WO2007100162A1

WO2007100162A1 - 新規細菌及びそれを用いた植物病害の防除方法

Info

Publication number: WO2007100162A1
Application number: PCT/JP2007/054624
Authority: WO
Inventors: Tsuyoshi Isawa; Michiko Yasuda; Satoshi Shinozaki; Hideo Nakashita; Toshiaki Kudo
Original assignee: Mayekawa Mfg. Co., Ltd.; Riken
Priority date: 2006-03-03
Filing date: 2007-03-02
Publication date: 2007-09-07
Also published as: US8728459B2; EP1997882A1; EP1997882B1; AU2007221590B2; CA2638813C; US20090155214A1; JPWO2007100162A1; AU2007221590A1; JP5120849B2; CA2638813A1; EP1997882A4

Abstract

　本発明は農業上有用な植物に、病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウイルスによる病害に対する抵抗性を付与する手段を提供することを目的とする。　本発明は、Azospirillum属又はHerbaspirillum属に属し、植物体内に共生して宿主植物に病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウイルスによる病害に対する耐性を付与する能力を有する細菌、該細菌を用いた植物病害の防除方法、並びに該方法により作出された植物に関する。

Description

• 新規細菌及びそれを用いた植物病害の防除方法技術分野 '

本発明は、新規細菌エンドフアイト、それを用いた植物における病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウィルスによる病害の防除方法、並ぴにこの方法により作出された植物に関する。

明背景技術

書

これまでの化学農薬を中心とした病害虫防除技術は、効率的な食糧確保に貢献してきた。ところが近年、栽培の効率性だけでなく、安心 ·安全といった領域を含めた無農薬、減農薬による環境保全型農業が望まれ、それに適合した病害虫防除技術（例えば微生物農薬）が必要とされている。発明の開示

本発明は農業上有用な植物に、病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウィルスによる病害に対する抵抗性を付与する手段を提供することを目的とする。

本発明は以下の発明を包含する。

( 1 ) Azospirillum属又は Herbaspirillum属に属し、植物体内に共生して宿主植物に病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウィルスによる病害に対する耐性を付与する能力を有する細菌を、植物に人為的に感染させる工程を含む、 '植物における病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ゥィルスによる病害の防除方法。

( 2 ) 前記細菌が Azospirillum 属新規細菌（受託番号 NITE BP- 194)、及び Herbaspirillura属新規細菌（受託番号 NITE BP- 193)、並びにそれらの変異株か' らなる群から選択される少なくとも 1種である、（1. ) 記載の方法。

( 3 ) 前記植物がイネ科又はアブラナ科に属する植物である、（1 ) 又は（2 ) 記載の方法。

( 4 ) 細菌の植物への感染が植物の育苗期に行われる、（1 ) 〜（3 ) のいずれかに記載の方法。

( 5 ) Azospirillum属又は Herbaspirillum属に属し、植物体内に共生して宿主植物に病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウィルスによる病害に対する耐性を付与する能力を有する細菌を有効成分として含有する、植物における病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウィルスによる病害の防除剤。

( 6 ) 前記細菌が Azospirillum 属新規細菌（受託番号 NITE BP- 194)、及び Herbaspirillum属新規細菌（受託番号 NITE BP-193)、並びにそれらの変異株からなる群から選択される少なくとも 1種である、（5 ) 記載の防除剤。

( 7 ) Azospirillum属新規細菌（受託番号 NITE BP- 194) 又はその変異株であつて植物体内に共生して宿主植物に病原性糸状藺、病原性細菌又は病原性ウィルスによる病害に.対する耐性を付与する能力を有する変異株。

( 8 ) Herbaspirillum属新規細菌（受託番号 NITE BP-193) 又はその変異株であつて植物体内に共生して宿主植物に病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウィルスによる病害に対する耐性を付与する能力を有する変異株。

( 9 ) Azospirillum属新規細菌 (受託番号 NITE BP- 194)、及ぴ Herbaspirillum 属新規細菌（受託番号 NITE BP- 193)、並びにこれらの変異株であって植物体内に共生して宿主植物に病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウィルスによる病害に対する耐性を付与する能力を有する変異株からなる群から選択される少なくとも 1種が人為的に感染された、病原性糸'状菌、病原性細菌又は病原性ウィルスによる病害に対する耐性を有する植物。

本明細書において「Azospirillum属新規細菌」とは、実施例 1で単離同定された、受託番号 NITE BP-194が付与された Azospirillum属に属する細菌を指す。本明細書において「Herba_Spirilluni属新規細菌」とは、実施例 2で単離同定された、受託番号 NITE BP-193が付与された Herbaspirillum属に属する細菌を指す。

本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2006-58483 号の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。図面の簡単な説明図 1 一 1 は、 Azospirillum 属新規細菌と Azospirillum sp. Arm2- 2 株 (Accession No. AF521650) との 16S rDNAの比較結果を示す（図 1一 2に続く）。図 1 — 2は、 Azospiri llum 属新規細菌と Azospirillum sp. Arm2_2 株 (Accession No. AF521650) との 16S rDNAの比較結果を示す（図 1一 3に続く）。図 1 一 3は、 Azospiri llum 属新規細菌と Azospirillum sp. Arm2_2 株 (Accession No. AF521650) との 16S rDNAの比較結果を示す。 '

