CN104789507A - 一种用于降解苯醚甲环唑的细菌bmjhz-01及其筛选方法 - Google Patents

一种用于降解苯醚甲环唑的细菌bmjhz-01及其筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于降解苯醚甲环唑的细菌BMJHZ-01及其筛选方法,本发明发现细菌BMJHZ-01能以苯醚甲环唑作为碳源并进行增殖,因此,细菌BMJHZ-01能作为降解苯醚甲环唑的微生物并进行利用,通过本发明实验证明,在相应的培养条件下,细菌BMJHZ-01能使苯醚甲环唑浓度为60-180mg/L的基础盐液体培养基中的苯醚甲环唑在7天之内完全降解。在具体使用的过程中,可将大量扩培的细菌BMJHZ-01制成以其为活性成分的降解剂,并修复含有苯醚甲环唑农药残留的土壤。

Description

一种用于降解苯醚甲环唑的细菌BMJHZ-01及其筛选方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种用于降解苯醚甲环唑的细菌BMJHZ-01及其筛选方法,属于微生 物领域。
背景技术
[0002] 苯醚甲环唑,英文通用名为Difenoconazole,分子式为C19H 17C12N303,其分子量为 406. 26。苯醚甲环唑纯品为无色固体,熔点76°C,沸点220°C /4Pa,蒸气压120nPa(20°C )。 溶解性(20°C ):水3. 3毫克/升,易溶于有机溶剂。< 300°C稳定,在土壤中移动性小,缓 慢降解。
[0003] 研宄表明,三唑类杀菌剂是内吸性杀菌剂,对植物体无害,但对致病真菌具有极 高的生物毒性。其杀菌机理是三唑类化合物的结构中含氮杂环部分的氮原子与细胞色 素P-450的铁离子结合,表现出抗菌活性和植物生长调节活性。R.GadnerS以酵母和鼠肝 均浆为酶,麦角留醇生物合成过程中,三唑类化合物明显地与细胞色素P-450结合;接着 T. E.Wiggins用鼠肝微粒件和酵母细胞色素P-450研宄证实了三唑类化合物作为生长调节 剂阻碍植物中赤霉素的生物合成,在抑制植物生长的同时,有抗菌活性。
[0004] 另外,相关研宄表明,苯醚甲环唑对罗非鱼为高毒药物,24、48、72、96h半数致死浓 度分别为6. 29、5. 46、4. 70、4. 31mg/L。苯醚甲环挫对蜜蜂为低毒。苯醚甲环挫微乳剂对家蚕 进行急性毒性试验,96h LC50值为46. 5_154mg • I71,属于中毒级;在农业生产中,杀菌剂等 化学农药的施用一直是保证粮食作物增产稳产有效的手段之一。尤其是随着苯醚甲环唑的 大量使用,使得土壤中残存的苯醚甲环唑逐渐累积,进而造成严重的土壤污染;另外,苯醚 甲环唑农药生产过程中产生的废水废气也通过排放以及流失等方式积累到土壤中,进一步 的加剧了土壤的污染。但是,苯醚甲环唑在土壤中降解较慢,半衰期分别为:51. 3d-125. 8d, 43. 6d-69. 3d,47. 5-63. 6d。显然不能有效解决土壤中苯醚甲环唑逐渐累积的现状。
[0005] 目前,微生物为农田中农药残留(包括苯醚甲环唑)的主要降解者,逐渐成为农药 污染土壤生物修复的热点。因此,提供一种能够降解苯醚甲环唑的微生物,并将其应用到苯 醚甲环唑农药土壤的修复中是本领域技术人员亟待解决的一个技术问题。
发明内容
