BR112016029884B1 - Método para aumentar pelo menos um parâmetro de crescimento de uma planta leguminosa a partir de uma semente leguminosa - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA INTENSIFICAR PELO MENOS UM PARÂMETRO DE CRESCIMENTO DE UMA PLANTA LEGUMINOSA, PLANTA LEGUMINOSA, PARTE DE PLANTA LEGUMINOSA, OU MATERIAL REPRODUTIVO DE PLANTA LEGUMINOSA, MICRO-ORGANISMO ACTINOBACTERIANO ISOLADO E COMPOSIÇÃO INOCULANTE. A presente invenção refere-se a métodos para aumentar pelo menos um parâmetro de crescimento de uma planta leguminosa por coinoculação de uma planta leguminosa com pelo menos um micro-organismo rizobial juntamente com pelo menos um micro-organismo actinobacteriano. Em aspectos adicionais, a presente invenção também se refere às plantas leguminosas coinoculadas com, pelo menos, um micro-organismo rizobiano junto com pelo menos um micro-organismo actinobacteriano, bem como cepas actinobacterianas específicas e composições inoculantes que são úteis de acordo com a presente invenção.

Description

REIVINDICAÇÃO DE PRIORIDADE

[001] Este pedido reivindica prioridade para o Pedido de Patente Provisória Australiana 2014902374, depositado em 20 de junho de 2014, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência.

CAMPO

[002] A presente invenção refere-se a métodos para aumentar pelo menos um parâmetro de crescimento de uma planta leguminosa por co-inoculação de uma planta leguminosa com pelo menos um microrganismo rizobiano juntamente com pelo menos um microrganismo actinobacteriano. Em aspectos adicionais, a presente invenção também se refere às plantas leguminosas co-inoculadas com, pelo menos, um microrganismo rizobiano junto com pelo menos um microrganismo actinobacteriano, bem como cepas actinobacterianas específicas e composições inoculantes que são úteis de acordo com a presente invenção.

ANTECEDENTES

[003] Existem cerca de 44 a 66 milhões de toneladas de nitrogênio fixado a partir do nitrogênio atmosférico por simbiose de microrganismos rizobianos e leguminosas a cada ano, que é quase metade do nitrogênio usado na agricultura em todo o mundo.

[004] A interação de leguminosas e rizobianas é altamente específica e cada espécie rizobiana possui uma gama distinta de hospedeiros leguminosos para formação de nódulos e fixação de nitrogênio. Diferentes etapas do processo de nodulação requer a troca de vários sinais entre as leguminosas e rizobianos hospedeiros.

[005] As actinobactérias são um grande grupo que inclui diferentes gêneros de bactérias Gram-positivas com um alto conteúdo de G-C em seu DNA. As actinobactérias são amplamente distribuídas em ambientes terrestres e algumas, como os simbiontes fixadores de nitrogênio Frankia, são conhecidas por formarem associações com plantas através de relações simbióticas. Estudos recentes também descobriram que as actinobactérias endofíticas produziram compostos promotores do crescimento de plantas tais como ácido indol-3-acético (IAA) e sideróforos.

[006] Os efeitos de actinobactérias sobre rizóbio e simbiose com leguminosas têm sido observados, mas não muitos estudos têm investigado esta combinação complexa, embora vários estudos têm sugerido antagonismo ocorrendo entre actinobactérias e rizobianos.

[007] Por exemplo, Antoun et al. (Canadian Journal of Microbiology 24: 558-562, 1978) revelaram testes de antagonismo entre actinobactérias isoladas de diferentes solos e cepas eficazes de rizóbio. Estes dados demonstraram que algumas actinobactérias inibem o crescimento de rizóbio in vitro e in planta. Especificamente, trinta e um por cento das 481 actinobactérias investigadas inibiram duas cepas eficientes de rizóbio, Rhizobium meliloti A2 e S14.

[008] Num estudo adicional, Damirgi e Johnson (Agronomy Journal 58: 223-224, 1966) revelaram que o número de nódulos em sementes de soja inoculadas com cepas de Rhizobium japonicum 122 e 123 em solo autoclavado foi reduzido em até 35% e 53%, respectivamente, por tratamento com a actinobactéria E8. Também isolaram cerca de 60 actinobactérias de uma amostra de solo onde houve nodulação deficiente de trevos. No entanto, 20 de 24 actinobactérias isoladas de um campo experimental de soja não inibiram oito cepas de R. Japonicum sensíveis em testes in vitro.

[009] O antagonismo também foi examinado entre as actinobactérias e 12 cepas de rizóbio de cinco amostras de solo por Patel (Plant and Soil 41: 395-402, 1974). Foi relatado que cerca de 2370% das actinobactérias inibiram as cepas de rizobianos.

[0010] À luz do exposto, seria desejável a identificação de inoculantes actinobacterianos que sejam compatíveis com microrganismos rizobianos e que possam aumentar o crescimento e o desenvolvimento de leguminosas.

DESCRIÇÃO

[0011] As sequências de nucleotídeos e de aminoácidos são aqui referidas por um número de identificador de sequência (SEQ ID NO:). Um resumo dos identificadores de sequência é fornecido abaixo:

[0012] Uma listagem de sequências também é fornecida no final do relatório descritivo.

[0013] Num primeiro aspecto, a presente invenção proporciona um método para aumentar pelo menos um parâmetro de crescimento de uma planta leguminosa, o método compreendendo coinocular a planta leguminosa com:

[0014] pelo menos um microrganismo rizobiano; e

[0015] pelo menos um microrganismo actinobacteriano;

[0016] em que a planta leguminosa co-inoculada tem pelo menos um parâmetro de crescimento aumentado relativamente a uma planta leguminosa da mesma taxonomia que não foi co-inoculada.

[0017] Um "microrganismo actinobacteriano", como aqui referido, deve ser entendido como incluindo qualquer microrganismo do filo de Actinobacteria.

[0018] Em algumas modalidades, o microrganismo actinobac- teriano é um microrganismo actinobacteriano endofítico. Um organismo actinobacteriano "endofítico" deve ser entendido como incluindo qualquer organismo actinobacteriano que seja capaz de viver dentro de uma planta durante pelo menos uma parte do seu ciclo de vida sem causar doença aparente. Em algumas modalidades, um endófito também pode ser capaz de completar o seu ciclo de vida na ausência de um hospedeiro vegetal e, deste modo, ser apenas um endófito oportunista. Em algumas modalidades, um microrganismo actinobac- teriano endofítico refere-se a um microrganismo actinobacteriano que pode ser isolado a partir de tecido vegetal saudável esterilizado em superfície. Para referência, um exemplo de isolamento de endófitos actinobacterianos a partir de tecido de planta esterilizado de superfície está descrito em Coombs & Franco (Appl. Environ. Micro. 69(9): 56035608, 2003).

[0019] Em algumas modalidades, o microrganismo actinobacteriano é de um gênero selecionado de Streptomyces, Microbispora ou Micromonospora.

[0020] Em algumas modalidades, o microrganismo actinobacteriano é do gênero Streptomyces.

[0021] Em algumas modalidades, o microrganismo actinobacteriano é de uma espécie selecionada de:

[0022] Streptomyces drozdowiczii;

[0023] Streptomyces ciscaucasicus;

[0024] Streptomyces canus;

[0025] Streptomyces rishiriensis;

[0026] Streptomyces badius; ou

[0027] Streptomyces parvus

[0028] Em algumas modalidades, o microrganismo actinobacte- riano é de uma espécie selecionada de Streptomyces ciscaucasicus, Streptomyces canus ou Streptomyces rishiriensis.

[0029] Em algumas modalidades, o microrganismo actinobacte- riano compreende uma sequência nucleotídica do gene 16S rRNA que é pelo menos 90% idêntica a uma ou mais de: SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 e /ou SEQ ID NO: 10.

[0030] Em algumas modalidades, o microrganismo actinobacte- riano compreende uma sequência nucleotídica do gene 16S rRNA que é pelo menos 90% idêntica a uma ou mais das SEQ ID NO: 5 e /ou SEQ ID NO: 6.

[0031] Em algumas modalidades o microrganismo actinobacteriano compreende uma sequência nucleotídica do gene 16S rRNA que é pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 91,5%, pelo menos 92%, pelo menos 92,5%, pelo menos 93%, pelo menos 93,5% Pelo menos 94%, pelo menos 94,5%, pelo menos 95%, pelo menos 95,5%, pelo menos 96%, pelo menos 96,5%, pelo menos 97%, pelo menos 97,5%, pelo menos 98%, pelo menos 98,1% Pelo menos 98,2%, pelo menos 98,3%, pelo menos 98,4%, pelo menos 98,5%, pelo menos 98,6%, pelo menos 98,7%, pelo menos 98,8%, pelo menos 98,9%, pelo menos 99%, pelo menos 99,1%, pelo menos 99,2%, pelo menos 99,3%, pelo menos 99,4%, pelo menos 99,5%, pelo menos 99,6%, pelo menos 99,7% pelo menos 99,8% ou pelo menos 99,9% ou 100% identidade de sequência a uma janela de comparação de um ou mais de: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 e /ou SEQ ID NO: 10.

[0032] Quando comparadas as sequências de ácido nucleico para calcular uma percentagem de identidade, as sequências de ácido nucleico comparadas devem ser comparadas numa janela de comparação de, pelo menos, 100 resíduos de nucleotídeos, pelo menos 300 resíduos de nucleotídeos, pelo menos 600 resíduos de nucleotídeos, pelo menos 1000 resíduos de nucleotídeos, pelo menos 1100 resíduos de nucleotídeos, pelo menos 1200 resíduos de nucleotídeos, pelo menos 1300 resíduos de nucleotídeos ou pelo menos 1400 resíduos de nucleotídeos. Em algumas modalidades, a janela de comparação pode compreender a região em cada uma das sequências de nucleotídeos comparadas entre e incluindo os sítios de ligação do iniciador 27f (SEQ ID NO: 1) e o iniciador 1465r (SEQ ID NO: 2) nas sequências de nucleotídeos comparadas.

[0033] A janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, lacunas) de cerca de 20% ou menos em comparação com a sequência de referência (que não inclui adições ou deleções) para o alinhamento ideal das duas sequências. O alinhamento ideal de sequências para alinhar uma janela de comparação pode ser conduzido por implementações computadorizadas de algoritmos tais como a família de programas BLAST como, por exemplo, divulgada por Altschul et al. (Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402, 1997). Uma discussão detalhada da análise de sequências pode ser encontrada na Unidade 19. 3 de Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Chapter 15,1998).

[0034] Um número de microrganismos actinobacterianos particularmente úteis da presente invenção foi depositado de acordo com as disposições do Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microrganismos para os Fins do Procedimento de Patente.

[0035] O primeiro microrganismo depositado, aqui referido como Streptomyces sp. LuP30, foi depositado no National Measurement Institute (NMI), Austrália em 12 de dezembro de 2013 com o número de acessão V13/030101.

[0036] Em conformidade, algumas modalidades, o microrganismo actinobacteriano é Streptomyces sp. LuP30 como depositado no National Measurement Institute, Austrália com o número de acessão V13 /030101; ou um mutante ou derivado do referido microrganismo que retém a capacidade de aumentar pelo menos um parâmetro de crescimento de uma planta leguminosa quando o microrganismo actinobacteriano coinoculado numa planta leguminosa com um microrganismo rizobiano.

[0037] O segundo microrganismo depositado, aqui referido como Streptomyces sp. LuP47B, foi depositado no National Measurement Institute (NMI), Austrália, em 12 de dezembro de 2013, com o número de acessão V13 /030100.

[0038] Em conformidade, em algumas modalidades, o microrga nismo actinobacteriano é Streptomyces sp. LuP47B como depositado no National Measurement Institute, Austrália com o número de acessão V13/030100; ou um mutante ou derivado do referido microrganismo que retém a capacidade de aumentar pelo menos um parâmetro de crescimento de uma planta leguminosa quando o microrganismo actinobacteriano é coinoculado numa planta leguminosa com um microrganismo rizobiano.

