CN113736685B - 一种复合菌群的构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物菌种构建复合功能菌群的生物技术领域，具体涉及一种复合菌群的构建方法，包括以下步骤：分析健康植株与患病植株的微生物群落差异，得到丰度显著富集的细菌属与丰度显著下降的细菌属；根据植株的根系菌库及促生、抗病特性，筛选与丰度显著富集的细菌属匹配的细菌，混合得到合成群落S1；按同样的方法筛选丰度显著降低的细菌，混合得到合成群落S2；将S1、S2接种到植株中，得到促生与抗病效果最佳的最优合成群落；将最优合成群落接种到植株根系中，筛选出成功定殖在植株根系内的菌种，混合，即得复合菌群。本发明提供的复合菌群的构建方法得到的抗黄芪根腐病的复合菌群能够显著促进黄芪的生长，并有效抑制病原菌繁殖。

Description

一种复合菌群的构建方法
技术领域
本发明属于微生物菌种构建复合功能菌群的生物技术领域，具体涉及一种复合菌群的构建方法。
背景技术
微生物在自然界中是以群落的形式存在，根据特定的共性，聚集为不同的功能类群。而不同微生物在其所处的功能类群或群落里并不是各自独立地凑在一起，通常会通过资源竞争、营养共生、群体感应等各种复杂的相互作用机制形成一个复杂的生态系统，因此难以利用这些群落来进行可重复、可控的实验。目前实验室里通常基于某一功能菌来研发菌剂或采用“自下而上”的方式构建合成菌剂，如专利号为CN112574895A的“一种哈茨木霉菌、微生物菌剂及其应用”公开的一种用于防治葡萄霜霉病的菌剂有效成分为哈茨木霉菌，专利号为CN110564637A的“一种促进小麦生长的复合菌剂及应用”则采用了“自下而上”的方式构建了菌剂。
随着高通量测序技术的发展，近年来科学界对微生物群落在不同环境下的多样性有了一定程度的了解，微生物群落在改善土传病害、人类健康、农业生产与环境污染等方面显示出巨大的应用潜力。基于此，通过“自上而下”的方式构建复合菌群成为了可能，而从这一角度出发，尚没有一种成熟的理论模型作为指导，开发具有良好重复性与稳定性的复合菌群。
现有的依据“自下而上”的方式构建菌剂产品虽然过程简单，但存在一些明显的弊端：一、通常取一非本土的功能菌剂应用于田间(芽孢杆菌属、木霉菌属等成员)，长期施用易导致田间生态失衡；二、单一菌株难以适应田间复杂的环境，某些在实验室能发挥作用的菌株在田间则达不到理想效果；三、单一菌株功能有限，抗菌谱较窄；四：采用“自下而上”的方式构建菌群虽简单，但效率较低，有时几株功能菌的叠加并不会起到加强菌群功能的作用，反而会消减单接菌原有的功效。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是依据植株本土的微生物群落结构特点，根据菌株的促生与抗病特性，选择从植株根内与根际分离到的细菌，构建一个具有良好稳定性且能促生、抗病的复合菌群，避免由于长期使用单一菌剂引发的田间生态失衡问题。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供的复合菌群的构建方法，包括以下步骤：
分析健康植株与患病植株根系的微生物群落差异，得到患病植株根内丰度显著富集的细菌属与丰度显著下降的细菌属；
查找该植株的根系菌库，筛选出与所述丰度显著富集的细菌属匹配的细菌属，再从所述匹配的细菌属中筛选出具有促生、抗病特性的细菌，将筛选得到的所述细菌等量混合得到合成群落S1；按同样的方法筛选出在患病植株根内丰度显著降低的细菌，将这些菌等量混合后得到合成群落S2；
将所述合成群落S1、所述合成群落S2分别接种到植株根部，筛选出促生与抗病效果最佳的最优合成群落；
将所述最优合成群落接种到植株根系中，筛选出成功定殖在植株根系的菌种，混合，即得所述复合菌群。
优选地，所述微生物群落差异分析是提取植株根内及根系土壤的总DNA，扩增植株根内细菌及根系土壤细菌后，测序，得到健康植株与患病植株根系的微生物群落的丰度值。
更优选地，根据所述丰度值得到相对丰度比，确定相对丰度阈值，再根据所述相对丰度阈值得到患病植株根内丰度显著富集的细菌属与丰度显著下降的细菌属。
优选地，所述植株为黄芪。
优选地，所述丰度显著富集的细菌属为39个；所述丰度显著下降的细菌属为137个。