[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种用于降解苯醚甲环唑的细菌BMJHZ-01及 其筛选方法,本发明发现细菌BMJHZ-01能以苯醚甲环唑作为碳源并进行增殖,因此,其能 作为降解苯醚甲环唑的微生物并进行利用,通过实验证明,在相应的培养条件下,BMJHZ-01 能使苯醚甲环唑浓度为60-180mg/L的基础盐培养基中的苯醚甲环唑在7天之内完全降解。 在具体使用的过程中,可将大量扩培的BMJHZ-01制成以其为活性成分的降解剂,并修复含 有苯醚甲环唑农药残留的土壤。
[0007] 本发明解决上述技术问题的技术方案如下:一种用于降解苯醚甲环唑的细菌 BMJHZ-01,Pseudomonasnitroreducens为此细菌的英文名,中文名硝基还原假单胞菌, BMJHZ-01为本发明对该细菌命名的简称。细菌Pseudomonasnitroreducens已经被专利 200610046646. 9保藏,2005年10月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心,保藏号为CGMCCNo. 1488,菌株的具体生理生化特征见专利200610046646. 9。
[0008] 细菌Pseudomonasnitroreducens为革兰氏阴性,有鞭毛,无芽孢的杆菌,菌落较 大为白色、隆起,边缘规则,表面光滑,严格好氧,化能异养。明胶不能液化,硝酸盐可以还原 成亚硝酸盐,氧化酶阳性;接触酶阳性;不产硫化氢,不能淀粉水解;能够利用葡萄糖、葡萄 糖酸盐、2-酮类葡萄糖酸盐、乙醇、琥珀酸盐、柠檬酸盐等碳源,不能利用水杨酸、安息香酸 盐、龙胆酸盐和氨基苯甲酸盐。
[0009] 本发明还提供一种含有上述细菌BMJHZ-01的降解剂,由于细菌BMJHZ-01能以苯 醚甲环唑为碳源进行繁殖,因此,以细菌BMJHZ-01为活性成分并制成相应的降解剂,能修 复含有大量苯醚甲环唑的土壤。
[0010] 本发明还提供一种如上述的细菌BMJHZ-01在降解水体和/或土壤中的苯醚甲环 唑残留的应用。
[0011] 本发明还提供一种如上述的含有细菌BMJHZ-01的降解剂在降解水体和/或土壤 中的苯醚甲环唑残留的应用。
[0012] 本发明还提供一种用于降解苯醚甲环唑的细菌BMJHZ-01的筛选方法,包括:
[0013] 1)取苯醚甲环唑生产厂废水排水道中的泥样,将泥样置于第一基础盐液体培养基 中,泥样与第一基础盐液体培养基的质量比为1:20,摇床培养后得到第一混和菌液,摇床培 养的温度为30°C,转速为200转/分钟,时间为7天,在该培养条件下,细菌繁殖迅速,大量 的微生物呈现对数期生长,为后续的传代培养提供了保障;
[0014] 本步骤将泥样与第一基础盐液体培养基混合,由于在第一基础盐液体培养基中仅 包含了苯醚甲环唑作为微生物的碳源,所以在培养过程中,能够分解并利用苯醚甲环唑的 微生物则正常增殖,不能利用苯醚甲环唑的微生物则会死亡,进而初步筛选出了第一混和 菌液。
[0015] 2)将1)得到的第一混合菌液接种到第二基础盐液体培养基中,接种量为第一混 合菌液体积量的5 %,进行传代培养,培养的温度为30°C,转速为200转/分钟,时间为7天, 得到第二混合菌液;
[0016] 第一混合菌液在增殖过程中会消耗第一基础盐液体培养基中大量的养分(苯醚 甲环唑或各种无机盐),因此,得到第一混合菌液后,需要将其再次接种,并进行传代培养, 获得进一步筛选的第二混合菌液。
[0017] 由于第一混合菌液中的微生物生理活性旺盛,因此,需要对其接种量进行有效控 制,接种量太大会导致后续的营养不能保证其繁殖所需,接种量太小则会影响其筛选效果。 由于目前还未见该菌的报道,因此,本发明对其接种量的控制(5%)是通过大量的探索和 研宄获得的;