[0039] Além disso, de acordo com a presente invenção, também foram surpreendentemente identificados dois organismos previamente conhecidos como sendo particularmente úteis de acordo com o método da presente invenção:

[0040] Em algumas modalidades o microrganismo actinobacteriano é Streptomyces sp. EN23 como descrito na publicação PCT WO/2005/003328 e depositado como AGAL Depósito N° NM03/35605; ou um mutante ou derivado do referido microrganismo que retém a capacidade de aumentar pelo menos um parâmetro de crescimento de uma planta leguminosa quando o microrganismo actinobacteriano é coinoculado numa planta leguminosa com um microrganismo rizobiano.

[0041] Em algumas modalidades o microrganismo actinobacteriano é Streptomyces sp. EN27 como descrito na publicação PCT WO/2005/003328 e depositado como AGAL Depósito N° NM03/35606; ou um mutante ou derivado do referido microrganismo que retém a capacidade de aumentar pelo menos um parâmetro de crescimento de uma planta leguminosa quando o microrganismo actinobacteriano é coinoculado numa planta leguminosa com um microrganismo rizobiano.

[0042] Deve-se entender que um "mutante ou derivado" dos sujeitos microrganismos actinobacterianos abrange, por exemplo, qualquer mutante espontâneo ou induzido, progênie de conjugação ou forma geneticamente modificada das cepas depositadas que retêm a capacidade de aumentar pelo menos um parâmetro de crescimento de uma Planta leguminosa quando o microrganismo actinobacteriano é coinoculado em uma planta leguminosa com um microrganismo rizobiano.

[0043] As técnicas de mutagenização que podem ser utilizadas para gerar derivados ou mutantes incluem, por exemplo, mutagênese química (por exemplo, Mutagênese EMS), mutagênese induzida por radiação ionizante (por exemplo, Mutagênese de raios X, mutagênese de raios Y e mutagênese UV), métodos de mutagênese de inserção genética (por exemplo, mutagênese de transposição) e semelhantes.

[0044] Conforme exposto acima, a presente invenção contempla um método para aumentar pelo menos um parâmetro de crescimento de uma planta leguminosa.

[0045] Um "parâmetro de crescimento" de uma planta leguminosa, como referido aqui, pode incluir qualquer característica mensurável da planta leguminosa.

[0046] Em algumas modalidades, o parâmetro de crescimento é um comprimento e/ou massa de uma parte aérea da planta leguminosa.

[0047] Em algumas modalidades, o parâmetro de crescimento é um comprimento e/ou massa de uma raiz da planta leguminosa.

[0048] Em algumas modalidades, o parâmetro de crescimento é um número e/ou massa de nódulos da planta leguminosa.

[0049] Em algumas modalidades, o parâmetro de crescimento é um número e/ou massa de vagens de sementes e/ou de sementes produzidas pela leguminosa.

[0050] Em algumas modalidades, o parâmetro de crescimento é uma concentração e/ou quantidade de um nutriente na planta leguminosa.

[0051] Em algumas modalidades, o nutriente é selecionado a partir de: Boro, Cálcio, Cobre, Magnésio, Manganês, Fósforo, Sódio, Enxofre, Nitrogênio e/ou Zinco.

[0052] A concentração e/ou a quantidade de nutriente podem ser medidas utilizando qualquer método conhecido na técnica para ser adequado para o nutriente relevante. Tais métodos podem incluir, por exemplo, os métodos descritos por: Kirsten (Organic Elemental Analysis - Ultramicro, Micro and Traces Methods. Academic Press, New York, 1984); Horwath (Instrumental Organic Analylsis. Academic Press, New York, 1977); Colombo and Giazzi (American Laboratory 38-45, 1982); Fraisse and Schmidt (J. Microchem. 22: 109-130, 1977); Hegedus (Microchim. Acta 441-446, 1977); e Baur and Dirscherl (Microchim. Acta 1: 299-244, 1980).

[0053] Em algumas modalidades, o nutriente é nitrogênio.

[0054] Em algumas modalidades, o parâmetro de crescimento é uma taxa de germinação de uma semente de leguminosa. Em algumas modalidades, a "taxa de germinação" pode referir-se à proporção de sementes de uma leguminosa que germina com êxito. Em algumas modalidades, a "taxa de germinação" pode referir-se a uma velocidade de germinação de uma semente de leguminosa, e/ou uma proporção de sementes de uma leguminosa que germina com sucesso por unidade de tempo, por exemplo, a proporção de sementes de uma planta leguminosa que germina com sucesso 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 dias.

[0055] A "taxa de germinação" de uma semente de leguminosa pode ser avaliada utilizando qualquer método adequado baseado em laboratório ou em campo, como seria facilmente verificado pelos especialistas na técnica.

[0056] Conforme exposto acima, a presente invenção contempla o "aumento" de um ou mais parâmetros de crescimento da planta leguminosa. "Melhora" de um parâmetro de crescimento deve ser entendido como incluindo qualquer melhoria num parâmetro de crescimento numa planta leguminosa co-inoculada relativamente a uma planta leguminosa da mesma taxonomia que não foi co-inoculada de acordo com o método da presente invenção.

[0057] Em algumas modalidades, o aumento de um parâmetro de crescimento irá incluir um aumento no valor medido do parâmetro de crescimento. Por exemplo, um aumento em qualquer um dos:

[0058] um comprimento e/ou massa de um broto;

[0059] um comprimento e/ou massa de uma raiz;

[0060] um número e/ou massa de nódulos;

[0061] um número e/ou massa de vagens e/ou sementes de sementes;

[0062] uma concentração e/ou uma quantidade de um nutriente; ou

[0063] uma taxa de germinação.

[0064] Deve ser considerado um aumento de tais parâmetros de crescimento.

[0065] Em algumas modalidades, o aumento de um parâmetro de crescimento pode compreender o aumento dentro de um período de tempo particular. Por exemplo, em algumas modalidades, a melhora do parâmetro de crescimento pode compreender a melhora durante um período de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 dias.

[0066] Em algumas modalidades, uma "melhora" num parâmetro de crescimento pode incluir, por exemplo, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes, 100 vezes no parâmetro de crescimento numa planta leguminosa co-inoculada relativamente a uma planta leguminosa da mesma taxonomia que tem foi co-inoculada.

[0067] Em algumas modalidades, no entanto, a "melhora" do parâmetro de crescimento pode incluir uma diminuição no valor medido do parâmetro de crescimento. Por exemplo, uma diminuição da concentração e/ou quantidade de um agente patogênico, um sintoma de doença e/ou uma toxina na planta e/ou uma diminuição no tempo de germinação de uma semente de leguminosa, pode ser considerada "melhoria" de tais parâmetros de crescimento.

[0068] Em algumas modalidades, uma "diminuição" num parâmetro de crescimento pode incluir, por exemplo, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% no parâmetro de crescimento numa planta leguminosa co-inoculada relativamente a uma planta leguminosa da mesma taxonomia que não foi co-inoculada.

[0069] Conforme exposto acima, a presente invenção contempla a co-inoculação da planta leguminosa com pelo menos um microrganismo rizobiano e pelo menos um microrganismo actinobacteriano.

[0070] Um "microrganismo rizobiano" como referido aqui pode incluir qualquer microrganismo que seja capaz de fixar nitrogênio depois de se ter estabelecido num nódulo de raiz de uma planta leguminosa.

[0071] Os microrganismos rizobianos são um grupo parafilético que geralmente caem em duas classes das proteobactérias, as proteobactérias alfa e beta. A maioria dos microrganismos rizobianos pertence à ordem Rhizobiales, mas vários rizobianos ocorrem em ordens bacterianas distintas das proteobactérias.

[0072] Exemplos de microrganismos rizobianos incluem:

[0073] Bradyrhizobium spp., como B. canariense, B. elkanii, B. japonicum, B. liaoningense e B. yuanmingense;

[0074] Ochrobactrum spp., como O. cytisi e O. lupini;

[0075] Azorhizobium spp., como A. caulinodans e A. doebereinerae;

[0076] Devosia spp., como D. neptuniae;

[0077] Methylobacterium spp., como M. nodulans;

[0078] Mesorhizobium spp., como M. albiziae, M. amorphae, M. chacoense, M. cicero, M. huakuii, M. loti, M. mediterraneum, M. plurifarium, M. septentrionale, M. temperatum, e M. tianshanense;

[0079] Phyllobacterium spp., como P. ifriqiyense, P. leguminum, e P. trifoli;

[0080] Rhizobium spp., como R. cellulosilyticum, R. daejeonense, R. etli, R. galegae, R. gallicum, R. giardinii, R. hainanense, R. huautlense, R. indigoferae, R. leguminosarum, R. loessense, R. lupini, R. lusitanum, R. mongolense, R. miluonense, R. sullae, R. tropici, R. undicola e R. yanglingense;

[0081] Sinorhizobium spp. como S. abri, S. adhaerens, S. americanum, S. arboris, S. fredii, S. indiaense, S. kostiense, S. kummerowiae, S. medicae, S. meliloti, S. mexicanus, S. morelense, S. saheli, S. terangae e S. xinjiangense;

[0082] Ensifer spp.;

[0083] Burkholderia spp., como B. caribensis, B. dolosa, B. mimosarum, B. phymatum and B. tuberum;

[0084] Cupriavidus spp., como C. taiwanensis; e

[0085] Herbaspirillum spp., como H. lusitanum.

[0086] Em algumas modalidades, o microrganismo rizobiano é um Rhizobium spp., um Sinorhizobium spp. ou Ensifer spp., ou um Bradyrhizobium spp.

[0087] Em algumas modalidades, o microrganismo rizobiano é da espécie Sinorhizobium meliloti or Sinorhizobium medicae. Em algumas modalidades, o microrganismo rizobiano é selecionado a partir da lista de: S. meliloti cepa RRI128 (referida doravante como 'RRI128'), Sinorhizobium cepa SRDI736 (referida doravante como 'SRDI736') or S. medicae cepa WSM1115G (referida doravante como 'WSM1115G').

[0088] Em algumas modalidades, o microrganismo rizobiano é da espécie Rhizobium leguminosarum. Em algumas modalidades, o microrganismo rizobiano é selecionado a partir da lista de: R. leguminosarum bv. viciae (referida doravante como 'WSM1455') ou R. leguminosarum bv. trifolii (referida doravante como 'WSM1325').

[0089] Em algumas modalidades, o microrganismo é rizobiana das espécies Bradyrhizobium sp. lupini ou Bradyrhizobium japonicum. Em algumas modalidades, o microrganismo rizobiano é selecionado a partir da lista de: Bradyrhizobium sp. lupini cepa WSM471 (referida doravante como 'WSM471') ou Bradyrhizobium japonicum cepa CB1809 (referida doravante como 'CB1809').

[0090] Está disponível uma gama de microrganismos rizobianos a partir de uma gama de coleções e de culturas comerciais, como seria facilmente verificado pelos especialistas na técnica. Em relação a uma gama de microrganismos rizobianos aqui descritos, estes organismos podem ser acessados a partir da coleção de culturas de rizóbio do Instituto South Australian Research & Development (Plant Research Centre, Hartley Grove, Urrbrae SA 5064, Australia; www.sardi.sa.gov.au).

[0091] Conforme exposto acima, a presente invenção contempla um método para aumentar pelo menos um parâmetro de crescimento de uma planta leguminosa.

[0092] Uma "planta leguminosa" como referida aqui deve ser entendida como qualquer membro da Fabaceae (ou Leguminosae) que pode formar nódulos quando infectado com um microrganismo rizobiano.

