CN116179434A - 高效稳定的硫氧化脱氮工程微生物组构建方法及应用 - Google Patents

高效稳定的硫氧化脱氮工程微生物组构建方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了高效稳定的硫氧化脱氮工程微生物组构建方法及应用。本发明根据“自上而下”的随机稀释富集为导向，通过“自下而上”的菌株复配获得高效稳定的具有硫氧化脱氮功能的工程微生物组，能在废水处理系统和污染水体或者沉积物中氧化去除硫化物，同时实现脱氮，为废水处理和污染水体或者沉积物修复提供工程微生物制剂，同时该研究将为应用于废水处理和污染水体或者沉积物修复提供理论指导。

Description

高效稳定的硫氧化脱氮工程微生物组构建方法及应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及高效稳定的硫氧化脱氮工程微生物组构建方法及应用。
背景技术
微生物在工业、农业、医药和环境等人类生产生活的各个领域都发挥着重要的作用。微生物主要以群落的方式存在于各类环境中，不同的微生物之间形成复杂多样的相互作用关系，有代谢上的相互依赖，也有物种之间的资源竞争。这些相互作用关系影响着微生物群落的功能及其稳定性。因此，微生物之间的相互作用关系是构建高效稳定微生物群落的重要理论依据。
目前，工程微生物组的构建主要有“自上而下”富集、“自下而上”从头合成、以及将两者整合等三种类型的方法。“自上而下”富集的方法主要受自然选择和随机性因素决定；而“自下而上”从头合成的方法主要依据不同物种的功能特征进行理性组合，具有较高的可控性；两者的结合是理性地通过物种功能信息，以“自上而下”为参考，构建出与自然一致的群落。但是，目前仍不清楚“自上而下”与“自下而上”这两种方法所构建的微生物组之间的差异，尚不了解哪种方法可以获得更加高效稳定的微生物群落。
硫氧化脱氮微生物在自然界中广泛存在，对氮的去除和硫化物的氧化解毒起着重要作用。因而，硫氧化脱氮菌也被广泛应用到各种环境污染治理工程中进行脱氮和硫化物的解毒，对提高处理效率和降低能耗具有重要作用。然而，目前仍缺乏相关的微生物菌种资源，还未能充分利用和发挥这类微生物的功能作用。
发明内容
本发明的目的在于提供高效稳定的硫氧化脱氮工程微生物组的构建方法和高效稳定的硫氧化脱氮工程微生物组在硫氧化脱氮中的应用。
为实现上述目的，本发明的高效稳定的硫氧化脱氮工程微生物组构建方法，包括以下步骤：
(1)使用硫氧化脱氮培养基对环境样品进行多组随机稀释，使硫氧化脱氮微生物不同的组合随机分配到不同的培养体系中；
(2)对(1)中的随机群落进行富集和传代培养，并测定培养体系中底物的变化，初步鉴定其硫氧化脱氮功能活性；
(3)将富集获得的随机群落按照一致的生物量，分别接种到新鲜的硫氧化脱氮培养基中，测定底物的变化情况，表征不同样品的潜在硫氧化脱氮活性特征；
(4)提取随机群落经富集后的总DNA，通过引物扩增16S rRNA基因V4-V5区，并进行高通量测序，分析样品中的微生物结构组成；
(5)根据不同样品群落中的物种组成，分析不同物种之间的相互作用关系及其与群落功能和稳定性的关系；
(6)利用选择培养基对群落中的关键物种进行分离培养，测定其基因组，并分析其基因组中与硫氧化脱氮相关的基因组成；
(7)根据步骤(4)的物种相对丰度组成、步骤(5)中的互作关系，以及步骤(6)中物种的基因组特征，将分离获得的不同物种合成微生物群落，接种到硫氧化脱氮培养基中测定群落功能特征；
(8)通过比较富集群落和合成群落的硫氧化脱氮功能特征，得到高效稳定的硫氧化脱氮工程微生物组。
优选，所述的硫氧化脱氮培养基每升包括2g KNO3、1g Na2S·9H2O、1g NaHCO3、2gK2HPO4、0.1g MgCl2和1000ml H2O。
优选，所述的环境样品包括但不限于一种类型，可以是土壤、沉积物和水体等。
优选，所述的选择性培养基为根据目标功能微生物对象而设定，不限于一种特定的选择性培养基。
优选，所述的步骤(7)中的合成微生物群落是根据物种之间的相互作用关系，选定有利于群落功能和稳定性的物种组合。
优选，所述的根据物种之间的相互作用关系，是根据物种之间形成代谢分工或代谢物分享而相互促进，避免物种之间的底物竞争和产物拮抗。
优选，所述步骤(7)中的合成微生物群落，是根据所选定物种在富集群落中的相对丰度确定物种的组合比例。
优选，所述的高效稳定的硫氧化脱氮工程微生物组是Thiobacillus与Ciceribacter或Azonexus共存的复配群落。
本发明的第二个目的是提供高效稳定的硫氧化脱氮工程微生物组在硫氧化脱氮中的应用。
优选，高效稳定的硫氧化脱氮工程微生物组在废水处理、废气净化、沉积物修复、土壤治理等环境污染治理工程中硫氧化脱氮方面的应用。
优选，将工程微生物群落制备成菌剂，或者与其他功能微生物和载体材料共同投加到废水处理系统、废气处理系统、污染水体、沉积物或土壤中，进行硫氧化脱氮。
本发明根据工程微生物组的构建理念，结合“自上而下”富集和“自下而上”的合成两种方法，构建出了高效稳定的硫氧化脱氮工程微生物组，能在废水处理系统和污染水体或者沉积物中氧化去除硫化物，同时实现脱氮，为废水处理和污染水体或者沉积物修复提供工程微生物制剂，同时该研究将为应用于废水处理和污染水体或者沉积物修复提供理论指导。
附图说明
图1是实施例1中随机稀释富集群落的功能活性和微生物物种组成特征；
