JPWO2007100162A1 - 新規細菌及びそれを用いた植物病害の防除方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は以下の発明を包含する。
(1)Azospirillum属又はHerbaspirillum属に属し、植物体内に共生して宿主植物に病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウイルスによる病害に対する耐性を付与する能力を有する細菌を、植物に人為的に感染させる工程を含む、植物における病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウイルスによる病害の防除方法。
(2)前記細菌がAzospirillum属新規細菌(受託番号NITE BP−194)、及びHerbaspirillum属新規細菌(受託番号NITE BP−193)、並びにそれらの変異株からなる群から選択される少なくとも1種である、(1)記載の方法。
(3)前記植物がイネ科又はアブラナ科に属する植物である、(1)又は(2)記載の方法。
(4)細菌の植物への感染が植物の育苗期に行われる、(1)〜(3)のいずれかに記載の方法。
(5)Azospirillum属又はHerbaspirillum属に属し、植物体内に共生して宿主植物に病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウイルスによる病害に対する耐性を付与する能力を有する細菌を有効成分として含有する、植物における病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウイルスによる病害の防除剤。
(6)前記細菌がAzospirillum属新規細菌(受託番号NITE BP−194)、及びHerbaspirillum属新規細菌(受託番号NITE BP−193)、並びにそれらの変異株からなる群から選択される少なくとも1種である、(5)記載の防除剤。
(7)Azospirillum属新規細菌(受託番号NITE BP−194)又はその変異株であって植物体内に共生して宿主植物に病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウイルスによる病害に対する耐性を付与する能力を有する変異株。
(8)Herbaspirillum属新規細菌(受託番号NITE BP−193)又はその変異株であって植物体内に共生して宿主植物に病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウイルスによる病害に対する耐性を付与する能力を有する変異株。
(9)Azospirillum属新規細菌(受託番号NITE BP−194)、及びHerbaspirillum属新規細菌(受託番号NITE BP−193)、並びにこれらの変異株であって植物体内に共生して宿主植物に病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウイルスによる病害に対する耐性を付与する能力を有する変異株からなる群から選択される少なくとも1種が人為的に感染された、病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウイルスによる病害に対する耐性を有する植物。
本明細書において「Azospirillum属新規細菌」とは、実施例1で単離同定された、受託番号NITE BP−194が付与されたAzospirillum属に属する細菌を指す。
本明細書において「Herbaspirillum属新規細菌」とは、実施例2で単離同定された、受託番号NITE BP−193が付与されたHerbaspirillum属に属する細菌を指す。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2006−58483号の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。
図1−2は、Azospirillum属新規細菌とAzospirillum sp.Arm2−2株(Accession No.AF521650)との16S rDNAの比較結果を示す(図1−3に続く)。
図1−3は、Azospirillum属新規細菌とAzospirillum sp.Arm2−2株(Accession No.AF521650)との16S rDNAの比較結果を示す。
図2−1は、Herbaspirillum属新規細菌とHerbaspirillum rubrisbalbicans(Accession No.AF137508)との16S rDNAの比較結果との16S rDNAの比較結果を示す(図2−2に続く)。
図2−2は、Herbaspirillum属新規細菌とHerbaspirillum rubrisbalbicans(Accession No.AF137508)との16S rDNAの比較結果との16S rDNAの比較結果を示す(図2−3に続く)。
