에너지부에 의해 제정된 법령 DE-AC02-98CH10886 하에서 정부 지원으로 만들어졌다. 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 갖는다.

본 발명은 신규한 종의 엔테로박터 및 식물 성장 및 발달과 관련된 이의 용도에 관한 것이다.

지구 기후의 변화는 농업 생산성에 강한 영향을 미칠 것으로 예상될 수 있다. 예를 들면, 화석 연료 연소로부터 배기가스의 증가로 지구 기후에 영향을 미쳤다고 여겨지며, 이것은 보다 바람직한 재생 자원으로부터 바이오연료를 생산하게 하고 있다. 기후 변화가 농업 생산성에 부여할 것이라고 기대하고 있는 또 다른 것은 온도 증가 및 강수 패턴에 영향을 미치는 것에 의해서이다.

비록 바이오연료 제조를 위한 공급원료의 생산에서 농업 자원의 증가된 수요가 요구되지만, 이런 증가된 요구는 여전히 증가하는 세계 인구에게 공급하는 식품을 위한 동시에 증가된 수요에 의해 균형이 맞춰진다.

따라서, 식량 및 바이오연료 공급원료의 생산을 최적화하기 위해 사용될 수 있는 지속가능한 실행방법에 대한 요구가 있다. 이런 실행방법은 적합한 방식으로 최적으로 전체 식물 생산성을 증가시키고, 작물과 공급원료가 강수 패턴에서 주된 변동을 견딜 수 있도록 식물에 가뭄 내성을 증가시키고, 식물의 병원성 감염에 대한 내성을 증가시키는 것이다.

하나의 양태에서, 본 발명은 엔테로박터 에스피( Enterrobacter sp.) 638의 단리된 배양물에 관한 것이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 식물용 접종제에 관한 것이다. 상기 접종제는 엔테로박터 에스피. 638의 단리된 배양물 및 생물학적 허용가능한 배지를 포함한다.

여전히 또 다른 양태에서, 본 발명은 식물의 성장을 증가시키기 위한 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 식물의 성장을 증가시키기 위하여 식물에 유효량의 조성물을 적용시키는 단계를 포함하고, 여기서 상기 조성물은 엔테로박터 에스피.638의 단리된 배양액을 포함하는 것이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 식물의 바이오매스를 증가시키기 위한 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 식물의 바이오매스를 증가시키기 위하여 식물에 유효량의 조성물을 적용시키는 단계를 포함하고, 여기서 상기 조성물은 엔테로박터 에스피.638의 단리된 배양액을 포함하는 것이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 식물의 열매 및/또는 씨앗 생산성을 증가시키기 위한 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 식물의 열매 및/또는 씨앗 생산성을 증가시키기 위하여 식물에 유효량의 조성물을 적용시키는 단계를 포함하고, 여기서 상기 조성물은 엔테로박터 에스피.638의 단리된 배양액을 포함하는 것이다.

또 다른 추가적인 양태에서, 본 발명은 식물에서 질병 내성을 증가시키기 위한 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 식물에서 질병 내성을 증가시키기 위하여 식물에 유효량의 조성물을 적용시키는 단계를 포함하고, 여기서 상기 조성물은 엔테로박터 에스피.638의 단리된 배양액을 포함하는 것이다.

여전히 또 따른 추가적인 양태에서, 본 발명은 식물에서 가뭄 내성을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 식물에서 가뭄 내성을 증가시키기 위하여 식물에 유효량의 조성물을 적용시키는 단계를 포함하고, 여기서 상기 조성물은 엔테로박터 에스피.638의 단리된 배양액을 포함하는 것이다.

도 1은 엔테로박터 에스피. 638 균주의 16S 계통발생학적 분석이다.
도 2는 엔테로박터 에스피.638 염색체를 원형으로 나타낸 것이다. 보여진 원(외부로부터) : 100-bp 원도우에서 GC 퍼센트 편차(GC 윈도우 - 평균 GC), 시계 방향으로 기록된 예측된 CDS, 반시계 방향으로 기록된 예측된 CDS, 이들의 COG 글래스에 따라 책색된 시계방향 및 반시계 방향에서 CDS, 모든 회귀성(palindromic) 반복의 위치, 100 회귀성 반복(CCCTCTCCCXX(X)GGGAGAGGG)(시퀀스 ID No. 1)의 위치, 100-bp 윈도우에서 GC 스큐(skew) (G+C/G-C), 킬로 염기상에서 코디네이트. 이.콜라이 K12(E. coli K12)와 비교된 합성 영역은 오렌지로 나타낸 유전자로 보여지고, 반면 보라색으로 나타낸 유전자는 비합성 영역에 대응한다. 화살표는 이.콜라이 K12와의 합성에서 존재하지 않는 영역에 위치된 유전자의 추정 기능을 나타낸다(각각의 영역에 대한 유전자 내용에 대한 상세한 것은 표 1 참조). 합성 영역은 박테리아 게놈 서열에 존재하는 및 다른 박테리아 게놈에서 동일한 유전자에 대한 것과 유사한 유전적 조직을 보여주는 최소의 세 개의 연이은 유전자에 의해 규정된다.
도 3은 엔테로박터 에스피.638 플라스미드 pENT638-1를 원형으로 나타낸 것이다. 외부로부터 보여진 원 : pENT-01 그룹의 기능의 하위구분, 유전자 주석, 100-bp 원도우에서 GC 퍼센트 편차(GC 윈도우 - 평균 GC), 시계 방향으로 기록된 예측된 CDS, 반시계 방향으로 기록된 예측된 CDS, 100-bp 윈도우에서 GC 스큐(skew) (G+C/G-C), IS 요소(핑크) 및 가유전자(회색)으로부터 교환가능한 요소. 독성/해 T 독성(TA) 시스템은 애스테리스크(*)로 보여진다.
도 4는 다른 식내서성(endophytic) 박테리아로 접종된 포플러 꺾꽃이 순(poplar cuttings)에 대한 성장 인덱스를 나타낸다. 성장 인덱스는 모래 토양에서 꺾꽃이 순의 접종 및 식목(planting) 후 10주에 결정되었다. 식물들은 온실에서 성장시켰다. 막대는 표준 오차를 나타낸다. 성장 인덱스는 접종 및 비접종 식물의 성장 10주에서 (Mt-M0)/M0로서 계산하였다. M0는 0주에서 식물의 중량(g); Mt는 10주에서 식물의 중량(g)이다. 비접종된 대조 식물과 비교되는 접종된 식물의 증가된 바이오매스 생산의 통계적 유의성은 던네트 테스트(Dunnett test)를 사용하여 5% 레벨(**)에서 확인하였다.
도 5는 포플러 DN-34의 어린싹 및 뿌리 형성에서 엔테로박터 에스피.638의 효과를 보여준다. 식물은 균주 638 부재(대조군) 또는 존재(638)에서 반-강도 호글랜드의 용액으로 수경법으로 접종시켰다. 뿌리와 어린싹 발달은 1(A) 및 10(B) 주후에 보여졌다.
도 6은 4개월의 성장 기간 지난 후 수확된 토마토의 전체 중량을 보여준다. 엔테로박터 에스피.638로 접종된 식물은 비접종된 대조 식물과 비교하여 10% 더 높은 수율을 가졌다.
도 7은 대조군으로서 비접종된 해바라기 식물과 비교되는 엔테로박터 에스피.638로 접종된 해바라기 식물의 접종 후 개화에 걸리는 시간에서의 감소를 보여준다.
도 8은 식물 추출물의 부재(상부 크로마토그래프) 또는 존재(하부 크로마토그래피)에서 성장된 엔테로박터 에스피.638 추출물의 비교되는 크로마토그래프를 보여준다.
도 9는 이들의 유전적 국소화에 의존하는 특정 COG 클래스로부터 유전자의 퍼센트를 보여준다: 염색체 또는 플라스미드 pENT638-1. Cog 클래스의 범례 : D:세포 사이클 제어, 셀 분화, 염색체 분할; M 세포 벽/멤브레인/엔벨롭프 생체합성; N 세포 운동성 ; O 번역후 변형, 단백질 턴오버, 샤프론(chaperones); T 시그널 형질도입 메카니즘; U 세포내 트래피킹(trafficking), 분비 및 소낭 수송(vesicular transport); V 방어 메카니즘; W 세포외 구조; J 번역, 리보솜 구조 및 생체합성; K 전사; L 복제, 재조합 및 수선; C 에너지 생산 및 전환; E 아미노산 수송 및 물질대사; F 뉴클레오티드 수송 및 물질대사; G 탄수화물 수송 및 물질대사; H 코엔자임 수송 및 물질대사; I 지질 수송 및 물질대사; P 무기 이온 수송 및 물질대사; Q 이차 대사물 생합성, 수송 및 이화; R 일반적 기능 예측 만; S 비공지된 기능.
도 10은 엔테로박터 에스피.638의 염색체에서 회귀성 반복의 분포를 보여준다. 보여지는 원(외부로부터) : 시계방향 및 반시계 방향에서 기록된 예측 CDS, 모든 회귀성 반복 및 엔테로박터 에스피. 638 게놈에서 발견된 "CCCTCTCCCXX(X)GGGAGAGGG"(SEQ ID No. 1) 회귀성 반복의 위치, GC 퍼센트 편차, GC 스큐. 측면에서 표는 XX(X) 핵산 서열의 변이 및 이들의 누적 수를 보여준다.
도 11은 엔테로박터 에스피.638로 접종되는 경우 담배의 증가된 바이오매스 생성을 보여준다. 비교를 위해, 비접종된 대조 식물 및 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) W619로 접종된 식물을 포함시켰다. 엔테로박터 에스피.638로 접종된 식물에서 담배는 가장 증가된 성장을 보여주었을 뿐만 아니라 가장 이른 시기의 개화가 해바라기와 함께 보여졌다.

본 발명의 다른 이로운 목적 및 양태는 다음의 상세한 설명 및 도면으로부터 명백해 질 것이다.

본 발명에 따른 엔테로박터 에스피. 638의 생물학적 기탁은 미국, 버지니아주 20110, 마나사스, 블루버드 유니버시티 10801, ATCC 특허 기탁소에 2011년 3월 4일에 기탁되었다.

A. 엔테로박터 에스피 .638의 배양

일 양태에서, 본 발명은 엔테로박터 에스피.638의 단리된 배양물에 관한 것이다. 엔테로박터 에스피.638은 비-식물병원체성 박테리아 균주이다. 상기 엔테로박터 에스피.638은 미사질 양토(silty loam soil)에서 사염화탄소 또는 삼염화에틸렌으로 오염된 지하수로 성장시킨 하이브리드 포플러 나무 H11-11로부터 취한 표면-살균된 뿌리 및 줄기 샘플로부터 에어로졸 조건하에서 단리시켰다.

상기 엔테로박터 에스피.638 균주는 52,98%의 전체 G+C 함량을 갖는 4,518,712 bp의 단일 원형 염색체를 포함하고, 이것은 안정적으로 50.57%의 전체 G+C 함량을 갖는 157,749 bp의 플라스미드 pENT638-1를 포함한다. 상기 pENT638-1 플라스미드는 GC 함량에 기초하여 적어도 4개의 구별된 영역을 보여준다(도 3). 상기 pENT638-1 플라스미드는 다른 엔테로박테리아세아(Enterobacteriaceae)에서 발견된 F 플라스미와 관련이 있다. 이런 패밀리의 플라스미드는 숙주 상호작용 및 독성, 예를 들면 전염병 균 엘시니아 페스티스(Yersinia pestis)의 pFra 플라미스에 관여된다. 그러나, pENT638-1에서 pFra 병원체(pathogenicity) 섬은 고유의 23-kb 추정 게놈 섬(인터그라제 유전자에 의해 플랭크되고 나머지 플라스미드와 현저하게 다른 GC 함량을 갖는)에 의해 대체된다.

여기서 "단리된 배양물"은 (i)미생물이 성장하는 토양에서 일반적으로 발견되고/되거나 (ii) 미생물이 단리되어지는 다른 물질을 포함하지 않는 미생물의 배양물을 말한다. 또한, 이런 배양물은 배양물의 복제를 간섭하기에 또는 보통의 세균학적, 분자생물학 및/또는 화학적 기술에 의해 검출될 수 있게 충분한 양으로 임의의 다른 생물학적, 미생물 및/또는 박테리아성 종을 포함하지 않는 배양물일 수도 있다.

B. 식물을 위한 접종제

또 다른 양태에서, 본 발명은 식물용 접종제에 관한 것이다. 상기 접종제는 엔테로박터 에스피. 638의 단리된 배양물 및 생물학적으로 허용가능한 배지를 포함한다.