优选地，所述促生是具有产IAA、溶无机磷、溶有机磷或解钾的特性；所述抗病是抗黄芪根腐病。
本发明还提供一种根据上述构建方法得到的复合菌群，所述复合菌群是由Stenotrophomonas maltophilia CCNWHYBXL-13、Agrobacterium CCNWDCBXLAMB-100、Ochrobactrum pecoris CCNWDCBXLAMB-306与Advenella kashmirensis CCNWDCBXLAMB-316等量混合得到，且该四种菌的保藏编号依次为CCTCC M 2021393、CCTCC M 2021394、CCTCC M 2021395、CCTCC M 2021396。
上述复合菌群能够用于抗黄芪根腐病。
优选地，所述黄芪根腐病是由病原真菌Fusarium oxysporum引起的。
对比现有技术，本发明的有益效果为：
1、根据患根腐病黄芪根内细菌群落差异分析的结果，从患病黄芪根内富集的13个属中各选择了1株菌，菌液浓度均调为1×108cfu/mL，等体积混合，得到S1(合成群落1)；选择在患病黄芪根内丰度显著降低的13株细菌等量混合，得到S2(合成群落2)。
2、由于S1菌群具有良好的抗病与促生作用，通过16S rRNA扩增子的全长测序，得出S1合成菌群中最终定殖于黄芪根系的菌株仅有4株，将这4株菌等量混合，得到最终的复合菌群FC。
3、与单接菌CCNWHYBXL-13、CCNWDCBXLAMB-100、CCNWDCBXLAMB-306和CCNWDCBXLAMB-316相比，通过本发明构建的复合菌群FC对根腐病的防治效果(使发病率降低了41.24％)优于所有单接菌。
4、复合菌群FC显著促进了黄芪的生长，其中，使黄芪株高增长了23.63％，使黄芪根长增长了49.17％，使黄芪鲜重增加了36.19％，使黄芪干重增加了10.19％，使黄芪叶绿素含量增加了19.45％。
5、本发明筛选出的抗黄芪根腐病的复合菌群针对性强，优化了黄芪根系微生态平衡，抑制了病原菌的繁殖。
6、本发明提供的构建方法具有普适性，可有效减少复合菌群的构建时间，同时节约人力物力财力的成本消耗，且可为酿酒、污水处理等其他行业的复合菌群构建提供理论依据。
生物保藏说明：
生物材料：
CCNWHYBXL-13；分类命名：嗜麦芽窄食单胞菌(拉丁文名称：Stenotrophomonasmaltophilia)；
CCNWDCBXLAMB-100；分类命名：土壤杆菌(拉丁文名称：Agrobacterium sp.)；
CCNWDCBXLAMB-306；分类命名：苍白杆菌(拉丁文名称：Ochrobactrum)；
CCNWDCBXLAMB-316；分类命名：克什米尔小陌生菌(拉丁文名称：Advenellakashmirensis)；
以上4株菌均于2021年4月19日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，CCNWHYBXL-13、CCNWDCBXLAMB-100、CCNWDCBXLAMB-306与CCNWDCBXLAMB-316的保藏编号分别为CCTCC M 2021393、CCTCC M2021394、CCTCC M 2021395、CCTCC M 2021396，保藏地址为中国·武汉·武汉大学。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施过程与菌群功效，下面将对实施过程中所需要使用的附图作简单介绍。
图1是实施例1中丰度前40的细菌属在患病黄芪根际、健康黄芪根际、患病黄芪根内、健康黄芪根内的丰度差异图；
图2是实施例2中初步构建的两个复合菌群S1与S2的功效对比；其中：a-f，复合菌群S1、S2分别对黄芪干重、鲜重、根长、株高、叶绿素含量以及根腐病发病率的影响；
图3是实施例3中复合菌群FC的功效验证；其中：a-f，合成菌群S1、S2与复合菌群FC分别对黄芪干重、鲜重、根长、株高、叶绿素含量以及根腐病发病率的影响；
图4是实施例3中复合菌群FC与其4个菌株成员的功效比较；其中：a-f，复合菌群FC与其4个菌株成员分别对黄芪干重、鲜重、根长、株高、叶绿素含量以及根腐病发病率的影响。
具体实施方式