2— 1は、 Herbaspirillum属俞夫細菌と Herbaspirillum rubrisbalbicans (Accession No. AF137508) との 16S rDNAの比較結果との 16S rDNAの比較結果を示す（図 2— 2に続く）。

2— 2は、 Herbaspiril lum 新規細菌と Herbaspirillum rubrisoalbicans (Accession No. AF137508) との 16S rDNAの比較結果との 16S rDNAの比^結果を示す（図 2— 3に続く）。

図 2— 3は、 Herbaspirillum 新規細 ¾と HerDaspirillum rubrisbalbicans (Accession No. AF137508) との 16S rDNAの比較結果との 16S rDNAの比較結果を示す。

図 3は、 ITS領域と nested PCR プライマーとの位置関係を示す。

図 4は、 Azospirillum属新規細菌によるシロイヌナズナにおける細菌性病害の防除効果を示す写真である。

図 5は、 Azospirillum属新規細菌及び Herbaspirillum属新規細菌によるシロ：'ナにおける細菌性病害の防除効果を示す写真である。発明を実施するための最良の形態

本発明の細菌の感染により、病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウィルスによる病害に対する耐性が付与される植物としては、イネ科植物又はアブラナ科植物が挙げられる。イネ科植物としては、特にイネ、コムギ、才ォムギ、ライムギ、 ' ライコムギ、ノヽトムギ、ソノレガム、ェンバク、トウモロコシ、サトウキビ、ァヮ、ヒェなどの穀類が挙げられる。イネ科植物としてはさらに、シバ、バッファローグラス、バミユーダグラス、ウィービンググラス、センチピードグラス、カーぺットグラス、ダリスグラス、キクュグラス、セントオーガスチングラスなどの飼料または牧草が挙げられる。アブラナ科植物としては、特にアブラナ、カブ、チンゲンサイ、ノザヮナ、カラシナ、タカナ、コブタカナ、水菜、コールラビ一、ルツコ.ラ、クレソン、タアサイ、カリフラワー、キャベツ、ケ一ル、ハクサイ、コマツナ、ダイコン、ハツカダイコン、ブロッコリ一、メキャベツ、ヮサビ、セィョゥヮサビが挙げられる。

本発明はまた、本発明の細菌が人為的に感染された、病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウィルスによる病害に対する耐性を有する上記植物に関する。

本発明により防除され得る病原性糸状菌による植物病害としては、イネいもち病（病原糸状菌： Magnaporthe grisea)、イネゴマ葉枯病（病原糸状菌： Bipolaris leersiae)ヽイネばか苗病 (病原糸状菌： Gibberella fujikuroi).、イネ紋枯病（病原糸状菌： Thanatephorus cucumuris ) , イネ黄化萎縮病菌（病原糸状菌：

Ssc丄 erophthora.macrospora)、ィィ、疑似紋枯 (丙原糸状菌： Rhizoctonia solani) コムギ麦角病（病原糸状菌： Claviceps purpurea) , コムギ裸黒穂病（病原糸状菌：

Ustilago tritici) , ォォムギ裸黒穂病（病原糸状菌： Ustilago nuda)、ライムギ雪腐褐色小粒菌核病（病原糸状菌： Typhula incarnata) , ライムギ斑点病（病原糸状菌： Cochliobolus sativus) イネ、ェンバタ、コムギ、.ォォムギ、ライムギの立枯病 (病原糸状菌： Gaeumannomyces graminis) , トウモロコシすす紋病 (病原糸状菌： Setosphaeria turcica) , アブラナ科野菜根こぶ病（病原糸状菌：

Plamodiophora brassicae) アフラナ科野菜立枯病 (病原糸状菌： Thanatephorus cucumeris)、ハクサイ黄化病（病原糸状菌： Vertici ll ium albo - atrum)、ダコン麥黄 ( 3原糸状菌： Fusarium oxysporum f . sp. Raphani)、ダイコン白さぴ病（病原糸状菌： Albugo macrospora)、コマツナ白さぴ病（病原糸状菌： Albugo macrospora) 力げられる。

本発明により防除され得る病原性細菌による植物病害としては、イネ白葉枯れ炳 (病原細菌： Xanthomonas oryzae pv. oryzae)、ィ不もみ iff細菌病 (病原細菌：

Pseudomonas gluraae) ハクサイ、アブラナ科野菜に重大な被害をもたらす野菜類軟腐病 (炳原細菌： Erwinia caroto霄 a )、キャベツ黒腐病 ( Xanthomonas carapestris pv. campestris 力 S孪げられる。

