CN115678921A - 一种同时生产生长素和2-苯乙醇的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种同时生产生长素和2‑苯乙醇的方法及其应用，属于微生物发酵技术领域。为了提供一种同时生产2‑苯乙醇和IAA的方法。本发明提供了一种利用肠杆菌(Enterobacter sp.)得到发酵液，接种在水稻上，可以促进水稻的生长和抑制水稻纹枯病，同时肠杆菌经过发酵可以同时生产2‑苯乙醇和IAA。可用于微生物肥料及农药的开发及应用，有利于促进我国农业绿色可持续发展。不仅扩大我国粮食作物促生菌种质资源，也为开发高效的微生物肥料及农药提供基础。在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵工程技术领域，具体涉及一种同时生产生长素和2-苯乙醇的方法 及其应用。
背景技术
急需寻求一种既能够提高农作物产量，又不造成环境危害的解决方法。农用生物制剂因 其对植株的生防效果显著、对环境友好，逐渐受到人们的关注。可用于补充或替代化肥、农 药及其他投入品，以促进作物生长、防御作物病害。
小麦和水稻是我国的两大主要粮食作物，筛选小麦、水稻根际促生菌，以其替代部分化 肥和农药使用，对提高小麦、水稻产量、节约资源、保护农业生态环境具有重要意义。水稻 纹枯病是世界性流行病害，是水稻三大病害之一，对水稻生产造成严重威胁。化学药剂的使 用虽然能够有效防治该病害，但其易残留不易在自然条件下降解，造成农产品残毒增加,环境 污染加剧。近年来，利用微生物进行生物防治对环境安全,无污染且无抗性，维护了生态平衡， 越来越受到各国专家学者重视。目前生物防治已成为防治水稻纹枯病的新途径。目前用于水 稻纹枯病的生防细菌主要是芽孢杆菌和荧光假单胞菌，此外也筛选到了假紫色色杆菌、伯克 霍尔德菌、产溶酶杆菌等潜在的水稻纹枯病生防菌株。植物根际促生菌已有较多研究,但是能 够防治水稻纹枯病同时兼具促生作用的菌株很少，目前报道仅有荧光假单胞菌PfALR2菌株 可将水稻纹枯病病情降低42％，并对产量有所促进(增加29％)，但防病及促生效果仍不理 想。目前，市面上仍然缺乏对水稻纹枯病进行高效生物防治又能明显促进水稻生长的菌株。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种同时生产2-苯乙醇和IAA的方法。
本发明提供了一种同时生产2-苯乙醇和IAA的方法，所述方法的具体步骤如下：
将肠杆菌(Enterobacter sp.)转接到含有5mL的发酵培养基中，按培养基体积1％-5％ 的菌液接种量接种到发酵培养基内，在37℃、180rpm摇床振荡培养24～48h条件下发酵， 利用气相色谱GC或气相色谱-质谱联用仪GC-MS对产物2-PE进行定性定量检测，利用Salkowski显色法对IAA进行定性定量检测，获得2-苯乙醇和IAA。
进一步地限定，所述肠杆菌的保藏号为CGMCC NO.5087。
进一步地限定，所述肠杆菌是按照如下方法培养：
取-80℃保存的菌种，划线活化，在37℃培养箱静置培养12h，挑取单菌落接种于液体 培养基发酵培养基中37℃、180rpm摇床培养活化菌种，获得肠杆菌。
进一步地限定，所述发酵培养基的成分为：10g/L NaCl、5g/L酵母粉和10g/L蛋白胨。
本发明还提供了一种促进作物根生长和抑制水稻纹枯病菌的方法，所述方法是将5mL 的肠杆菌发酵液或肠杆菌培养液接种到水稻根部。
进一步地限定，所述肠杆菌发酵液的制备方法如下：
1)培养肠杆菌(Enterobacter sp.)：取-80℃保存的菌种，在发酵培养基平板上划线， 在37℃培养箱静置培养12h，挑取单菌落接种于液体培养基发酵培养基中，37℃、180rpm 摇床培养活化菌种，获得肠杆菌；
2)按培养基体积1％-5％的菌液接种量，将种子液接种到5-10mL发酵培养基，在37℃ 和180rpm的培养箱中过夜培养，收集肠杆菌细胞，转接至新的发酵培养基中培养，OD600为0.02-0.1；
