JP2003274779A - イネおよびイネへの共生菌の導入方法 - Google Patents
イネおよびイネへの共生菌の導入方法Info
- Publication number
- JP2003274779A JP2003274779A JP2003006988A JP2003006988A JP2003274779A JP 2003274779 A JP2003274779 A JP 2003274779A JP 2003006988 A JP2003006988 A JP 2003006988A JP 2003006988 A JP2003006988 A JP 2003006988A JP 2003274779 A JP2003274779 A JP 2003274779A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- rice
- bacterium
- symbiotic
- ferm
- plant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】生育促進効果と種子増量効果とが現われるとと
もに、化学合成肥料の使用量を少なくするようにしたイ
ネを提供する。 【解決手段】天然の植物中に共生している細菌中から窒
素固定を行なう共生菌を分離し、分離された共生菌を人
工増殖させた後にイネに人工接種し、これによって窒素
固定を行なう共生菌をイネに感染させるようにしたもの
である。
もに、化学合成肥料の使用量を少なくするようにしたイ
ネを提供する。 【解決手段】天然の植物中に共生している細菌中から窒
素固定を行なう共生菌を分離し、分離された共生菌を人
工増殖させた後にイネに人工接種し、これによって窒素
固定を行なう共生菌をイネに感染させるようにしたもの
である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は人為的に共生菌に感
染させたイネおよびイネに対する共生菌の導入方法に関
する。ここでイネは栽培イネＯｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ
と野生イネＯｒｙｚａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓの両方
を含むものである。また栽培イネはイネ科イネ連イネ属
のＯｒｙｚａ ｓａｔｉｖａに属する植物であり、野生
イネはイネ科イネ連イネ属のＯｒｙｚａ ｏｆｆｉｃｉ
ｎａｌｉｓである。
染させたイネおよびイネに対する共生菌の導入方法に関
する。ここでイネは栽培イネＯｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ
と野生イネＯｒｙｚａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓの両方
を含むものである。また栽培イネはイネ科イネ連イネ属
のＯｒｙｚａ ｓａｔｉｖａに属する植物であり、野生
イネはイネ科イネ連イネ属のＯｒｙｚａ ｏｆｆｉｃｉ
ｎａｌｉｓである。
【０００２】
【従来の技術】イネには水稲と陸稲の２種類がある。日
本では９７％が水田を利用した水稲栽培である。イネの
栽培管理は、水田で苗代期間が３５〜５０日、田植えか
ら出穂までが３０〜４０日、出穂から収穫までが４０〜
５０日である。そしてイネが玄米５００Ｋｇを作るのに
必要な窒素の量は約１０．５Ｋｇであり、その内の６．
３Ｋｇを土壌と水から取込み、残りの４．２Ｋｇを肥料
から吸収すると言われている。施肥は硫酸アンモニウム
を主とする化学肥料によって行なわれ、施した窒素の内
の４０％前後が吸収利用されているものと推定される。
よって残りの約６０％は土壌中に残存することになり、
過剰な施肥による地下水への窒素の流出や、河川や湖沼
への残存肥料の影響が社会問題化している。
本では９７％が水田を利用した水稲栽培である。イネの
栽培管理は、水田で苗代期間が３５〜５０日、田植えか
ら出穂までが３０〜４０日、出穂から収穫までが４０〜
５０日である。そしてイネが玄米５００Ｋｇを作るのに
必要な窒素の量は約１０．５Ｋｇであり、その内の６．
３Ｋｇを土壌と水から取込み、残りの４．２Ｋｇを肥料
から吸収すると言われている。施肥は硫酸アンモニウム
を主とする化学肥料によって行なわれ、施した窒素の内
の４０％前後が吸収利用されているものと推定される。