本明細書に開示する実施例では、本発明に係る細菌が、病原性糸状菌による植物病害の防除に有効であること、並びに病原性細菌による植物病害の防除に有効であることが示されている。このことから、本発明に係る細菌は、宿主植物自身の病害抵抗性を高めていることがわかる。よって、本発明に係る細菌は、病原性糸状菌又は病原性細菌による植物病害の防除に有効であるだけでなく、病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウィルスによる植物病害の防除においても有効である。

本発明により防除され得る病原性ウィルスによる植物病害としては、イネ萎縮丙 Rice dwarf reovirus、ィ不 t葉枯; )p¾ Rice stripe tenuivirus ィネ黒すし萎縮病 Rice blach- streaked dwarf reovirus、ィネえそモザィク病 Rice necrosis mosaic potyvirus^ イネわいィ匕病 Rice waika virus.ヽコムギメ搞 ' ΐίί 5 Wheat yellow mosaic virus、ォォムギ縞妻縮病 Barley yellow mosaic virus、ォォムギ斑葉モザイクウィルス Barley stripe hordeivirus, ダイコン、カブ、コマツナのウィルス病としてキュゥリモ.ザィクウィルス、カブモザイクポティゥイノレス、ダイコンひだ葉モザィクコモウィルス、ソラマメウィルトフアバウイノレスが挙げられる。

本発明に用いることができる細菌としては、 Azospirillum 属又は Herbaspirillum属に属し、植物体内に共生して宿主植物に病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウィルスによる病害に対する耐性を付与する能力を有する細菌であれば特に限定されない。具体例を挙げれば、 Azospirillum属新規細菌（受託番号 NITE BP- 194)、及ぴ Herbaspirillum属新規細菌（受託番号 NITE BP- 193) が挙げられる。また、 Azospirillum 属新規細菌（受託番号 NITE BP - 194)、又は Herbaspirillum属新規細菌（受託番号 NITE BP- 193)と同等の能力を有する細菌、例えば、 Azospiri llum属に属し、実施例 1に示す Azospirillum属新規細菌と同 —の炭素源の資化能力を有する細菌や、 Azospirillum属に属し、配列番号 1に示す塩基配列を少なくとも一部分に含む 16S rDNAを有する細菌や、 Herbaspirillum 属に属し、実施例 2に示す Herbaspirillum属新規細菌と同一の炭素源の資化能力を有する細菌や、 Herbaspirillum属に属し、配列番号 2に示す塩基配列を少なくとも一部分に含む 16S rDNAを有する細菌が挙げられるがこれらには限定されなレ、。更にまた、 Azospirillum属新規細菌（受託番号 NITE BP-194)、又は Herbaspirillum 属新規細菌（受託番号 NITE BP - 193) が変異誘発処理されて作出された変異株であって、植物体内に共生して宿主植物に病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ゥィルス.による病害に対する耐性を付与する能力を有する変異株もまた、本発明に好適に使用することができる。このような変異株のなかでも、 Azospirillum属に属し、実施例 1に示す Azospirillum属新規細菌と同一の炭素源の資化能力を有する細菌や、 Azospirillum属に属し、配列番号 1に示す塩基配列を少なくとも一部分に含む 16S rDNAを有する細菌や、 Herbaspirillum属に属し、実施例 2に示す Herbaspirillum 属新規細菌と同一の炭素源の資化能力を有する細菌や、 Herbaspiri llum属に属し、配列番号 2に示す塩基配列を少なくとも一部分に含む 16S rDNAを有する細菌が好ましい。変異誘発処理は任意の適当な変異原を用いて行われ得る。ここで、「変異原」なる語は広義の意味を有し、例えば変異原効果を有する薬剤のみならず U V照射のごとき変異原効果を有する処理をも含むものと理解すべきである。適当な変異原の例と.してェチルメタンスルホネート、 U V照射、 N—メチルー N' —二トロー N—二トロソグァ二ジン、ブロモウラシルのようなヌクレオチド塩基類似体及びァクリジン類が挙げられるが、他の任意の効果的な変異原もまた使用され得る。

本発明に用いられる細菌は、振とう培養等の通常の培養法により、通常の条件下で培養されうる。培養に用いる培地としては炭素源としてグルコース、シユークロース、デンプン、デキストリンなどの糖類を、窒素源として硫酸アンモニゥム、塩化アンモニゥム、硝酸アンモニゥム等のアンモニゥム塩、硝酸塩等の無機窒素源、または、酵母エキス、コーン ' スティープ ' リーカー、肉エキス、小麦胚芽、ポリペプトン、サトウキビ絞り粕（バカス）、ビールカス、大豆粉、米糠、魚粉等の有機窒素源を、無機塩としてリン酸一カリ、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸第一鉄等の、リン、カリウム、マンガン、マグネシウム、鉄等を含む塩類を、それぞれ含有する合成または天然の培地が挙げられる。

本発明はまた、本発明の細菌を有効成分として含有する、植物における病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウィルスによる病害の防除剤に関する。当該植物病害防除剤としては、本発明の細菌の培養液をそのまま使用することができる力細菌の培養液を膜分離、遠心分離、濾過分離等の方法により分離した、本発明の細菌の高濃度物を'用いることもできる。