3)然后在37℃和180rpm的培养箱中培养48h，去除菌体，将培养液上清用ddH2O稀释108-105倍获得发酵液。
进一步地限定，所述方法应用的对象为水稻或小麦。
本发明还提供了一种肠杆菌在同时生产2-苯乙醇和IAA中的应用。
本发明还提供了一种肠杆菌在制备抑制水稻纹枯病的生物制剂中的应用。
本发明还提供了一种肠杆菌在制备促进作物生长的生物制剂中的应用。
有益效果：本发明利用对环境无毒无害的微生物促进小麦及水稻生长，可使水稻根长增 加50％，同时该菌株可防治水稻纹枯病，抑菌效果达77％，具有较高防效。提供了一种绿色 环保高效的农用生物制剂，可用于微生物肥料及农药的开发及应用，有利于促进我国农业绿 色可持续发展。不仅扩大我国粮食作物促生菌种质资源，也为开发高效的微生物肥料及农药 提供基础。在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。
附图说明
图1为肠杆菌Enterobacter sp.CGMCC 5087产IAA的定性及定量图，其中，A是IAA检测显色图片，B是IAA检测含量结果。
图2为肠杆菌Enterobacter sp.CGMCC 5087促进水稻根生长结果图，其中，A是不同浓 度处理萌发水稻种子的图片，B是稀释108浓度处理水稻萌发种子的图片。C是稀释108浓 度处理水稻萌发种子的根长统计结果。
图3为肠杆菌Enterobacter sp.CGMCC 5087抑制水稻纹枯病菌生长结果图，其中，A是 肠杆菌与水稻纹枯病菌共培养时的菌落生长图片，B是肠杆菌与水稻纹枯病菌共培养时，水 稻纹枯菌的菌落直径统计结果。
具体实施例
1.2-苯乙醇产物检测：用GC定量的条件为：气相仪器采用HP-Innowax毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)，升温程序：柱温50℃，维持1min，50-120℃(15℃/min)，维持1min，120-240℃(20℃/min)，维持10min。N2作为载气，FID检测器，气化室温度250℃，检 测室温度280℃。用GC-MS检测条件为：(Agilent 6890N GC和5975inert MSD)，使用1μL 的脉冲压力注射器，Innowax-101025柱(30m×0.25mm，0.25μm膜厚)，电离离子源(EI)， 每个特征离子峰的保留时间为40msec。柱箱温度：50℃，维持1min，50-240℃(20℃/min)， 维持30min，进样量1μL。
2.生长素进行定性定量检测：利用Salkowski显色法对生长素进行定性定量检测。方法 为：
(1)配制Salkowski试剂：在通风橱中将1mL 0.5M的FeCl3加入50mL 35％的高氯酸中，混合均匀，待试剂冷却，保存在棕色瓶中。
(2)配制IAA标准品，在单独的试管中取100μL每种IAA标准品，并在每个试管中 加入2 200μL Salkowski试剂。
(3)另外，做一个空白，其中使用不含IAA的溶剂并加入等量的试剂。
(4)取100μL待测样品，加入200μL Salkowski试剂。
(5)通过温和涡旋将反应混合物充分混合，并在黑暗中孵育25min。
(6)孵育后，读取530nm波长处的吸光度，吸光度与IAA浓度图来绘制标准曲线， 计算IAA浓度。
发酵培养基成分有：10g/L NaCl、5g/L酵母粉和10g/L蛋白胨。
肠杆菌的保藏号为CGMCC NO.5087，记载在公开号为CN103131645B的专利申请中。
实施例1.一种肠杆菌发酵液的制备方法
(1)将肠杆菌接于5mL发酵培养基中，在37℃和180rpm的培养箱中过夜培养，收集肠杆菌细胞，用无菌水洗2次，转接至新的发酵培养基中培养，OD600为0.1；
(2)然后在37℃和180rpm的培养箱中培养48h，去除菌体，将培养液上清用ddH2O稀释105倍获得生物制剂。
实施例2.一种肠杆菌发酵液的制备方法