よって残りの約６０％は土壌中に残存することになり、
過剰な施肥による地下水への窒素の流出や、河川や湖沼
への残存肥料の影響が社会問題化している。
【０００３】ところで自然界には大気中の窒素を固定
し、植物に供給している根粒菌と呼ばれる微生物がい
る。すなわちＲｈｉｚｏｈｉｕｍ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚ
ｏｂｉｕｍ、Ｍｅｓｏｒｈｉｘｏｂｉｕｍ、Ｓｉｎｏｒ
ｈｉｚｏｂｉｕｍ等はマメ科植物根に根粒を作って生活
し、大気中の４／５を占める窒素ガスを取込み、窒素化
合物に変換して植物体に供給している。なおダイズ根粒
菌はＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍである。
し、植物に供給している根粒菌と呼ばれる微生物がい
る。すなわちＲｈｉｚｏｈｉｕｍ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚ
ｏｂｉｕｍ、Ｍｅｓｏｒｈｉｘｏｂｉｕｍ、Ｓｉｎｏｒ
ｈｉｚｏｂｉｕｍ等はマメ科植物根に根粒を作って生活
し、大気中の４／５を占める窒素ガスを取込み、窒素化
合物に変換して植物体に供給している。なおダイズ根粒
菌はＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍである。
【０００４】植物は大気中の窒素をこの種の微生物を介
して取込むことで、土壌中の窒素供給を最小限に保ちな
がら生育することが可能になる。これらの技術はすでに
広く実用化され、ダイズ等の植物は根粒菌を種子に接種
して販売されている。また根粒菌はマメ科植物に特異的
に感染するものの、イネ科の植物には感染しないため
に、イネではこのような技術が存在せず、また利用され
てもいない。
して取込むことで、土壌中の窒素供給を最小限に保ちな
がら生育することが可能になる。これらの技術はすでに
広く実用化され、ダイズ等の植物は根粒菌を種子に接種
して販売されている。また根粒菌はマメ科植物に特異的
に感染するものの、イネ科の植物には感染しないため
に、イネではこのような技術が存在せず、また利用され
てもいない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】根粒菌を利用して大気
中の窒素を窒素化合物に変換し、植物体に供給するシス
テムの利用は、上述の如くマメ科にとどまっており、イ
ネには応用されていない。ところが自然界に存在する野
生の植物の中には、内部共生菌であるエンドファイトが
共生している植物がある。エンドファイトは植物体の組
織中に、とくに細胞間隙と呼ばれる細胞と細胞との間に
生息している。エンドファイトは大別すると糸状菌と細
菌とに分かれる。とくに細菌エンドファイトの中には窒
素固定を行なうものがいる。しかし現在栽培されている
栽培イネや野生イネにおいては、マメ科に感染する根粒
菌のように効率良く大気中の窒素を固定し、イネに供給
している細菌エンドファイトはこれまでのところ見つか
ってはいない。
中の窒素を窒素化合物に変換し、植物体に供給するシス
テムの利用は、上述の如くマメ科にとどまっており、イ
ネには応用されていない。ところが自然界に存在する野
生の植物の中には、内部共生菌であるエンドファイトが
共生している植物がある。エンドファイトは植物体の組
織中に、とくに細胞間隙と呼ばれる細胞と細胞との間に
生息している。エンドファイトは大別すると糸状菌と細
菌とに分かれる。とくに細菌エンドファイトの中には窒
素固定を行なうものがいる。しかし現在栽培されている
栽培イネや野生イネにおいては、マメ科に感染する根粒
菌のように効率良く大気中の窒素を固定し、イネに供給
している細菌エンドファイトはこれまでのところ見つか
ってはいない。
【０００６】本発明は細菌エンドファイトに感染してい
ないイネに細菌エンドファイト、とくに大気中の窒素を
固定することができる細菌エンドファイトを人工的に接
種して成るイネおよびこのようなエンドファイトを人工
的にイネに導入する方法を提供することを目的とする。
ないイネに細菌エンドファイト、とくに大気中の窒素を
固定することができる細菌エンドファイトを人工的に接
種して成るイネおよびこのようなエンドファイトを人工
的にイネに導入する方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本願の主要な発明は、細