本発明の植物病害防除剤としてはまた、本発明の細菌の培養液を乾燥させたものを使用することができる。また、本発明の細菌の培養液を活性炭粉末、珪藻土、タルク等の多孔吸着体に吸着させ乾燥させたものを使用することができる。乾燥方法は通常の方法でよく、例えば凍結乾燥、減圧乾燥でよい。これらの乾燥物は乾燥後さらにボールミル奪の粉砕手段で粉碎されてもよい。 '

本発明の細菌は上述の培養液、高濃度物または乾燥物としてそれ自体単独で本発明に用いることができるが、更なる他の任意成分と組み合わせて通常の微生物製剤と同様の形態（例えば粉剤、水和剤、乳剤、液剤、フロアブル剤、塗布剤等の形態）に製剤化して、植物病害防除用組成物として提供されてもよい。組み合わせて使用することができる任意成分としては例えば固体担体、補助剤のような植物への適用が許容される材料が挙げられる。

本発明の細菌の植物への感染は、植物の栄養成長期に行われることが好ましい。本発明の細菌またはそれを含有する組成物の植物への施用方法としては、嘖霧、灌注、どぶ漬け、植物体への塗布、人為的に付けた傷への接触、シリンジによる注入、土壌への混合、水耕液への混入、砂等へ混合してサンドブラストのように吹きつける方法などが考えられる。本発明の細菌を懸濁してなる懸濁液を植物に灌注処理する場合には、懸濁液中の本発明の細菌の濃度は 10⁴〜： L0¹² CFU/mlが好ましい。 ' 実施例 1

Azospirillum属新規細菌の単離と同定

栽培イネ日本晴（Oryza sativa cv. Nipponbare) の茎を 3cm程とり、 70%エタノールと 1%次亜塩素酸ナトリウム溶液で表面殺菌した。それを滅菌した乳鉢で、滅菌した 0. 85%食塩水と海砂を加えながら磨碎した。窒素固定菌が窒素固定活性を発現可能な、 Rermie 培地が知られている（Rennie, R. J. 1981. Can. J.

Micribiol. 27 : 8-14)。磨砕液の上清を、試験管の Rennie半流動培地に接種し培養した。アセチレン還元活性のあった試験管から、 Nutrient Agar 培地に植菌して、シングルコロニーを単離した。 . . 単離したシングルコロニーの菌株を栽培イネに接種し、いもち病に対する抵抗性評価試験を実施した。その結果、イネに病害抵抗性を付与する細菌の菌株を選抜した.。

当該菌株を Nutrient Brothで培養し、菌体からゲノム DNAを単離した。単離した DNAを铸型に、 16S rDNA領域のほぼ全長の塩基配列を dyeプライマー法で決定した（配列番号.1)。相同性検索プログラム FASTAを利用し、決定した塩基配列と、 DDBJ/EMBL/GenBank 国際塩基配列データベースとの相同性検索を行つた。

当該菌株は Azospirillum sp. Arm2-2 株 (Accession No. AF521650) と、 98. 5 % 相同であった（図 1)。当該菌株の 16S rDNAは既存の種の 16S rDNAと一致しなかつた。

当該菌株の基質資化能を検討したところ、表 1に示す結果が確認された。

表 1

実施例 1で選抜された菌株による資化が確認された基質グリセ口一ノレ .

L-ァラビノース

リポース

D-キシロース

ガラクトース

グルコース（嫌気条件）

フルクトース（嫌気条件）

イノシトール

マンニトール

ソルビトール

エスクリン

D-マンノース

N -ァセチル -D-グルコサミン

ダルコン酸カリウム ' '

n-カプリン酸

DL-リンゴ酸

タエン酸ナトリウム実施例 1で選抜された菌株による資化が確認されなかった基質エリスリト—ノレ

D-ァラビノース

L-キシロース

ァドニトール

β -メチル- D-キシロース

■マンノース

ソノレボース

ラムノース

ズルシトール

α -メチルマンノース

α -メチル- D-グルコース

Ν-ァセチルグルコサミン

アミグダリン

アルブチン

以上の結果から、選抜された菌株は Azospirill確属に属する細菌の新規株であると結論づけた。

本発明者らは、 Azospirillum属新規細菌を独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足 2-5-8)に 2006年 2月 10 日付で受託番号 NITE BP-194として寄託した。

実施例 2 Herbaspirillum属新規細菌の単離と同定

日本に保存されている野生イネ（Oryza barthi i W1407) の葉身を 3cm程とり、 70%エタノールと 1%次亜塩素酸ナトリウム溶液で表面殺菌した。それを滅菌した乳鉢で、滅菌した 0. 85%食塩水と海砂を加えながら磨砕した。窒素固定菌が窒素固定活性を発現可能な、 Rennie培地が知られている（Rennie, R. J. 1981. Can. J. Micribiol. 27 : 8-14)。磨砕液の上清を、試験管の Rennie半流動培地に接種し培養した。アセチレン還元活性のあった試験管から、 Nutrient Agar培地に植菌して、シングルコロニーを単離した。

単離したシングルコロニーの菌株を栽培イネに接種し、いもち病に対する抵抗性評価試験を実施した。その結果、イネに病害抵抗性を付与する細菌の菌株を選抜した。 .