상기 용어 "미생물 접종제" 또는 "접종제"는 엔테로박터 에스피.638의 단리된 배양물을 포함하는 제제를 말한다.

엔테로박터 에스피. 638의 배양을 촉진하기 위해, 상기 배양물은 예를 들면, 적합한 배지 또는 캐리어로 희석될 수 있다. "생물학적으로 허용가능한 배지"는 엔테로박터 에스피.638의 생물학적 활성의 효능을 간섭하지 않고, 엔테로박터 에스피.638에 독성이 없는 배지를 말한다.

생물학적 허용가능한 배지의 실예는 글루코네이트를 갖는 최소 염 배지 및 희석된 리치(rich) 배지(1/100 LB)를 포함한다. 상기 생물학적 허용가능한 배지는 다음과 같은 예시적인 화합물과 같은 탄소원: D-만니톨, 락토즈, 수크로즈, 알부틴, 살리신, 트레할로제, D-만노스, L-아라비노스, 말토즈, 셀로바이오제(cellobiose), 크실로즈, 글루코네이트 및 글루코스를 포함할 수도 있다. 바람직한, 상기 배지는 글루코스, 수크로즈, 기타 식물 유도된 슈거 및/또는 식물 성장-촉진 식물호르몬의 유도를 유도하는 포플러 추출물(아세토인, 2,3-부탄디올, 도 8 참조)를 포함한다.

하나의 구현예에서, 상기 접종제는 추가로 식물-성장 촉진 미생물(예를 들면, 식물-성장 촉진 식내서성 박테리아, 곰팡이, 근권(rhizosphere) 박테리아 및/또는 균근(mycorrhizal) 곰팡이를 포함). 식물 성장 촉진 미생물의 특정 실예는 이것으로 제한되지 않지만, 액티노박터(Actinobacter ), 알카리젠스( Alcaligenes ), 바실러스( Bacillus ), 버크홀데리아( Burkholderia ), 버티옥셀라( Buttiauxella ), 엔터박터( Enterobacter ), 클렙시엘라( Klebsiella ), 클루이버(Kluyvera ), 프세도모나스( Pseudomonas ), 라넬라( Rahnella ), 랄스토니아(Ralstonia ), 리조비튬( Rhizobitum ), 세라티아( Serratia ) 및 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas)를 포함한다.

C. 성장을 증가시키기 위한 방법

또 다른 양태에서, 본 발명은 식물에서 성장을 증가시키기 위한 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 엔테로박터 에스피.638의 단리된 배양물을 포함한 조성물의 유효량을 식물에 적용하는 단계를 포함한다.

본 명세서에서 "식물"은 임의의 타입의 식물, 예를 들면, 나무, 관목, 꽃, 허브, 덩굴식물 또는 풀과 같은 것을 포함한다. 상기 용어 "식물"은 식물의 임의의 부분, 예를 들면, 전체 식물, 식물 일부, 식물 세포, 또는 식물 세포의 그룹, 예를 들면, 식물 조직, 또는 이들의 자손을 말한다. 모종(plantlets)은 "식물"의 의미내에 포함된다. 식물은 예를 들면, 임의의 겉씨식물(gymnosperms) 및 속씨식물(angiosperms), 외떡잎식물(monocotyledons) 및 쌍떡잎식물(dicotyledons) 모두 및 나무를 포함한다.

외떡잎 속씨식물의 실예로는 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 아스파라거스, 옥수수 및 단옥수수, 보리, 밀, 쌀, 수수, 양파, 진주 기장(pearl millet), 호밀 및 귀리 및 기타 시리얼 곡물, 사탕수수, 엘리펀트 잔디(elephant grass), 스위치 풀(switch grass) 및 억세를 포함한다.

쌍떡잎 속씨식물의 실예로는 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 토마토, 담배, 면화, 유채, 필드빈, 소이빈, 고추, 상추, 완두콩, 알팔파, 클로버, 콜 크롭(cole crops) 또는 브라시카 올레라세아(Brassica oleracea, 예를 들면, 양배추, 브로콜리, 컬리플라워, 브루셀 양배추(brussel sprouts)), 무, 당근, 비트, 가지, 시금치, 오이, 호박, 멜론, 참회(cantaloupe), 해바라기 및 다양한 장식용 식물을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 식물은 토마토이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 식물은 해바라기이다. 여전히 바람직한 구현예에서 식물은 담배이다.

식물의 나무종의 실예는 포플러, 소나무, 세퀘이어, 삼나무, 떡깔나무, 등을 포함한다. 나무 종은 또한 예를 들면, 전나무, 소나무, 가문비 나무, 낙엽송, 삼나무, 독미나리, 아카시아, 오리나무, 사시나무, 너도밤나무, 자작나무, 스위트 검, 시카모아, 포플러, 버드 나무 등등을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 식물은 포플러이다.

본 명세서에서 사용되고 있는 용어 "증가" 성장은 본 발명의 방법 또는 조성물로 처리된 식물의 성장 특성에서 증가하는 것을 말하고, 성장 특성에서 증가는 대응하는 본 발명의 방법 또는 조성물의 적용없이 동일한 조건하에서 성장되는 경우 대조 식물에서의 성장보다 큰 것이다. "대응하는" 대조 식물은 본 발명의 방법 또는 조성물로 처리된 식물로서 동일한 유형 또는 종의 야생형 식물을 말한다.

성장에서의 증가는 식물의 특정 부분, 예를 들면 뿌리, 어린싹, 잎, 꽃, 열매 및/또는 씨앗의 성장에서의 증가일 수 있거나 또는 성장은 전체 식물에 전반적으로 분포될 수 있다. 성장을 측정하기 위한 수단은 이 분야에 알려진 것이다.

증가된 성장은 예를 들면, 식물에서 및/또는 식물의 일부에서 다음의 특징 들의 적어도 하나 또는 조합에서의 증가를 포함할 수 있다: 특정 시간의 기간 지난 후 높이, 폭, 질량, 방사능 탄소의 축적, 건조 중량에서의 증가, 생중량에서의 증가 및/또는 이런 증가의 속도에서 증가를 포함할 수도 있다.

성장에서의 증가는 또한, 생산된 열매의 양, 개화까지의 시간의 감소, 및/또는 유용한 목적을 제공하는 야채 부분, 예를 들면 이들 부분이 식량원인 식물로부터 뿌리 또는 괴경(tubers)의 질량에서의 증가를 포함한다.

성장에서의 증가는 본 발명의 방법 또는 조성물의 적용없이 동일한 조건하에서 성장된 대응하는 대조 식물의 성장과 비교하여, 2배, 4배, 5배, 6배, 8배, 10배, 20배 또는 그 이상으로 더 큰 증가일 수 있다. 예를 들면, 대조 식물과 비교하여 증가된 성장을 갖는 식물은 본 발명의 방법 또는 조성물의 적용없이 동일한 조건하에서 성장된 대응하는 대조 식물의 성장보다 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 65%, 75%, 80%, 90%, 100% 또는 그 이상 더 큰 성장을 가질 수 있다.

D. 바이오매스를 증가시키기 위한 방법

또 다른 양태에서, 본 발명은 식물에서 바이오매스를 증가시키기 위한 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 엔테로박터 에스피.638의 단리된 배양물을 포함하는 조성물의 유효량을 식물에 적용하는 단계를 포함한다.

상기 용어 "바이오매스"는 식물의 건조 중량 또는 생중량을 말한다. 바이오매스는 다르게 규정되지 않은 이상 식물의 모든 부분, 예를 들면, 어린싹 바이오매스(땅위에 있는 모든 식물 부분), 잎 바이오매스 및 뿌리 바이오매스를 포함한다. "건조 중량" 용어는 대다수의 세포의 수분을 제거하기 위해 건조시킨 식물의 중량을 말한다. "생중량" 용어는 대다수의 세포의 수분을 제거하기 위해 건조시키지 않은 식물의 중량을 말한다. 바이오매스를 측정하기 위한 수단은 이 분야에 알려진 것이다.

"증가하는 바이오매스" 용어는 본 발명의 방법 또는 조성물로 처리된 식물의 바이오매스에서의 증가를 말하고, 여기서 바이오매스에서의 증가는 본 발명의 방법 또는 조성물의 적용없이 동일한 조건하에서 성장된 대응하는 대조 식물에서 바이오매스의 양보다 큰 양이다.

바이오매스에서의 증가는 본 발명의 방법 또는 조성물의 적용 없이 동일한 조건하에서 성장된 대응하는 대조 식물의 바이오매스와 비교하여 2배, 4배, 5배, 6배, 8배, 10배, 20배 또는 그 이상 배 큰 증가일 수 있다. 예를 들면, 야생형 식물과 비교하여 증가된 바이오매스를 갖는 식물은 본 발명의 방법 또는 조성물의 적용없이 동일한 조건하에서 성장된 대응하는 대조 식물보다 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 100% 또는 그보다 큰 바이오매스를 가질 수 있다.

E. 질병 내성 및/또는 저항성을 증가시키기 위한 방법

또 다른 양태에서, 본 발명은 식물의 질병 내성 및/또는 저항성을 증가시키기 위한 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 엔테로박터 에스피.638의 단리된 배양물을 포함하는 조성물의 유효량을 식물에 적용하는 단계를 포함한다. 어떠한 이론에 제안되지 않고, 엔테로박터 에스피. 638은 엔테로박터 에스피.638에 의한 아세토인 또는 2,3-부탄디올의 생산에 기인하여 또는 항균성 화합물 2-페닐에탄올 및 4-히드록시벤조에이트의 생산에 기인하여, 또는 사이더로포어 엔테로백틴의 합성을 통해 필수 영양분에 대한 직접적인 경쟁을 통해, 및/또는 엔테로박터 에스피.638에 의해 비상동적으로 생성된 철 사이더로포어 복합물의 흡수를 통해 식물에 질병 내성 및/또는 저항성을 증가시킬 수 있다.

상기 "질병 내성"이라는 용어는 질병에도 불구하고 기능 및 생산 능력을 유지하면서 질병에 견디고 저항하는 식물의 능력을 말한다. 질병은 예를 들면 식물의 생육성(viablility)에 나쁘게 영향을 미치지는 병리학의 존재, 예를 들면, 식물에 및/또는 상에 병원체(예를 들면, 곰팡이, 바이러스 또는 박테리아)에 의해 감염을 포함한다.

상기 "질병 저항성"이라는 용어는 동일한 조건 및 질병 하에서 성장되는 경우 질병 저항성을 보여주지 않는 대응하는 대조 식물보다 질병에의 노출에 따른 질병 증상이 덜 발전하는 식물의 능력을 말한다. 질병 저항성은 질병에 대한 완벽한 저항성 및/또는 감소된 증상, 보다 긴 생존성 또는 기타 질병 파라미터, 예를 들면, 보다 높은 수율, 증가된 성장, 증가된 바이오매스, 촉진된 열매 숙성 등과 같은 것으로 나타낸 저항성의 다양한 정도를 포함한다.

질병은 예를 들면 셉토리아(Septoria), 멜람프소라(Melampsora) 또는 셉토티나(septotina), 바이러스 감염, 예를 들면 포플러 모자익 바이러스 및/또는 박테리아 감염 예를 들면, 아그로박테리움(Agrobacterium), 리케티시아(Rickettsia) 또는 코리네박테리움(Corynebacterium)으로부터 감염과 같은 곰팡이 감염일 수 있다.

상기 용어 "증가하는" 질병 내성 및/또늦 저항성은 용어는 본 발명의 방법 또는 조성물로 처리된 질병 있는 식물의 질병 내성 및/또는 저항성에서의 증가를 말하고, 여기서 질병 내성 및/또는 저항성에서의 증가는 본 발명의 방법 또는 조성물의 적용없이 동일한 조건하에서 성장된 대응하는 대조 식물에서의 질병 내성 및/또는 저항성보다 큰 것이다.

질병 내성 및/또는 저항성의 증가는 동일한 조건 및 질병 노출 하에서 성장된 대응하는 대조 식물의 내성 및 저항성과 비교하여 2배, 4배, 5배, 6배, 8배, 10배, 20배 또는 그 이상 배 큰 증가일 수 있다. 예를 들면, 야생형 식물과 비교하여 증가된 질병 내성 및/또는 저항성을 갖는 식물은 본 발명의 방법 또는 조성물의 적용없이 동일한 조건하에서 성장된 대응하는 대조 식물보다 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 100% 또는 그보다 큰 질병 내성 및/또는 저항성을 가질 수 있다.

질병 내성 및/또는 저항성을 평가하기 위한 방법은 이 분야에 잘 알려진 것이다. 예를 들면, 이런 방법은 대조 식물과 비교되는 질병 증상의 물리적 징후, 식물 활기의 상실 또는 죽음, 및 특정 질병 응답 유전자의 활성화의 관찰 및 정격(rating)를 포함한다.