菌から成る共生菌が存在しない植物体に細菌から成る共
生菌を人為的に導入して成るイネに関するものである。
ここで前記イネに導入された共生菌がイネに対して窒素
固定を行なう共生菌であってよい。また前記イネに導入
された共生菌が特許生物寄託センターに寄託されたＨｅ
ｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ＦＥＲＭ Ｐ−１８５６
３、ＦＥＲＭ ＢＰ−７９９８、ＦＥＲＭＢＰ−７９９
９、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ＦＥＲＭ Ｐ−１８５
６４またはＦＥＲＭ ＢＰ−８０００であってよい。ま
た共生菌が導入されるイネが栽培イネＯｒｙｚａ ｓａ
ｔｉｖａまたは野生イネＯｒｙｚａ ｏｆｆｉｃｉｎａ
ｌｉｓの何れかの植物であってよい。
菌から成る共生菌が存在しない植物体に細菌から成る共
生菌を人為的に導入して成るイネに関するものである。
ここで前記イネに導入された共生菌がイネに対して窒素
固定を行なう共生菌であってよい。また前記イネに導入
された共生菌が特許生物寄託センターに寄託されたＨｅ
ｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ＦＥＲＭ Ｐ−１８５６
３、ＦＥＲＭ ＢＰ−７９９８、ＦＥＲＭＢＰ−７９９
９、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ＦＥＲＭ Ｐ−１８５
６４またはＦＥＲＭ ＢＰ−８０００であってよい。ま
た共生菌が導入されるイネが栽培イネＯｒｙｚａ ｓａ
ｔｉｖａまたは野生イネＯｒｙｚａ ｏｆｆｉｃｉｎａ
ｌｉｓの何れかの植物であってよい。
【０００８】共生菌の導入方法に関する発明は、植物に
共生している細菌から成る共生菌を分離して増殖する工
程と、人工増殖させた共生菌をイネに人工接種する工程
と、人工接種した共生菌をイネに感染させて共生する工
程と、を具備するイネへの共生菌の導入方法に関するも
のである。ここで前記イネに導入された共生菌が特許生
物寄託センターに寄託されたＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌ
ｕｍ ＦＥＲＭ Ｐ−１８５６３、ＦＥＲＭ ＢＰ−７
９９８、ＦＥＲＭ ＢＰ−７９９９、Ａｚｏｓｐｉｒｉ
ｌｌｕｍ ＦＥＲＭ Ｐ−１８５６４またはＦＥＲＭ
ＢＰ−８０００であってよい。また細菌が共生している
と推定される植物を磨砕し、培地上に接種して培養によ
り細菌を分離するようにしてよい。また分離した菌をア
セチレンを封入した容器内に入れて密封し、前記アセチ
レンが還元されて生成したエチレンの量により分離され
た菌の窒素固定活性を測定して細菌を選抜するようにし
てよい。また分離した菌のＤＮＡをＰＣＲ法により増幅
するとともに、増幅されたＤＮＡを相同性検索を行なっ
て菌の特定をするようにしてよい。また識別手段を発現
するような外来遺伝子を前記細菌に導入し、植物体に感
染した前記細菌の定着を前記外来遺伝子による識別手段
によって確認するようにしてよい。また細菌を接種して
共生させた植物体をアセチレンを封入した容器に入れて
密封し、前記アセチレンが還元されて生成したエチレン
の量により細菌が導入された植物体の窒素固定能を評価
するようにしてよい。
共生している細菌から成る共生菌を分離して増殖する工
程と、人工増殖させた共生菌をイネに人工接種する工程
と、人工接種した共生菌をイネに感染させて共生する工
程と、を具備するイネへの共生菌の導入方法に関するも
のである。ここで前記イネに導入された共生菌が特許生
物寄託センターに寄託されたＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌ
ｕｍ ＦＥＲＭ Ｐ−１８５６３、ＦＥＲＭ ＢＰ−７
９９８、ＦＥＲＭ ＢＰ−７９９９、Ａｚｏｓｐｉｒｉ
ｌｌｕｍ ＦＥＲＭ Ｐ−１８５６４またはＦＥＲＭ
ＢＰ−８０００であってよい。また細菌が共生している
と推定される植物を磨砕し、培地上に接種して培養によ
り細菌を分離するようにしてよい。また分離した菌をア
セチレンを封入した容器内に入れて密封し、前記アセチ
レンが還元されて生成したエチレンの量により分離され
た菌の窒素固定活性を測定して細菌を選抜するようにし
てよい。また分離した菌のＤＮＡをＰＣＲ法により増幅
するとともに、増幅されたＤＮＡを相同性検索を行なっ