当該菌株を Nutrient Brothで培養し、菌体からゲノム DNAを単離した。単離した DNAを铸型に、 16S rDNA領域のほぼ全長の塩基配列を dyeプライマー法で決定した（配列番号 2)。相同性検索プログラム FASTAを利用し、決定した塩基配列と、 DDBJ/EMBL/GenBank 国際塩基配列データベースとの相同性検索を行った。

当亥菌は Herbaspirillum rubrisbalbicans (Accession No. AF1^7508) と 99. 6。/。相同であった（図 2)。当該菌株の 16S rDNAは既存の種の 16S rDNAと一致しなかった。

当該菌株の基質資化能を検討した。 16S rDNA塩基配列の相同性検索において相同製が高かった、 Herbaspirillum rubrisbalbicans の ATCC19308株と基質資化能を比較した。比較結果を表 2に示す。表中丸印は資化可能であったことを示し、バッ印は資化不能であったことを示す。

表 2 実施例 2で選抜された菌株と Herbaspirillum rubrisubalbicans ATCC 19308株の基質資可能の比較

また選抜された菌株は L -ラムノース以外にもケトグルタル酸ナトリウム、 m-ェリスリトール、セバシン酸 2アンモニゥムを資化する能力を有することがわかつた。

また選抜された菌株は表に示した基質以外にもダルコン酸カリゥム、 n -力プリン酸、アジピン酸、 DL-リンゴ酸、クェン酸ナトリウム、酢酸フヱニル、白糖を資化することができなかった。

以上の結果から、選抜された菌株は Herbaspirillum属に属する細菌の新規株であると結論づけた。

本発明者らは Herbaspirillum属新規細菌を、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（千葉県木更津巿かずさ.鎌足 2- 5-8)に 2006年 2月 10 日付で受託番号 NITE BP - 193として寄託した。

実施例 3

Nested- PCR法を用いた Azospirillum属新規細菌及び Herbaspirillum属新規細菌の検出

Azospirillum属新規細菌又は Herbaspirillum属新規細菌が感染しているか否かが不明の植物において、これらの菌の感染の有無を検出する方法を検討した。そして、以下に示す通り、 Nested-PCR法が有効であることが明らかとなった。

Azospirillum 属新規細菌及び Herbaspirillum 属新規細菌で、 16SrDNA と 23SrDNA間の ITS領域の塩基配列を決定した。 Azospirillum属新規細菌の ITS領域の塩基配列を配列番号 3に、 Herbaspirillum属新規細菌の ITS領域の塩基配列を配列番号 4にそれぞれ示す。

各菌株の ITS領域の塩基配列と、 DDBJ/EMBL/GeneBank 国際塩基配列データべ一スに登録されている近縁及ぴ遠縁の 6〜 7 細菌の ITS 領域塩基配列とを多重整列プログラム ClastalW を利用して比較し、 ITS 領域を増幅させるプライマー 2 セットを、他の細菌と相同性の低い領域で作製した（図 3、表 3)。

Azospirillum属新規細菌接種植物、 Xは Herbaspirillum属新規細菌接種植物の、成長点付近を取り、生理食塩水を加え、乳鉢、又はビーズによる細胞破砕装置で出来る限り細かく破砕した。その破砕液から DNA を抽出した。 DNA溶液を铸型とし表 4及び 5に示した条件で、プライマーセット 1 による PCR (第 1の PCR)、次にその PCR溶液を铸型とした、更に内側のプライマーセット 2 による PCR (第 2の PCR) を行い、目的 DNA 断片の検出を検討した。

Azospirillum属新規細菌接種植物では、プライマーセット 1 による PCR増幅断片のサイズは 4δ4 bpであり、プライマーセット 2 による PCR増幅断片のサイズは 2⁹8 bpであった。 Herbaspirillum属新規細菌接種植物では、プライマーセット 1 による PCR増幅断片のサイズは 356 bpであり、プライマーセット 2 による PCR増幅断片のサイズは 241 bpであった。

以上の結果から、検査対象の植物体からの試料に対して表 3に示すプライマーセットを用いた Ne sted-PCR法を行い上記サイズの増幅断片が得られた場合に、増幅断片サイズに対応するエンドフアイト（Azospirillum 属新規細菌又は Herbaspirillum属新規細菌）が感染していると結論づけることができることが明らかとなつた。表 3

96一* .· k r 49 _

nest 4 5' - GTCGCCTTGTGGGCTTGC 18

Herb aspuillum nest 1 GCGGTCCGTGACACAA - 3' 63.34 16 nest 2 CAAGGTCACTGACTGGCTACTG - 3' 63.76 22 nest 3 ^ 55 & CAGTACGTCTTGCGTTTTGTG - 3' 63.20 21 nest 4 CGCAAGAACCaAAGTCCT 一 3' 62.99 18