图2是实施例2中分离获得物种的硫氧化和硝酸盐氧化功能特征；
图3是实施例3中分离获得物种的硫氧化和硝酸盐氧化功能基因组成特征；
图4是实施例5中复配微生物组的硫氧化脱氮功能活性特征。
具体实施方式
下面结合图，进一步通过实施案例对本发明高效稳定的硫氧化脱氮工程微生物组菌群的构建方法及应用进行详细说明。本发明不限于以下实施案例的描述。
实施例1：“自上而下”的随机稀释培养获得不同组合的硫氧化脱氮微生物群落
使用硫氧化脱氮培养基对河道沉积物样品1g进行随机稀释，稀释的倍数包括102～108不等，使1g沉积物中的微生物随机进入稀释群落中。硫氧化脱氮培养基包括2g KNO3、1gNa2S·9H2O、1g NaHCO3、2g K2HPO4、0.1g MgCl2和1000ml H2O。将随机稀释后的样品放置厌氧培养箱中30℃培养，分别在2周和一个月测定底物浓度和生物量变化情况，包括硝酸盐、亚硝酸盐和硫酸盐的浓度。重复两次将具有潜在硫氧化脱氮功能的群落接种到新鲜的硫氧化脱氮培养基中进行富集培养，获得稳定的微生物群落，定义为随机稀释富集群落。进一步按照一致的生物量分别将随机稀释富集群落接种到新鲜的培养基中，通过测定硝酸盐、亚硝酸盐和硫酸盐的浓度来比较随机稀释富集群落的硫氧化脱氮功能活性。
同时，分别提取随机稀释富集群落的总DNA，通用引物对16S rRNA基因的V4-V5区进行PCR扩增和高通量测序，通过Qiime 2流程解析这些随机稀释富集群落的微生物组成特征，并分析微生物群落与硫氧化脱氮功能活性的关系。
结果如图1所示，经过随机稀释富集，获得了36个不同功能特征的微生物群落，其中以Thiobacillus、Ciceribacter、Rhizobium和Azonexus为组合的微生物群落具有较高和稳定的硫氧化脱氮功能特征；而Thiobacillus单独存在时或者与Pseudoxanthomonas等共同存在时，群落的硫氧化脱氮功能较低，且不稳定。
实施例2：群落中硫氧化脱氮微生物的分离培养和功能测定
根据随机稀释富集群落设计固体培养基，对Thiobacillus、Ciceribacter、Rhizobium、Azonexus和Pseudoxanthomonas等相关物种进行分离培养。成功获得了Thiobacillus、Ciceribacter、Azonexus和Pseudoxanthomonas四个菌属的代表菌株。对这些菌株的硫氧化脱氮功能进行测定分析，包括使用硝酸盐为电子受体，硫化物、单质硫和硫代硫酸盐等为电子供体，测定硫氧化和硝酸盐还原功能。结果发现Thiobacillus是唯一能进行硝酸盐还原硫化物氧化的菌属(图2A)。而Ciceribacter、Azonexus和Pseudoxanthomonas具有硝酸盐还原硫代硫酸盐氧化功能(图2B)。其中，Ciceribacter和Azonexus将硫代硫酸盐氧化为硫酸盐，而Pseudoxanthomonas则将硫代硫酸盐氧化为连四硫酸盐(图2B)。
实施例3：功能菌株的基因组测序和功能分析
对这些物种进行基因组测序，发现Thiobacillus、Ciceribacter和Azonexus都具有完整的反硝化基因通路，Pseudoxanthomonas则缺乏反硝化最后一步nosZ基因，说明这些菌株都能通过反硝化将硝酸盐还原为气体，实现脱氮作用。而在硫氧化方面，Thiobacillus具有sat、dsrAB和aprAB等硫化物氧化基因(图3)，该菌的硫代硫酸盐氧化SOX系统缺乏soxCD蛋白(图3)，因此该菌具有硫化物氧化功能，而硫代硫酸盐氧化功能可能有限。Ciceribacter和Azonexus都具有完整的SOX系统进行硫代硫酸盐氧化(图3)。Pseudoxanthomonas则仅含有tst基因进行硫代硫酸盐氧化(图3)，该菌将硫代硫酸盐氧化为连四硫酸盐的基因未能鉴定，可能是一种新的途径。
实施例4：随机稀释富集群落中物种相互作用关系分析
根据文献报道，Thiobacillus在进行硫化物氧化过程会产生硫代硫酸盐中间产物，形成代谢分流，可能不利于硫氧化过程发生。结合菌株的功能活性和基因组分析，Ciceribacter和Azonexus等含SOX系统的物种存在，在硫代硫酸盐氧化方面形成互补，可能有利于硫氧化脱氮功能及其稳定性。而Pseudoxanthomonas则将硫代硫酸盐氧化为连四硫酸盐，加大了代谢分流，使得硫氧化脱氮功能更加不利。因此，Thiobacillus与Ciceribacter和Azonexus共存的群落具有较高的活性和稳定性，而Thiobacillus单独存在或者与Pseudoxanthomonas时功能较弱，且不稳定。
实施例5：“自下而上”的工程微生物组复配
将Thiobacillus分别与Ciceribacter、Azonexus和Pseudoxanthomonas按照随机稀释富集群落中的相对丰度进行复配，其中Thiobacillus的比例为50～90％，其他微生物的比例为10～50％。将复配后的微生物组接种到硫氧化脱氮培养基中，通过测定硝酸盐和硫酸盐来表征硫氧化脱氮功能活性。结果与随机稀释富集群落中的硫氧化脱氮功能活性一致，Thiobacillus与
Ciceribacter和Azonexus共存的复配群落具有较高且稳定的硫氧化脱氮功能活性(图4)；而
Thiobacillus与Pseudoxanthomonas共存的复配群落功能较弱，且不稳定(图4)。