[0018] 3)取2)得到的第二混合菌液lmL用质量浓度0. 9%的无菌生理盐水稀释105倍, 然后取100uL涂布到基础盐固体培养基中,30°C暗培养2天,分别收集平板上长出的单菌 落,并利用LB培养基划线纯化,30°C暗培养2天,得到多个纯化后的单菌落,
[0019] 为了保证单菌落快速繁殖,获得活性较高的单菌落,因此,所述LB培养基,包括如 下原料:蛋白胨9-llg、酵母膏4-6g、氯化钠9-llg、琼脂19-21g和水1000g ;
[0020] 基于2)同样的理由,获得第二混合菌液后,为了获得纯的单菌落,需对其利用基 础盐固体培养基培养,培养温度稍高或稍低以及培养时间超过3天则会出现微生物死亡的 现象,在培养过程中,使用基础盐固体培养基暗培养,不同的微生物会长出不同的菌落,然 后分别挑选出多个单菌落,将其利用LB培养基划线纯化,得到多个纯化后的单菌落。
[0021] 4)取3)得到的多个纯化后的单菌落,每个单菌落接种到一个第三基础盐液体培 养基中摇床培养,摇床培养的温度为30°C,转速为200转/分钟,时间为7天,得到多个单菌 菌液;
[0022] 纯化后的单菌落接种到第三基础盐液体培养基中,保证其正常繁殖,并得到多个 单菌菌液,多个单菌菌液通过后续的培养以及测定其对含有苯醚甲环唑的第四基础盐液体 培养基的降解效果进而分离出所需的细菌。
[0023] 5)取4)得到的多个单菌菌液,每个单菌菌液用一个第四基础盐液体培养基摇床 培养,每个单菌菌液的接种量为其体积量的5%,摇床培养的温度为30°C,转速为200转/ 分钟,时间为7天,摇床培养后,分别测定第四基础盐液体培养基中苯醚甲环唑的残留浓 度,并筛选出使苯醚甲环唑浓度降低的单菌菌液,利用标准的菌种鉴定手段鉴定所得单菌 菌液,得到细菌Pseudomonas nitroreducens,本发明将其简称为细菌BMJHZ-01。
[0024] 将单菌菌液分别摇床培养的过程中,会消耗第四基础盐培养基中的苯醚甲环唑, 因此,分别测定第四基础盐液体培养基中苯醚甲环唑的残留浓度,并筛选出使得苯醚甲环 唑浓度降低的单菌菌液,进而获得目标细菌。
[0025] 在培养的过程中也会获得一些降解效果不理想的微生物,其可能是实验误差或微 生物本身耐性较强等原因导致,因此,排出筛选范围,而获得细菌BMJHZ-01能以使苯醚甲 环唑浓度为180mg/L的基础盐培养基中的苯醚甲环唑在7天之内完全降解,降解效果非常 显著。
[0026] 在上述技术方案的基础上,本发明还可以做如下改进。
[0027] 进一步,在1)中所述第一基础盐液体培养基、2)中所述第二基础盐液体培养基、 4)中所述第三基础盐液体培养基和5)中所述第四基础盐液体培养基,为相同的基础盐液 体培养基,均包括如下原料:
[0028] 氯化钠 0. 9-1. lg、磷酸二氢钠 1. 4-1. 6g、磷酸氢二钠 0. 4-0. 6g、硫酸镁 0. 1-0. 3g、 硫酸亚铁0. 01-0. 02g、氯化钙0. 01-0. 03g、硫酸铵0. 9-1. lg和水1000g,每升上述原料含有 苯酿甲环挫180mg。
[0029] 进一步,在3)中,所述基础盐固体培养基,包括如下原料:
[0030] 氯化钠 0. 9-1. lg、磷酸二氢钠 1. 4-1. 6g、磷酸氢二钠 0. 4-0. 6g、硫酸镁 0. 1-0. 3g、 硫酸亚铁〇• 01-0. 02g、氯化钙0• 01-0. 03g、硫酸铵0• 9-1. lg、琼脂19-21g和水1000g,每升 上述原料还含有苯醚甲环挫180mg。
[0031] 本发明的有益效果是:
[0032] 本发明提供一种用于降解苯醚甲环唑的细菌BMJHZ-01及其筛选方法,本发明采 用了富集分离的培养方式从供试泥样中筛选了出能以苯醚甲环唑为唯一碳源生长的菌群, 具有针对性强,筛选结果理想的效果,以期为周期短、见效快的含苯醚甲环唑的土壤修复提 供保障。
附图说明
[0033] 图1为本发明实施例1得到的菌种的系统发育树图。
[0034] 图2为实施例2中不同培养温度下,苯醚甲环唑降解率的结果图;
[0035] 图3为实施例2中不同pH值的基础盐液体培养基下,苯醚甲环唑降解率的结果 图。
具体实施方式
[0036] 以下本发明的原理和特征进行描述,所举实例只用于解释本发明,并非用于限定 本发明的范围。
[0037] 本实施例所得细菌 Pseudomonas nitroreducens 已经被专利 200610046646. 9 保 藏,2005年10月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为 CGMCCNo. 1488,菌株的具体生理生化特征见专利200610046646. 9。
[0038] 实施例1
[0039] 1)为了找到能够耐受苯醚甲环唑,并含有大量被筛选细菌的供试样本,进而获得 较高的筛选效果;在本实施例中,选用苯醚甲环唑生产厂的废水排水道作为取样地点,由于 该地点苯醚甲环唑的浓度很大,所以能够存活的微生物其可能会较大程度地利用苯醚甲环 唑,因此,取自苯醚甲环唑生产厂的废水排水道使得供试样本的目的性更强,有助于分离筛 选的顺利进行。
[0040] 取苯醚甲环唑生产厂污水区的泥样,将泥样置于第一基础盐液体培养基中,泥样 与第一基础盐液体培养基的质量比为1:20,摇床培养后得到第一混和菌液100ml,摇床培 养的温度为30°C,转速为200转/分钟,时间为7天,所述第一基础盐液体培养基,包括如下 原料:
[0041] 氯化钠1. 0g,磷酸二氢钠1. 5g,磷酸氢二钠0. 5g,硫酸镁0. 2g,硫酸亚铁0.0 lg,氯 化钙0. 02g,硫酸铵1. 0g,水1L,每升上述原料含有苯醚甲环唑180mg ;
[0042] 2)将1)得到的第一混合菌液接种到第二基础盐液体培养基中,接种量为第一混 合菌液体积量的5 %,进行传代培养,培养的温度为30°C,转速为200转/分钟,时间为7天, 得到第二混合菌液l〇〇ml,所述第二基础盐液体培养基,包括如下原料:
[0043] 氯化钠1. 0g,磷酸二氢钠1. 5g,磷酸氢二钠0. 5g,硫酸镁0. 2g,硫酸亚铁0. 01g,氯 化钙0. 02g,硫酸铵1. 0g,水1L,每升上述原料含有苯醚甲环唑180mg ;
[0044] 3)取2)得到的第二混合菌液lmL用质量浓度0. 9%的无菌生理盐水稀释105倍, 然后取100uL涂布到基础盐固体培养基中,30°C暗培养2天,分别收集平板上长出的单菌 落,并利用LB培养基划线纯化,30°C暗培养2天,得到多个纯化后的单菌落;
[0045] 所述基础盐固体培养基,包括如下原料:
[0046] 氯化钠1. 0g、磷酸二氢钠1. 5g、磷酸氢二钠0. 5g、硫酸镁0. 2g、硫酸亚铁0. 01g、氯 化钙0.02g、硫酸铵1.0g、琼脂20g和水1000g,每升上述原料含有苯醚甲环唑180mg;
[0047] 所述LB培养基,包括:蛋白胨(购自北京信德科兴科学器材有限责任公 司)10. 0g,酵母膏(购自北京信德科兴科学器材有限责任公司)5. 0g,氯化钠10. 0g,琼脂 20. 0g 和水 1L;
[0048] 4)取3)得到的多个纯化后的单菌落,每个单菌落接种到一个第三基础盐液体培 养基中摇床培养,摇床培养的温度为30°C,转速为200转/分钟,时间为7天,得到多个单菌 菌液,每个单菌菌液l〇〇ml ;