図2−3は、Herbaspirillum属新規細菌とHerbaspirillum rubrisbalbicans(Accession No.AF137508)との16S rDNAの比較結果との16S rDNAの比較結果を示す。
図3は、ITS領域とnested PCRプライマーとの位置関係を示す。
図4は、Azospirillum属新規細菌によるシロイヌナズナにおける細菌性病害の防除効果を示す写真である。
図5は、Azospirillum属新規細菌及びHerbaspirillum属新規細菌によるシロイヌナズナにおける細菌性病害の防除効果を示す写真である。
本発明はまた、本発明の細菌が人為的に感染された、病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウイルスによる病害に対する耐性を有する上記植物に関する。
本発明により防除され得る病原性糸状菌による植物病害としては、イネいもち病(病原糸状菌:Magnaporthe grisea)、イネゴマ葉枯病(病原糸状菌:Bipolaris leersiae)、イネばか苗病(病原糸状菌:Gibberella fujikuroi)、イネ紋枯病(病原糸状菌:Thanatephorus cucumuris)、イネ黄化萎縮病菌(病原糸状菌:Ssclerophthora macrospora)、イネ疑似紋枯病(病原糸状菌:Rhizoctonia solani)、コムギ麦角病(病原糸状菌:Claviceps purpurea)、コムギ裸黒穂病(病原糸状菌:Ustilago tritici)、オオムギ裸黒穂病(病原糸状菌:Ustilago nuda)、ライムギ雪腐褐色小粒菌核病(病原糸状菌:Typhula incarnata)、ライムギ斑点病(病原糸状菌:Cochliobolus sativus)イネ、エンバク、コムギ、オオムギ、ライムギの立枯病(病原糸状菌:Gaeumannomyces graminis)、トウモロコシすす紋病(病原糸状菌:Setosphaeria turcica)、アブラナ科野菜根こぶ病(病原糸状菌:Plamodiophora brassicae)、アブラナ科野菜立枯病(病原糸状菌:Thanatephorus cucumeris)、ハクサイ黄化病(病原糸状菌:Verticillium albo−atrum)、ダイコン萎黄病(病原糸状菌:Fusarium oxysporum f.sp.Raphani)、ダイコン白さび病(病原糸状菌:Albugo macrospora)、コマツナ白さび病(病原糸状菌:Albugo macrospora)が挙げられる。
本発明により防除され得る病原性細菌による植物病害としては、イネ白葉枯れ病(病原細菌:Xanthomonas oryzae pv.oryzae)、イネもみ枯細菌病(病原細菌:Pseudomonas glumae)ハクサイ、アブラナ科野菜に重大な被害をもたらす野菜類軟腐病(病原細菌:Erwinia carotovora)、キャベツ黒腐病(Xanthomonas campestris pv.campestris)、が挙げられる。
本明細書に開示する実施例では、本発明に係る細菌が、病原性糸状菌による植物病害の防除に有効であること、並びに病原性細菌による植物病害の防除に有効であることが示されている。このことから、本発明に係る細菌は、宿主植物自身の病害抵抗性を高めていることがわかる。よって、本発明に係る細菌は、病原性糸状菌又は病原性細菌による植物病害の防除に有効であるだけでなく、病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウイルスによる植物病害の防除においても有効である。
本発明により防除され得る病原性ウイルスによる植物病害としては、イネ萎縮病 Rice dwarf reovirus、イネ縞葉枯病 Rice stripe tenuivirus、イネ黒すじ萎縮病 Rice blach−streaked dwarf reovirus、イネえそモザイク病 Rice necrosis mosaic potyvirus、イネわい化病 Rice waika virus、コムギ縞萎縮病 Wheat yellow mosaic virus、オオムギ縞萎縮病 Barley yellow mosaic virus、オオムギ斑葉モザイクウイルス Barley stripe hordeivirus、ダイコン、カブ、コマツナのウイルス病としてキュウリモザイクウイルス、カブモザイクポティウイルス、ダイコンひだ葉モザイクコモウイルス、ソラマメウイルトファバウイルスが挙げられる。