Claims (10)

1.一种高效稳定的硫氧化脱氮工程微生物组构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)使用硫氧化脱氮培养基对环境样品进行多组随机稀释，使硫氧化脱氮微生物不同的组合随机分配到不同的培养体系中；
(2)对(1)中的随机群落进行富集和传代培养，并测定培养体系中底物的变化，初步鉴定其硫氧化脱氮功能活性；
(3)将富集获得的随机群落按照一致的生物量，分别接种到新鲜的硫氧化脱氮培养基中，测定底物的变化情况，表征不同样品的潜在硫氧化脱氮活性特征；
(4)提取随机群落经富集后的总DNA，通过引物扩增16S rRNA基因V4-V5区，并进行高通量测序，分析样品中的微生物结构组成；
(5)根据不同样品群落中的物种组成，分析不同物种之间的相互作用关系及其与群落功能和稳定性的关系；
(6)利用选择培养基对群落中的关键物种进行分离培养，测定其基因组，并分析其基因组中与硫氧化脱氮相关的基因组成；
(7)根据步骤(4)的物种相对丰度组成、步骤(5)中的互作关系，以及步骤(6)中物种的基因组特征，将分离获得的不同物种合成微生物群落，接种到硫氧化脱氮培养基中测定群落功能特征；
(8)通过比较富集群落和合成群落的硫氧化脱氮功能特征，得到高效稳定的硫氧化脱氮工程微生物组。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的硫氧化脱氮培养基每升包括2gKNO3、1g Na2S·9H2O、1g NaHCO3、2g K2HPO4、0.1g MgCl2和1000ml H2O。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的环境样品是土壤、沉积物或水体；所述的选择性培养基为根据目标功能微生物对象而设定，不限于一种特定的选择性培养基。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的步骤(7)中的合成微生物群落是根据物种之间的相互作用关系，选定有利于群落功能和稳定性的物种组合。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述的根据物种之间的相互作用关系，是根据物种之间形成代谢分工或代谢物分享而相互促进，避免物种之间的底物竞争和产物拮抗。
6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(7)中的合成微生物群落，是根据所选定物种在富集群落中的相对丰度确定物种的组合比例。
7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的高效稳定的硫氧化脱氮工程微生物组是Thiobacillus与Ciceribacter或Azonexus共存的复配群落。
8.权利要求1中的高效稳定的硫氧化脱氮工程微生物组在硫氧化脱氮中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，高效稳定的硫氧化脱氮工程微生物组在废水处理、废气净化、沉积物修复、土壤治理等环境污染治理工程中硫氧化脱氮方面的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，将工程微生物群落制备成菌剂，或者与其他功能微生物和载体材料共同投加到废水处理系统、废气处理系统、污染水体、沉积物或土壤中，进行硫氧化脱氮。
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