[0093] Exemplos de plantas leguminosas incluem:

[0094] Medicago spp., como Medicago sativa (ainda referida como luzerna ou alfalfa);

[0095] Pisum spp., como Pisum abyssinicum (syn. P. sativum subsp. abyssinicum), Pisum fulvum, Pisum sativum, Pisum sativum subsp. elatius (syn. P. elatius, P. syriacum) e Pisum sativum subsp. sativum;

[0096] Glycine spp., como Glycine max, Glycine albicans, Glycine aphyonota, Glycine arenaria, Glycine argyrea, Glycine canescens, Glycine clandestine, Glycine curvata, Glycine cyrtoloba, Glycine falcate, Glycine gracei, Glycine hirticaulis, Glycine hirticaulis subsp. leptosa, Glycine lactovirens, Glycine latifolia, Glycine latrobeana, Glycine microphylla, Glycine montis-douglas, Glycine peratosa, Glycine pescadrensis, Glycine pindanica, Glycine pullenii, Glycine rubiginosa, Glycine stenophita, Glycine syndetika, Glycine tabacina, Glycine tomentella e Glycine soja;

[0097] Cicer spp., como Cicer arietinum;

[0098] Vicia spp., como V. faba;

[0099] Vigna spp., como V. aconitifolia, V. angularis, V. mungo, V. radiate, V. subterranean, V. umbellatta ou V. unguiculata

[00100] Lathyrus spp., como Lathyrus sativus ou Lathyrus tuberosus;

[00101] Lens spp., como L. culinaris

[00102] Lablab spp., como L. purpureus;

[00103] Phaseolus spp., como P. acutifolius, P. coccineus, P. lunatus, P. vulgaris, P. polyanthus ou P. Dumosus;

[00104] Psophocarpus spp., como P. tetragonolobus;

[00105] Cajanus spp., como C. cajan;

[00106] Stizolobium spp.;

[00107] Cyamopsis spp., como C. tetragonoloba;

[00108] Canavalia spp., como C. ensiformis ou C. gladiata;

[00109] Macrotyloma spp., como M. uniflorum;

[00110] Lupinus spp., como L. mutabilis ou L. albus; ou

[00111] Erythrina spp., como E. herbacea.

[00112] Trifolium spp., como Trifolium subterraneum

[00113] Em algumas modalidades, a planta leguminosa é uma planta Medicago spp.. Em algumas modalidades, a leguminosa é uma planta Medicago sativa, luzerna ou alfafa.

[00114] Em algumas modalidades, a planta leguminosa é um Trifolium sp. Em algumas modalidades, a leguminosa é uma planta Trifolium subterraneum.

[00115] Em algumas modalidades, a planta leguminosa é Pisum sp. Em algumas modalidades, a planta leguminosa é uma planta Pisum sativum.

[00116] Em algumas modalidades, a planta leguminosa é uma Glicina sp. Em algumas modalidades, a planta leguminosa é uma planta Glycine max.

[00117] Conforme exposto acima, a presente invenção contempla a co-inoculação de uma planta leguminosa com um microrganismo rizobiano e um microrganismo actinobacteriano. Conforme referido aqui, "co-inoculação" deve ser entendida como incluindo qualquer método ou processo em que uma leguminosa (incluindo uma semente de leguminosa) é posta em contato com um microrganismo rizobiano e um microrganismo actinobacteriano. Em algumas modalidades, a coinoculação pode compreender o microrganismo rizobiano e/ou o microrganismo actinobacteriano a ser aplicado a uma semente de leguminosa. Exemplos de inoculação de sementes de leguminosas são descritos por Hartley et al. (Crop and Pasture Science 63: 858-865, 2012). Em algumas modalidades, a coinoculação pode compreender o microrganismo rizobiano e/ou o microrganismo actinobacteriano a ser aplicado ao solo no qual uma planta leguminosa está crescendo. Em algumas modalidades, a coinoculação pode compreender o microrganismo rizobiano e/ou o microrganismo actinobacteriano a ser aplicado ao tecido de raiz e/ou broto de uma planta leguminosa.

[00118] Em algumas modalidades, a "coinoculação" também pode compreender onde o microrganismo actinobacteriano ou microrganismo rizobiano é preexistente no ambiente (por exemplo, solo) no qual uma planta leguminosa é cultivada. Por exemplo, a co-inoculação pode compreender a aplicação de um microrganismo actinobacteriano a uma planta ou solo e em que um microrganismo rizobiano natural ou prexistente no solo co-inocula a planta.

[00119] Em algumas modalidades, a planta leguminosa é exposta a um patógeno e, quando exposta ao patógeno, a planta leguminosa coinoculada tem pelo menos um parâmetro de crescimento aumentado relativamente a uma planta leguminosa da mesma taxonomia que não foi coinoculada.

[00120] Em algumas modalidades, o patógeno é um patógeno de raiz. Deve entender-se que um "patógeno da raiz" aqui referido deve incluir qualquer patógeno vegetal leguminoso que infecte e/ou danifique as raízes da planta leguminosa. Exemplos de patógenos radiculares de plantas leguminosas incluem fungos, oomicetos, bactérias e/ou nemátodos patogênicos.

[00121] Em algumas modalidades, o patógeno de raiz é um patógeno de raiz de nematoide como um Pratylenchus spp., como P. neglectus ou P. thornei.

[00122] Em algumas modalidades, o patógeno de raiz é um patógeno de raiz de oomiceto como um Phytophthora spp., como P. sojae.

[00123] Em algumas modalidades, o patógeno é um patógeno fúngico. Plantas leguminosas podem estar sujeitas a ataque por uma variedade de patógenos fúngicos, incluindo patógenos de raiz fúngicos. Exemplos de tais patógenos incluem Rhizoctonia spp., Pythium spp. ou Aphanomyces spp.

[00124] Em algumas modalidades, o patógeno é uma Rhizoctonia sp. Em algumas modalidades, o patógeno é Rhizoctonia solani. Em algumas modalidades o patógeno é Rhizoctonia solani AG8.

[00125] Em um segundo aspecto, a presente invenção proporciona uma planta leguminosa, uma planta leguminosa ou um material reprodutivo de planta leguminosa, co-inoculada com pelo menos um microrganismo rizobiano e pelo menos um microrganismo actinobacteriano.

[00126] A planta leguminosa contemplada no segundo aspecto da invenção pode ser qualquer planta leguminosa como aqui anteriormente descrita com referência ao primeiro aspecto da invenção.

[00127] A referência aqui a uma planta, parte de planta ou material de reprodução de planta deve ser entendida como englobando tecidos, órgãos, organismos inteiros e suas partes. Em algumas modalidades, o termo planta, parte de planta ou material de reprodução vegetal também deve ser entendido como englobando agregações multicelulares de células cultivadas tais como colônias, calos de plantas, culturas em suspensão e semelhantes.

[00128] Em algumas modalidades, a parte vegetal leguminosa ou material reprodutor vegetal pode incluir uma semente vegetal leguminosa. Conforme referido aqui, uma "semente" de planta deve ser entendida como referindo-se a uma semente de planta madura ou imatura. Como tal, o termo "semente" inclui, por exemplo, sementes imaturas carregadas por uma planta materna ou semente liberada da planta materna. Em algumas modalidades, o termo "semente" pode abranger qualquer esporófito de planta de semente entre os estágios de desenvolvimento de fertilização e germinação.

[00129] Em algumas modalidades, o microrganismo actinobacte- riano contemplado de acordo com o segundo aspecto da invenção é um microrganismo actinobacteriano como aqui descrito anteriormente com referência ao primeiro aspecto da invenção.

[00130] Em algumas modalidades, o microrganismo rizobiano contemplado de acordo com o segundo aspecto da invenção é um microrganismo rizobiano como aqui anteriormente descrito com referência ao primeiro aspecto da invenção.

[00131] Em um terceiro aspecto, a presente invenção proporciona um microrganismo actinobacteriano isolado, como depositado no National Measurement Institute, Austrália com o número de acessão V13/030101; ou um mutante ou derivado do referido microrganismo que retém a capacidade de melhorar pelo menos um parâmetro de crescimento de uma planta leguminosa quando o microrganismo actinobacteriano é coinoculado numa planta leguminosa com um microrganismo rizobiano.

[00132] Em um quarto aspecto, a presente invenção proporciona um microrganismo actinobacteriano isolado, como depositado no National Measurement Institute, Austrália, sob o número de acessão V13/030100; ou um mutante ou derivado do referido microrganismo que retém a capacidade de aumentar pelo menos um parâmetro de crescimento de uma planta leguminosa quando o microrganismo actinobacteriano é coinoculado numa planta leguminosa com um microrganismo rizobiano.

[00133] Em algumas modalidades, a presente invenção proporciona qualquer um dos microrganismos actinobacterianos isolados anteriormente descritos quando utilizados de acordo com o método do primeiro aspecto da invenção.

[00134] Em um quinto aspecto, a presente invenção também proporciona uma composição inoculante compreendendo um microrganismo actinobacteriano.

[00135] Em algumas modalidades, o microrganismo actinobacte- riano compreende um microrganismo actinobacteriano como aqui anteriormente descrito em relação ao primeiro aspecto da invenção.

[00136] Em algumas modalidades, a composição inoculante compreende ainda um microrganismo rizobiano. Em algumas modalidades, o microrganismo rizobiano compreende um microrganismo rizobiano como aqui descrito anteriormente em relação ao primeiro aspecto da invenção.

[00137] Em algumas modalidades, a composição de inoculante compreende um carreador ou aditivo. O carreador ou os aditivos utilizados dependerão da natureza da composição inoculante. Por exemplo, a composição inoculante pode ser na forma de uma composição líquida, uma composição sólida (como um pó, grânulo ou composição granular) um revestimento de sementes ou similares.

[00138] As composições de inoculante da presente invenção podem ser adaptadas para serem aplicadas a uma planta leguminosa de qualquer modo adequado. Por exemplo, a composição inoculante pode ser adaptada para ser aplicada como um revestimento de semente, aplicada como uma composição sólida ou líquida à folhagem ou raízes de uma planta, ou aplicada como uma composição sólida ou líquida ao solo antes, durante ou após a semeadura de uma leguminosa.

[00139] Uma variedade de suportes ou aditivos úteis seria facilmente evidente para os especialistas na técnica e pode incluir, por exemplo: uma ou mais gomas (incluindo goma de xantano), ou carreadores a base de argila ou turfa, um ou mais nutrientes, incluindo fontes de carbono ou nitrogênio, um ou mais agentes antifúngicos ou antibacterianos, um ou mais agentes de revestimento de sementes, um ou mais agentes molhantes e semelhantes.

[00140] Em algumas modalidades, a presente invenção proporciona a composição de inoculante aqui anteriormente descrita, quando usada de acordo com o método do primeiro aspecto da invenção.

[00141] A presente invenção é ainda descrita com referência aos seguintes exemplos não limitantes:

DESCRIÇÃO SUMÁRIA DAS FIGURAS E TABELAS

[00142] A FIGURA 1 mostra a endoflora actinobacteriana cultivável isolada de raízes e nódulos de diferentes legumes - incluindo ervilha, alfafa, trevo e luzerna-escura.

[00143] A FIGURA 2 mostra os efeitos benéficos de actinobactéria endofíticas na germinação de sementes de luzerna em placas de ágar após 36 horas de incubação. A placa da esquerda mostra sementes esterilizadas na superfície com 0,85% de solução salina; a planta da direita mostra as sementes esterilizadas na superfície revestida com uma suspensão de esporos de LuP83 em 0,85% de solução salina.

[00144] A FIGURA 3 mostra a produção de ácido indol acético por actinobactérias endofíticas selecionadas.

[00145] A FIGURA 4 mostra a estimulação do crescimento de Rhizobium leguminosarum bv. trifolii cepa WSM 1325 e Bradyrhizobium lupini strain WSM 471 por duas actinobactérias LuP30 e LuP47B após 5 dias de crescimento do rizóbio em meio YMA em diferentes concentrações de rizóbio. Painel A - De cima para baixo e da esquerda para a direita: WSM 1325 em 2 semanas de idade com 103 CFU por placa; plugs LuP30 na WSM 1325 com colônias maiores; WSM 471 em 7 dias de idade com 105 CFU por placa (A) plugs de controle ISP2, (B) tampões LuP47B e (C) tampões LuP30; WSM 1325 aos 7 dias de idade, com 10 5 CFU por placa. Painel B - Da direita para a esquerda, imagens da melhora do crescimento de dois rizóbios quando mais perto do tampão de LuP30 ou LuP47B mostrado sob microscopia.