本発明に用いることができる細菌としては、Azospirillum属又はHerbaspirillum属に属し、植物体内に共生して宿主植物に病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウイルスによる病害に対する耐性を付与する能力を有する細菌であれば特に限定されない。具体例を挙げれば、Azospirillum属新規細菌(受託番号NITE BP−194)、及びHerbaspirillum属新規細菌(受託番号NITE BP−193)が挙げられる。また、Azospirillum属新規細菌(受託番号NITE BP−194)、又はHerbaspirillum属新規細菌(受託番号NITE BP−193)と同等の能力を有する細菌、例えば、Azospirillum属に属し、実施例1に示すAzospirillum属新規細菌と同一の炭素源の資化能力を有する細菌や、Azospirillum属に属し、配列番号1に示す塩基配列を少なくとも一部分に含む16S rDNAを有する細菌や、Herbaspirillum属に属し、実施例2に示すHerbaspirillum属新規細菌と同一の炭素源の資化能力を有する細菌や、Herbaspirillum属に属し、配列番号2に示す塩基配列を少なくとも一部分に含む16S rDNAを有する細菌が挙げられるがこれらには限定されない。更にまた、Azospirillum属新規細菌(受託番号NITE BP−194)、又はHerbaspirillum属新規細菌(受託番号NITE BP−193)が変異誘発処理されて作出された変異株であって、植物体内に共生して宿主植物に病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウイルスによる病害に対する耐性を付与する能力を有する変異株もまた、本発明に好適に使用することができる。このような変異株のなかでも、Azospirillum属に属し、実施例1に示すAzospirillum属新規細菌と同一の炭素源の資化能力を有する細菌や、Azospirillum属に属し、配列番号1に示す塩基配列を少なくとも一部分に含む16S rDNAを有する細菌や、Herbaspirillum属に属し、実施例2に示すHerbaspirillum属新規細菌と同一の炭素源の資化能力を有する細菌や、Herbaspirillum属に属し、配列番号2に示す塩基配列を少なくとも一部分に含む16S rDNAを有する細菌が好ましい。変異誘発処理は任意の適当な変異原を用いて行われ得る。ここで、「変異原」なる語は広義の意味を有し、例えば変異原効果を有する薬剤のみならずUV照射のごとき変異原効果を有する処理をも含むものと理解すべきである。適当な変異原の例としてエチルメタンスルホネート、UV照射、N−メチル−N′−ニトロ−N−ニトロソグアニジン、ブロモウラシルのようなヌクレオチド塩基類似体及びアクリジン類が挙げられるが、他の任意の効果的な変異原もまた使用され得る。
本発明に用いられる細菌は、振とう培養等の通常の培養法により、通常の条件下で培養されうる。培養に用いる培地としては炭素源としてグルコース、シュークロース、デンプン、デキストリンなどの糖類を、窒素源として硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム等のアンモニウム塩、硝酸塩等の無機窒素源、または、酵母エキス、コーン・スティープ・リーカー、肉エキス、小麦胚芽、ポリペプトン、サトウキビ絞り粕(バカス)、ビールカス、大豆粉、米糠、魚粉等の有機窒素源を、無機塩としてリン酸一カリ、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸第一鉄等の、リン、カリウム、マンガン、マグネシウム、鉄等を含む塩類を、それぞれ含有する合成または天然の培地が挙げられる。
本発明はまた、本発明の細菌を有効成分として含有する、植物における病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウイルスによる病害の防除剤に関する。当該植物病害防除剤としては、本発明の細菌の培養液をそのまま使用することができるが、細菌の培養液を膜分離、遠心分離、濾過分離等の方法により分離した、本発明の細菌の高濃度物を用いることもできる。
本発明の植物病害防除剤としてはまた、本発明の細菌の培養液を乾燥させたものを使用することができる。また、本発明の細菌の培養液を活性炭粉末、珪藻土、タルク等の多孔吸着体に吸着させ乾燥させたものを使用することができる。乾燥方法は通常の方法でよく、例えば凍結乾燥、減圧乾燥でよい。これらの乾燥物は乾燥後さらにボールミル等の粉砕手段で粉砕されてもよい。
本発明の細菌は上述の培養液、高濃度物または乾燥物としてそれ自体単独で本発明に用いることができるが、更なる他の任意成分と組み合わせて通常の微生物製剤と同様の形態(例えば粉剤、水和剤、乳剤、液剤、フロアブル剤、塗布剤等の形態)に製剤化して、植物病害防除用組成物として提供されてもよい。組み合わせて使用することができる任意成分としては例えば固体担体、補助剤のような植物への適用が許容される材料が挙げられる。