F. 열매 및/또는 씨앗 생산성을 증가시키기 위한 방법

또 다른 양태에서, 본 발명은 식물의 열매 및/또는 씨앗의 생산성을 증가시키기 위한 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 엔테로박터 에스피.638의 단리된 배양물을 포함하는 조성물의 유효량을 식물에 적용하는 단계를 포함한다.

"증가하는 생산성"은 본 발명의 방법 또는 조성물로 처리된 식물에 의해 생산된 열매 및/또는 씨앗의 질량 또는 개수의 증가를 말하며, 여기서 생산성에서의 증가는 본 발명의 방법 또는 조성물의 적용없이 동일한 조건하에서 성장된 경우 대응하는 대조 식물에서 생산성의 양보다 큰 양이다.

생산성에서의 증가를 평가하는 방법은 예를 들면, 식물에 의해 생산된 열매의 개수, 식물에 의해 생산된 개개의 열매의 중량, 식물에서 개화까지의 시간, 식물에서 열매 숙성까지의 시간, 및/또는 식물의 개개의 열매 또는 꽃에 의해 생산된 씨앗의 개수를 결정하는 것을 포함한다.

생산성은 만일 본 발명의 방법 또는 조성물의 적용 없이 동일한 조건에서 성장된 경우 대응하는 대조 식물과 비교하여 식물의 의해 생산된 열매의 개수, 식물에 의해 생산된 개개의 열매의 중량, 식물에서 개화까지의 시간, 식물에서 열매 숙성까지의 시간, 및/또는 식물의 개개의 열매 또는 꽃에 의해 생산된 씨앗의 개수의 증가가 있는 경우 증가된 것이다.

생산성에서의 증가 또는 감소는 본 발명의 방법 또는 조성물의 적용 없이 동일한 조건 하에서 성장된 대응하는 대조 식물의 생산성보다 2배, 4배, 5배, 6배, 8배, 10배, 20배 또는 그 이상 배 크거나 또는 작은 증가 또는 감소일 수 있다. 예를 들면, 대조 식물과 비교하여 증가된 생산성을 갖는 식물은 본 발명의 방법 또는 조성물의 적용없이 동일한 조건하에서 성장된 대응하는 대조 식물보다 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 100% 또는 그보다 큰 생산성을 가질 수 있다.

G. 가뭄 내성 및/또는 저항성

또 다른 양태에서, 본 발명은 식물의 가뭄 내성 및/또는 저항성을 증가시키기 위한 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 엔테로박터 에스피.638의 단리된 배양물을 포함하는 조성물의 유효량을 식물에 적용하는 단계를 포함한다. 어떠한 이론에 제안되지 않고, 엔테로박터 에스피. 638은 엔테로박터 에스피.638에 의한 아세토인 또는 2,3-부탄디올의 생산에 기인하여 식물에 가뭄 내성 및/또는 저항성을 증가시킬 수 있다.

상기 용어 "가뭄 내성"은 가뭄 조건에서 이겨내거나 저항하는 식물의 능력을 말한다. "가뭄"은 식물이 삼투 스트레스 또는 감소된 수분 잠재력에 속한 조건을 말한다. 예를 들면, 가뭄은 일정 기간 동안 유용한 수분의 부족이 원인일 수 있다. 가뭄 조건은 식물에 유용한 수준의 양과 식물의 성장 또는 성숙을 위해 요구되는 양을 비교하는 것으로 평가될 수 있다. 가뭄 조건은 예를 들면, 식물에 의해 내부적으로 사용되거나 또는 발생되는 물의 양에 비하여 강수(rainfall) 또는 관개(irrigation)의 부족에 의한 것이 원인이 될 수 있다.

상기 용어 "가뭄 저항성"은 수분 스트레스의 동일한 조건하에서 성장된 대응하는 대조 식물 보다 수분 스트레스의 증상(예를 들면, 낮은 생산성, 잎 손실, 죽음)을 덜 나타나는 식물의 능력을 말한다. 가뭄 저항성은 가뭄의 효과에 대한 완벽한 저항(생산성의 손실 없음) 또는 감소된 증상 또는 보다 긴 생존과 같은 것으로 나타나는 저항성의 다양한 정도를 포함한다.

증상의 표현형 평가는 식물이 가뭄으로 고통받는지의 여부 및 어느 정도인지 결정하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 가뭄 내성 및/또는 저항성은 식물에서 시들음, 성장 저지, 죽음, 생산성, 잎 손실(예를 들면, 잎 말림, 잎 훼손, 잎 떨어짐, 잎 누렇게 마름), 줄기 또는 잔가지 마름병, 광합성 효능, 개화 및 수율 수준을 관찰 및 정격(rating)하는 것에 의해 평가될 수 있다. 게다가 식물의 가뭄 내성 및/또는 저항성은 예를 들면, 식물에서 특이적 반응 유전자의 발현 또는 활성화를 측정하기 위하여 생화학적 또는 핵산 기초된 어세이에 의해 평가될 수 있다.

가뭄 내성 및/또는 저항성은 만약 식물이 가뭄이 원인인 스트레스의 심한 증상을 덜 보여준다면 식물에서 증가된 것이다. 예를 들면, 가뭄 내성 및/또는 저항성은 시들음, 성장 저지, 죽음, 잎 손실(예를 들면, 잎 말림, 잎 훼손, 잎 떨어짐, 잎 누렇게 마름), 줄기 또는 잔가지 마름병이 본 발명의 방법 또는 조성물의 적용 없이 동일한 조건하에서 성장된 대응하는 대조 식물과 비교되는 경우 감소된 것이다. 증가된 가뭄 내성 및/또는 저항성의 다른 실예는 본 발명의 방법 또는 조성물의 적용없이 동일한 조건하에서 성장된 경우 대응하는 대조 식물과 비교하여 식물에서의 생산성 증가, 식물 활력, 광합성 효능, 개화 및/또는 수율 수준에서의 증가를 포함한다.

따라서, 상기 용어 "증가"하는 가뭄 내성 및/또는 저항성은 본 발명의 방법 또는 조성물로 처리되어 영향을 미친 식물의 가뭄 내성 및/또는 저항성에서 증가를 말하고, 여기서 내성 및/또는 저항성은 동일한 조건 및 수분 스트레스 하에서 성장된 대응하는 대조 식물에서 가뭄 내성 및/또는 저항성보다 큰 것이다.

가뭄 내성 및/또는 저항성 증가는 동일한 조건 및 수분 스트레스 하에서 성장된 대응하는 대조 식물의 생산성보다 2배, 4배, 5배, 6배, 8배, 10배, 20배 또는 그 이상 배 큰 증가일 수 있다. 예를 들면, 대조 식물과 비교하여 증가된 가뭄 내성 및/또는 저항성을 갖는 식물은 본 발명의 방법 또는 조성물의 적용없이 동일한 조건하에서 성장된 대응하는 대조 식물보다 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 100% 또는 그보다 큰 가뭄 내성 및/또는 저항성을 가질 수 있다.

H. 일반 방법

식물에 조성물을 적용하는 임의의 방법이 본 발명의 방법으로 사용될 수 있다. 식물에 및/또는 식물에서 조성물을 적용하는 방법은 이 분야에 알려진 것이다. 하나의 구현예에서, 상기 조성물은 식물과 토양에 접종될 수도 있다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 수경 배지에서의 성장을 통해 또는 식물의 잎에 분사되는 것을 통해 식물 뿌리에 도입될 수도 있다.

본 발명의 조성물은 적합한 코팅 메카니즘 또는 바인더의 사용을 통하여 씨앗을 포함하는 식물의 임의의 부분에 적용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 식목 전에 식물에 적용될 수 있거나 또는 식목 동안 식물 고랑으로 도입될 수 있다. 또 다른 실예에서, 본 발명의 조성물의 식물의 뿌리에 적용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 캐리어 없이 또는 있이 제조될 수 있으며, 식물이 심어지는 고랑으로 직접적으로 삽입되어지는 별도의 접종제로 판매될 수 있다.

본 발명의 방법에 따라서, 유효량의 본 발명 조성물은 요구된 결과가 처리된 식물에서 성취되도록 충분한 박테리아 성장을 구축하기에 충분한 양이다. 유효량의 본 발명의 조성물은 특정 식물 종에 대해 이 분야에서 공지된 수단에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 조성물로의 접종은 5일 동안 수경법으로 실시될 수 있고, 박테리아 현탁액은 3일 후에 교체하고, 이어서 접종할 수 있다.

하나의 구현예에서, 유효량은 예를 들면 식물 당 약 10¹ 내지 약 10¹² 세포의 양일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 유효량은 접종물의 약 10⁵ 내지 약 10¹⁰ CFU/ml의 세포 농도이고, 보다 바람직하게는 약 10⁶ 내지 약 10⁸ CFU/ml이고, 가장 바람직하게는 약 10⁸ CFU/ml이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 토양 그램 당 약 10⁵ 내지 10¹⁰ 세포의 양으로 토양과 혼합될 수 있다.

실시예

실시예 1 : 엔테로박터 에스피 .638의 단리와 특성화

뿌리 및 어린싹(shoot) 샘플을 워싱턴 주의 실험 위치에서 8년 동안 사염화탄소의 존재(120ppm 균질하게)하에서 성장하고 있는 10년산 하이브리드 포플러 나무 H11-11(Populus trichocarpa _ P. deltoides)로부터 수집하였다. 추가로 천연 버드나무( Salix gooddingii) 물질은 5년 동안 삼염화에틸렌(18ppm) 및 사염화탄소(12ppm) 모두의 존재하에서 성장하고 있는 5년산 천연 식물로부터 수집하였다. 꺾꽃이 순(cuttings)를 식물로부터 칼날 사이를 에탄올로 세척한 가위로 잘라서, 필드로부터 수송을 위해 얼음상에 놓았던 아세톤 세정된 휘발성 유기 분석 유리병에 넣었다. 뿌리와 어린싹은 별도로 처리하였다. 신선한 뿌리 및 어린싹 샘플을 5분 동안 증류수로 격렬하게 세정하고, 5분 동안 용액 100ml 당 1 방울의 Tween 80으로 보충된 1%(wt/wol) 활성 염소(하이포클로라이트[NaOCl] 용액으로 첨가)를 함유한 용액중에서 5분 동안 표면 살균하고, 무균 증류수로 세번 린스하였다. 세 번째 린스로부터 100㎕ 샘플의 물을 살균의 효과를 확인하기 위하여 869 배지(25) 상에 위치시켰다. 살균 후, 뿌리와 어린싹을 폴리트론(Polytron) PT1200 혼합기(Kinematica A6)을 사용하여 10mM MgSO₄의 10ml에서 불렸다. 일련의 희석이 행해지고, 100㎕ 샘플을 내부기생생물의 존재 및 이들의 특성을 테스트하기 위해 비선택된 배지에 위치시켰다.

엔테로박터 에스피.638을 사염화탄소 또는 삼염화에틸렌 및 사염화탄소로 오염된 지하수와 양질 옥토(silty loam soil)에서 성장시킨 하이브리드 포플러 나무 H11-11 및 천연 버드나무(Salix gooddingii)로부터 취한 표면 살균된 뿌리 및 줄기 샘플로부터 에어로빅 조건하에서 단리하였다. 이들의 전체 게놈 DNA를 추출하고, 16rRNA 유전자를 증폭하는데 사용하였다. 16S rRNA 유전자는 표준 26F-1392R 프라이머 셋트(Amann 1995)를 사용하여 PCR 증폭시켰다.