[0049] 所述第三基础盐液体培养基,包括如下原料:
[0050] 氯化钠1. 0g、磷酸二氢钠1. 5g、磷酸氢二钠0. 5g、硫酸镁0. 2g、硫酸亚铁0.Olg、氯 化钙0.02g、硫酸铵1.0g和水1000g,每升上述原料含有苯醚甲环唑180mg;
[0051] 5)取4)得到的多个单菌菌液,每个单菌菌液用一个第四基础盐液体培养基摇床 培养,每个单菌菌液的接种量为其体积量的5%,摇床培养的温度为30°C,转速为200转/ 分钟,时间为7天,摇床培养后,分别测定第四基础盐液体培养基中苯醚甲环唑的残留浓 度,并筛选出使苯醚甲环唑浓度降低的单菌菌液,得到一个单菌菌液,所述第四基础盐液体 培养基,包括如下原料:
[0052] 氯化钠1. 0g、磷酸二氢钠1. 5g、磷酸氢二钠0. 5g、硫酸镁0. 2g、硫酸亚铁0. 01g、氯 化钙0.02g、硫酸铵1.0g和水1000g,每升上述原料含有苯醚甲环唑180mg。
[0053] 对提取获得的单菌菌液(本发明将此样品命名为BMJHZ-01),委托北京三博远志 微生物技术有限责任公司进行了细菌16s rDNA全部基因序列正义链的测序,用MEGA 4构 建分子进化树,采用Neighbor. Joining法的Complete Deletion模式建树,Bootstrap进 行检验,并重复1000次,菌种的系统发育树如图1,序列如SEQ ID NO :1所示,鉴定结果如 表1,菌种鉴定的测序峰型图结果如表2,鉴定结果为细菌Pseudomonas nitroreducens,本 发明就将此细菌的样品名称BMJHZ-01作为此细菌的简称了。
[0054] 表1鉴定结果
Figure CN104789507AD00071
[0056] 表2菌种鉴定的测序峰型图结果
Figure CN104789507AD00072
[0058] 实施例2在不同培养温度和不同pH值的基础盐液体培养基的条件下苯醚甲环唑 的降解率
[0059] 为了获得优选的培养条件,本发明对实施例1制备的BMJHZ-01单菌菌液利用含苯 醚甲环唑的基础盐液体培养基摇床培养过程中的条件进行了优选。
[0060] 将实施例1获得的BMJHZ-01单菌菌液设定不同的培养温度,并对含有苯醚甲环唑 的基础盐液体培养基的pH值设定不同的梯度,测定相应条件下,苯醚甲环唑的降解率,进 而优选出其培养参数,具体步骤如下。
[0061] 取5个相同的基础盐液体培养基,接种实施例1制备的BMJHZ-01单菌菌液,摇床 培养,接种量为BMJHZ-01单菌菌液体积量的5%,即5ml,所用基础盐液体培养基包括如下 原料:氯化钠1.〇g、磷酸二氢钠1. 5g、磷酸氢二钠0. 5g、硫酸镁0.2g、硫酸亚铁0.0 lg、氯化 钙0. 02g、硫酸铵1. 0和水1000g,每升上述原料含有苯醚甲环唑180mg。摇床培养的温度分 别为20 °C、25 °C、30 °C、35 °C和40 °C,转速为200转/分钟,时间为7天,测定不同摇床培养 温度下苯醚甲环唑的降解率,结果如图2。
[0062] 通过图2看出,细菌BMJHZ-01在不同摇床培养温度下的生长情况不同,摇床培养 温度为25°C时,苯醚甲环唑的降解率达到56-60% ;摇床培养温度为35°C时,苯醚甲环唑的 降解率达到63. 67%,但摇床培养温度为30°C时,苯醚甲环唑的降解率达到97. 78%,因此, 本申请实施例1中所涉及的摇床培养温度优选为30°C。