本発明の細菌の植物への感染は、植物の栄養成長期に行われることが好ましい。
本発明の細菌またはそれを含有する組成物の植物への施用方法としては、噴霧、潅注、どぶ漬け、植物体への塗布、人為的に付けた傷への接触、シリンジによる注入、土壌への混合、水耕液への混入、砂等へ混合してサンドブラストのように吹きつける方法などが考えられる。本発明の細菌を懸濁してなる懸濁液を植物に潅注処理する場合には、懸濁液中の本発明の細菌の濃度は104〜1012CFU/mlが好ましい。
栽培イネ日本晴(Oryza sativa cv.Nipponbare)の茎を3cm程とり、70%エタノールと1%次亜塩素酸ナトリウム溶液で表面殺菌した。それを滅菌した乳鉢で、滅菌した0.85%食塩水と海砂を加えながら磨砕した。窒素固定菌が窒素固定活性を発現可能な、Rennie培地が知られている(Rennie,R.J.1981.Can.J.Micribiol.27:8−14)。磨砕液の上清を、試験管のRennie半流動培地に接種し培養した。アセチレン還元活性のあった試験管から、Nutrient Agar培地に植菌して、シングルコロニーを単離した。
単離したシングルコロニーの菌株を栽培イネに接種し、いもち病に対する抵抗性評価試験を実施した。その結果、イネに病害抵抗性を付与する細菌の菌株を選抜した。
当該菌株をNutrient Brothで培養し、菌体からゲノムDNAを単離した。単離したDNAを鋳型に、16S rDNA領域のほぼ全長の塩基配列をdyeプライマー法で決定した(配列番号1)。相同性検索プログラムFASTAを利用し、決定した塩基配列と、DDBJ/EMBL/GenBank国際塩基配列データベースとの相同性検索を行った。
当該菌株はAzospirillum sp.Arm2−2株(Accession No.AF521650)と、98.5%相同であった(図1)。当該菌株の16S rDNAは既存の種の16S rDNAと一致しなかった。
当該菌株の基質資化能を検討したところ、表1に示す結果が確認された。
本発明者らは、Azospirillum属新規細菌を独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター(千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8)に2006年2月10日付で受託番号NITE BP−194として寄託した。
日本に保存されている野生イネ(Oryza barthii W1407)の葉身を3cm程とり、70%エタノールと1%次亜塩素酸ナトリウム溶液で表面殺菌した。それを滅菌した乳鉢で、滅菌した0.85%食塩水と海砂を加えながら磨砕した。窒素固定菌が窒素固定活性を発現可能な、Rennie培地が知られている(Rennie,R.J.1981.Can.J.Micribiol.27:8−14)。磨砕液の上清を、試験管のRennie半流動培地に接種し培養した。アセチレン還元活性のあった試験管から、Nutrient Agar培地に植菌して、シングルコロニーを単離した。
単離したシングルコロニーの菌株を栽培イネに接種し、いもち病に対する抵抗性評価試験を実施した。その結果、イネに病害抵抗性を付与する細菌の菌株を選抜した。
当該菌株をNutrient Brothで培養し、菌体からゲノムDNAを単離した。単離したDNAを鋳型に、16S rDNA領域のほぼ全長の塩基配列をdyeプライマー法で決定した(配列番号2)。相同性検索プログラムFASTAを利用し、決定した塩基配列と、DDBJ/EMBL/GenBank国際塩基配列データベースとの相同性検索を行った。
当該菌株はHerbaspirillum rubrisbalbicans(Accession No.AF137508)と99.6%相同であった(図2)。当該菌株の16S rDNAは既存の種の16S rDNAと一致しなかった。
当該菌株の基質資化能を検討した。16S rDNA塩基配列の相同性検索において相同製が高かった、Herbaspirillum rubrisbalbicansのATCC19308株と基質資化能を比較した。比較結果を表2に示す。表中丸印は資化可能であったことを示し、バツ印は資化不能であったことを示す。
また選抜された菌株は表に示した基質以外にもグルコン酸カリウム、n−カプリン酸、アジピン酸、DL−リンゴ酸、クエン酸ナトリウム、酢酸フェニル、白糖を資化することができなかった。
以上の結果から、選抜された菌株はHerbaspirillum属に属する細菌の新規株であると結論づけた。
本発明者らはHerbaspirillum属新規細菌を、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター(千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8)に2006年2月10日付で受託番号NITE BP−193として寄託した。