실시예 2 : 포플러에서 식물 성장-촉진 특성을 위한 식내서성 박테리아의 스크리닝

접종물(250ml 배양물)을 세포 농도가 10₉ CFL/ml에 도달(1의 660nm에서 광학 밀도[OD660])할 때까지 회전 쉐이커(rotary shaker)에서 30℃의 1/10-강도 869 배지(25) 중에 식내서성 박테리아를 성장시키는 것으로 제조하였다. 상기 세포들을 원심분리로 수집하고, 10mM MgSO4로 2번 세척하고, 1010 CFU/ml의 세포 농도를 갖는 접종물을 얻기 위해 원래 부피(10mM MgSO4 중에서)의 1/10으로 현탁시켰다. 테스트되는 미생물 균주에 대하여, 대략 30cm의 포플러(populus deltoides x P, nigra) DN-34로부터의 7개의 꺾꽃이 순을 칭량하고, 3일마다 교체되는 0.5ℓ의 1/2-강도 멸균 호글랜드 영양 용액(5)를 함유한 1ℓ 비이커에 놓았다. 상기 꺾꽃이 순을 뿌리 형성을 시작할 때까지 대략 4주 동안 뿌리내리게 했다. 이어서, 박테리아 접종물을 1/2-강도 호글랜드 용액중에 최종 10⁸ CFU/ml의 농도로 각각의 병에 첨가시켰다. 접종 3일 후, 꺾꽃이 순을 칭량하고, 메마른 모래흙에 심고, 22℃의 일정 온도와 165mmol/m2s의 광합성 활성 방사선과 14시간 광-10시간 어둠 사이클을 갖는 그린 하우스로 옮겼다. 10주 후, 식물을 수확하고, 이들의 전체 바이오매스, 바이오매스에서 이들의 증가, 및 다른 식물 조직의 바이오매스를 결정하였다. 테이터를 또한 비접종된 대조 식물로부터 수집하였다. 성장 인덱스를 식내서성 접종물의 존재 또는 부재하에서 성장 10주 후에 (Mt-M0)/M0로서 계산하였고, 여기서 M0는 식물의 0주에서의 중량이고, Mt는 10주후 식물의 중량이다. 상기 결과의 통계적 유의성은 던네트(Dunnett) 테스트를 사용하여 5% 레벨에서 확인하였다. 포플러 DN-34 상에서 식내서성 박테리아의 효과를 결정하기 위하여, 꺾꽃이 순을 식내서성 접종물을 1일부터 첨가하였다는 것만 제외하고, 상기 설명된 바와 같이 처리하였다.

포플러로부터 단리된 엔테로박터 에스피.638은 포플러 나무에서 발견된 다른 식내서성 감마프로테오박테리아gammaproteobacteria)와 함께 이들의 숙주 식물의 성장을 개선시키기 위한 이것의 용량을 위해 테스트하였다. 포플러 나무에서 식물 성장-촉진 효과를 갖는 것으로 밝혀진 노란 루핀으로부터 원래 단리된 내부기생식물, 버크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia) Bu 72, 및 알려진 식물 성장 촉진 효과가 없는 전형적인 토양 박테리아, 쿠프리아비더스 메탈리두란스(Cupriavidus metallidurans) CH34(또는 랄스토니아 메탈리두란스(Ralstonia metllidurans CH34)로 언급)을 각각 양성 및 음성 대조군으로 포함시켰다. 또한, 비접종된 꺾꽃이 순을 대조군으로 사용하였다.

수경 조건하에서 뿌리 형성 및 후속의 식내서성 접종 후에, 포플러 DN-34 꺾꽃이 순을 한계 모래흙에 심고, 10주 동안 성장하게 하고, 식물이 수확된 후 이들의 바이오매스를 결정하였다. 성장의 10주 후, 엠.포플리(M. populi ) BJ001로 접종된 포플러 나무는 대조군보다 새로운 바이오매스를 덜 가졌다(도 4)(P<0.05). 엔테로박터 에스피.638(P=0.018) 및 비. 세파시아(B. cepacia) BU72(P=0.042)로 접종된 포플러 꺾꽃이 순은 이들의 성장 인덱스에 의해 반영되는 바와 같이 대조 식물보다 통계적으로 우수한 성장을 보여주었다(도 4). 엔테로박터 에스피. 638 및 비. 세파시아 BU72의 식물 성장 촉진 효과는 독립적으로 수행된 실험에서 재현성이 있었다.

테스트되는 온실 조건하에서, 성장 인덱스의 차이는 비접종된 대조 식물 및 에스.말토필리아(S. maltophilia) R551-3, 피. 푸티다(P. putida) W619 및 에스. 프로테마쿠란스(S. proteamaculans) 568로 접종된 식물에서 없었고; 이들의 성장은 씨.메탈리두란스(C. metallidurans ) CH34로 접종된 식물에서 관찰된 것과 비교될 수 있었다. 또한. 대조 식물 및 식내서성 박테리아로 접종된 식물들은 엠. 포플리(M. populi) BJ001로 접종된 식물만 제외하고 건강하게 나타났으며, 이것은 잎의 황백화를 포함하는 스트레스의 신호를 보여준다.

실시예 3 : 담배에서 식물 성장-촉진 특성을 위한 식내서성 박테리아의 스크리닝.

니코티아나(Nicotiana) 종이 형질전환 및 대사물질 연구를 위한 거대-식물 모델로서 실험실에서 사용되었기 때문에, 이것이 필드 적용에 대해 유용하지 않을지라도, 이와 같은 연구를 위한 식물로 사용되기에 유용하다. 니코티아나 크산티(Nicotiana xanthi) 모종을 토양 없는 성장 배지에서 시작하고, 일차 잎이 나온 후에 수경 용액으로 옮겼다. 일주 후, 식물을 10⁸ CFU 엔테로박터 에스피.638을 함유한 용액에 넣고, 3일 후, 접종물을 교체하고, 추가적인 3일 후에, 식물을 온실내 화분에 놓았다.

식물 성장을 주별로 모니터하고, 개화의 개시 시간을 기록하였다. 식물은 비접종된 식물보다 빠르게 완전한 크기에 도달하였고, 주된 식물은 비접종된 식물의 동일한 개수가 개화하기 전에 개화하였다.

실시예 4 : 포플러 뿌리 발달에서 식내서성 박테리아의 효과

뿌리 발달에서 식내서성 박테리아의 효과를 추가적으로 테스트하기 위하여, 발근(rooting) 실험을 엔테로박터 에스피.638의 gfp-라벨된 유도체의 존재 및 부재에서 수행하였다. 뿌리 형성은 비접종된 식물에서 매우 느렸다. 반면, 선택된 내부기생식물의 존재에서 발근시킨 꺾꽃이 순을 위해, 뿌리 형성을 1주 내에 개시하였고, 어린싹 형성은 비접종된 식물의 그것과 비교하여 더 명확했다(도 5A). 10주 후, 비접종된 대조군에서 뿌리 형성은 여전히 나빴지만; 그러나 엔테로박터 에스피. 638로 접종된 식물에서, 뿌리와 어린싹은 잘 발달하였다(도 5B). 형광 현미경을 이들의 식내서성 행동을 확인하는 gfp-라벨된 균주에 의해 식물 뿌리의 내부 콜로니화(colonization)을 시각화하기 위해 사용하였다. 피. 푸티다(P. putida) W619에 대해 관찰된 바와 같이 뿌리 표면에서 미소집락(microcolonies)의 형성이 엔테로박터 에스피.638로 접종된 식물에서 없었으며, 여기서는 오로지 내부 콜로니화만 관찰되었다. 비접종된 대조 식물로부터의 뿌리에서는 gfp 발현이 검출되지 않았다.

실시예 5 : 열매 및 꽃 생산성에서 식내서성 박테리아의 효과

생산 열매의 질량에 식내서성 박테리아가 미치는 영향을 테스트하기 위하여, 토마토 씨앗(heirlom variety Brandywine, Park Seed)를 펄라이트/물 매트릭스에서 시작하고, 1/2 강도 호글랜드 용액의 수경 용액으로 옮겼다. 식물이 대략 3인치(10cm) 키를 가질 때, 이들을 상기 설명된 바와 같이, 식내서성 박테리아의 ml 마다 10⁸ CFUs 함유하는 용액으로 옮겼다. 접종 후, 3일에, 모종을 시판되는 화분 믹스(potting mix)인 프로믹스(ProMix)의 온실에서 심었다. 첫 번째 열매 세트의 날짜와 토마토의 전체 질량을 3개월 동안 기록하였다. 엔테로박터 638로 접종된 토마토 식물은 비접종된 식물보다 열매 생산성에서 10%를 증가를 가졌다. 비접종된 식물은 전체 질량 22.374kg을 갖는 82개의 열매를 생산한 반면, 접종된 식물은 합져진 질량 24.909kg을 갖는 90개의 열매를 생산하였다(도 6).

해바라기 모종(Mammoth, Park Seed)을 상기 설명된 방법을 사용하여 시작하고, 개화하는 시간을 기록하였다. 온실 조건하에서, 접종된 해바라기는 비접종된 식물보다 5일 앞서 개화하였고, 50%는 꽃인 반면 비접종된 식물의 10%만이 개화하였고, 접종된 식물의 100%가 개화한 반면에, 비접종된 식물의 70%만 개화하였다(도 7)

실시예 6 : 가뭄 저항성

하이브리드 포플러 견목 꺾꽃이 순(OP 367 포플러스 델토이데스(Populus deltoides) 엑스 피. 니그라(P.nigra)를 뿌리 형성을 개시하기 위하여 3일 동안 물에 놓았고, 이어서 3일 동안 식내서성 박테리아의 ml 당 10⁸ CFU를 함유하는 1/2 강도 호글랜드 용액으로 이동하였다. 이어서 꺾꽃이 순을 가든 토양을 함유한 화분에 심고, 공급된 잉여 물로 3개월 동안 온실에서 성장하였다. 3개월 후, 식물에 물주는 것을 중지하고, 노화하는 시간을 모니터하였다. 접종된 식물은 비접종된 식물과 비교하여 평균 가뭄 증상의 개시에서 20% 지연을 보여주었다.

실시예 7 : 질병 저항성

식물의 증가된 활력뿐만 아니라 식내서성 박테리아에 존재하는 유전적 요인에 기인하여, 접종된 식물은 병원체 콜로니화에 더 저항적이 될 것이고, 증상은 접종된 식물에서 덜 분명할 것이다.

하이브리드 포플러 꺾꽃이 순, H11-11(곰팡이 질병에 매우 취약함) 및 OP-367(곰팡이 질병에 대해 저항성 있음) 모두가 상기에서 설명된 바와 같이 접종될 것이다. 식물은 살균 화분 믹스에 심을 것이고, 6개 내지 8개의 잎의 나타날 때까지 성장시킬 것이다. 이어서 식물을 곰팡이 병원균에 노출시킬 것이고, 감염의 물리적 증상이 나타나는 시간 및 심각성에 대해 모니터할 것이다. 식물들은 또한 알려진 질병 반응성 유전자의 활성을 결정하기 위해 분석될 수 있다.

실시예 8 : 게놈 구조 및 일반적 특징

감마-프로테오박테리움(proteobacterium) 엔테로박터 에스피. 638의 게놈(도 2)은 52.98%의 전체 G+C 함량을 갖는 4,518,712 bp의 단일 원형 염색체를 포함하고, 이것은 50.57%의 전체 G+C 함량을 갖는 157,749 bp의 플라스미드 pENT638-1을 포함한다(표 1). 엔테로박터 에스피.638의 염색체는 이것의 복제 기원(oriC) 및 말단에 대응하는 GC 스큐 전이(skew transition) 를 보여준다(도 2). 상기 oriC 사이트는 완벽한 DnaA-결합 박스(TTATCCACA)(SEQ ID No.2)를 포함하며, 이것은 dnaA ATG 시작 코돈의 31,985 bp 업스트림에 위치하고 있다(코디네이트 4,487,246 bp).

상기 pENT638-1 플라스미드는 GC 함량에 기초하여 적어도 4개의 구별되는 영역을 보여준다(도 3), 상기 플라스미드는 F-패밀리 플라스미드에 공통적이며, 전달 및 복제를 위한 플라스미드의 기본 기능을 포함하고, 수평 유전자 전달을 통해 획득되어지는 영역의 선조형 백본을 포함한다. pENT638-1 플라스미드에서 이들 영역은 엔테로박터리아시아(Enterobacteriaceae)의 종의 나머지와 다른 코돈 사용 매트릭스(codon usage matrix)를 보여준다. 또한, 이들 영역은 근접하게 관련된 균주로부터 서열된 염색체 또는 플라스미드에 신터니(synteny)를 갖지 않고 이들 영역은 식물 부착과 콜로니화에 관련된 유전자를 흥미롭게 암호화(encode)한다. 엔테로박터 에스피.638 및 이것의 식물 숙주 사이에 성공적인 상호작용에서 중요한 역할을 한다고 추정되는 8-1의 엔테로박터 에스피.638 및 이들 영역에서 안정성 유지는 6 relBE 독성/해-독성(TA) 시스템의 존재가 중요한 것으로 여겨진다.

반면에, 엔테로박터 에스피.638의 염색체는 오직 3쌍의 독성/해-독성(Ent638_0434_0435, Ent638_0475-0477, 및 Ent38_2066-2067)을 암호화한다. 이 낮은 숫자는 숙주-관련된 유기체를 대표한다.