[00146] A FIGURA 5 mostra crescimento da planta melhorado, tamanhos de nódulos e fixação de nitrogênio em plantas de luzerna co- inoculadas com actinobactérias endofíticas selecionadas e S. meliloti RRI128. (Rhi. = Rhizobium RRI128). (A) e (B), plantas e nódulos na sétima semana após a adição do rizóbio. (C) e (D), as plantas e os nódulos em 45 dias após a adição do rizóbio.

[00147] A FIGURA 6 mostra o nitrogênio total fixado nos brotos de luzerna inoculados com bactérias endofíticas actinobactérias EN23, LuP30 e LuP47B juntamente com rizóbio RRI128.

[00148] A FIGURA 7 mostra o efeito de actinobactérias endofíticas na simbiose entre rizóbio e luzerna em condições limitadas de nutrientes. Duas sementes de luzerna de superfície esterilizada foram semeadas em 65 g de areia lavada autoclavada em um tubo de 50 ml contendo 10 ml de McKnight + iniciador N (300 mg de 20 L) foi adicionado no dia 0 e água MQ conforme necessário mais tarde. Uma das mudas foi mantida em cada tubo com 12h de luz e 12h de escuro e cinco repetições para cada tratamento. Um ml (cerca de 108 cfu/ml) do S.meliloti RRI 128 foi adicionado em cada muda para tratamento após 6 dias, e as plantas foram cultivadas até 7 semanas. As plantas restantes foram inoculadas com RRI 128 somente enquanto as plantas da direita foram co-aplicadas com LuP5B e RRI 128

[00149] A FIGURA 8 mostra a resposta de plantas de luzerna co- inoculadas com LuP30 ou LuP47B em diferentes concentrações de S. meliloti RRI 128. O painel A é uma representação gráfica mostrando broto, raiz e pesos secos da planta total depois de três semanas a três concentrações de rizóbio: (A) 5x102, (B) 5x104, (C) 5x106 CFU.ml-1. As barras de erro: Média ± SE Painel B é uma fotografia de plantas luzerna representativas em tubos de três semanas após a inoculação com S. meliloti RRI 128 a 5 x 102 CFU.ml-1. Esquerda - S.meliloti RRI 128 isolado; direita - S. meliloti RRI 128 mais LuP30.

[00150] A FIGURA 9 é uma representação gráfica que mostra resposta de peso seco de broto de luzerna pelo impacto da LuP30 e LuP47B depois de 10, 21 e 35 dias de inoculação com S. meliloti RRI 128. Os asteriscos indicam diferenças significativas em P <0,05 (*) ou P <0,01 (**).

[00151] A FIGURA 10 é uma representação que mostra a acumulação gráfica de N (14 N e 15N) em plantas de luzerna inoculadas com rizobianos e actinobactérias.

[00152] A FIGURA 11 é uma representação gráfica que mostra os efeitos de LuP30 e LuP47B sobre o crescimento e a nodulação do trevo quando coinoculado com Rhizobium WSM 1325. Os asteriscos indicam diferenças significativas em p < 0,05 (*) ou p < 0,01 (**).

[00153] A TABELA 1 mostra a atividade de produção de ácido indol acético e solubilização de fosfato de actinobactérias endofíticas selecionadas. (+) produção positiva; (-) Nenhuma produção.

[00154] A Tabela 2 mostra resultados do ensaio de interação in vitro entre actinobactérias endofíticas selecionadas e três rizóbios diferentes em várias concentrações. (++) efeitos positivos sobre o crescimento do rizóbio; (+) efeitos ligeiramente positivos (0) efeito neutro sobre o crescimento do rizóbio; (-) efeitos ligeiramente negativos sobre o crescimento do rizóbio; (-) efeitos negativos sobre o crescimento do rizóbio.

[00155] TABE LA 3 mostra os efeitos de seis ac tinobactérias endofíticas de raízes de trigo saudáveis na simbiose de RRI128 e plantas luzerna após sete semanas de plantio. As sementes foram revestidas com seis diferentes actinobactérias em 0,3% de goma de xantano um dia antes da plantação. A inoculação com a cepa RRI128 ocorreu cinco dias após o plantio. nN = 5 potes, 4 plantas por pote).

Não tratados*: sementes foram revestidas com 0,3% de goma xantana sem rizóbio. As diferentes letras na mesma coluna indicam uma diferença significativa (p <0,05). Os dados foram analisados usando ANOVA de uma via e teste de Duncan.

[00156] TABELA 4 mostra os efeitos de actinobactérias endofíticas na simbiose rizóbio de cepa RRI128 e plantas luzerna após 45 dias do plantio. As sementes foram revestidas com seis diferentes actinobactérias em 0,3% de goma de xantano um dia antes da plantação. A inoculação com a cepa RRI128 ocorreu cinco dias após o plantio. (n = 10 potes, 4 plantas por pote).

Não tratados*: sementes foram revestidas com 0,3% de goma xantana sem rizóbio. As diferentes letras na mesma coluna indicam uma diferença significativa (p <0,05). Os dados foram analisados usando one way ANOVA e teste de Duncan.

[00157] A TABELA 5 mostra os efeitos de actinobactérias endofíticas, EN23, LuP30 e LuP47B em simbiose do rizóbio cepa RRI128 e luzerna em termos de teor de nitrogênio e elementos traços em brotos de luzerna em 45 dias de idade.

[00158] As diferentes letras na mesma co una indicam uma diferença significativa (p <0,05). Os dados foram analisados usando one way ANOVA e teste de Duncan.

[00159] A TABELA 6 mostra a efeitos de actinobactérias endofíticas em simbiose de RRI128 e plantas luzerna após sete semanas de plantio em condições limitadas de nutrientes. As sementes foram revestidas com seis diferentes actinobactérias em 0,3% de goma de xantano um dia antes da plantação. A inoculação da cepa RRI128 ocorreu cinco dias após o plantio (n = 5 tubos, 1 planta por tubo).

* Não tratados: sementes foram revestidas com 0,3% de goma xantana sem rizóbio, As diferentes letras na mesma coluna indicam uma diferença significativa (p < 0,05), Os dados foram analisados utilizando testes ANOVA e Duncan

[00160] A TABELA 7 mostra o efeito da coinoculação actinobacteriana e rizóbio em Rhizoctonia raiz podre radicular de plantas de luzerna e as características de crescimento do rebento e pesos secos de raiz.

Controle 1, apenas rizóbio RRI128 e nenhum R, solani ; Controle 2, sem rizóbio RRI128 e R, solani aplicado; Controle 3, rizóbio RRI128 e R,solani aplicado; R +, rizóbio RRI128 mais actinobactérias endofíticas

[00161] A TABELA 8 mostra identidades de sequências de genes 16S rRNA de actinobactérias endofíticas selecionadas usando BLASTN no GenBank.

[00162] A TABELA 9 mostra respostas das plantas, devido ao tratamento com Streptomyces spp. EN23, LuP30 e LuP47B sozinho ou co-inoculação com S. meliloti IRR 128 em 7 semanas após o plantio (n = 4). Controlea: plantas não inoculadas; Controleb: plantas inoculadas apenas com S.meliloti RRI 128; (A) = 3 ppm N, (B) = 25 ppm N, (C) = 50 ppm N; Os asteriscos indicam diferenças significativas em P <0,05 (*) ou P <0,01 (**).

[00163] A TABELA 10 mostra o efeito de actinobactéria e N de solo no número de nódulos por planta de luzerna em 4 e 7 semanas depois de inoculado (n = 4). Letras diferentes na mesma coluna indicam meios são significativamente diferentes (P < 0,05).

[00164] TABELA 11 mostra os efeitos da LuP30 e LuP47B sobre o número de nódulos por planta Luzerna após 3 semanas de inoculação com diferentes concentrações de S.meliloti RRI 128. (n = 4) Média ± SE.

[00165] A TABELA 12 mostra peso seco de rebento de luzerna em resposta a co-inoculação com LuP30 ou LuP47B e S. meliloti RRI 128 depois de 10, 21 e 35 dias em 25 ppm N (15NH4 15NO3). Os asteriscos indicam diferenças significativas em p < 0,05.

[00166] A TABELA 13 mostra a acumulação de N (14N e 15N) no rebento e raiz de plantas luzerna inoculadas com rizobianos e actinobactérias (n = 4). Letras diferentes na mesma coluna indicam meios são significativamente diferentes (P < 0,05).

[00167] A TABELA 14 mostra a resposta de crescimento e nodulação de trevo para LuP30 LuP47B e após 4 e 7 semanas de co-inoculação com Rhizobium WSM 1325, (n = 4). Letras diferentes na mesma coluna indicam meios são significativamente diferentes (P <0,05).

[00168] TABELA 15 mostra os efeitos de duas actinobactérias LuP30 e LuP47B sobre o crescimento de duas cepas de rizóbio em placas de ágar em três concentrações após 7 dias. (++) Efeitos positivos sobre o crescimento rizobiano visível como uma zona de crescimento aumentado em torno do tampão actinobacteriano; (+) efeitos ligeiramente positivos, uma zona menor de crescimento melhorado em torno do tampão actinobacteriano; (0) efeito neutro.

[00169] TABELA 16 mostra o crescimento e a nodulação da soja ( Glycine max cv. Djackal) em resposta a co-inoculação com cada uma das quatro cepas de actinobactéria e Bradyrhizobium cepa CB 1809, 4 semanas após a inoculação.

[00170] A TABELA 17 mostra o efeito de actinobactérias sobre o conteúdo elementar de rebentos de soja (quantidade por planta).

[00171] TABELA 18 mostra o efeito de actinobactérias endofíticas (Streptomyces spp. LuP8, LuP3, LuP44 e LuP47B em combinação com Bradyrhizobium cepa CB1809) e 25 mg NH4NO3 por kg de solo no crescimento da soja, a nodulação e sementes após 7 semanas de inoculação com o rizóbio (n = 4). Letras diferentes na mesma coluna indicam meios são significativamente diferentes (P <0,05). Rhi = Bradyrhizobium sp. CB1809.

[00172] A TABELA 19 mostra o número de nódulos, peso de nódulos, número de vagens e da biomassa total da planta em plantas de ervilha cultivadas em ensaios de campo em três locais (Riverton SA, Hart SA e Pimpinio Vic).

EXEMPLO 1 - MATERIAIS E MÉTODOS Isolamento e identificação de actinobactérias endofíticas

[00173] Quatro legumes diferentes, incluindo luzerna, ervilha, trevo e luzerna-escura foram coletados em locais diferentes e escolhidos aleatoriamente em vários estágios de crescimento em torno do Sul da Austrália. Diferentes meios utilizados para o isolamento de actinobactérias endofíticas foram ácido húmico vitamina B ágar (HV; Masayuki and Hideo, Journal of Fermentation Technology 65(5): 501509, 1987), ágar extrato de levedura-hidrolisado de caseína (YECD), ágar de soja tríptica (TSA) (Oxoid Ltd., Reino Unido), extrato de agar de levedura e água corrente (TWYE), todos em pH 7,2 ± 0,2. Benomyl (DuPont Qualicon, Wilmington, Del. USA) foram adicionados a cada meio de ágar a uma concentração final de 50 μg.ml-1 para controlar o crescimento de fungos.

[00174] As plantas foram lavadas em água corrente para remover a poeira e solo ligado às raízes e nódulos. As raízes e nódulos foram separadas das plantas e secas ao ar durante a noite em temperatura ambiente. As raízes secas e nódulos foram esterilizadas na superfície seguindo o método de Coombs e Franco (Applied and Environmental Microbiology, Vol. 69: 5603-5608, 2003). O processo de esterilização de superfície iniciado por lavagem com etanol absoluto durante 1 minuto, seguido de 6 minutos em 4% de NaOCl, 30 segundos em etanol absoluto e uma lavagem final com água R.O. autoclavada.