Azospirillum属新規細菌又はHerbaspirillum属新規細菌が感染しているか否かが不明の植物において、これらの菌の感染の有無を検出する方法を検討した。そして、以下に示す通り、Nested−PCR法が有効であることが明らかとなった。
Azospirillum属新規細菌及びHerbaspirillum属新規細菌で、16SrDNAと23SrDNA間のITS領域の塩基配列を決定した。Azospirillum属新規細菌のITS領域の塩基配列を配列番号3に、Herbaspirillum属新規細菌のITS領域の塩基配列を配列番号4にそれぞれ示す。
各菌株のITS領域の塩基配列と、DDBJ/EMBL/GeneBank国際塩基配列データベースに登録されている近縁及び遠縁の6〜7細菌のITS領域塩基配列とを多重整列プログラムClastalWを利用して比較し、ITS領域を増幅させるプライマー2セットを、他の細菌と相同性の低い領域で作製した(図3、表3)。
Azospirillum属新規細菌接種植物、又はHerbaspirillum属新規細菌接種植物の、成長点付近を取り、生理食塩水を加え、乳鉢、又はビーズによる細胞破砕装置で出来る限り細かく破砕した。その破砕液からDNAを抽出した。DNA溶液を鋳型とし表4及び5に示した条件で、プライマーセット1によるPCR(第1のPCR)、次にそのPCR溶液を鋳型とした、更に内側のプライマーセット2によるPCR(第2のPCR)を行い、目的DNA断片の検出を検討した。
Azospirillum属新規細菌接種植物では、プライマーセット1によるPCR増幅断片のサイズは484bpであり、プライマーセット2によるPCR増幅断片のサイズは298bpであった。Herbaspirillum属新規細菌接種植物では、プライマーセット1によるPCR増幅断片のサイズは356bpであり、プライマーセット2によるPCR増幅断片のサイズは241bpであった。
以上の結果から、検査対象の植物体からの試料に対して表3に示すプライマーセットを用いたNested−PCR法を行い上記サイズの増幅断片が得られた場合に、増幅断片サイズに対応するエンドファイト(Azospirillum属新規細菌又はHerbaspirillum属新規細菌)が感染していると結論づけることができることが明らかとなった。
実施例3に示す方法の外に、Azospirillum属新規細菌又はHerbaspirillum属新規細菌が感染しているか否かが不明の植物において、これらの菌の感染の有無を検出する方法を検討した。そして、以下に示す通り、ELISA法が有効であることが明らかとなった。
ELISA法のためにAzospirillum属新規細菌、Herbaspirillum属新規細菌に対するポリクローナル抗体を以下の方法で作製した。Azospirillum属新規細菌及びHerbaspirillum属新規細菌をホルマリン処理し、抗原菌体液を調製した。それぞれウサギ背部に3〜4X108細胞ずつ免疫した。エマルジョン作製は、初回はフロイントコンプリートアジュバント、2回目からはフロイントインコンプリートアジュバントを使用し2週間間隔で免役した。6回免疫後に全採血し、ウサギ抗Azospirillum属新規細菌血清、ウサギ抗Herbaspirillum属新規細菌血清を調製した。
Azospirillum属新規細菌又はHerbaspirillum属新規細菌を接種した植物体に生理食塩水を加え、乳鉢、又はビーズによる細胞破砕装置で出来る限り細かく破砕した。破砕液を弱く遠心し、大きな植物残さを除き、上記ポリクローナル抗体を用い常法のELISAに供試した。
植物破砕液をマイクロタイタープレートに注入し、菌体を壁に吸着させ、洗浄後に、10万倍希釈した上記ポリクローナル抗体を反応させた。コントロールとして、無接種植物の破砕液、既知量の菌体を同時に供試した。洗浄後、パーオキシデース標識された二次抗体(抗ウサギ抗体)を反応させ、パーオキシデースによる色素生成反応後に吸光度を測定した。
その結果、Azospirillum属新規細菌又はHerbaspirillum属新規細菌接種植物サンプルでは無接種植物サンプルより吸光度が上昇し、接種菌(Azospirillum属新規細菌又はHerbaspirillum属新規細菌)が感染していると結論づけることができることが明らかとなった。また、コントロールと比較することにより植物中の定着菌数の推定が可能であった。
(目的)
本実施例ではAzospirillum属新規細菌又はHerbaspirillum属新規細菌(以下両菌株の総称として「エンドファイト」ということがある)に感染したイネ(Oryza sativa Nipponbare)を用いてイネいもち病(Magnaporthe grisea race 007)に対する病害抵抗性誘導効果について検証した。イネは単子葉植物のモデル植物である。
(実験方法)