염색체는 87.9%의 코딩 밀도를 대표하는 4395 추정 코딩 서열(CDS)을 코드하고, 플라스미드 pENT638-1은 80.4%의 코딩 밀도를 갖는 153 추정 CDS를 코드한다. 이들의 매뉴얼 주석(manual annotation) 후에, 3562 CDS(78.3%)는 추정 생물학적 기능에 할당될 수 있고, 반면 835 CDS(18.4%)는 미지의 기능의 가상 단백질로 주석을 달았다. 보호된 가상 단백질은 648 CDS(15.0%)로 나타내어지는 반면, 151 CDS(3.3%)는 이전에 기록된 임의의 서열과 상동성을 갖지 않았다. MaGe 시스템으로부터의 COGnitor 모듈를 사용하여, 3597 CDS(79.1%)는 하나 이상의 COG 기능 클래스에 할당될 수 있다(도 9 참조). 다른 COG 글래스 중에서 엔테로박터 에스피. 638 CDS의 재분배는 이.콜라이 K12에서 관찰된 것과 매우 유사하였다. 3개의 가장 풍부한 클래스는 아미노산(E), 탄수화물(G) 및 무기 철(P) 전달 및 대사이며, 모든 CDS의 37% 이상을 나타내며, 이는 숙주-제공 영양분의 충분한 흡수를 요구하는 엔테로박터 에스피.638 및 이.콜라이 K12의 공생 생활양식을 나타낸다. 7개의 세트의 5S, 16S, 23S rRNA 유전자 및 하나의 추가적인 5S rRNA 유전자를 발견하였다. 모든 20개의 아미노산에 대해 특이성을 갖는 전체 83 tRNA 유전자 및 셀레노시스테인(selenocysteine)을 위한 단일 tRNA를 동정하였다.

엔테로박터 에스피. 638의 게놈은 8개의 시그마 인자를 암호화한다: fliA (Ent638_2509; Sigma 28), 3 rpoE-유사 Sigma 24 (Ent638_3060, Ent638_3117 및 Ent638_3389), rpoS (Ent638_3212, Sigma 38), rpoD (Ent638_3473, Sigma 70), rpoN (Ent638_3638, Sigma 54) and rpoH (Ent638_3865, Sigma 32).

엔테로박터 에스피. 638은 GATC 사이트에서 아데닌 메틸화에 관여된 활성 댐(dam) 메틸라제를 암호화하며, 이는 DNA의 Mbol 및 Sau3AI 소화(digestion)에 의해 확인되어지는 바와 같이, 제 1 효소는 메틸화된 엔테로박터 에스피. 638 DNA를 소화할 수 없다.

엔테로박터 에스피. 638의 게놈 상에, 백 개의 회귀성(palindromic) 반복 (CCCTCTCCCXX(X)GGGAGAGGG)이 염색체 위에 고르지 않게 분포되는 것으로 밝혀졌다(도 10 참조). 이들 헤어핀 루프 형성 반복(XX(X)는 주로 TGT/ACA 또는 AC/TG 임)은 주로 유전자의 3' 말단에서 이중 또는 삼중으로 위치되며, 전사 종료(transcription termination)에서 중요한 역할을 한다고 추정된다.

8 삽입 서열(IS) 요소는 엔테로박터 에스피. 638의 게놈에서 발견하였다: IS3/IS51 패밀리 (세 개의 ORF와 프레임쉬프트로 구성된 하나 (Ent638_0739, Ent638_0740, Ent638_0741) 및 단일 ORF로 구성된 하나 (Ent638_0060))로부터의 2개, IS110 패밀리 (Ent638_1530)로부터의 하나의 IS 요소, 및 IS481 패밀리 (Ent638_2980, Ent638_3160 및 Ent638_3288)로부터의 세 개의 IS 요소. 이들 IS 요소의 일부는 한계 정하는 추정 게놈 섬이다 (하기 섹션 참조).

플라스미드 pENT638-1은 2개의 완벽한 IS 요소, 하나의 ORF (Ent638_4224)로구성된 Tn3 패밀리로부터의 하나 및 2개의 ORFs (Ent638_4320 및 Ent638_4321)로부터 구성된 IS3/IS407 패밀리로부터의 하나를 가지며, 뿐만 아니라 후자의 패밀리로부터 2개의 끝을 자른 트랜스포사제(truncated transposase)를 갖는다. IS3/IS407 패밀리로부터 완벽한 IS 및 끝을 자른 트랜스포사제는 플라스미드 유지 및 복제(sopAB, repA)에 관여된 거대 영역 암호화 유전자 및 컨쥬게이션에 의한 플라스미드 전달에 포함된 유전자(tra)를 플랭킹(flanking)하였다. 이 75kb 영역은 pENT638-1 백본으로 여겨질 수 있다.

엔테로박터 에스피.638의 게놈과 밀접하게 관련된 균주의 게놈과 비교하는 경우, 엔테로박터 캔세로지너스(Enterobacter cancerogenus) ATCC 35316은 엔테로박터 에스피. 638과 신터니(synteny)에서 80.4%의 CDS와 가장 가까운 게놈인 것으로 결정되었고, 이어서 클레브시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae) 342 및 MGH 78578(모두 신터니에서 74%의 CDS를 가짐), 이어서 시트로박터 코세리(Citrobacter koseri) ATCC BAA-895(73%) 및 이어서 에스케리치아 콜리 종(63 내지 73% 사이)이다.

그의 식물 숙주에 엔테로박터 에스피.638의 특이적 순응을 다른 식물과 관련된 미생물 및 위장 박테리움 이.콜라이 K12(MG1655)의 게놈 비교를 통해 면밀히 조사하였다. 가장 명백한 박테리아 게놈이기 때문에 기준 유기체로서 선택된 이 균주는 엔테로박터 에스피. 638를 갖는 2938 신터니 CDS(이들 게놈의 69.2%)를 공유하였다(단백질 길이의 80%에 표준 80%의 동정). 상기 신터니 영역은 신톤(synton) 마다 10.5CDS의 평균 수를 갖는 304 신톤들로 그룹지워진다.

56 영역은 엔테로박터 에스피. 638 상에서 동정되었고, 이것은 근접하게 관련된 박테리아의 게놈을 갖는 신터니에서는 아니다. 이들 중에서 18 영역은 추정 게놈 성에 대한 표준과 맞는다(표 2에서 회색으로 하이라이트). 이들 게놈 섬은 슈거 수송(PTS 시스템), 부착, 펙테이트(pectate) 이용, 사이드로포어 수용체를 통한 철의 흡수, 질산염 환원, 선모(pilus) 생합성, 뿐만 아니라 많은 다른 수송자 및 조절자에 관여된 단백질을 암호화하는 유전자를 운반하다. 영역 넘버 47은 식내서성 생활방식에 대한 순응에 관여된 유전자를 함유하는 게놈 섬의 획득의 예시적인 실예이다. 이 영역은 추정 펙테이트 수송자 및 열화(degradation) 단백질을 암호화하고, 이것은 균주 638이 탄소원으로써 펙테이트(중요한 식물 합성된 화합물) 상에서 성장하게 한다. 이 게놈 섬은 인터그라제 유전자에 의해 플랭크되고, tRNA-Gly 사이트로 삽입되었다.

8 파지 및 1의 추정 통합 플라스미드를 염색체 상에서 발견하였다. 18 추정 인터그라제 유전자를 포함하는 전체 302 파지 단백질을 동정하였다.

추가로, 엔테로박터 에스피. 638 염색체는 CRISOR-관련 서열(Cas)을 암호하는 6개 유전자(Ent638_1401_1406) 옆에 위치된 클러스트된 정기적 인터스페이스된 쇼트 회귀성 반복(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats(CRISPR)을 갖는 영역을 함유한다. CRISPR은 박테리오파지에 대한 획득된 내성을 제공하는 것이다. 8개의 프로파지의 6개는 영역에 의해 플랭킹되며, 이것은 이. 콜라이 K12, O157-H7 및 UTI89와 같은 밀접하게 관련된 박테리아, 클레브시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae) MGH 78578 또는 시트로박터 코세리(Citrobacter koseri) BAA-895에서 대응하는 영역을 갖는 신터니가 부족하며, 파지 형질도입을 통해 획득되어질 수 있다. 이들 영역은 아미노산 및 철/사이더로포어 수송자, 헤모리신(HCP) 및 헤마클루틴인(hemagglutinin) 단백질과 같은 박테리아/식물 상호작용에서 중요한 유전자 및 수송자를 포함한다(표 2, 도 2). 지금까지, 게놈 섬, 파지 및 IS 요소의 세포내 또는 세포외 운동성은 실험적으로 보여지지 않았다.

실시예 9 : 식물 근권( rhizosphere )에서의 생존 : 엔테로박터 에스피 .638 대사물 역량의 개요

일반적으로, 포플러는 꺾꽃이 순에 의해 증식되고, 꺾꽃이 순에 내부기생식물의 수가 매우 낮기 때문에, 식내서성 박테리아의 많은 종은 포플러를 콜로니화하기 전에 토양에서 생존해야 한다. 엔테로박터 에스피. 638은 식물 근권에서 잘 생존한다. 이는 이것이 탄수화물, 아미노산 및 철 흡수뿐만 아니라 일부 중금속 저항성 유전자에 포함된 많은 수송자를 암호화하기 때문이다. 이하에 설명된 대사 경로의 대부분은 선택적인 성장 조건하에서 균주 638을 중경(cultivation)하는 것으로 확인하였다(Taghavi et al. 2009).

탄수화물 대사

엔테로박터 에스피.638 게놈은 트리카르복실산 사이클, 엔트너-도우도로프(Entner-Doudoroff), 엠브덴메이어호프-파나스(EmbdenMeyerhof-Parnas) 및 펜토즈-인산염 경로를 포함한 중앙 대사를 위한 모든 경로를 암호화한다. 상기 균주는 자가영향으로 성장할 수 없지만, 탄소원으로써 다양한 화합물: D-만니톨, 락토즈, 수크로즈, 알부틴, 살리신, 트레할로즈, D-만노즈, L-알라비노즈, 말토즈, 셀로바이오제, 크실로즈, 글루코네이트 및 글루코스(Taghavi et al. 2009)를 사용할 수 있다. 엔테로박터 에스피. 638은 락타즈(lacZ, Ent638_0928), 크실로즈 아이소머라제(Ent638_0516) 및 크실루로키나제(xylulokinase)(Ent638_0157)를 갖는다. 단독 탄소원으로서 락토즈 이용은 엔테로박테리아세아(Enterobacteriaceae)의 특징이다. 엔테로박터 에스피.638은 말로네이트상에서 성장하는 유전적 능력을 갖고, 이 게놈은 말로네이트를 아세테이트로 전환하는 것을 촉진하는 말로네이트 디카르복실화에 관여된 9개 유전자(mdcABCDEFGHR, Ent638_3779_Ent638_3772)의 클러스터를 포함한다.

슈거 이용의 다양성은 글리코사이드 히드로라제의 다양성과 관련되어진다. 엔테로박터 에스피.638 게놈은 22개 다른 패밀리(CAZy 데이터베이스)를 나타내는 55개 유전자 코딩 추정 글리코사이드 히드로라제를 운반한다. 반면에, 이것은 사람 병원성 엔테로박터 사카자키(Enterobacter sakazakii)는 63개 글리코사이드 히드로라제를 갖는다(CAZy 데이터베이스).

식물 병원성 박테리아 및 곰팡이는 셀룰라제/엔도글루카나제를 포함한 글리코사이드 히드로라제(글리코사이드 히드로라제 패밀리 GH5, GH9, GH44, GH48 및 GH74의 멤버 포함), 리체나제(GH16) 및 크실라나제(GH10, GH11)를 사용하여 식물 세포벽 화합물을 활성적으로 열화하는 것으로 접근한다. 식물 세포벽 폴리머를 열화하는데 일반적으로 사용된 엔도-, 엑소-, 셀룰라제 및 헤미셀룰라제 패밀리의 추정 멤버를 대표하는 글리코사이드 히드로라제는 엔테로박터 에스피. 638 게놈 상에서 암호화되지 않는다. 이 관찰은 엔테로박터 에스피.638의 비식물병원성 행동과 일치된다. 그러나, 이것은 2개의 엔도-1,4-D-글루코나제(GH8)(bcsZ: Ent638_3928, Ent638_3936)가 박테리아 셀룰로스 합성 로커스(locus)의 일부로서 밝혀졌음을 명심해야 한다.