本发明提出一种能够高效构建复合菌群的方法。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细描述：
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
甘肃患病黄芪根系微生物群落分析
(1)土壤样品采集：
2018年8月从甘肃省黄芪种植基地选择三块一年生黄芪地块(N3415.123′；e10409.727’)，每块地中随机选择健康黄芪与患根腐病黄芪，并采集每株黄芪对应的根际土壤与根。
提取黄芪根与根系土壤的总DNA，使用引物515F(GTGCCAGCMGCCGCCG)/907R(CCGTCAATTCMTTTRAGTTT)扩增土壤细菌16S rRNA的V4-V5区域，使用引物799F(AACMGGATTAGATACCCKG)/1193R(ACGTCATCCCCACCTTCC)扩增黄芪根内细菌16S rRNA的V5-V7区域，使用ITS1F引物(CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA)/ITS2R(GCTGCGTTCTTCATCGATGC)扩增真菌的ITS区域，并在美吉生物医药科技有限公司的Illumina MiSeq PE300平台上对其进行测序。根据测序结果对健康黄芪与患病黄芪根系微生物群落差异进行了分析。
(2)患病黄芪根系微生物群落分析
在R v3.6.0(R Software Foundation,Vienna,Austria)环境下，对健康黄芪与患病黄芪根系微生物群落进行了差异分析。
结果如图1所示，健康黄芪根和患病黄芪根内的细菌群落明显不同(相对丰度越高，则越接近黑色；相对丰度越小，则越接近灰色)。将相对丰度比为2作为阈值，发现有39个细菌属在患病黄芪根内富集，如Pseudomonas、Strenotrophomonas、Chryseobacterium、Achromobacter和Flavobacterium等；137个细菌属在患病黄芪根内减少，如Pantoea、Parablastomonas和Microbacterium等。
实施例2
复合菌群构建方法
1、复合菌群初步构建
1.1、复合菌群筛选
从上述微生物群落差异分析中得出，有39个细菌属在患病黄芪根内的相对丰度比健康株中高2倍以上。查询本实验室黄芪菌库，发现患病黄芪根内富集的13个细菌属具有较强活性，其中每个属中有2～8个种。在同属中选择一株具有1种或同时具有几种表1所示特性的菌株(该特性是指具有F.oxysporum拮抗性、产IAA、溶无机磷、溶有机磷、解钾特性)，有些细菌属的全部菌株均无促生或抗病特性，则随机选择一株细菌。
由表1所示，本研究从上述的13个属中各选择了1株菌，将所述13株细菌的菌液浓度均调为1×108cfu/mL，等体积混合后得到S1(合成群落1)。
选择在患病黄芪根系丰度显著降低，且具有抑制根腐病病原菌Fusariumoxysporum与促生特性的13株细菌等量混合，得到S2(合成群落2)，作为加菌对照组，如表1所示。
表1 S1和S2中的细菌特性
Figure BDA0003148510080000081
Figure BDA0003148510080000091
1.2、复合菌群对黄芪的促生特性
分别将S1、S2(有菌对照组)与无菌水(无菌对照组)接种到正在生长的黄芪种植袋中，并在所有种植袋中接种病原真菌Fusarium oxysporum。接种病原真菌Fusariumoxysporum后第24天统计黄芪根腐病发病率和死亡率。在黄芪生长24d后，对所有植物进行收样，测定S1与S2合成菌群对黄芪根长、株长、鲜重和干重等生长指标的影响。
植物实验结果表明，在黄芪生长24d后，S1处理组黄芪的干重、鲜重、根长、株高均显著高于接种无菌水的对照组和S2处理组。其中S1处理组黄芪的干重分别比接种无菌水的对照组和S2处理组高44.45％和30％，如图2a所示。S1处理组黄芪的鲜重分别比对照组和S2处理组高33.33％和20％，如图2b所示。S1处理组黄芪的根长分别比对照组和S2处理组高92.2％和54.61％，如图2c所示。S1处理组黄芪的株高分别比对照组和S2处理组黄芪高34.43％和20.56％，如图2d所示。S1、S2处理组和对照组黄芪间的叶绿素含量没有显著差异。