(1)将肠杆菌接于5mL发酵培养基中，在37℃和180rpm的培养箱中过夜培养，收 集肠杆菌细胞，用无菌水洗2次，转接至新的发酵培养基中培养，OD600为0.1；
(2)然后在37℃和180rpm的培养箱中培养48h，去除菌体，将培养液上清用ddH2O稀释108倍获得生物制剂。
实施例3.一种促进水稻增长和抑制水稻纹枯病菌的方法
将实施例2获得肠杆菌(Enterobacter sp.)取5mL接种到正常水稻根部，然后水稻纹枯 病菌分别接种到未接种肠杆菌的水稻和接种肠杆菌的水稻。
结果：接种肠杆菌的水稻发病率相对于未接种肠杆菌的水稻发病率低，且生物量也相对 较高，说明肠杆菌可以有效的预防水稻受水稻纹枯病的侵害，也促进水稻的生长。
实施例4.利用肠杆菌同时生产生长素和2-苯乙醇的方法：
1.培养肠杆菌：菌种活化：取-80℃保存的菌种，在发酵培养基平板上划线，在37℃培 养箱静置培养12h，挑取单菌落接种于液体培养基发酵培养基中37℃、180rpm摇床培养活 化菌种，获得一级种子。
本发明所述的肠杆菌能够适合于工程大肠杆菌的中等至大规模培养的任何液体培养 基，优选为发酵培养基，其配方为：10g/L NaCl、5g/L酵母粉、10g/L蛋白胨，其余为水。
菌体发酵：选取生长良好的活化菌株转接到含有5mL的发酵培养基，按培养基体积1％-5％的菌液接种量，将种子液接种到发酵培养基内，37℃、180rpm摇床振荡培养24～48h，利用气相色谱GC或气相色谱-质谱联用仪GC-MS对产物2-苯乙醇进行定性定量检测， 利用Salkowski显色法对生长素进行定性定量检测。
利用以下实验验证效果：
步骤一、肠杆菌Enterobacter sp.CGMCC 5087产IAA能力测定
(1)IAA定性检测
将肠杆菌Enterobacter sp.CGMCC 5087接于5mL发酵培养基中，37℃、180rpm的培养箱中振荡培养24h；取200μL菌液的上清样品，加入400μL Salkowski reagent试剂，黑 暗反应25min；以发酵培养基作为对照；观察颜色变化，颜色变红为产生IAA。如图1中的 A所示。
(2)IAA定量检测
将肠杆菌Enterobacter sp.CGMCC 5087接于5mL发酵培养基中，37℃、180rpm的培养箱中振荡培养24h；取200μL菌液的上清样品，加入400μL Salkowski reagent试剂，黑 暗反应25min；取150μL反应液于96孔透明板中，用酶标仪测量530nm处的吸光值；以 发酵培养基作为对照；对照标准曲线，计算IAA产量。如图1中的B所示。
分析结果：与对照相比，Enterobacter sp.CGMCC 5087的发酵液颜色明显变红，说明该 样品中含有IAA。
步骤二、肠杆菌Enterobacter sp.CGMCC 5087促进水稻根的生长
在直径9cm的无菌培养皿中放入无菌滤纸，加入5mL无菌水，将水稻种子(Oryzasativa cv.Nipponbare)放在培养皿中，在28℃培养箱萌发36h；将肠杆菌Enterobactersp.CGMCC 5087接于5mL发酵培养基中，37℃、180rpm的培养箱中振荡过夜培养；收集肠杆菌细胞， 用无菌水洗2次，转接与新的发酵培养基中，调节OD600＝0.1,37℃、180rpm的培养箱中振 荡培养48h；去除菌体，培养液上清用ddH2O稀释102、105、108倍，取5mL稀释后的上 清液放于含滤纸的培养皿中；取5颗萌发的水稻种子放于该培养皿中，28℃，黑暗培养60 h，测量根长。结果如图2中的A和B所示。取5mL稀释相同倍数的发酵培养基按相同 方法培养萌发的水稻种子作为对照组。
结果：用不同浓度的培养液上清处理萌发的水稻种子，对根伸长的影响作用不同，当 用102梯度时，根长比对照短，对根的生长有抑制作用(图2中的A)；当用105和108梯度时，根长比对照长，对根的生长有促进作用(图2中的A)，且108处理促生效果最好(图2 中的A和图2中的B)，与对照相比，可使水稻根长增加50％(图2中的C)。促生率＝[实验 组水稻根长(cm)/对照组水稻根长(cm)-1]×100％。