식물 영양분의 흡수

엔테로박터 에스피. 638과 그의 포플러 숙주와 같은 공생관계에 있는 살아있는 유기체는 예를 들면 자원을 공유할 필요가 있으며, 따라서, 엔테로박터 에스피. 638의 게놈은 식물-방출된 영양분을 취하도록 하는 매우 다양한 수송자를 암호화한다고 기대된다. 전체 631개의 ORF는 추정 수송자 단백질에 대해 암호화한다: 이들 중 295개는 ABC 수송자(하나의 인산염 수송자)를 암호화하고, 81개는 주된 촉진제 슈퍼패밀리(MFS)를 암호화하고, 41개는 포스포트랜스퍼라제 시스템 패밀리(PTS)로부터 수송자를 암호화하고, 14개는 저항성 근류형성(nodulation) 및 세포 분열 패밀리(RND)로부터 수송자를 암호화한다(추정 수송자의 완벽한 리스트 및 이들의 SOM에서의 기질 참조). 이 관찰은 근권으로 방출된 것들을 포함하는 식물 합성된 영양분의 효과적인 흡수를 요구하는 엔테로박터 에스피. 638의 식물 관련된 생활양식과 일치하였다.

엔테로박터 에스피. 638 게놈은 많은 PTS 수송자를 암호화한다. 계통발생학적 분석은 엔테로박터 에스피. 638 PTS 수송자에 기질 특이성을 할당하는데 사용되었다: 7은 α-글루코사이드(글루코스, N-아세틸글루코사민, 말토즈, 글루코사민 및 α-글루코사이드의 흡수를 위해)에 속하고, 7은 β-글루코사이드(수크로즈, 트레할로즈, N-아세틸무라민산, 및 β-글루코사이드의 흡수를 위해)에 속하고, 2는 프룩토즈 PTS 수송자(프룩토즈, 만니톨, 만노즈 및 2-O-α-만노실-D-글리세레이트의 흡수를 위해)이고, 6은 락토즈 PTS 수송자(락토즈, 셀로바이오제 및 방향족 β-글루코사이드의 흡수를 위해)이다.

중금속에 대한 저항성

엔테로박터 에스피. 638 게놈은 P-타입 ATP아제 CopA(Ent638_0962)(이것의 발현은 CueR(Ent638_09630)에 의해 규제), 구리 유출 오페론 cusABCF(Ent638_1157_1154), 다중 구리 옥시다제 CueO(Ent638_0671) 및 추정 CopC 및 CopD 구리 저항성 단백질(Ent638_2411-12)에 대한 오페론 코딩을 포함하는 구리 저항성에서 추정적으로 관여된 유전자를 운반한다. 흥미롭게, 상기 균주는 100μM Cu(NO₃)₂의 존재하에서 284 글루코스 최소 배지에서 성장하는데 실패하였다.

엔테로박터 에스피. 638은 플라스미드 pENT638-l (arsHRBC, Ent638_4254-Ent638_4257)의 복제 기원 다음에 발견된 아르세닉/아르세네이트(arsenic/arsenate) 저항성 클러스터를 암호화하고, 균주 638은 200μΜ 아르세네이트(Na₂HAs0₄로서)의 존재하에서 284 글루코스 최소 배지에서 성공적으로 성장시키는 것으로 밝혔졌다.

아르세네이트 및 추정 구리 저항성 유전자의 존재는 WA의 Tacoma의 ASARCO 용광로로부터 방출되는 것으로 영향을 받는 지역에서 성장하는 포플러로부터 단리시킨 엔테로박터 에스피.638로 예상하지 못한 것이며, 1905년부터 1982년까지 운영중인 구리 용광로는 미국에서 가장 큰 아르세닉 방출원의 하나인 것으로 여겨졌다.

염색체에 위치된 기타 중금속 저항성 유전자는 아연/카드뮴/코발트 저항성에 관여된 추정 크로메이트 리덕타제(YieF 또는 ChrR, Ent638_4144) 및 P-타입 방출 ATP아제 ZntA(Ent638_3873)을 포함한다. 균주 638은 500 μΜ ZnS04 , 500 μΜ CdCl₂, 100 μΜ CoCl₂, 및 50 μΜ NiCl₂의 존재하에서 284 글루코스 최소 배지에서 성장할 수 있었다. 비록 이들 유전자는 다른 이. 콜라이 종에 존재되고 있다고 주장될 수 있지만, 이들의 존재는, 특히 이들 금속이 존재되는 경우 근권에서 생존하는 다른 박테리아보다 선택적인 이점을 제공하기에 충분하게 될 수 있다.

중금속은 또한 중요한 보조인자이고, 엔테로박터 에스피.638 게놈은 중금속의 흡수 및 방출에 관여된 여러 개의 유전자를 암호화한다. 유전자는 아연(znuACB, Ent638_2426- 2428) 및(nikABCDE, Ent638_1834-Ent638_1838) 흡수에 포함된 ABC 수송자에 대해 발견되었다. 니켈은 우레아제를 위한 필수 보조인자이고(Dosanjh et al. 2007), 이. 콜라이 K12 및 S. 프로테아마쿠란스(proteamaculans) 568과는 달리, 엔테로박터 에스피.638은 우레아를 암모니아(ureABC, Ent638_3464-Ent638_3466)로 전환할 수 있다.

식물의 방어 메카니즘에 대응하는 산화 스트레스

식물은 반응성 산소종의 생산(ROS)(수퍼옥사이드, 히드로퍼옥실 라디칼, 과산화수소 및 히드록실 라디칼 종), 산화질소 및 피토알렉신(phytoalexins)의 생산을 포함하여, 박테리아, 바이러스 및 곰팡이 감염에 대한 다양한 방어 메카니즘을 사용한다. 뿌리 콜로니화 이전에, 균주 638은 산화 근권 환경에서 살아남아야 한다. 엔테로박터 에스피. 638 염색체는 세개의 슈퍼옥사이드 디스뮤타제를 암호화한다: SodA, Mn 슈퍼옥사이드 디스무타제 (Ent638_4063); SodB Fe 슈퍼옥사이드 디스무타제 (Ent638_l191); 및 SodC, Cu/Zn 슈퍼옥사이드 디스무타제 (Ent638_1801). 이것은 또한 세개의 카탈라제, KatE (Ent638_1712), KatN (Ent638_3129) 및 KatG (Ent638_4032), 세개의 히드로퍼옥사이드 리덕타제, ahpC (Ent638_0872 및 Ent638_l145) 및 ahpF (Ent638_l146), 2개의 추가적 히드로퍼옥사이드 리덕타제 (추정 ahpC Ent638_3391 및 AhpD 도메인을 갖는 Ent638_0498), 클로로퍼옥시다제 (Ent638_l149), 및 2개의 티올 퍼옥시다제 (Ent638_2151 및 Ent638_2976).

본 발명자들은 또한 그의 유기 과산화물 센서/조절자(ohrR, Ent638_0519) 다음에 위치된 추정 유기 과산화물 저항성 단백질(ohr, Ent638_0518)을 동정하였다.

엔테로박터 에스피. 638은 플라보헤모프로테인 산화질소 디옥시게나제(Ent638_3037) 및 혐기성 질산염 환원 오페론(norRVW, Ent638_3181-3183)의 존재에 의해 프리 라디칼 산화 질소를 해독할 수 있다고 여겨진다. 상기 산화 스트레스 응답 시스템의 발현은 복합 규제 네트워크(complex regulatory networks)를 통해 제어된다. 중요한 조절자는 katG , gor(글루타티온 리덕타제, Ent638_3913), ahpC, ahpF , oxyS (규제 RNA, Ent638_misc_RNA_29), dpsA (단백질 기아 동안 DNA 보호, Ent638_1299), fur (사이더로포어 생합성 및 수송의 DNA-결합 전사 이중 조절자, Ent638_l198) 및 grxA(글루타레독신, Ent638_1364)와 같은 과산화수소 센서 OxyR이고, 이것은 과산화수소-유발 유전자의 레귤론의 발현을 활성화하며, 이들 모두는 엔테로박터 에스피.638에 존재한다. 3개의 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST) 유전자 (Ent638_0139, Ent638_0268 및 Ent638_1329), 글루타티온 ABC 수송자 (GsiABCD, Ent638_1323-1326), 2개의 글루타티온 퍼옥시다제 (Ent638_1732 및 Ent638_2699), 감마-글루타메이트-시스테인 리가제 (GshA, Ent638_3168), 글루타티온의 신테타제 (GshB, Ent638_3351) 및 감마-글루타밀트랜스펩티다제(GGT, Ent638_3850)가 엔테로박터 에스피.638의 게놈상에서 발견되었다. 수송자의 RND 패밀리에 속한 AcrAB (Ent638_0943-0944) 로커스(locus)는 또한 엔테로박터 에스피.638에서 동정되었다.

실시예 10 : 숙주 식물에서 식내서성 콜로니화 및 확립

식물 숙주의 식내서성 콜로니화는 4단계 프로세스(Van der Lelie et al. 2009)로 나눌 수 있다.

단계 1: 포플러 뿌리를 향한 이동: 운동성/ 화학독성

엔테로박터 에스피. 638은 식물 뿌리, 식내서성 콜로니화의 바람직한 사이트로 적극적으로 이동하도록 잘 갖추어져 있다. 이것의 게놈은 3개의 편모 생합성 오페론을 함유한다(flgNMABCDEFGHIJKL , flhEAB fimA yralJ IPP cheZYBR tap tar csuEDCAB INT cheWA motBA flhCD fliYZA fliCDSTEFGHJKLMNOPQR, Ent638_2445-2541 및 fliEFHIJKLMNOPQR).

그러나, 엔테로박터 에스피. 638의 flh 오페론은 필리(pili) 생합성 유전자의 2개 삽입체를 함유한다. 이들의 영역의 하나는 습득 후를 가리키는 인터그라제에 의해 플랭크시켰다. 엔테로박터 에스피. 638에서, 섬모(pilus)/핌브리아(fimbriae) 생합성 유전자를 10개의 구별되는 영역으로 그룹지웠다. 주화성(chemiotaxis)에 관여된 결정 요인을 또한 편모 생합성 유전자 클러스터 안에서 발견하였다.

단계 2 및 단계 3 : 뿌리 표면의 부착 및 콜로니화

엔테로박터 에스피.638에서, 여러 개의 유전자는 뿌리에 추정 부착에 관여된 동정된 암호화 단백질이였다. 많은 것은 식물 뿌리 콜로니화의 단계 동안 이 플라스미드의 특이적 역할을 가리키는 게놈 섬에 위치되거나 또는 플라스미드 pENT638-1에 위치되었다. 특별히, pENT638-1은 23kb 추정 게놈 섬(인터그라제 유전에 의해 플랭크되고, 56.2%의 GC%를 가지며, 이것은 플라스미드의 나머지보다 현저하게 크다), 뿐만 아니라 추정 srfABC 오페론을 포함한다. srfABC 오페론의 정확한 기능은 불분명하게 남아있지만, 이것은 숙주 콜로니화에 포함된다고 믿어지고 있다.

식물 침입에 관여된 많은 다른 유전자는 pENT638-1에 존재되고, 오트로트랜스포터(autrotransporter) 도메인 (분비 타입 V) 및 병독성/부착 도메인(헤마글루티인(Ent638_4267), 퍼택틴(Ent38_4201 및 Ent638_4206) 및 부착(Ent638_4317))을 갖는 추정 단백질을 포함한다(도 3).

헤마글루틴인 : 엔테로박터 에스피. 638의 염색체를 2개의 추정 헤마글루틴인 단백질(Ent638_0148, Ent638_3119) 및 섬질의 헤마글루틴인을 위한 암호화하는 5개 유전자로 구성된 클러스터(Ent638_0052-0057).

추가로, 여러 개의 유전자는 펙틴 리아제/퍼택틴 도메인(Ent638_1775, Ent638_0318, Ent638_0501) 또는 부착 도메인(Ent638_1867, Ent638_3408)을 갖는 자가수송자 단백질을 위해 암호화하는 엔테로박터 에스피. 638의 염색체에서 발견되었다.

2개의 엔테로박터 에스피.638 yadA 유전자(Ent638_1867 및 Ent638_4317) 모두는 자가수송자 도메인 및 인베이신(invasin)/부착 도메인을 갖는 단백질을 암호화하였다. YadA 단백질은 식물 콜로니화/침입(invasion)을 촉진하지만, 고대 장(ancient enteric)의 생활양식의 램넌트(remnant)를 대표할 수 있다.

pENT638-1(Ent638_4267)에의 헤마글루틴인 유전자는 2개의 RelB/ 독성/해-독성 시스템에 의해 둘러싸여 있다. 이것은 pENT638-1에서 이런 방식으로 안정화되어진 Ent638_4267 헤마글루틴인이 뿌리 부착에서 중요한 역할을 해야한다는 가설이다. 헤마글루틴인 유전자 Ent638_4267과 함께, 테트라트리코펩타이드(TPR-2) 반복 도메인을 함유하는 단백질을 위해 코딩하는 2개의 유전자(Ent638_4265-4266)가 동정되었으며, 단백질-단백질 상호작용 및 부착 장치의 정확한 어셈블리에 추정적으로 관여되었다.