[00175] Nódulos esterilizados na superfície foram cortados a partir das raízes e esmagados em 0,9% de solução salina até formar uma mistura homogênea. A suspensão de nódulo foi espalhada sobre a superfície de pelo menos três meios de isolamento diferentes. As raízes esterilizadas foram secas ao ar antes de serem cortadas em fragmentos de cerca de 1 cm por uma lâmina ou uma tesoura, e colocadas sobre as diferentes placas de meio. As placas foram incubadas a 27oC e 37oC.

[00176] As placas foram verificadas regularmente, pelo menos uma vez por semana desde a primeira semana até que novas colônias individuais não pudessem ser encontradas. Quando as colônias apareceram, foram transferidas para a metade da potência de ágar de dextrose de batata (HPDA) para a purificação. As colônias individuais foram transferidas para três meios diferentes, como HPDA, ágar de aveia (ISP3) e ágar manitol soja (MS) para distinguir as mesmas com base em suas diferentes morfologias, cor e pigmentos produzidos (as receitas de todos por Atlas, Handbook of Microbiological Media, 1993).

Sementes de Actinobactéria, Sinorhizobium meliloti e Luzerna

[00177] Sementes de Luzerna chamados 'SARDI Ten' e Sinorhizobium meliloti RRI128 (referidas como RRI128), que é um inoculante comercial para luzerna, foram fornecidas pelo South Australian Research and Development Institute (SARDI). Sementes escolhidas para plantação foram semelhantes em tamanho e peso. Cinco actinobactéria endofíticas (EN2, EN16, EN23, EN27, EN46), que foram isoladas a partir da raiz do trigo saudável e demonstraram se beneficiar do crescimento de plantas de alguns cereais (ver Tratado de Cooperação de Patentes publicação WO2005/003328, aqui incorporada por referência), juntamente com 148 actinobactérias endofíticas de diferentes legumes, foram testados ambos in vitro e in planta.

Efeitos de actinobactérias endofíticas na germinação de Luzerna - em ágar

[00178] Sementes de luzerna foram colocadas em placas de Petri (geralmente de 2-3 vezes a quantidade necessária) e esterilizadas na superfície pelo método seguinte: 30 segundos em 70% (v/v) de etanol, 2-3 minutos em 3% (v/v) solução de hipoclorito, enxaguadas três vezes em água R.O. autoclavada, permanecendo na terceira lavagem durante 10 minutos e depois deixado sob o fluxo laminar para secar. Cinco sementes esterilizadas foram colocadas em placa ágar 1% solução de McKnight com uma gota de uma suspensão actinobactéria isolada (200 - 2000 células) aplicada a cada semente, enquanto as sementes de controle receberam uma gota de solução salina a 0,9%. As placas foram deixadas sob um ciclo de luz de 14 horas por dia em temperatura ambiente (20-30oC) durante 2 semanas. O número de sementes germinadas e o comprimento de raízes foram registrados.

Efeitos de actinobactérias endofíticas na germinação de Luzerna - em arenoso

[00179] Sementes de luzerna também foram esterilizadas, como descrito acima e o arenoso foi autoclavado a 121 oC durante 15 minutos. Arenoso com umidade a doze por cento foi preparado pela adição de solução de McKnight antes de adicionar 300 g de arenoso, com 20 sementes esterilizadas a uma pequena cesta, 10 cm de largura e 20 cm de comprimento. As sementes foram semeadas com suspensão actinobacteriana aplicada no topo antes de cobrir ligeiramente com a arenosa. Os cestos foram mantidos sob um ciclo de 14 horas luz/escuro 10 horas em temperatura ambiente (20-30 o C) durante 2 semanas. O número de sementes germinadas foi registrado, e quando germinadas, o comprimento das raízes das plantas foi medido. Um total de 148 actinobactéria esporuladas em poço foi testado.

Produção de IAA

[00180] A capacidade de actinobactérias endofíticas para produzir IAA foi avaliada seguindo o método de Khanma et al. (World Journal of Microbiology and Biotechnology 25: 649-655, 2009). Um tampão de 6 mm de diâmetro actinobactéria que foi cultivado em ISP2 durante 5-7 dias foi transferido em 5 ml de extrato de levedura de malte (YME) contendo 0,2% de L-triptofano. O caldo foi agitado a 125 rpm durante 7 dias a 27 o C antes da centrifugação de 1 ml de caldo a 11.000 rpm durante 15 min. A mistura de 0,5 ml de sobrenadante e 1 ml de reagente Salkowski (12 g de FeCl 3por litro de 7,9 M H 2SO 4) foi bem misturada e mantida no escuro durante 30 minutos. A atividade de produção de IAA foi medida usando a densidade óptica (DO) a 530 nm. Caldo YME sem L-triptofano foi usado como linha de base e IAA puro (Sigma) com diferentes concentrações foi usado para gerar a curva padrão.

Atividade de solubilização de fosfato

[00181] A capacidade de solubilização de fosfato de isolados selecionados foi detectada seguindo o método descrito por Beneduzi et al. (Applied Soil Ecology 39: 311-320, 2008). Os isolados actinobactéria foram inoculados em meio de levedura glicose (GY), que continha 10 g de glicose, 2 g de extrato de levedura e 1,5% de ágar em 1 L de água destilada. Duas soluções foram adicionadas ao meio, o primeiro foi 5 g de K2HPO4 em 50 ml de água destilada e a segunda solução foi de 10 g de CaCl2 em 100 ml de água destilada. Estas duas soluções foram autoclavadas separadamente e adicionadas ao meio GY antes de se verter em placas. Estas duas soluções mudaram a cor do meio GY a opaco branco que mostra a presença de fosfato de cálcio insolúvel. Uma reação positiva foi demonstrada pela presença de uma zona clara em torno da área dos isolados.

Testes de antagonismo

[00182] Cepas de rizóbio foram cultivadas em placas de ágar de levedura manitol (YMA; Graham, Applied Microbiology 17(5): 769-770, 1969) ou inclinações para 3-5 dias antes da colheita. As cepas de rizóbios foram colhidas e diluídas em série em solução salina 0,9%. O OD a 600 nm das soluções rizobianas foi verificado e o número de unidades formadoras de colônias foi contado seguindo o método de Miles e Misra (Journal Hygiene 38: 732-749, 1938). Ao mesmo tempo, 100 μL destas diluições seriadas com diferentes valores de OD foram espalhadas em placas de YMA e deixadas secar. Dois plugues de cerca de 25 mm2 de cada cepa actinobacteriana cultivada em meio International Streptomyces Project 2 (ISP2; Atlas, Handbook of Microbiological Media, 1993) durante 7 dias foram colocados na superfície das placas YMA inoculadas. As placas foram incubadas durante 5-7 dias a 27oC e verificadas diariamente pela atividade antagônica contra o rizóbio. Rizóbio e o actinobactéria que foram cultivados separadamente como culturas puras em placas YMA foram usadas como controles negativos. Estreptomicina, vancomicina e foram utilizados como controles positivos antibacterianos. Todos os tratamentos foram repetidos duas vezes e incubados a 27oC.

Interação entre actinobactérias endofíticas e rizóbio em Luzerna

[00183] Sementes de luzerna foram esterilizadas na superfície, como descrito acima e semeadas em potes autoclavados. Cada pote continha cerca de 1 kg de areia e mistura de vermiculita, e tinha duas partes separadas para permitir a drenagem fácil. Cinco e 148 actinobactérias endofíticas isoladas a partir das raízes de trigo saudáveis esterilizadas na superfície e raiz saudável esterilizada na superfície e nódulos de quatro leguminosas diferentes, tais como luzerna, ervilhas, trevo e luzerna-escura, respectivamente, foram revestidas na superfície das sementes de luzerna em uma solução 0,3% (p/v) de goma de xantano estéril. 100 ml de água MQ foram adicionados a cada pote antes de plantar as dez sementes revestidas. O topo do pote foi coberto com uma fina camada de esferas de plástico granuladas. Então, a solução de 200 mL de 1/80 solução McKnight contendo nitrogênio iniciador (266 mg NH 4 NO por 20 L de solução de McKnight) foi suavemente adicionada a cada pote antes de cobrir com bolsas de congelamento e colocadas na estufa. O número de mudas foi diluído para baixo de quatro plantas antes de adicionar 1 ml de RRI128 rizóbio cerca de 108 UFC/ml em cinco dias de plantio. A cada semana 50 ml de solução de nitrogênio (1,2 gL - 1 de NH4NO3) foi aplicado a cada pote para plantas tratadas com nitrogênio e água MQ foi adicionada conforme necessário.

[00184] Todos os tratamentos foram repetidos dez vezes completamente randomizados na estufa, com a posição dos potes alteradas aleatoriamente a cada semana. As plantas foram colhidas após a sexta à sétima semana de semeadura. Os parâmetros avaliados foram altura e peso seco do rebento, comprimento e massa seca da raiz, o número e peso seco de nódulos por planta. Nódulos foram removidos, contados e secos a 60oC. Peso seco de cada nódulo foi calculado dividindo o peso total de nódulos pelo número total de nódulos de duas plantas, com cinco repetições.

Leituras SPAD 502, análises de nitrogênio total e N2 fixo no rebento.

[00185] Durante a sexta semana, folhas de plantas de luzerna foram medidas por um SPAD de 502 metros (medidor de clorofila SPAD-502, Konica Minolta) projetado para indicar a quantidade de clorofila presente nas folhas das plantas. As três maiores folhas foram verificadas para obter leituras SPAD. Além disso, as folhas secas das plantas de controle (apenas tratadas com Sinorhizobium), e as plantas tratadas com rizóbio e EN23 e EN27, LuP30 e LuP47B colhidas na sétima semana foram analisadas para o conteúdo de nitrogênio e outros elementos. As folhas foram secas a 60 o C durante 48 h para se obter um peso constante e foram moídas até cerca de 1 mm de tamanho para análise.

[00186] Fixação de N 2 associada com os rebentos foi calculada pela seguinte equação:

[00187] N2 fixado no rebento = (% N*SDW)tratamento - (% N*SDW)não inoculado

Experimento de limitação de nutrientes

[00188] Sementes de luzerna foram esterilizadas à superfície e revestidas com actinobactéria como descrito acima. Duas sementes revestidas foram semeadas em um tubo de centrífuga de 50 ml contendo 65 g de areia lavada autoclavada e 10 ml de iniciador N de McKnight (0,133 mg) cinco vezes menor do que em comparação com o 0,665 mg normal por planta em ensaios em pote. Este foi então coberto por areia e esferas plásticas. O número de mudas foi diluído para baixo de uma muda antes de inocular com suspensão 108 CFU.ml-1 RRI128. Os tubos foram mantidos no interior da câmara de crescimento com ciclo de 12 horas de luz e 12 horas de escuro. A água foi fornecida como necessário, até 7 semanas.