1.3、复合菌群的抗病作用
在S1和S2处理组黄芪播种后的第12天，往种植袋中接种Fusarium oxysporum。由图2f可知，S1和S2处理组黄芪的根腐病发病率显著不同，S1显著降低了黄芪根腐病的发病率。接种病原菌Fusarium oxysporum的第24天，S1处理组黄芪的平均发病率比对照组低26.79％。而S2则与对照组无显著差异。
综上，在患病黄芪根内显著富集的S1菌群能够降低黄芪的根腐病发病率，且具有一定的促生作用。
2、复合菌群优化
上述S1菌群具有良好的抗病与促生作用，为了确定其在温室条件下，哪些细菌经过植物-微生物相互作用成功定殖于黄芪根系并在根际或根中发挥功能，于是将S1接种到黄芪幼苗中，30天后收集植物样，提取DNA，并在北京诺禾致源生物信息科技有限公司的PacBio平台上完成16S rRNA扩增子的全长测序，以探究S1菌群的13株细菌中哪些能被检测到。
16S rRNA全长测序结果表明，S1合成菌群的13个菌株成员中，最终定殖于黄芪根际或根内的菌株仅有4株。所述4株菌分别为CCNWHYBXL-13、CCNWDCBXLAMB-100、CCNWDCBXLAMB-306和CCNWDCBXLAMB-316，继续将这4株菌等量混合，得到最终的复合菌群FC。
实施例3
复合菌群FC功效验证
1、分别将合成菌群S1、S2和FC接种于黄芪种植袋中，探究FC抗根腐病的功效是否由于菌株成员的减少而有所损耗。
结果如图3所示，接病原菌15天后，S1和FC处理组中患病幼苗数量显著低于接无菌水的对照组和S2处理组的植物；其中FC处理组黄芪中患病幼苗数显著低于S1处理组，FC对根腐病的防治效果(使发病率降低了79.49％)优于S1(使发病率降低了56.41％)。此外，FC促进黄芪株高(使株高增长4.3％)效果优于S1(使株高增长2.98％)，促进黄芪根长(使根长增长30.95％)效果优于S1(使根长增长28.4％)，促进黄芪鲜重(使鲜重增长64.09％)效果优于S1(使鲜重增长47.01％)，促进黄芪干重(使干重增长9.09％)效果优于S1(未明显促进干重增加)。FC未明显促进黄芪叶绿素含量增加。说明优化菌群FC的促生与抗病功效优于S1。
2、分别将FC菌群与FC成员CCNWHYBXL-13、CCNWDCBXLAMB-100、CCNWDCBXLAMB-306和CCNWDCBXLAMB-316接种到黄芪种植袋中，以探究FC菌群抗黄芪根腐病能力是否优于单接菌。
结果如图4所示，接种病原菌的第20天，FC与CCNWDCBXLAMB-316处理组均显著降低了黄芪根腐病的发病率，其中FC对根腐病的防治效果(使发病率降低了41.24％)优于所有单接菌。此外，FC菌群显著促进了黄芪的生长，其中，使黄芪株高增长了23.63％，使黄芪根长增长了49.17％，使黄芪鲜重增加了36.19％，使黄芪干重增加了10.19％，使黄芪叶绿素含量增加了19.45％。
由以上结果可知，由本发明构建的复合菌群FC防治黄芪根腐病的效果最好，同时也具有良好的促生效果。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (3)

1.一种用于抗黄芪根腐病的复合菌群，其特征在于，所述复合菌群是由Stenotrophomonas maltophilia CCNWHYBXL-13、Agrobacterium CCNWDCBXLAMB-100、 Ochrobactrum pecoris CCNWDCBXLAMB-306与 Advenella kashmirensis CCNWDCBXLAMB-316等量混合得到，且该四种菌的保藏编号依次为CCTCC M 2021393、CCTCC M 2021394、CCTCC M 2021395、CCTCC M 2021396。
2.一种权利要求1所述的复合菌群在抗黄芪根腐病中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述黄芪根腐病是由病原真菌Fusarium  oxysporum引起的。
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