타입 I 및 IV 필리 : 6개의 추정 어셔(usher) 단백질이 엔테로박터 에스피. 638 게놈 상에서 발견되었다(Ent638_0084, Ent638_0403, Ent638_0990, Ent638_1071, Ent638_2450, 및 Ent638_2459). 이 수는 다른 일반적인 식물 관련된 박테리아에서 발견된 어셔 단백질의 평균 수보다 훨씬 많은 것이다.

엔테로박터 에스피.638의 염색체에서, 필리/컬리/핌브리아 생합성에 관여된 56개의 유전자, 타입-I 필리 생합성 유전자(Ent638_0074-0086, Ent638_0401-0409, Ent638_0987-0994, Ent638_1068-1072, Ent638_2448-2451, Ent638_2458-2462)의 6 클러서터를 포함하여, 동정시켰다. 마지막 2개의 클러스터를 주화성(chemiotaxis) 및 운동성(편모 생합성)(운동성 섹션 참조)에 관여된 유전자에 의해 플랭크시키고 분리시키고, 생물이 아닌 표면에서 바이오필름의 형성에 관여되는 것이 가능하다. 이 영역(Ent638_2445-2541)은 식물 뿌리 콜로니화의 다른 측면에 관여된 클러스터링 유전자의 좋은 실예를 대표한다(주화성, 운동성 및 부착).

타입 IV 필리 : 엔테로박터 에스피. 638 유전자에서, 타입 IV 필리 생합성 유전자의 2개의 클러스터를 동정하였고, (Ent638_0650-0652, 및 Ent638_3266-3268) 뿐만 아니라 DNA 흡수에 가능하게 관여되는 추정 비특징 선모(pilus) 생합성 유전자(Ent638_3804 및 Ent638_3808)의 클러스터를 동정하였다.

컬리 화이버스 ( Curli fibers ) : 구조적으로 및 생화학적으로, 컬리는 아밀로이드로 잘 알려진 화이버의 성장 클래스에 속한다. 엔테로박터 에스피.638의 게놈 상에, 컬리 생합성(Ent38_1533-1599)을 위한 하나의 클러스터를 동정하였다.

셀룰로스 생합성

비병원성 행동과 일치하여, 엔테로박터 에스피. 638의 게놈은 셀룰로스 열화에 관여된 단백질을 암호화하지 않는다. 그러나, 셀룰로스 생합성에 대해 책임있는 오페론을 동정하였다(Ent38_3927-3940).

병독성( Virulence )

현미경 연구는 엔테로박터 에스피. 638은 피목의 루멘 사이에 뿌리 물관부를 콜로니화하는 것을 보여주며, 새포내 콜로니화는 관찰되지 않았다(Taghavi et al. 2009).

비록 엔테로박터 에스피.638은 결코 식물 콜로니화 연구에서 기회감염성의 병원체로서 행동하는 것으로 밝혀지지 않았고, 이것의 게놈은 병독성에 관여하는 여러개의 단백질에 대해 추정적으로 코드한다. 병독성은 식내서성 콜로니화를 위해 요구되어지는 것과 유사하게 박테리아와 그의 숙주 사이에 밀접한 상호작용을 요구할 수 있다는 점에 명심해야 한다. 내부 멤브레인 헤모리신을 위해 코딩하는 하나의 유전자(yafA, Ent638_3317), 추정 헤모리신 도메인을 함유하는 부분적 CDS(Ent638_0251), 및 병독성 인자를 위한 코딩하는 세 개의 유전자 hcp(Ent638_0829, Ent638_2912 및 Ent38_3004)를 동정하였다.

다른 추정 독성 인자는 마크로파지 내에 병독성 및 생존을 위해 요구되는 PagC (Ent638_3136) 및 msgA (Ent638_1656), 및 그의 생성물이 박테리아 세포 표면 상에 VirG(Enmt638_3560)의 발현 및 정확한 멤브레인 국소화를 위해 요구되는 추정 virK 유전자(Ent638_1394 및 Ent638_2409)를 포함한다.

그러나, 에르위니아(Erwinia) 및 피. 시린게이(P. syringae)와 같은 병원체를 위해 전형적인 활성 병독성 생활양식을 위한 전제조건인 타입 III 분비 시스템을 위해 암호화하는 유전자가 엔테로박터 에스피.638 게놈상에서 동정되지 않았다.

최종적으로, pENT638-1 플라미스미드와 유사하게, srfABC 오페론(Ent638_2108-Ent638_2110)은 엔테로박터 에스피.638 염색체에서 발견되었다. 식내서성 행동에서 이들 유전자의 기능은 불분명하게 남아있다.

단계 4: 활성 콜로니화를 통한 뿌리 및 인 플랜타 ( i n planta ) 구축의 침입

엔테로박터 에스피. 638은 이것의 게놈 서열이 식물 세포벽의 활성 파괴를 통해 식내서성 콜로니화를 허용하는 엔도/엑소-셀룰라제 또는 헤미셀룰라제를 암호화하지 않기 때문에 조직 손상에서 식물 뿌리에 들어갈 수도 있다.

펙틴/ 펙테이트 열화

비록 엔테로박터 에스피.638은 단독의 탄소 원으로 펙틴(폴리(1,4-알파-D-갈락투로네이트)) 상에 성장할 수 없지만, 그의 게놈은 펙테이트의 열화, 펙티의 디메틸화된 백본 및 식물 세포 벽의 구성에 관여된 유전자를 암화화하는 게놈 섬을 포함하고 있다. 엔테로박터 에스피, 638의 펙테이트를 열화하는 능력은 식물 세포 사이에 공간 영역을 콜로니화하는데 중요한 역할을 할 수 있다.

펙테이트를 이들의 비-환원성 말단에 4-데옥시-알파-D-갈락트-4-엔우로노실 기를 갖는 올리고사카라이드로 개열하는데 관여된 분비된 펙테이트 리아제, PelB는 올리고갈락투로나이드의 주변세포질로의 흡수에 관여된 올리고고갈락투로네이트-특이적 폴린, KdgM에 옆에서 발견되었다. 게놈의 다른 영역에 의해 암호화되는 주변세포질의 펙티나제, PelX는 올리고갈락투로나이드의 주변세포질 열화에 관여된다.

또 다른 영역에서, 내부 멤브레인을 가로지르는 올리고갈락투로나이드의 전위에 관여된 탄수화물 흡수 ABC 수송자, TogMNAB, 및 올리고갈락투로나이드를 2-데히드로-3-데옥시-D-글루코네이트로 열화하는데 관여하는 여러 개의 추가 단백질, Ogl, KduI및 KduD를 동정하였다. D-글루코로네이트 대사에 관여된 KdgK 및 KdgA는2-데히드로-3-데옥시-D-글루코네이트를 일반적인 세포 대사 화합물인 피루베이트 및 3-포스포글리세알데히드로 추가로 열화한다. IS481 패밀리로부터 트랜포사제에 의해 플랭크되는 이 영역은 수평 유전자 전달을 통해 얻어질 수 있다. 갈락투로네이트를 2-데히드로-3-데옥시-D-글루코네이트로 열화하는 선택적 경로를 위해 요구되는 단백질 UxaA, UxaB, 및 UxaC는 또한 엔테로박터 에스피. 638 염색체에 의해 암호화될 수 있다. 펙테이트의 열화는 병원성 효과를 피하기 위하여 잘 규제되어야 한다.

플라스미드 pENT638-1은 오트로트랜스포터 단백질을 위해 펙틴 리아제 도멘으로 암호화하는 2개의 이웃하는 유전자(Ent638_4201, Ent638_4206)를 운반한다. 이들 단백질은 엔테로박터 에스피.638의 포플러 뿌리에 부착에 관여될 수 있거나, 또는 효소의 수출(export)을 관여하는 콜로니화 메카니즘의 일부로서 뿌리 세포의 세포 벽을 용해할 수 있다. 이들 2개의 유전자 사이에, 타이트한 규제를 제안하는 두 개의 성분 전사적 조절자를 동정하였으며, 뿐만 아니라 캡슐의 폴리사카라이드 생합성(Ent638_4207)에 관여되고 글리코실 트랜스퍼라제(Ent38_4209)에 대해 암호화는 2개의 추가적 유전자를 동정하였다. 세포 표면 리포폴리사카라이드(LPS)는 숙주 특이성에 관여되어진다고 가설화되었으며, 이들 유전자의 근접성은 엔테로박터 에스피.638에 의한 식물 침입에 공동의 역할을 제안한다.

pENT638 -1 플라스미드 셀로바이오제 포스포릴라제

플라스미드 pENT638-1에서, 플라스미드의 복제 개시점 옆에 위치된 ndvB 유전자(8532bp)는 β-(1→2)-글루칸의 생성에 관여된 단백질을 암호화한다. 멤브레인 결합된 NdvB 단백질은 세 개의 효소적 활성을 촉매화한다: 개시(단백질 글루코실화), 신장(elongation), 및 주변세포질로 방출되어지는 β-(1→2)-글루칸의 그 자리에서 고리화(cyclization).

실시예 11 : 숙주 식물과의 상승적 상호작용 : 식물 성장 촉진 및 건강

간접적 식물 성장 촉진 효과

질소 고정 및 대사

엔테로박터 에스피.638은 질소를 고정시키는데 불안정하고, 요구된 nif 유전자가 부족하다. 그러나, 이것은 이화적 및 동화적 질산염 환원 경로를 위해 요구된 유전자를 포함한다. 상기 질산염 수송 및 질산염/아질산염 환원 유전자는 인터그라제 및 추정 부착/침입 유전자에 의해 분리된 2개의 오페론 ( narlJHGKXL 및 nasAB ntrCBA nasR, Ent638_2312-Ent638_2326) 내에 존재된다. 질산염 수송 및 환원(nirBDC, Ent638_3793-3795), 질산염 수송 및 환원(narUZYWV, Ent638_2061-Ent638_2065) 및 암모니아 흡수 수송자(amtB, Ent638_0919) 및 그의 조절자(Ent638_0918), 뿐만 아니라 질산염/아질산염 센서 단백질(narQ, Ent638_2964)에 관여된 기타 영역이 또한 그의 염색체에서 발견되었다.

사이더로포어

엔테로박터 에스피. 638은 철(iron) 흡수를 취급하는 중간체 용액을 발전시키고 있다. 이것의 게놈은 2개의 제1철(ferrous)의 철 흡수 시스템(FeoAB, EfeUOB) 및 9개의 철 ABC 수송자를 함유한다.

엔테로박터 에스피. 638은 사이더로포어 엔테로박틴(siderophore enterobactin)을 합성하고(EntD, EntF, EntC, EntE, EntB alc EntA), 이것을 분비하고(EntS), 제2철(ferric)의 사이드러포어 흡수 시스템을 이용하여 철-엔테로박틴 착물을 회수하고(ExbDB), 철-엔테로박틴 착물의 내재화(internalization)후에 엔테로박틴 에스터라제(Fes)를 사용하여 철을 추출할 수 있다. 엔테로박틴의 생합성에 관연된 유전자는 17개의 유전자의 큰 클러스터(Ent638_l 1 11-1128)에서 철 흡수(sitABCD 및 fepCGDB)에 관여된 2개의 ABC 수송자를 암호화하는 유전자와 함께 그룹지워진다. 또한, 엔테로박터 에스피.638은 12개의 외부 멤브레인 제2철 및 제2철-관련된 사이더로포어 수용체(TonB 의존성)를 가지며, 이것은 이.콜라이 K12에서 발견된 수의 거의 2배이다(오직 7개의 사이더로포어 수용체만 소유). 이 관찰은 철을 위해 경쟁하는데 필요한 박테리아에 대한 것과 일치하였다. 충분한 철 흡수 시스템의 존재는 따라서 곰팡이 감염에 대하여 숙주 식물을 보호하는데 기여할 수 있다.

항균성 화합물

엔테로박터 에스피. 638은 페닐에틸알콜을 본질적으로 생성하기 위해 보여졌다. 일반적으로 향수에 사용되는 이 분자는, 엔테로박터 에스피. 638에게 향기로운 꽃 냄새를 제공하지만, 보다 흥미롭게 항균 특성을 갖고 있다. 두 후보 유전자 (Ent638_1306 및 Ent638_1876)는 페닐-아세트알데하이드를 페닐에틸알콜로 전환하는데 추정적으로 관여되는 효소를 암호화한다. 이 두 유전자는 다른 밀접하게 관련 균주과 신터니하지 않는 영역에 위치하고 있다.