Extração de DNA

[00189] Em um tubo esterilizado Eppendorf de 1,5 mL, 10 μL de lisozima foram adicionados a 500 μL de Tris-EDTA (TE) pH 7,4, antes de voltar a suspender as células de 2-3 alças de células actinobacterianas na mistura, a qual foi então agitada em vórtice e centrifugada depois. O tubo Eppendorf foi incubado a 37oC durante 60 minutos antes da adição de 10 μL de proteinase K e 32,5 μL de SDS a 10% e incubado a 55oC durante 60 minutos. Em seguida, foram adicionados 100 μL de NaCl 5 M e 65 μL de CTAB/NaCl e a mistura foi incubada a 55oC durante 10 minutos. Seiscentos microlitros de fenolclorofórmio foram adicionados e o tubo foi deixado em temperatura ambiente durante 30 minutos com agitação intermitente a cada 10 minutos. Após centrifugação a 12.000 rpm durante 15 minutos, o sobrenadante foi transferido para um novo tubo Eppendorf de 1,5 ml estéril. Um adicional de 500 μL de clorofórmio foi adicionado ao tubo e deixado em temperatura ambiente durante 15 minutos, com mistura por inversão a cada 7-8 minutos antes da centrifugação a 12.000 rpm durante 15 minutos. A fase aquosa foi transferida para um novo tubo Eppendorf de 1,5 ml estéril antes da adição de 20 μL de 10 mg.mL-1 RNAse e incubando a 37oC durante 60 minutos. Em seguida, foram adicionados 500 μL de clorofórmio e o tubo deixado em temperatura ambiente durante 15 minutos. Após centrifugação a 12.000 rpm durante 15 minutos, o sobrenadante foi transferido para um novo tubo Eppendorf de 1,5 ml estéril. Um adicional de 500 μL de clorofórmio foi adicionado e o tubo foi deixado em temperatura ambiente durante 15 minutos (com mistura por inversão a cada 7-8 minutos). Após centrifugação a 12.000 rpm durante 15 minutos, o sobrenadante foi transferido para um novo tubo eppendorf estéril de 1,5 mL (etapas repetidas). Um volume de 0,1 x de acetato de Na 3M (50 μL) e o volume de 3x 100% de etanol (1 mL) foi adicionado ao tubo antes de deixar a -20 o C durante a noite. O sobrenadante foi removido com cuidado de modo a não perturbar o sedimento após centrifugação em velocidade máxima de 16.000 rpm durante 15 minutos. O sedimento foi lavado duas vezes com etanol a 70% e seco, colocando os tubos em um bloco de aquecimento a 55oC com as tampas abertas durante aproximadamente 10 minutos. Finalmente, o sedimento foi ressuspenso em 50 μL de água estéril.

PCR do gene 16S rRNA

[00190] Uma mistura principal foi preparada como 1 μL de dNTPs (10 mM), 1 μL de DNA Taq polimerase (5 U/μL), 5 μL de tampão ThermoPol, 2 μL de iniciador 27f (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG; SEQ ID NO: 1), 2 μL de iniciador 1465r (TACGGYTACCTTGTTACGACTT; SEQ ID NO: 2), 2 μL de amostra de DNA e 37 μL de água de injeção. PCR foi realizada por aquecimento dos tubos de PCR a 94oC durante 2 minutos, seguido por 40 ciclos de 94oC durante um minuto, 52oC durante um minuto e 72oC durante dois minutos, e 72oC durante 10 minutos. Um gel de agarose a 1,2% contendo 3 μL de GelRed (Biotium) em 40 ml de agarose foram usados para separar o peso molecular dos produtos de PCR. Um microlitro de corante de carregamento foi bem misturado com 2 μL de cada produto de PCR antes de carregar o gel, que foi executado em um tampão de corrida 0,5x TBE a 70 V e 400 mA durante 60 minutos. Os produtos da PCR foram sequenciados por Macrogen, Coreia. As sequências 16S rRNA resultantes foram comparadas com o banco de dados GenBank utilizando o banco de dados National Centre for Biotechnology (NCBI) do programa BLASTN, incluindo os resultados das maiores combinações para cada isolado e o correspondente bit escore e percentual de identidade.

EXEMPLO 2 - ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DEACTINOBACTÉRIAS ENDOFÍTICAS

[00191] 225 actinobactérias endofíticas foram isoladas de raízes e nódulos de ervilha, alfafa, trevo e luzerna-escura. 73 eram de nódulos e 152 eram de raízes. Com base na sua morfologia, 126 culturas (56%) pertencem ao gênero Streptomyces, 54 (24%) pertencem a Microbispora, 20 (8,89%) pertencem a Micromonospora e 25 culturas são ainda não identificadas. Meios de ágar vitamina B ácido úmido (HV), extrato de levedura caseína dextrose (YECD) e extrato de levedura em água corrente (TWYE) permitiu com sucesso o crescimento de quase todos os isolados mencionados. 125 culturas foram isoladas a partir do meio HV, 72 culturas eram de TWYE, 26 eram de YECD e uma destas foi isolada a partir de TSA. Não havia muita diferença no número de culturas isoladas a 37°C e 27°C, que foram 125 e 112 culturas, respectivamente. Oitenta e cinco culturas foram isoladas a partir de raízes de luzerna, enquanto que 65 isolados eram de ervilha (42 a partir de raízes e 23 de nódulos), 37 culturas foram do trevo (16 a partir de raízes e 26 de nódulos) e 35 eram de luzerna-escura (12 a partir de raízes e 23 de nódulos). Trinta e dois dos 73 isolados de nódulos foram Streptomyces, 17 eram Microbispora, 5 eram Micromonospora e 19 eram não identificados.

EXEMPLO 3 - EFEITOS DE ACTINOBACTÉRIAS ENDOFÍTICAS NA GERMINAÇÃO DE LUZERNA, A PRODUÇÃO DE IAA E SOLUBILIZAÇÃO DE FOSFATO

[00192] Cinquenta e seis de 148 culturas (38%) isoladas de luzerna promoveram germinação de sementes de luzerna e 27 (18%) isolados afetaram negativamente a germinação de sementes de luzerna, em termos de número de sementes germinadas e comprimento de raízes em placas de ágar. Além disso, 39 de 148 culturas melhoraram a germinação de sementes de luzerna com a presença de rizóbio em arenosa.

[00193] Como mostrado na Tabela 1 e na Figura 3, uma gama de actinobactéria endofítica mostrou a capacidade de produzir IAA. A Tabela 1 identifica também as culturas que demonstraram ter a capacidade de solubilização de fosfato. Estas foram LuP5B, LuP44 e LuP8A.

Exemplo 4 - TESTE DE ANTAGONISMO

[00194] Duas concentrações de rizóbio foram testadas para o antagonismo com 14 actinobactérias endofíticas; cinco culturas isoladas de não legume e nove leguminosas isoladas. Como mostrado na Tabela 2, a maior parte das actinobactérias endofíticas teve efeitos neutros ou positivos no crescimento de três rizóbios RRI128, SRDI736, WSM1115G, exceto para LuP10, EN28 e EN46. LuP10 melhorou o crescimento de RRI128, mas inibiu o crescimento de SRDI736 e WSM1115G, enquanto que LuP3, LuP30 LuP47B e um crescimento melhorado dos três rizóbios em várias concentrações.

[00195] Como mostrado na Figura 4, LuP30 e LuP47B mostrou estimulação significativa de crescimento rizobiano Rhizobium leguminosarum bv. trifolii cepa WSM 1325 e Bradyrhizobium lupini cepa WSM 471.

EXEMPLO 5 - EFEITOS DE SEIS ACTINOBACTÉRIAS ENDOFÍTICAS DE NÃO LEGUMINOSAS

[00196] Como mostrado na Tabela 3, algumas actinobactérias endofíticas de raízes de trigo mostraram interações benéficas com as plantas luzerna inoculadas em RRI128 enquanto algumas eram neutras, sem impactos significativos sobre diferentes parâmetros. EN2 melhorou significativamente a massa fresca e seca do rebento, bem como o comprimento da raiz, enquanto EN23 melhorou não só a altura, massa fresca e seca do rebento, mas também comprimento e peso fresco da raiz. Em particular, a altura média das plantas de rebentos que recebem tratamento combinado de RRI128 e EN23 foi 15,2 cm, enquanto que as plantas tratadas com apenas RRI128 foi 12,55 cm. EN23 melhorou a altura do rebento da planta de 21,1%. Além disso, EN23 melhorou significativamente o peso seco de cada nódulo, o peso seco total de nódulos, teor de nitrogênio da planta, bem como de nitrogênio total por planta, embora não melhorou significativamente o número de nódulos por planta. Massa total por planta tratada com EN23 aumentou 25,7% em comparação com plantas tratadas com o rizóbio apenas de controle.

[00197] O tratamento com EN27 resultou em ligeiras melhoras de altura, massa fresca e seca do rebento e massa fresca e seca da raiz. Embora EN27 reduziu significativamente o número de nódulos, o peso fresco de cada nódulo e o peso seco total de nódulos por planta foram maiores do que apenas plantas RRI128. Além disso, EN27 também melhorou significativamente as leituras SPAD, teor de nitrogênio (% N 2) e nitrogênio total por planta. EN23 e EN27 melhorou a quantidade de N 2 fixado nos rebentos, de 0,85 e 0,80 mg por planta, respectivamente, em comparação com apenas plantas RRI128 (Tabela 3). Em contraste, EN16 reduziu significativamente o número de nódulos e peso seco total de nódulos por planta após sete semanas de plantio. EN28 e EN46 não tiveram efeito significativo sobre o crescimento de plantas luzerna com o RRI128. O teor de nitrogênio foi 2,725% da massa para o controle, 3,225% da massa para plantas tratadas com EN23 e 3,65% para as plantas tratadas com EN27. Houve 1,38 mg de N total por planta controle, enquanto as plantas tratadas com EN23 e EN27 tiveram 2,23 mg e 2,18 mg N total, respectivamente.

EXEMPLO 6 - EFEITOS DE ACTINOBACTÉRIAS ENDOFÍTICAS ISOLADAS DE LEGUMES

[00198] As interações entre rizóbio RRI128 e 148 culturas isoladas de leguminosas foram triadas em termos de crescimento da planta e fixação de nitrogênio. LuP47B e LuP30 mostrou efeitos benéficos sobre a simbiose de rizóbio e luzerna, com a melhora da altura do rebento, massa do rebento e planta e fixação de nitrogênio por planta. Como mostrado na Tabela 4, o tratamento com estas culturas levou a uma melhora de 35,33% e 24,87% de massa seca e 29,91% e 25,87% da massa total por planta, respectivamente. LuP47B também melhorou a altura do rebento significativamente, até 26,25%. Embora LuP30 não tenha promovido significativamente a altura do rebento, este desenvolveu uma raiz mais longa em comparação com plantas tratadas com apenas RRI128. Em contraste, LuP10 melhorou a biomassa de raiz em vez de comprimento radicular.

[00199] Como mostrado na Tabela 5, a combinação de rizóbio RRI128 e EN23 melhorou significativamente teor de cobre, fósforo, sódio e nitrogênio no rebento em comparação com o RRI128 sozinho. Tratamento de LuP30 e LuP47B resultou em uma melhora significativa de todos os elementos traços testados, com exceção do ferro com a presença do RRI128. Embora a massa seca de plantas inoculadas com o RRI128 e LuP30 fosse menos do que a de plantas tratadas com RRI128 e LuP47B estas mostraram maiores quantidades de cobre, ferro e zinco, em comparação com LuP47B. EN23, LuP30 e LuP47B também melhoraram o conteúdo de nitrogênio no rebento, com 0,35, 0,61 e 0,83 mg por cada rebento, respectivamente (ver Figura 6).

EXEMPLO 7 - EFEITOS DE ACTINOBACTÉRIAS ENDOFÍTICAS EM SIMBIOSE ENTRE RIZÓBIO E LUZERNA COM LIMITAÇÃO DA OFERTA DE NUTRIENTE

[00200] Como mostrado na Tabela 6 e Figura 7, em condições de nutrientes limitados LuP5B melhorou significativamente todos os parâmetros de crescimento, tais como a altura do rebento, comprimento da raiz, peso seco de rebento e raiz, exceto para número de nódulos. Tratamento de LuP47B resultou em melhora do comprimento de raiz e peso seco de rebento, mas LuP30 não melhorou outros parâmetros de crescimento da planta. Embora LuP12A melhorou peso seco de raiz, isto não promoveu o comprimento das raízes. Em contraste, LuP3 aumentou o comprimento de raiz, mas não aumentou o peso seco da raiz (Tabela 6).