[0063] 取5个相同的基础盐液体培养基,所用基础盐液体培养基包括如下原料:氯化钠 1. 〇g、磷酸二氢钠1. 5g、磷酸氢二钠0.5g、硫酸镁0.2g、硫酸亚铁0.01g、氯化妈0.02g、硫酸 铵1. 0和水1000g,每升上述原料含有苯醚甲环唑180mg,用0.lmol/L的NaOH和0.lmol/L 的HC1来调整基础盐液体培养基的pH值,使5个基础盐液体培养基的pH值分别为5、6、7、 8和9,向5个不同pH值的基础盐液体培养基中接种实施例1制备的BMJHZ-01单菌菌液, 摇床培养,接种量为实施例1制备的BMJHZ-01单菌菌液体积量的5%,即5ml,摇床培养的 温度为30°C,转速为200转/分钟,时间为7天,测定不同pH值下苯醚甲环唑的降解率,结 果如图3。
[0064] 通过图3看出,细菌BMJHZ-01在不同pH值的基础盐液体培养基中,苯醚甲环唑的 降解情况,细菌BMJHZ-01在基础盐液体培养基的pH值为7时,苯醚甲环唑的降解率最高, 达到94%。
[0065] 因此,在实施例1中,摇床培养的温度为30°C、转速为200转/分钟、时间为7天, 含有苯醚甲环唑的基础盐液体培养基的pH值为7 (实施例1中基础盐液体培养基配方的设 定以及苯醚甲环唑的浓度即可保证基础盐液体培养基的pH值为7)。
[0066] 实施例3细菌BMJHZ-01降解苯醚甲环唑的效果实验
[0067] 本实施例对实施例1获得的细菌BMJHZ-01的降解效果进行了验证,通过将含有苯 醚甲环唑的基础盐液体培养基设定不同的浓度,检测培养基中苯醚甲环唑的残留量,进而 证实细菌BMJHZ-01具有高效降解苯醚甲环唑的功效。
[0068] 具体方法如下:
[0069] 实验分成两组:试验组和对照组,每组有四个含有不同浓度苯醚甲环唑的基础盐 液体培养基,所用基础盐液体培养基,包括如下原料:氯化钠1. 〇g、磷酸二氢钠1. 5g、磷酸 氢二钠0. 5g、硫酸镁0. 2g、硫酸亚铁0. 01g、氯化钙0. 02g、硫酸铵1. 0和水1000g,每升上述 原料含有苯酿甲环挫60mg、160mg、300mg、600mg。
[0070] 从试验组四个含有不同浓度苯醚甲环唑的基础盐液体培养基中各取100mL,接种 入5mL实施例1制备的BMJHZ-01单菌菌液,摇床培养,对照组4个基础盐液体培养基中不 接入BMJHZ-01单菌菌液,摇床培养的温度为30°C,转速为200转/分钟,于第0、1、2、3、5、7 天分别取样,测定苯醚甲环唑残留量。具体数据请参考表3 :
[0071] 表3细菌BMJHZ-01对不同浓度苯醚甲环唑培养液的降解效果
Figure CN104789507AD00091
[0073] 通过表3可以看出,细菌BMJHZ-01在不同浓度苯醚甲环唑基础盐液体培养基中对 苯醚甲环唑具有降解效果;含有苯醚甲环唑的基础盐液体培养基包括 60至600mg/L总共4 个梯度。当初始苯醚甲环唑浓度为60或180mg/L时,BMJHZ-01菌在5天之内能完全从培 养基中除去苯醚甲环唑(100% )。
[0074] 米用专利 200610046646. 9 保藏的细菌 Pseudomonas nitroreducens,重复本发明 实施例2和实施例3的实验,经检测,同样能达到跟本发明一样的技术效果。
[0075] 综上所述,采用本发明实施例1得到的细菌BMJHZ-01单菌菌液或专利 200610046646. 9保藏的细菌Pseudomonas nitroreducens,都能用于降解苯酿甲环挫,通过 大量的扩培养,并以其为活性成分制成相应的降解制剂,用于含有苯醚甲环唑土壤的修复 中。