4 - 하이드록시벤조에이트는 중요한 전자 운반 유비퀴논의 전구체이지만, 항균 활성을 가지고 있다고 알려져 있다. 엔테로박터 에스피. 638은 ubiC (Ent638_0243) 유전자를 가지며, 이 반응을 수행할 수 있는 추정 단백질에 대해 암호화한다.

엔테로박터 에스피. 638 게놈은 클로로암페니콜(chloramphenicol) 내성에 관여된 클로로암페닐콜 아세틸트랜스퍼라제(cat, Ent638_1533)을 암호화하고 그 박테리아가 다른 식내서성 또는 근권 유기체에 의해 생성된 항균 화합물에 대해 생존되도록 도울 수 있다.

실시예 12 : 엔테로박터 에스피 . 638에 의한 직접 식물 성장 촉진

1-아미노시클로프로판-1-카르복실레이트 데아미나제(l- aminocyclopropane -l-carboxylate deaminase )

1-아미노시클로프로판-L-카르복실레이트(ACC) 데아미나제 (ACD), (EC : 3.5.99.7)는 엔테로박터 638 게놈으로부터 존재되지 않으며, 이것은 균주가 ACC를 대사할 수 없다는 이전 연구를 확인해준다(Taghavi 외 2009). 그러나, 아미노산 데아미나제가 발견되었지만, 그들은 활성 사이트에서 PLP의 피리딘 질소 원자에 접근하는 특정 아미노산 E 296과 L 323(각각 T 또는 S와 T로 대체)이 모두 부족하다.

뿌리 성장 촉진 호르몬 아세토인 및 2,3- 부탄디올의 생성

엔테로박터 에스피. 638 게놈은 피루베이트 탈수소효소를 암호화하는 유전자 poxB (Ent638_1387)을 운반한다. PoxB의 주요 기능은 피루베이트를 아세트 알데히드로 전화하는 것인 반면, 피루베이트의 작은 프랙션은 히드록시에틸-티아민 디포스페이트 반응 중간체의 부산물로서 아세토인으로 전환된다.

엔테로박터 에스피. 638 게놈은 아세토락테이트로 피루베이트의 전환에 관여된 아세토락테이트 신타제(budB, Ent638_2027)를 암호화한다. 아세토인 디카르복실라제 (BudA, Ent638_2026)는 아세토인으로 아세토락테이트의 전환을 촉진한다. 아세토인은 박테리아에 의해 방출되거나 또는 이후 아세토인 리덕타제 (budC, Ent638_2028)에 의해 엔테로박터 에스피.638 또는 포플러에 의한 2,3-부탄디올로 전환할 수 있다. 호기성 상태에서, 아세토락테이트는 자발적으로 아세토인 디히드로게나제 단백질 (Ent638_2737)에 의해 교대로 아세토인으로 전환할 수 있는 디아세틸로 전환된다.

엔테로박터 에스피. 638에 의한 휘발성 화합물의 생합성 및 포플러 잎 추출물의 첨가에 의한 이들의 유도는 질량 분석법을 통해 조사되었다. 2,3-부탄디올과 아세토인의 생산은 엔테로박터 에스피. 638 및 유도 후 12 시간부터 포플러의 잎 추출물을 함유하는 샘플에 대해서 보여졌다(도 8). 디아세틸 합성이 확인될 수 없지만, 세 가지 화합물에 대한 완전한 대사 경로의 존재에 따라 발생할 수 있다는 것에 명심해야 한다. 추가 피크는 실험 및 대조 샘플 (6:42, 9:45, 및 14:1)의 모두에서 볼 수 있고, 이들 화합물의 동정이 현재 수행되고 있는 것이다.

엔테로박터 에스피. 638은 아세토인 및 2,3-부탄디올을 중심 대사물로의 이화적 전환에 관련된 유전자(acoABCX adh)가 부족하다. 따라서 엔테로박터 에스피. 638에 의한 이들 식물 성장 호르몬의 생산 및 저하 사이에 대립 효과가 없다.

식물 성장 호르몬 IAA 의 생성

엔테로박터 에스피. 638에 의한 인돌 아세트산 (IAA)의 생산은 실험적으로 입증되었다(Taghavi 외. 2009). IAA 생합성은 트립토판 열화 경로 VII (방향족 아미노산 아미노트랜스퍼라제, Ent638_1447)에 의한 중간 분자로 인돌피루베이트의 생산을 통해 가능하다. 인돌피루베이트 디카르복실라제 IpdC (Ent638_2923)과 피루베이트 인돌-3-아세트 알데히드 디히드로게나제(Ent638_0143는)는 IAA 합성을 추가적으로 촉진한다.

본 발명의 바람직한 실시예로 현재 여겨지는 것을 설명하고 있지만, 본 발명이 속한 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 정신에서 이탈됨 없이 이것으로부터 많은 변화와 변형이 만들어질 수 있음을 깨달을 것이고, 이런 변화와 변형은 첨부되는 청구 범위에 명시된 바와 같이 본 발명의 진정한 범위 내에서 주장될 수 있다.

	엔테로박터 에스피. 638
특징	염색체	플라스미드
크기(bp)	4,518,712	157,749
G+C 함량	52.98	50.57152
ORF 개수	4406	108
할당된 기능(추정 포함)	3457	2
아미노산 생합성	174	0
방향족 아미노산류	28	0
아스파테이트 패밀리	44	1
글루타메이트 패밀리	47	1
피루베이트 패밀리	35	0
세린 패밀리	21	0
히스티딘 패밀리	11	0
퓨린, 피리미딘, 뉴클레오사이드 및 뉴클레오티드	93	0
지방산 및 인지질 대사	71	0
보조인자, 프로스테틱기 및 캐리어의 생합성	195	2
중앙 중간대사	218	2
에너지 대사	553	2
수송 및 결합 단백질	631	3
수송자 단백질의 퍼센트	14%	2%
ABC 패밀리	293	2
MFC 패밀리	79	2
PTS 패밀리	41	0
RND 패밀리	14	0
아미노산, 펩티드 및 아민	118	0
음이온	20	0
탄수화물, 유기 알콜 및 산	106	1
양이온 및 철을 갖는 화합물	109	1
뉴클레오사이드, 퓨린 및 피리미딘	9	0
포린	18	0
미공지 기질 또는 약물	2	0
DNA 대사	152	4
전사	281	4
단백질 합성	177	0
단백질 페이트(fate)	188	1
규제 기능	515	6
2 성분 시스템	65	3
세포 엔벨로프	279	3
세포의 프로세스	457	6
생물학적 프로세스	276	0
RHS	2	0
플라스미드 기능	7	42
추정 통합 플라스미드	1	0
독성/해-독성 커플	3	7
프로파지 기능	302	0
파지 영역	8

주어진 코디네이트는 유전자의 것들이고, 비교를 위해 사용된 파지 유기체로부터 반복된 것이 아니다: K. pneumoniae MGH78578, E.coli K12, O157-H7, UTI89, C.koseri BAA-895

568 및 342와 비교하여, K12 및 638은 오페론을 가지고 있다:0231-0234 포린 및 리포단백질;

표 S1( 프라이머 )

표 S4 마이크로어레이

표 S-3 수송자 비교 Ent638

Claims

엔테로박터 에스피( Enterrobacter sp.) 638의 단리된 배양물.
제1항에 있어서, pENT638-1 플라스미드를 더 포함하는 배양물.
엔테로박터 에스피. 638의 단리된 배양물 및 생물학적 허용가능한 배지를 포함하는 식물의 접종제.
제3항에 있어서, 상기 배지는 식물호르몬(phytohormone)을 포함하는 접종제.
제4항에 있어서, 상기 식물호르몬은 아세토인인 접종제.
제4항에 있어서, 상기 식물호르몬은 2,3-부탄디올인 접종제.
제4항에 있어서, 상기 식물호르몬은 인돌-아세트산인 접종제.
제3항에 있어서, 상기 배지는 항균성 화합물을 포함하는 접종제.
제8항에 있어서, 상기 항균성 화합물은 페닐에탄올인 접종제.
제8항에 있어서, 상기 항균성 화합물은 4-히드록시벤조에이트인 접종제.
제3항에 있어서, 상기 배지는 식물호르몬 및 항균성 화합물을 포함하는 접종제.
제3항에 있어서, 식물-성장 촉진 미생물을 더 포함하는 접종제.
제12항에 있어서, 상기 미생물은 액티노박터(Actinobacter ), 알카리젠스( Alcaligenes ), 바실러스( Bacillus ), 버크홀데리아( Burkholderia ), 버티옥셀라( Buttiauxella ), 엔터박터( Enterobacter ), 클렙시엘라( Klebsiella ), 클루이버(Kluyvera ), 프세도모나스( Pseudomonas ), 라넬라( Rahnella ), 랄스토니아(Ralstonia ), 리조비튬( Rhizobitum ), 세라티아( Serratia ) 및 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas)의 종으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 접종제,
식물의 성장을 증가시키기 위하여 식물에 유효량의 조성물을 적용시키는 단계를 포함하고, 여기서 상기 조성물은 엔테로박터 에스피.638의 단리된 배양액을 포함하는 것인 식물에서의 성장 증가 방법.
제14항에 있어서, 상기 조성물은 식물의 뿌리, 어린싹, 잎 및/또는 씨앗에 적용되는 단계를 포함하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 식물은 속씨식물인 방법.
제16항에 있어서, 상기 속씨식물은 토마토인 방법.
제16항에 있어서, 상기 속씨식물은 해바라기인 방법.
제16항에 있어서, 상기 속씨식물은 담배인 방법.
제16항에 있어서, 상기 속씨식물은 포플러인 방법.
식물에서의 바이오매스를 증가시키기 위하여, 식물에 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 조성물은 엔테로박터 에스피.638의 단리된 배양액을 포함하는 것인 식물에서의 바이오매스 증가 방법.
제21항에 있어서, 상기 조성물은 식물의 뿌리, 어린싹, 잎 및/또는 씨앗에 적용되는 단계를 포함하는 방법.
제21항에 있어서, 상기 식물은 속씨식물인 방법.
제23항에 있어서, 상기 속씨식물은 토마토인 방법.
제23항에 있어서, 상기 속씨식물은 해바라기인 방법.
제23항에 있어서, 상기 속씨식물은 담배인 방법.
제23항에 있어서, 상기 속씨식물은 포플러인 방법.
식물에서의 열매 및/또는 씨앗 생산성을 증대시키기 위하여, 식물에 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 조성물은 엔테로박터 에스피.638의 단리된 배양액을 포함하는 것인 식물에서의 열매 및/또는 씨앗 생산성 증대 방법.
제28항에 있어서, 상기 조성물은 식물의 뿌리, 어린싹, 잎 및/또는 씨앗에 적용되는 단계를 포함하는 방법.
제29항에 있어서, 상기 식물은 속씨식물인 방법.
제30항에 있어서, 상기 속씨식물은 토마토인 방법.
제30항에 있어서, 상기 속씨식물은 해바라기인 방법.
제30항에 있어서, 상기 속씨식물은 담배인 방법.
제30항에 있어서, 상기 속씨식물은 포플러인 방법.
식물에서의 질병 내성을 증가시키기 위하여, 식물에 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 조성물은 엔테로박터 에스피.638의 단리된 배양액을 포함하는 것인 식물에서의 질병 내성 증가 방법.
제35항에 있어서, 상기 질병은 곰팡이, 박테리아 또는 바이러스인 방법.
제35항에 있어서, 상기 조성물은 식물의 뿌리, 어린싹, 잎 및/또는 씨앗에 적용되는 단계를 포함하는 방법.
제37항에 있어서, 상기 식물은 속씨식물인 방법.
제38항에 있어서, 상기 속씨식물은 토마토인 방법.
제38항에 있어서, 상기 속씨식물은 해바라기인 방법.
제38항에 있어서, 상기 속씨식물은 담배인 방법.
제38항에 있어서, 상기 속씨식물은 포플러인 방법.
식물에서의 가뭄 내성을 증가시키기 위하여, 식물에 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 조성물은 엔테로박터 에스피.638의 단리된 배양액을 포함하는 것인 식물에서 가뭄 내성 증가 방법.
제42항에 있어서, 상기 조성물은 식물의 뿌리, 어린싹, 잎 및/또는 씨앗에 적용되는 단계를 포함하는 방법.
제42항에 있어서, 상기 식물은 속씨식물인 방법.
제44항에 있어서, 상기 속씨식물은 토마토인 방법.
제44항에 있어서, 상기 속씨식물은 해바라기인 방법.
제44항에 있어서, 상기 속씨식물은 담배인 방법.
제44항에 있어서, 상기 속씨식물은 포플러인 방법.