AzospiHllum属新規細菌の第 1の PCRの条件

温度 (°C)_時 L (秒）サイクル数

94 30 1

94 30 40

68 30

72

16 οο

Azospirillum厲新規細菌の第 2の PCRの条件

温度（°C) 時間（秒）サイクル数

94 10 1

0 40

0

16 ∞

表 5

Herbaspirillum属新規細菌の第 1の PGRの条件

温度（°C)_ 時間（秒）サイクル n

94 30

66 20

+

L 72 1 2

16 oo

Herbaspirillum孱新規細菌の箄 2の PCRの条件

温度（°C) 時間（秒）サイ _クル数

実施例 4

ELISA法を用いた Azospirillum属新規細菌及び Herbaspirillum属新規細菌の検出

実施例 3に示す方法の外に、 Azospirillum属新規細菌又は Herbaspiri llum属新規細菌が感染しているか否かが不明の植物において、これらの菌の感染の有無を検出する方法を検討した。そして、 ·以下に示す通り、 ELISA 法が有効であることが明らかとなった。

ELISA法のために Azospirillum属新規細菌、 Herbaspiri llum属新規細菌に対するポリクローナル抗体を以下の方法で作製した。 Azospirillum属新規細菌及ぴ Herbaspirillum属新規細菌をホルマリン処理し、抗原菌体液を調製した。それぞれゥサギ背部に 3〜4 X 10⁸ 細胞ずつ免疫した。ェマルジヨン作製は、初回はフ口イントコンプリートアジュバント、 2 回目からはフロイントインコンプリ一ト' アジュバントを使用し 2週間間隔で免役した。 6回,免疫後に全採血し、ゥサギ抗 Azospirillum属新規細菌血清、ゥサギ抗 Herbaspirillum属新規細菌血清を調製した。

Azospirillum属新規細菌又は Herbaspirillum属新規細菌を接種した植物体に生理食塩水を加え、乳鉢、又はビーズによる細胞破砕装置で出来る限り細かく破砕した。破砕液を弱く遠心し、大きな植物残さを除き、上記ポリクローナル抗体を用い常法の ELISA に供試した。

植物破砕液をマイクロタイタープレートに注入し、菌体を壁に吸着させ、洗浄後に、 10 万倍希釈した上記ポリクローナル抗体を反応させた。コントロールとして、無接種植物の破砕液、既知量の菌体を同時に供試した。洗浄後、パーォキシデース標識された二次抗体（抗ゥサギ抗体）を反応させ、パーォキシデースによる色素生成反応後に吸光度を測定した。

その結果、 Azospirillum属新規細菌又は Herbaspirillum属新規細菌接種植物サンプルでは無接種植物サンプルより吸光度が上昇し、接種菌（Azospirillum属新規細菌又は Herbaspirillum属新規細菌）が感染していると結論づけることができることが明らかとなった。また、コントロールと比較することにより植物中の定着菌数の推定が可能であった。 .

実施例 5

イネにおける、 Azospirillum属新規細菌及び Herbaspirillum属新規細菌のイネいもち病に対する病害抵抗性誘導効果

(目的）

本実施例では Azospirillum属新規細菌又は Herbaspirillum属新規細菌（以下両菌株の総称として「ェンドフアイト」 'というこどがある）に感染したイネ（Oryza sativa Nipponbare を用レヽてィネレヽもち g (Magnaporthe grisea race 007)にスナする病害抵抗性誘導効果について検証した。イネは単子葉植物のモデル植物である。

(実験方法）

1. イネは 3葉期にセルシート（1区画 2 cm X 2 cmにイネ幼苗 5株）から 1%肥料溶液中での水耕栽培に移植した。 3. 5葉に生育したイネに 2種類のェンドファィト調製液をそれぞれ 10⁵〜10⁹CFU/mlになるように灌注処理した。エンドフアイト処理 5日後にいもち病菌の胞子懸濁液（0. 2% Tween 20添力 B)を嘖霧接種し、暗黒下、湿度 100%の条件下に 24時間静置した後、 25°C、湿度 60%の温室でさらに

4 日間栽培した。いもち病菌接種 5 日後に、第 4葉に出現したいもち病の病斑数を計測した。各処理区における病斑数を比較し、いもち病抵抗性を評価した。

2. 上記の方法を用いて、処理期間を 5日と 10日に設定し、エンドフアイトの処理期間がいもち病抵抗性に及ぼす影響について解析した。

なお、表 7に示した Benzisothiazole (BIT)は抗イネいもち病農薬プロべナゾールの活性代謝物である。 BIT 0. 5mg/potを処理したイネは強いイネいもち病抵抗性を誘導する。本実験ではエンドフアイト処理区のいもち病抵抗性誘導効果を比較するポジティブコントロールとして BIT処理区を設けた。