[0076] 以上所述仅为本发明的较佳实施例,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和 原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
[0077]
Figure CN104789507AD00101
[0078]
Figure CN104789507AD00111

Claims (7)

1. 一种用于降解苯醚甲环唑的细菌BMJHZ-Ol。
2. -种含有权利要求1所述的细菌BMJHZ-Ol的降解剂。
3. -种如权利要求1所述的细菌BMJHZ-Ol在降解水体和/或土壤中的苯醚甲环唑残 留的应用。
4. 一种如权利要求2所述的含有细菌BMJHZ-Ol的降解剂在降解水体和/或土壤中的 苯醚甲环唑残留的应用。
5. -种用于降解苯醚甲环唑的细菌BMJHZ-Ol的筛选方法,其特征在于,包括: 1) 取苯醚甲环唑生产厂废水排水道中的泥样,将泥样置于第一基础盐液体培养基中, 泥样与第一基础盐液体培养基的质量比为1:20,摇床培养后得到第一混和菌液,摇床培养 的温度为30°C,转速为200转/分钟,时间为7天; 2) 将1)得到的第一混合菌液接种到第二基础盐液体培养基中,接种量为第一混合菌 液体积量的5 %,进行传代培养,培养的温度为30 °C,转速为200转/分钟,时间为7天,得 到第二混合菌液; 3) 取2)得到的第二混合菌液ImL用质量浓度0. 9%的无菌生理盐水稀释IO5倍,然后 取IOOuL涂布到基础盐固体培养基中,30°C暗培养2天,分别收集平板上长出的单菌落,并 利用LB培养基划线纯化,30°C暗培养2天,得到多个纯化后的单菌落,所述LB培养基,包括 如下原料:蛋白胨9-llg、酵母膏4-6g、氯化钠9-llg、琼脂19-21g和水1000 g; 4) 取3)得到的多个纯化后的单菌落,每个单菌落接种到一个第三基础盐液体培养基 中摇床培养,摇床培养的温度为30°C,转速为200转/分钟,时间为7天,得到多个单菌菌 液; 5) 取4)得到的多个单菌菌液,每个单菌菌液用一个第四基础盐液体培养基摇床培养, 每个单菌菌液的接种量为其体积量的5%,摇床培养的温度为30°C,转速为200转/分钟, 时间为7天,摇床培养后,分别测定第四基础盐液体培养基中苯醚甲环唑的残留浓度,并筛 选出使苯醚甲环唑浓度降低的单菌菌液,利用标准的菌种鉴定手段鉴定所得单菌菌液,得 到细菌Pseudomonasnitroreducens。
6. 根据权利要求5所述的筛选方法,其特征在于,在1)中所述第一基础盐液体培养基、 2)中所述第二基础盐液体培养基、4)中所述第三基础盐液体培养基和5)中所述第四基础 盐液体培养基,为相同的基础盐液体培养基,均包括如下原料: 氯化钠0. 9-1.lg、磷酸二氢钠I. 4-1. 6g、磷酸氢二钠0. 4-0. 6g、硫酸镁0. 1-0. 3g、硫酸 亚铁0. 01-0. 02g、氯化钙0. 01-0. 03g、硫酸铵0. 9-1.Ig和水1000g,每升上述原料还含有苯 酿甲环挫180mg。
7. 根据权利要求5或6所述的筛选方法,其特征在于,在3)中,所述基础盐固体培养 基,包括如下原料: 氯化钠0. 9-1.lg、磷酸二氢钠I. 4-1. 6g、磷酸氢二钠0. 4-0. 6g、硫酸镁0. 1-0. 3g、硫酸 亚铁0• 01-0. 02g、氯化钙0• 01-0. 03g、硫酸铵0• 9-1.lg、琼脂19-21g和水1000g,每升上述 原料还含有苯醚甲环唑180mg。
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