EXEMPLO 8 - ATIVIDADE BIOCONTROLE NA PLANTA

[00201] Tubos de centrífugas de cinquenta mililitros foram usados para triar para a capacidade de biocontrole de cepas actinobac- terianas contra o patógeno fúngico de raiz Rhizoctonia. Quarenta e cinco gramas de argila arenosa esterilizada foram utilizados a um teor de umidade de 12%, adicionada em solução de nitrogênio de iniciador de McKnight (266 mg de NH 4 NO 3). Duas sementes de painço infectadas com R. solani AG8 cepa W19 foram adicionadas ao topo da argila arenosa, e um adicional de 10 g de solo contendo 12% de umidade foi adicionado para cobrir as sementes de painço. Dois tubos sem adicionar as sementes de painço infestadas com o patógeno e sem actinobactérias endofíticas foram assim utilizados como controle. Os tubos foram colocados em um rack coberto com folha de alumínio e colocados numa câmara durante duas semanas a 15 o C na ausência de luz.

[00202] Sementes de luzerna foram esterilizadas na superfície e pré- germinadas com suspensões actinobacterianas em papel de filtro úmido autoclavado em placas de petri. Quando as raízes foram cerca de 1-3 mm de comprimento foram mergulhadas em 5ml (para cobrir todas as sementes) da suspensão rizobiana (aproximadamente 108 CFU/ml) durante 3 minutos. Duas sementes pré-germinadas e revestidas foram transferidas para cada um dos tubos de 50 ml e cobertas com 5 g de solo (12% de umidade) e uma camada de esferas de plástico. Os tubos foram mantidos a 15 o C numa câmara de crescimento durante 3 semanas. Houve duas repetições de cada tratamento, e água MQ foi adicionada conforme necessário. O número de plântulas que emergiu, o comprimento de raiz e raiz danificada foi registrado.

[00203] Os resultados do ensaio de controle biológico são mostrados na Tabela 7.

EXEMPLO 9 - IDENTIFICAÇÃO DE ACTINOBACTÉRIAS USANDO SEQUÊNCIA DO GENE 16 S RRNA

[00204] LuP3, LuP12A, LuP30, LuP47B, EN23, EN27, LuP8 e LuP44 foram putativamente identificados como Streptomyces sp. por sequenciamento do gene 16S rRNA.

[00205] As sequências de genes 16S rRNA determinadas para cada organismo foram como se segue:

[00206] Como mostrado na Tabela 8, a correspondência mais próxima para LuP3 foi Streptomyces drozdowiczii com até 99,4% de identidade de sequência de gene 16S rRNA. A correspondência mais próxima para LuP30 foi Streptomyces rishiriensis, que mostrou até 99,9% 16S rRNA identidade genética. LuP12A, LuP47B, LuP8 e LuP44 são todos muito perto de ambos Streptomyces ciscaucasicus e Streptomyces canus, com > 99% de identidade de sequência de genes 16S rRNA.

EXEMPLO 10 - EFEITO DE CO-INOCULAÇÃO DE ACTINOBACTÉRIAS/RIZOBIANOS SOBRE PARÂMETROS DE CRESCIMENTO DE LUZERNA EM CONCENTRAÇÕES DIFERENTES DE N

[00207] Os efeitos de três actinobactérias sobre o crescimento e a simbiose de luzerna e rizobianos foram estudados em três níveis de NH 4 NO 3 3 ppm, 25 ppm e 50 ppm.

[00208] O experimento fatorial composto (i) 3 cepas de actinobactérias, (ii) ± inoculação com Sinorhizobium meliloti RRI 128 e (iii) 3 níveis de NH 4NO 3de solo. Os potes foram preparados e regados com uma solução de McKnight deficiente de nitrogênio suplementada com NH 4NO 3 para fornecer o nitrogênio do solo, de 3, 25 e 50 ppm. As sementes de planta designadas para tratamentos de rizóbio foram inoculadas com uma suspensão (1 ml por planta contendo 10 8CFU) de rizobianos 6 dias após a semeadura. Cada tratamento foi repetido oito vezes. Potes foram dispostos em um desenho experimental inteiramente randomizado em uma estufa e as quatro potes de plantas de cada tratamento foram colhidas em 4 e 7 semanas após a inoculação com o S. meliloti RRI 128.

[00209] Como mostrado na Tabela 9, a coinoculação de cada um dos EN23, LuP30 e LuP47B com S. meliloti RRI 128 foi capaz de melhorar de forma estatisticamente significativa, pelo menos, um de peso seco de raiz ou peso seco de rebento sobre os não inoculados ou apenas Rhizobium controle em pelo menos uma concentração de N.

[00210] Como mostrado na Tabela 10, a coinoculação de cada um dos EN23, LuP30 e LuP47B com S. meliloti RRI 128 foi capaz de melhorar de forma estatisticamente significativa o número de nódulos sobre os não inoculadas ou apenas Rhizobium controle em pelo menos uma concentração de N na semana 4 e/ou semana 7 de tempo de amostragem.

[00211] Em relação aos níveis de nutrientes, na ausência do S. meliloti RRI 128 EN23, LuP30 ou LuP47B reduziu significativamente ferro e cobre em plantas de rebento após 7 semanas, em ambos 25 mg e 50 mg/kg nitrogênio NH4NO3, enquanto sódio e molibdênio foram aumentados. Nitrogênio total em plantas de rebento foi aumentado significativamente com sementes revestidas com LuP47B a 50 mg de N enquanto EN23 e LuP30 aumentou a quantidade total de nitrogênio de rebento de planta, mas não significativo. A actinobactéria apresentou o melhor impacto sobre o nutriente no rebento de Luzerna, a 25 mg de N após 4 semanas de inoculação com S. meliloti RRI 128 EN23. Três estações de tratamento com actinobactéria tiverem maior o teor de ferro, manganês, boro, cobre, molibdênio, zinco, e macro elementos, tais como o cálcio, potássio, fosfato e nitrogênio.

EXEMPLO 11 - EFEITO DE COINOCULAÇÃO DE ACTINOBACTÉRIAS/RIZOBIANOS SOBRE PARÂMETROS DE CRESCIMENTO DE LUZERNA EM DIFERENTES DOSAGEM DE INOCULAÇÃO DE RIZÓBIO

[00212] Aumentar concentrações de dose de S. meliloti RRI 128 resultou em ligeiros aumentos de número de nódulos e do crescimento da planta. O número de nódulos por planta melhorou de 4,3 para 7,0 e 8,8 nódulos quando a concentração de rizobia foi aumentada de 5x102 para 5x104 e 5x106, respectivamente (ver Tabela 11). Os efeitos significativos da LuP30 e LuP47B no crescimento das plantas e nodulação das plantas luzerna foram em 5x102 CFU.ml-1 de S. meliloti RRI 128 (Ver Figura 8). O peso seco de rebento e massa total por planta foram aumentados até cerca de 50% a 60% e foi semelhante com plantas tratadas com os rizóbios em 104 e 106 CFU.ml-1 (veja Figura 8A). Além disso, a co-inoculação com qualquer LuP30 ou LuP47B individualmente com S. meliloti RRI 128 em 5x102 CFU.ml-1 melhorou o número de nódulos de até 7 e 9 por planta, respectivamente, enquanto as plantas de controle tiveram 4,3 nódulos por planta.

EXEMPLO 12 - 15N EXPERIMENTO

[00213] Streptomyces spp. LuP30 LuP47B e foram adicionados como esporos de sementes de luzerna com uma solução estéril a 0,3% de goma de xantano e secas ao ar antes da semeadura. As sementes foram tratadas com S. meliloti RRI 128. O processo de plantação foi como descrito no EXEMPLO 10.

[00214] O nitrogênio fornecido era 15NH415NO3 (98%), com concentração inicial de N no solo (25 mg/kg 15NH415NO3). As plantas foram colhidas após 10, 21 e 35 dias após a inoculação com o S. meliloti RRI 128. Nitrogênio no rebento e materiais de raízes foram analisados por espectrometria de massa para determinar as proporções de N da planta derivado da atmosfera e do solo.

[00215] As plantas foram colhidas em três vezes - em 10, 21 e 35 dias após a inoculação com S. meliloti RRI 128. A eficácia da LuP30 e LuP47B foi novamente confirmada pela melhora do peso seco do rebento e do número de nódulos após 21 e 35 dias de coinoculação com S. meliloti IRR 128 (Figura 9) e (Tabela 12). A quantidade de 15N e 14N em plantas foi estimada por espectrometria e o total de N em toda a coinoculação da planta com LuP30 ou LuP47B foi aumentada até 40% e 60% respectivamente, em comparação com plantas tratadas S. meliloti IRR 128 sozinhas (Figura 10). Isto foi principalmente devido ao maior acúmulo de 14N (derivado de fixação de N2), que foi aumentada em LuP30 ou LuP47B em 47% e 72%, respectivamente. A actinobactéria melhorou significativamente a quantidade de 14N em suas plantas, enquanto LuP47B também melhorou a quantidade de 15N em seus rebentos e raízes (Tabela 13).

EXEMPLO 13 - EFEITO DAS ACTINOBACTÉRIAS NO CRESCIMENTO E SIMBIOSE DE TREVO

[00216] Trevo de cultivar Campeda (Trifolium subterraneum L.), foi escolhido para examinar os efeitos das duas actinobactérias LuP30 e LuP47B que têm mostrado uma melhora no crescimento e fixação de nitrogênio de Luzerna em experimentos anteriores. Cepa de Rizóbio Rhizobium WSM 1325 foi inoculada em sementes de trevo.

[00217] O experimento fatorial compreendeu (i) duas cepas de actinobactérias (LuP30 e LuP47B), (ii) a inoculação com cepa de rizóbio WSM1325 para trevo. Crescimento de rizóbios e actinobactérias, meios de crescimento de plantas e nutrição, semeadura e fornecimento de água foram como descrito acima. A concentração de NH 4 NO 3 foi fornecida a 25 mg por kg de areia e vermiculita, onde as actinobactérias LuP30 e LuP47B mostraram melhora de crescimento da planta e fixação de nitrogênio para as plantas luzerna. Oito repetições para cada tratamento com quatro potes cada colhidas em 4 e 7 semanas após a inoculação com rizóbio.

[00218] Coinoculação de LuP30 com WSM 1325 melhorou o número de nódulos após 7 semanas e massa de nódulos após 4 e 7 semanas no trevo (Tabela 14). Actinobacteria cepa LuP47B coinoculada com Rhizobium WSM 1325 melhorou significativamente o peso seco do rebento, massa total e número de nódulos por planta após 4 e 7 semanas de inoculação com o Rhizobium enquanto a massa de nódulos por planta melhorou apenas após 7 semanas (ver Figura 11 e Tabela 14). Houve uma mudança significativa no peso seco de raiz de plantas entre as duas colheitas; por exemplo, LuP30 melhorou peso seco de raiz após 4 semanas, enquanto LuP47B melhorou peso seco de raiz após 7 semanas.

EXEMPLO 14 - INTERAÇÃO IN VITRO DE RIZÓBIOS E ACTINOBACTÉRIAS

[00219] A interação entre LuP30 ou LuP47B sobre o crescimento de dois rizóbios Rhizobium WSM 1325 e Bradyrhizobium WSM 471 foi estudada em três concentrações 104, 106 e 108 CFU.ml-1 (ou 103, 105 e 107 células em cada placa de ágar) das duas cepas de rizóbio. As duas actinobactéria LuP30 LuP47B e foram cultivadas em ISP2 durante 7-10 dias e os tampões de ágar de culturas bem crescidas foram colocados sobre as placas de ágar que contêm as três taxas de Rhizobium. O crescimento do rizóbio foi examinado 5 a 14 dias após a adição dos tampões de actinobactéria.

[00220] LuP30 e LuP47B mostraram efeitos positivos e não antagônicos sobre o crescimento de ambos rizóbios (Rhizobium WSM 1325 e Bradyrhizobium WSM 471). Em baixas concentrações de rizóbios, menos do que 107 CFU.ml-1 ou 105 CFU.ml-1 em cada placa de ágar, LuP30 e LuP47B promoveram uma melhora visível no crescimento de ambos rizóbios em meio YMA após 5 dias de incubação a 27oC (Tabela 15). Quando a concentração do Rhizobium foi mais do que 10 7 CFU.ml -1 os efeitos de duas actinobactérias LuP30 e LuP47B não eram óbvios no crescimento dos dois rizóbios como analisado por observação visual, como foi observado com as baixas concentrações rizobianas. Estes resultados mostram que cepas de rizóbio obtêm benefícios de crescimento e são não inibidas pelas duas actinobactérias LuP30 e LuP47B.