3. 栄養条件がエンドフアイト誘導性の病害抵抗性に及ぼす影響について検討するために、肥料濃度を 0. 5%、 0. 75%、 1 %の 3段階設定し、 3葉期のイネを移植した。 2日後にエンドフアイト懸濁液を処理し、 5日後にいもち.病菌を接種し、いもち病抵抗性を評価した。

(結果)

Azospirillum属新規細菌及ぴ HerbasRirillum属新規細菌の 10⁸CFU/m 処理区においていもち病菌に対する防除価はそれぞれ約 52%、 55%であった（表 6)。また、いもち病抵抗性誘導効果にはエンドフアイトの処理期間（5日と 10日）による差は認められなかった（表 7)。 0. 5%肥料溶液の処理区では、エンドフアイトが誘導する病害抵抗性が認められなかったが、栄養が十分に存在する 0. 75%と 1%肥料溶液の条件では、ェンドフアイトの耐病性付与効果が認められた（表 8)。

表 6

Azospirillum菌濃度 (cfii/ml) 無処理区に対する防除価

10⁵ 39%

10⁶ 40%

10⁷ 30%

10^s 52%

1が 37%

Herbaspirillum菌濃度 (cfii/ml) 無処理区に対する防除価

10⁵ 40%

10⁶ 39%

10⁷ 23%

10⁸ 55%

1が 22%

表 7 処理区処理期間無処理区に対する防除価

BIT 5 day 81%

Azosoirillum 10⁸ (cfii/ml) 5 day 59%

Azoscirillum 10" fciu/ml) 10 day 58%

Herbaspirillum 10⁸ (cfii ml) 5 day 30%

Herbaspirillum 1が (cfu/ml) 10 day 38%

表 8 処理条件 ' 肥料濃度無処理区に対する防除価

Azospmllum 10^s (cm/ml) 10 day 0.5% 0%

0.75% 31%

1.0% 33%

Herbaspirillum 10⁸(cfu/ml> 10 day 0.5% 0%

0.75% 33%

1.0% 39%

実施例 6

シロイヌナズナにおける、 Azospirillum属新規細菌又は Herbaspirillum属新規細菌の細菌性病害に対する病害抵抗性誘導効果

(目的） . .

本実施例ではェンドフアイトに感染したシロイヌナズナ（Arabidopsis thai i ana Col-0)を用いてシロイヌナズナに罹病性の病原性バクテリァ

(Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000) に対する病害抵抗性誘導効果につレ、て検証した。シロイヌナズナは双子葉植物のモデル植物である。

(実験方法）

シロイヌナズナの種子を 70°/。エタノールで 20秒間、 1%次亜塩素酸水溶液で 5 分間処理して滅菌後、滅菌した蒸留水で 20分、 3回洗浄した。オートクレーブ滅菌（121°C、 40分）した園芸培土（Kureha) を入れたプラスチック容器（5x5x5 cm) に滅菌した種子を約 20粒ずつ播種し、人工気象器内で、温度 21° (：、湿度 60%、 16時間明 /8時間暗の条件下で栽培した。

1) エンドフアイト処理濃度が病害抵抗性誘導効果に及ぼす影響

播種後 4週間目のシロイヌナズナに Azospiri llum属新規細菌調製液を 10⁶〜 10⁸CFU/mlになるように権注処理した。エンドフアイト処理 5日後に Pst DC3000 (1 X 10⁷ CFU/ml)を接種し、 5日後に葉の病徴をコントロールと比較した。

2) エンドフアイト処理期間が病害抵抗性誘導効果に及ぼす影響

播種後 3 週間目のシロイヌナズナに Azospiril um 属新規細菌.と Herbaspirillum属新規細菌の菌懸濁液をそれぞれ 10⁷ CFU/mlになるように灌注処理した。エンドフアイト処理 10 日後と 15 日後に Pst DC3000 (1 X 10⁷ CFU/ml)を接種し、 5日後に葉の病徴をコントロールと比較した。

3) エンドフアイト処理が PstDC3000の増殖に及ぼす影響

播種後 3週間目のシロイヌナズナに上と同じように菌懸濁液をそれぞれ 10⁷又は 10⁸ CFU/mlになるように灌注処理した。処理後 15 日後に Ps DC3000 (2 X 10⁵ CFU/ml)を接種し、 3 日後の葉を回収し、 10mM MgCl₂中で磨砕した。磨碎液を三段階に希釈し、 NB平板培地（rifanpicin 50 mg/1)に塗布した。 28度でニ晚培養後、コロニーをカウントして植物体内での菌の増殖率を数値化した。

(結果）

1) Azospirillum属新規細菌を 10⁶から 10⁸ CFU/ml で処理した結果、エンドファィト処理濃度が高いほど Pst DC3000の病徴を抑制する傾向が認められた（図 4)。

2) Azospirillum属新規細菌処理区では処理期間が長い方が Pst DC3000の病徴抑制効果が高い傾向が観察された。

Herbaspirillum属新規細菌処理区では処理期間が異なっていても Pst DC3000 の病徴抑制効果に差はほとんど認められなかった（図 5)。

3) 植物体内における Pst DC3000の増殖を測定したところ、コントロールに比べてエンドフアイト処理区で Pst DC3000の増殖が抑制された。処理したエンドファイトは 10⁸ CFU/mlより 10⁷ CFU/mlの'方が病原菌増殖抑制効果が強かった（表 9)。