1. イネは3葉期にセルシート(1区画2cmx2cmにイネ幼苗5株)から1%肥料溶液中での水耕栽培に移植した。3.5葉に生育したイネに2種類のエンドファイト調製液をそれぞれ105〜109CFU/mlになるように潅注処理した。エンドファイト処理5日後にいもち病菌の胞子懸濁液(0.2% Tween 20添加)を噴霧接種し、暗黒下、湿度100%の条件下に24時間静置した後、25℃、湿度60%の温室でさらに4日間栽培した。いもち病菌接種5日後に、第4葉に出現したいもち病の病斑数を計測した。各処理区における病斑数を比較し、いもち病抵抗性を評価した。
2. 上記の方法を用いて、処理期間を5日と10日に設定し、エンドファイトの処理期間がいもち病抵抗性に及ぼす影響について解析した。
なお、表7に示したBenzisothiazole(BIT)は抗イネいもち病農薬プロベナゾールの活性代謝物である。BIT 0.5mg/potを処理したイネは強いイネいもち病抵抗性を誘導する。本実験ではエンドファイト処理区のいもち病抵抗性誘導効果を比較するポジティブコントロールとしてBIT処理区を設けた。
3. 栄養条件がエンドファイト誘導性の病害抵抗性に及ぼす影響について検討するために、肥料濃度を0.5%、0.75%、1%の3段階設定し、3葉期のイネを移植した。2日後にエンドファイト懸濁液を処理し、5日後にいもち病菌を接種し、いもち病抵抗性を評価した。
(結果)
Azospirillum属新規細菌及びHerbaspirillum属新規細菌の108CFU/ml処理区においていもち病菌に対する防除価はそれぞれ約52%、55%であった(表6)。また、いもち病抵抗性誘導効果にはエンドファイトの処理期間(5日と10日)による差は認められなかった(表7)。0.5%肥料溶液の処理区では、エンドファイトが誘導する病害抵抗性が認められなかったが、栄養が十分に存在する0.75%と1%肥料溶液の条件では、エンドファイトの耐病性付与効果が認められた(表8)。
(目的)
本実施例ではエンドファイトに感染したシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana Col−0)を用いてシロイヌナズナに罹病性の病原性バクテリア(Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000)に対する病害抵抗性誘導効果について検証した。シロイヌナズナは双子葉植物のモデル植物である。
(実験方法)
シロイヌナズナの種子を70%エタノールで20秒間、1%次亜塩素酸水溶液で5分間処理して滅菌後、滅菌した蒸留水で20分、3回洗浄した。オートクレーブ滅菌(121℃、40分)した園芸培土(Kureha)を入れたプラスチック容器(5x5x5cm)に滅菌した種子を約20粒ずつ播種し、人工気象器内で、温度21℃、湿度60%、16時間明/8時間暗の条件下で栽培した。
1)エンドファイト処理濃度が病害抵抗性誘導効果に及ぼす影響
播種後4週間目のシロイヌナズナにAzospirillum属新規細菌調製液を106〜108CFU/mlになるように潅注処理した。エンドファイト処理5日後にPst DC3000(1×107CFU/ml)を接種し、5日後に葉の病徴をコントロールと比較した。
2)エンドファイト処理期間が病害抵抗性誘導効果に及ぼす影響
播種後3週間目のシロイヌナズナにAzospirillum属新規細菌とHerbaspirillum属新規細菌の菌懸濁液をそれぞれ107CFU/mlになるように潅注処理した。エンドファイト処理10日後と15日後にPst DC3000(1×107CFU/ml)を接種し、5日後に葉の病徴をコントロールと比較した。
3)エンドファイト処理がPstDC3000の増殖に及ぼす影響
播種後3週間目のシロイヌナズナに上と同じように菌懸濁液をそれぞれ107又は108CFU/mlになるように潅注処理した。処理後15日後にPst DC3000(2×105CFU/ml)を接種し、3日後の葉を回収し、10mM MgCl2中で磨砕した。磨砕液を三段階に希釈し、NB平板培地(rifanpicin 50mg/l)に塗布した。28度で二晩培養後、コロニーをカウントして植物体内での菌の増殖率を数値化した。
(結果)
1)Azospirillum属新規細菌を106から108CFU/mlで処理した結果、エンドファイト処理濃度が高いほどPst DC3000の病徴を抑制する傾向が認められた(図4)。
2)Azospirillum属新規細菌処理区では処理期間が長い方がPst DC3000の病徴抑制効果が高い傾向が観察された。
Herbaspirillum属新規細菌処理区では処理期間が異なっていてもPst DC3000の病徴抑制効果に差はほとんど認められなかった(図5)。
3)植物体内におけるPst DC3000の増殖を測定したところ、コントロールに比べてエンドファイト処理区でPst DC3000の増殖が抑制された。処理したエンドファイトは108CFU/mlより107CFU/mlの方が病原菌増殖抑制効果が強かった(表9)。