步骤三、肠杆菌Enterobacter sp.CGMCC 5087抑制水稻纹枯病菌的生长
准备双格培养皿，一侧为发酵培养基(含1g/L L-苯丙氨酸)，另一侧为PDA培养基；将肠杆菌Enterobacter sp.CGMCC 5087接于5mL发酵培养基中，37℃、180rpm的培养箱 中振荡过夜培养；收集肠杆菌细胞，用无菌水洗2次，调节OD600＝0.02,取50μL菌液涂布 于双格培养皿的发酵培养基一侧；取水稻纹枯菌的菌核放于双格培养基的PDA培养基一侧； 用无菌水作替代肠杆菌作为对照；28℃培养箱中培养48h。结果如图3中的A和B所示所 示。
结果：当肠杆菌与水稻纹枯菌的菌共培养时，纹枯菌的菌落与对照相比显著减小(图3 中的A)，说明肠杆菌可以抑制水稻纹枯菌的生长，抑制效果可达77％(图3中的B)。抑制 率＝[1-实验组菌落直径(cm)/对照组菌落直径(cm)]×100％。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的 人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围 应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种同时生产2-苯乙醇和IAA的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：
将肠杆菌(Enterobacter sp.)接种到含有5mL的发酵培养基中，按发酵培养基体积1％-5％的菌液接种量，接种到发酵培养基内，在37℃、180rpm摇床振荡培养24～48h条件下发酵，利用气相色谱GC或气相色谱-质谱联用仪GC-MS对产物2-PE进行定性定量检测，利用Salkowski显色法对IAA进行定性定量检测，获得2-苯乙醇和IAA。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肠杆菌的保藏号为CGMCC NO.5087。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肠杆菌是按照如下方法培养：
取-80℃保存的菌种，划线活化，在37℃培养箱静置培养12h，挑取单菌落接种于液体培养基发酵培养基中37℃、180rpm摇床培养活化菌种，获得肠杆菌。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的成分为：10g/L NaCl、5g/L酵母粉和10g/L蛋白胨。
5.一种促进作物根生长和抑制水稻纹枯病菌的方法，其特征在于，所述方法是将5mL的肠杆菌发酵液或肠杆菌培养液接种到水稻根部。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述肠杆菌发酵液的制备方法如下：
1)培养肠杆菌(Enterobacter sp.)：取-80℃保存的菌种，在发酵培养基平板上划线，在37℃培养箱静置培养12h，挑取单菌落接种于液体培养基发酵培养基中，37℃、180rpm摇床培养活化菌种，获得肠杆菌；
2)按培养基体积1％-5％的菌液接种量，将种子液接种到5-10mL发酵培养基，在37℃和180rpm的培养箱中过夜培养，收集肠杆菌细胞，转接至新的发酵培养基中培养，OD600为0.02-0.1；
3)然后在37℃和180rpm的培养箱中培养48h，去除菌体，将培养液上清用ddH2O稀释108-105倍获得发酵液。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法应用的对象为水稻或小麦。
8.肠杆菌在同时生产2-苯乙醇和IAA中的应用。
9.肠杆菌在制备抑制水稻纹枯病的生物制剂中的应用。
10.肠杆菌在制备促进作物生长的生物制剂中的应用。
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