表 9 処理区無処理区に対する防除価

Azospirillum 10 (ctu/ml) 15 day 82%

Azospinllum 10⁸ (cfu ml) 15 day 42%

Herbaspirillum 10⁷ (cfu/ml) 15 day 70%

Herbaspirillum 10^B (cfu/ml) 15 day 62%

実施例 7

コマツナにおける Azospirillum属新規細菌の糸状菌性病害に対する病害抵抗性誘導効果

(目的)

エンドフアイトに感染したコマツナを用いて、糸状菌（Albugo macrospora) が引き起こす白さび病に対する病'害抵抗性誘導効果について検証した。

(実験方法）

(1)エンドフアイトの培養及び菌懸濁液調製方法 '

Azospirillum属新規細菌は、 500 ml三角フラスコに入れた NB液体培地 100ml に接種し、 28度で 30時間振とう培養した。遠心分離して菌体を回収し、 10mM MgCl₂ 溶液に懸濁させた後、菌濃度を 1 X 10⁹ CFU/mlになるように調製した。

( 2 ) コマツナ幼苗の栽培とエンドファイト処理

コマツナ（品種：夏楽天（タキイ種苗））を 200穴のセルトレイ（用土は clay_SOil、量は 20raL/穴）に 1株ずつ植えて温室内で栽培した。播種 4 日後の苗の根本にェンドフアイト菌液を終濃库が 5xl0⁷CFU/mlになるように処理した。温室内で 2週間栽培を継続した後、屋外の圃場に定植（株間 5cm、条間 15cm) した。

( 3 ) 白さび病の発病と調查

定植後 2週間後から白さぴ病の発病が観察され、定植後 Q週間後に発病程度を調査した。発病度は、甚（5)、多 (4)、中（3)、小（2)、極微（1)の 5段階で評価し、統計処理後発病度（％) を算出した。

(結果） +

エンドフィト無処理区の発病度 21. 8に対して、 Azospirillum属新規細菌処理区では 18. 8であり有意に低下していた。したがって、 Azospirillum属新規細菌処理はコマツナに白さび病抵抗性を誘導することが示された。

表 1 0

白さび病発病度

処理区発病度

Azospirillum員 f 夫見糸田 18. 8 a

対照 21. 8 b 産業上の利用可能性本発明により、宿主植物に病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウィルスによる病害に対する耐性を付与する能力を有する細菌、該細菌を用いた、植物における病害の防除方法、並びに、該方法により作出された病害耐性を有する植物が提供される。 '

本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるもめとする。 ·

Claims

請求の範囲

1 . . Azospirillum属又は Herbaspirillum属に属し、植物体内に共生して宿主植物に病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウィルスによる病害に対する耐性を付与する能力を有する細菌を、植物に人為的に感染させる工程を含む、植物における病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウィルスによる病害の防除方法。

2 . 前記細菌が Azospirillum属新規細菌（受託番号 NITE BP- 194)、及ぴ Herbaspirillum属新規細菌（受託番号 NITE BP- 193)、並びにそれらの変異株からなる群から選択される少なくとも 1種である、請求項 1記載の方法。

3 . 前記植物がイネ科又はアブラナ科に属する植物である、請求項 1又は 2 記載の方法。

4 . 細菌の植物への感染が植物の栄養成長期に行われる、請求項 1〜 3のいずれか 1項記載の方法。， .

5 . Azospirillum属又は Herbaspirillum属に属し、植物体内に共生して宿主植物に病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウィルスによる病害に対する耐性を付与する能力を有する細菌を有効成分として含有する、植物における病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウィルスによる病害の防除剤。

6 . 前記細菌が Azospirillum属新規細菌（受託番号 NITE BP- 194)、及び Herbaspirillum属新規細菌（受託番号 ITE BP 193)、並びにそれらの変異株からなる群から選択される少なくとも 1種である、請求項 5記載の防除剤。

7 . Azospirillum属新規細菌（受託番号 NITE BP- 194) 又はその変異株であつて植物体内に共生して宿主植物に病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウィルスによる病害に対する耐性を付与する能力を有する変異株。

8 . Herbaspirillum属新規細菌（受託番号 NITE BP-193) 又はその変異株であって植物体内に共生して宿主植物に病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウイルスによる病害に対する耐性を付与する能力を有す.る変異株。

9 . Azospirillum属新規細菌（受託番号 NITE BP-194)、及び Herbaspirillum 属新規細菌（受託番号 NITE BP- 193)、並びにこれらの変異株であって植物体内に共生して宿主植物に病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウィルスによる病寄に対する耐性を付与する能力を有する変異株からなる群から選択される少なくとも

1種が人為的に感染された、病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウィルスによる病害に対する耐性を有する植物。