て菌の特定をするようにしてよい。また識別手段を発現
するような外来遺伝子を前記細菌に導入し、植物体に感
染した前記細菌の定着を前記外来遺伝子による識別手段
によって確認するようにしてよい。また細菌を接種して
共生させた植物体をアセチレンを封入した容器に入れて
密封し、前記アセチレンが還元されて生成したエチレン
の量により細菌が導入された植物体の窒素固定能を評価
するようにしてよい。
【０００９】本願に含まれる発明の好ましい態様は、細
菌から成る共生菌、すなわちエンドファイトに感染して
おらず、あるいはまた感染したエンドファイトが除去さ
れたイネにエンドファイトを人為的に導入して成るイネ
に関するものである。ここでイネ科植物中のイネに人為
的に導入されるエンドファイトは窒素固定を行なう共生
菌である。このようなエンドファイトは自然界に生育す
る植物中に共生するエンドファイトを探索して発見する
とともに、窒素固定活性の評価を行ない、選抜されたも
のを人為的に導入することによって達成される。
菌から成る共生菌、すなわちエンドファイトに感染して
おらず、あるいはまた感染したエンドファイトが除去さ
れたイネにエンドファイトを人為的に導入して成るイネ
に関するものである。ここでイネ科植物中のイネに人為
的に導入されるエンドファイトは窒素固定を行なう共生
菌である。このようなエンドファイトは自然界に生育す
る植物中に共生するエンドファイトを探索して発見する
とともに、窒素固定活性の評価を行ない、選抜されたも
のを人為的に導入することによって達成される。
【００１０】本願発明者等によって探索培養されたエン
ドファイトであって、Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ
Ｂ５０２（特許生物寄託センター寄託菌ＦＥＲＭ Ｐ−
１８５６３）、同ＦＥＲＭ ＢＰ−７９９８、同ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−７９９９、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ Ｂ５
１０ａ（特許生物寄託センター寄託菌ＦＥＲＭ Ｐ−１
８５６４）または同ＦＥＲＭ ＢＰ−８０００は何れも
窒素固定能を有する共生菌であって、イネに導入して共
生させることができるエンドファイトであることが確認
された。またこのようなエンドファイトが導入される植
物としては、イネであってしかも有用な植物である次の
ような植物であってよい。すなわち栽培イネＯｒｙｚａ
ｓａｔｉｖａ、野生イネＯｒｙｚａ ｏｆｆｉｃｉｎ
ａｌｉｓの何れかの植物であってよく、ここではその後
代も含まれるものである。
ドファイトであって、Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ
Ｂ５０２（特許生物寄託センター寄託菌ＦＥＲＭ Ｐ−
１８５６３）、同ＦＥＲＭ ＢＰ−７９９８、同ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−７９９９、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ Ｂ５
１０ａ（特許生物寄託センター寄託菌ＦＥＲＭ Ｐ−１
８５６４）または同ＦＥＲＭ ＢＰ−８０００は何れも
窒素固定能を有する共生菌であって、イネに導入して共
生させることができるエンドファイトであることが確認
された。またこのようなエンドファイトが導入される植
物としては、イネであってしかも有用な植物である次の
ような植物であってよい。すなわち栽培イネＯｒｙｚａ
ｓａｔｉｖａ、野生イネＯｒｙｚａ ｏｆｆｉｃｉｎ
ａｌｉｓの何れかの植物であってよく、ここではその後
代も含まれるものである。
【００１１】次にイネへの共生菌、すなわちエンドファ
イトの導入方法について説明する。この方法は自然界等
に存在する植物に共生しているエンドファイトを分離し
て人工増殖を行なう。そして人工増殖されたエンドファ
イトをイネ科植物中のイネに人工接種する。そして人工
接種されたエンドファイトをイネに感染させて共生させ
ることによりイネへのエンドファイトの導入が行なわれ
る。
イトの導入方法について説明する。この方法は自然界等
に存在する植物に共生しているエンドファイトを分離し
て人工増殖を行なう。そして人工増殖されたエンドファ
イトをイネ科植物中のイネに人工接種する。そして人工
接種されたエンドファイトをイネに感染させて共生させ