EXEMPLO 15 - EFEITO DAS ACTINOBACTÉRIAS NO CRESCIMENTO E SIMBIOSE DE PLANTAS DE SOJA (GLYCINE MAX)

[00221] O objetivo global deste experimento foi avaliar uma gama de cepas actinobacterianas endofíticas sobre o crescimento de plantas de soja para determinar se estas cepas têm uma ampla gama de hospedeiros leguminosa. Os resultados do estudo de plantas colhidas 4 semanas depois da adição do inóculo de Bradyrhizbium para as plantas tratadas com actinobactérias mostraram que quatro das 18 cepas testadas tinham melhorado significativamente o crescimento das plantas e/ou o conteúdo de nitrogênio das plantas de soja.

Materiais e métodos

[00222] Sementes de soja (Glycine max cv. Djackal) foram esterilizadas na superfície e revestidas com esporos de actinobactéria em suspensão em 0,3% (v/p) de goma de xantano. Sementes revestidas (1 por pote) foram semeadas em uma mistura de envasamento pasteurizada ~ 1 kg (50:50 em volume de areia: vermiculita) contida em potes de 1,25 L. 200 ml de solução nutritiva de McKnight deficiente de nitrogênio foram aplicados na semeadura e suplementados para fornecer 25 mg de NH4NO3 por kg de meio de envasamento. Potes foram dispostos em um desenho em blocos aleatorizados com 5 repetições de cada tratamento. As plantas foram colhidas em 4 semanas e 7 semanas após a inoculação com Bradyrhizobium cepa CB 1809.

[00223] Os tratamentos foram controle nulo, rizóbios sem actinobactérias, e rizóbio mais cada uma das seguintes cepas de Streptomyces : Str. EN23, Str. EN27, Str. LuP3, Str. LuP5, LuP8, Str. LuP10, Str. LuP12A, Str. LuP30, Str. LuP44, Str. LuP46B, Str. LuP47B, Str. LuP73B, Str. LuP75, Str. PG3, Str. PG4, Str. PP1, Str. PP9, CM23.

[00224] Parâmetros medidos foram:

[00225] Comprimento, peso seco do rebento e da raiz.

[00226] Número e massa total de nódulos por planta.

[00227] Nitrogênio, P e elementos traços em rebentos das plantas.

Eficácia do Bradyrhizobium CB 1809 na nodulação e no crescimento da planta de soja

[00228] A inoculação com Bradyrhizobium CB 1809 na ausência de actinobactérias resultou na nodulação abundante (cerca de 120 nódulos por planta) e melhora de pesos secos de rebento e raízes, confirmando a eficácia da cepa Bradyrhizobium com cultivar Djackal. Não houve restrições óbvias a nodulação, no sistema de teste.

Efeito de actinobactérias no crescimento das plantas e simbiose de plantas de soja em 4 semanas após a inoculação

[00229] Os dados para quatro (isoladas de raiz luzerna) das 18 actinobactérias testadas são apresentados, com base nos seus efeitos positivos. Treze das cepas não afetaram nenhum dos parâmetros medidos. Como se mostra na Tabela 16, as plantas tratadas com Str. LuP8 e Bradyrhizobium CB 1809 cepa mostrou melhoras no crescimento das plantas em relação às plantas apenas inoculadas com CB1809. Str. LuP47B melhorou o peso seco do rebento e peso total da planta (+ 15%) e LuP30 melhorou o peso total da planta (+ 12%). Str. LuP30, LuP44 e LuP47B também melhorou a massa de nódulos por planta em 20, 22 e 29%, respectivamente.

[00230] Como mostrado na Tabela 17, as plantas tratadas com LuP47B também tiveram níveis elevados de ferro, magnésio, fósforo e nitrogênio (27%) em comparação com plantas inoculadas com apenas Bradyrhizobium CB1809. LuP8 melhorou N total (23%) e também ferro. LuP30 melhorou o teor de ferro.

Efeito de actinobactérias no crescimento das plantas e simbiose de plantas de soja em 7 semanas após a inoculação

[00231] Como mostrado na Tabela 18, resultados estatisticamente significativos foram:

[00232] LuP47B aumentou a altura de rebentos em 38%;

[00233] LuP8 melhorou a massa total de nódulos em 54%;

[00234] LuP8 melhorou o peso fresco de vagens em 24% e o número de sementes por planta em 35%; e

[00235] LuP47B melhorou o peso seco de sementes em 43%, enquanto LuP8 melhorou o peso seco total do rebento e vagens por planta em 24%.

EXEMPLO 16 - EFEITO DAS ACTINOBACTÉRIAS NO CRESCIMENTO E SIMBIOSE DE ERVILHA DE CAMPO (PISUM SP.)

[00236] Ensaios de Ervilha de campo foram semeadas em Hart (28 de Maio) e Riverton (10 de junho) em South Australia (SA), e em Pimpinio (15 de maio), em Victoria. Os ensaios foram dispostos em blocos randomizados com 3 repetições, cada uma compreendendo um controle não inoculado e 3 tratamentos de inoculação. Os tratamentos foram aplicados à ervilha de campo Kaspa que foi semeada para alcançar uma densidade de mudas de 50 plantas/m2. O tratamento com rizóbios (Rhizobium leguminosarum bv. viciae cepa WSM1455) foi aplicado em aproximadamente 100 vezes a dose recomendada comercialmente. O tratamento de coinoculação compreendeu o tratamento com rizóbio coinoculado com Streptomyces sp. cepa Lup47B, que foi aplicada como esporos na semente antes da semeadura.

[00237] Seis plantas foram amostradas de cada terreno em aproximadamente 8 semanas após a semeadura e número de nódulos e massa seca por planta determinado. Um adicional de dez rebentos de plantas adicionais foi amostrado de cada terreno em Out./Nov. (enchimento de vagem tardio) e utilizado para estimar a biomassa do rebento, número de vagens por planta e para estimar o % de N derivado de fixação usando o método de abundância natural de 15N. Os terrenos foram colhidos em máquina para estimar a produtividade de grãos e subamostras utilizadas para a determinação de proteína no grão (Total N Leco, CSBP).

[00238] A Tabela 19 mostra o número de nódulos, massa de nódulos, número de vagens e biomassa total da planta em plantas de ervilha cultivadas em ensaios de campo em três locais (Riverton SA, Hart SA e Pimpinio Vic). Um resumo dos resultados mostrados na Tabela 19 é o seguinte:

[00239] Um efeito significativo sobre a nodulação foi visto em Pimpinio, onde a co-inoculação de actinobactéria (LuP47B)/Rhizobium melhorou significativamente o número de nódulos relativos ao rizóbio de único controle; e

[00240] Coinoculação de actinobacteria (LuP47B)/rizóbio melhorou a biomassa em todos os locais em relação à inoculação apenas de rizóbio, com dois locais e a média de todos os locais que atingiram melhoras estatisticamente significativas na biomassa.

[00241] Os especialistas na técnica apreciarão que a invenção aqui descrita é suscetível de variações e modificações além das especificamente descritas. Deve ser entendido que a invenção inclui todas essas variações e modificações. A invenção também inclui todas as etapas, características, composições e compostos referidos ou indicados neste relatório descritivo, individualmente ou coletivamente, e quaisquer e todas as combinações de quaisquer duas ou mais das etapas ou características.

[00242] Além disso, deve notar-se que, como aqui utilizado, as formas singulares "um", "uma" e "o" incluem aspectos plurais a menos que o contexto dite de outra forma já. Assim, por exemplo, a referência a "um microrganismo" inclui um único microrganismo, bem como dois ou mais microrganismos; "uma leguminosa" inclui uma única planta, bem como duas ou mais plantas; e assim por diante.

[00243] A referência a qualquer técnica anterior neste relatório descritivo não é, e não deve ser tomada como, um reconhecimento ou qualquer outra forma de sugestão de que esta técnica anterior, faz parte do conhecimento geral comum em qualquer país.

[00244] Ao longo deste relatório descritivo, a menos que o contexto exija de outra forma, a palavra "compreendem", ou variações tais como "compreende" ou "compreendendo", será entendida como implicando a inclusão de um elemento declarado ou número inteiro ou grupo de elementos ou inteiros, mas não a exclusão de qualquer outro elemento ou número inteiro ou grupo de elementos ou números inteiros.

[00245] Faz-se referência a livros de texto padrão da biologia molecular que contêm métodos para a realização das técnicas básicas abrangidas pela presente invenção, incluindo a restrição e ligação de DNA para a geração das várias construções genéticas aqui descritas. Ver, por exemplo, Maniatis et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1982) and Sambrook et al. (2000, supra).

Claims (23)

1. Método para aumentar pelo menos um parâmetro de crescimento de uma planta leguminosa a partir de uma semente leguminosa, caracterizado pelo fato de que compreende a co- inoculação da semente leguminosa com: a. pelo menos um microrganismo rizobiano; e b. pelo menos um microrganismo Streptomyces, em que o microrganismo Streptomyces é Streptomyces sp. LuP30 conforme depositado sob o número de acesso NMI V13/030101 ou Streptomyces sp. LuP47B conforme depositado sob o número de acesso NMI V13/030100; em que a planta cultivada a partir da semente leguminosa co-inoculada exibe pelo menos um parâmetro de crescimento aumentado em relação a uma planta leguminosa cultivada a partir de uma semente da mesma taxonomia que não foi co-inoculada.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o microrganismo rizobiano é Rhizobium sp.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a co-inoculação compreende o revestimento da semente com uma primeira formulação compreendendo pelo menos 200 células individuais do microrganismo Streptomyces.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a primeira formulação compreende 200-2000 células individuais do microrganismo Streptomyces.

5. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a primeira formulação compreende um aditivo.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o aditivo é goma xantana e em que a quantidade de goma xantana na primeira formulação é de 0,3% p/v.

7. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a co-inoculação compreende co-inocular a semente com uma segunda formulação compreendendo o microrganismo rizobiano.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a segunda formulação compreende menos do que 5x104 UFCs do microrganismo rizobiano.

9. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a segunda formulação compreende menos do que 5x102 UFCs do microrganismo rizobiano.

10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o microrganismo rizobiano é um Sinorhizobium sp.

11. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o microrganismo rizobiano é um Bradyrhizobium sp.

12. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a semente leguminosa é uma semente de uma planta leguminosa selecionada do grupo que consiste em: Medicago sp., Trifolium sp., Pisum sp. e Glycine sp.

13. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o parâmetro de crescimento é um número e/ou massa de nódulos da planta leguminosa.

14. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o parâmetro de crescimento é um número e/ou massa de vagens e/ou sementes produzidas pela planta leguminosa.

15. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o parâmetro de crescimento é uma concentração e/ou quantidade de um nutriente na planta leguminosa.

16. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o nutriente é selecionado a partir de: Boro, Cálcio, Cobre, Magnésio, Manganês, Fósforo, Sódio, Enxofre, Nitrogênio e/ou Zinco.

17. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o parâmetro de crescimento é uma taxa de germinação de uma planta leguminosa.

18. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a planta leguminosa é selecionada do grupo que consiste em: Medicago sp., Trifolium sp., Pisum sp. e Glycine sp.

19. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a planta leguminosa é exposta a um patógeno e, quando exposta ao patógeno, a planta leguminosa co-inoculada apresenta pelo menos um parâmetro de crescimento aprimorado em relação a uma planta leguminosa da mesma taxonomia que não foi co-inoculada.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o patógeno é um patógeno da raiz.

21. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o patógeno é um patógeno fúngico.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o patógeno é um Rhizoctonia sp.

23. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um microrganismo rizobiano é selecionado de Rhizobium RRI128, Rhizobium WSM1325, cepa de Bradyrhizobium japonicum CB1809 e Rhizobium WSM1455..

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