(目的)
エンドファイトに感染したコマツナを用いて、糸状菌(Albugo macrospora)が引き起こす白さび病に対する病害抵抗性誘導効果について検証した。
(実験方法)
(1)エンドファイトの培養及び菌懸濁液調製方法
Azospirillum属新規細菌は、500ml三角フラスコに入れたNB液体培地100mlに接種し、28度で30時間振とう培養した。遠心分離して菌体を回収し、10mM MgCl2溶液に懸濁させた後、菌濃度を1x109CFU/mlになるように調製した。
(2)コマツナ幼苗の栽培とエンドファイト処理
コマツナ(品種:夏楽天(タキイ種苗))を200穴のセルトレイ(用土はclaysoil、量は20mL/穴)に1株ずつ植えて温室内で栽培した。播種4日後の苗の根本にエンドファイト菌液を終濃度が5x107CFU/mlになるように処理した。温室内で2週間栽培を継続した後、屋外の圃場に定植(株間5cm、条間15cm)した。
(3)白さび病の発病と調査
定植後2週間後から白さび病の発病が観察され、定植後6週間後に発病程度を調査した。発病度は、甚(5)、多(4)、中(3)、小(2)、極微(1)の5段階で評価し、統計処理後発病度(%)を算出した。
(結果)
エンドフィト無処理区の発病度21.8に対して、Azospirillum属新規細菌処理区では18.8であり有意に低下していた。したがって、Azospirillum属新規細菌処理はコマツナに白さび病抵抗性を誘導することが示された。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
[配列表]
Claims (9)
- Azospirillum属又はHerbaspirillum属に属し、植物体内に共生して宿主植物に病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウイルスによる病害に対する耐性を付与する能力を有する細菌を、植物に人為的に感染させる工程を含む、植物における病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウイルスによる病害の防除方法。
- 前記細菌がAzospirillum属新規細菌(受託番号NITE BP−194)、及びHerbaspirillum属新規細菌(受託番号NITE BP−193)、並びにそれらの変異株からなる群から選択される少なくとも1種である、請求項1記載の方法。
- 前記植物がイネ科又はアブラナ科に属する植物である、請求項1又は2記載の方法。
- 細菌の植物への感染が植物の栄養成長期に行われる、請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。
- Azospirillum属又はHerbaspirillum属に属し、植物体内に共生して宿主植物に病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウイルスによる病害に対する耐性を付与する能力を有する細菌を有効成分として含有する、植物における病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウイルスによる病害の防除剤。
- 前記細菌がAzospirillum属新規細菌(受託番号NITE BP−194)、及びHerbaspirillum属新規細菌(受託番号NITE BP−193)、並びにそれらの変異株からなる群から選択される少なくとも1種である、請求項5記載の防除剤。
- Azospirillum属新規細菌(受託番号NITE BP−194)又はその変異株であって植物体内に共生して宿主植物に病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウイルスによる病害に対する耐性を付与する能力を有する変異株。
- Herbaspirillum属新規細菌(受託番号NITE BP−193)又はその変異株であって植物体内に共生して宿主植物に病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウイルスによる病害に対する耐性を付与する能力を有する変異株。
- Azospirillum属新規細菌(受託番号NITE BP−194)、及びHerbaspirillum属新規細菌(受託番号NITE BP−193)、並びにこれらの変異株であって植物体内に共生して宿主植物に病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウイルスによる病害に対する耐性を付与する能力を有する変異株からなる群から選択される少なくとも1種が人為的に感染された、病原性糸状菌、病原性細菌又は病原性ウイルスによる病害に対する耐性を有する植物。
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