ることによりイネへのエンドファイトの導入が行なわれ
る。
【００１２】ここでエンドファイトを人工接種する工程
において特許生物寄託センターに寄託された上記のエン
ドファイトの何れかを人工接種するようにしてよい。ま
たイネに対するエンドファイトの導入は必ずしも１種類
のエンドファイトである必要はなく、２種類以上のエン
ドファイトを同時に、あるいはまた時間的にずらして導
入することもできる。
において特許生物寄託センターに寄託された上記のエン
ドファイトの何れかを人工接種するようにしてよい。ま
たイネに対するエンドファイトの導入は必ずしも１種類
のエンドファイトである必要はなく、２種類以上のエン
ドファイトを同時に、あるいはまた時間的にずらして導
入することもできる。
【００１３】Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｐ．
ＦＥＲＭ Ｐ−１８５６３、ＦＥＲＭ ＢＰ−７９９
８、ＦＥＲＭ ＢＰ−７９９９、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌ
ｕｍｓｐ． ＦＥＲＭ Ｐ−１８５６４、ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−８０００のそれぞれの株は野生イネＯｒｙｚａ ｏ
ｆｆｉｃｉｎａｌｉｓと栽培イネＯｒｙｚａ ｓａｔｉ
ｖａに接種、定着させた際に内生菌数も高く、高いアセ
チレン還元活性を示した。これらを接種した野生イネＯ
ｒｙｚａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓと栽培イネＯｒｙｚ
ａ ｓａｔｉｖａにおいて、実際に窒素固定が行なわれ
ており、また生育促進効果と種子収量増加効果とが現わ
れることが明らかとなった。このことは化学合成窒素を
施肥している現在の稲作において肥料の削減と、収量増
加という効果が期待できる。化学合成肥料の使用量低下
によって、肥料製造の際に必要となる化石燃料の使用量
が減少されるとともに、もともと水田は窒素の流亡が少
ないが、過剰施肥による余剰の窒素の環境への流出を減
らすことが可能になり、環境への負担の低減や、稲作の
際のコストを抑えることができる効果を生ずる。
ＦＥＲＭ Ｐ−１８５６３、ＦＥＲＭ ＢＰ−７９９
８、ＦＥＲＭ ＢＰ−７９９９、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌ
ｕｍｓｐ． ＦＥＲＭ Ｐ−１８５６４、ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−８０００のそれぞれの株は野生イネＯｒｙｚａ ｏ
ｆｆｉｃｉｎａｌｉｓと栽培イネＯｒｙｚａ ｓａｔｉ
ｖａに接種、定着させた際に内生菌数も高く、高いアセ
チレン還元活性を示した。これらを接種した野生イネＯ
ｒｙｚａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓと栽培イネＯｒｙｚ
ａ ｓａｔｉｖａにおいて、実際に窒素固定が行なわれ
ており、また生育促進効果と種子収量増加効果とが現わ
れることが明らかとなった。このことは化学合成窒素を
施肥している現在の稲作において肥料の削減と、収量増
加という効果が期待できる。化学合成肥料の使用量低下
によって、肥料製造の際に必要となる化石燃料の使用量
が減少されるとともに、もともと水田は窒素の流亡が少
ないが、過剰施肥による余剰の窒素の環境への流出を減
らすことが可能になり、環境への負担の低減や、稲作の
際のコストを抑えることができる効果を生ずる。
【００１４】
【発明の実施の形態】本発明の一実施の形態に係るイネ
へのエンドファイトの導入をその手順に従って詳細に説
明する。
へのエンドファイトの導入をその手順に従って詳細に説
明する。
【００１５】（１）エンドファイトの分離培養
探索採取された天然に存在する植物体の植物片を７０％
エタノールに３０秒、２％次亜塩素酸ナトリウムに５分
間浸すことにより表面殺菌を行ない、その後植物体を乳
鉢で滅菌した生理食塩水と海砂を加えながら磨砕し、試
験管のレニー半流動培地に接種し、３０℃で培養して分
離する。
エタノールに３０秒、２％次亜塩素酸ナトリウムに５分
間浸すことにより表面殺菌を行ない、その後植物体を乳
鉢で滅菌した生理食塩水と海砂を加えながら磨砕し、試
験管のレニー半流動培地に接種し、３０℃で培養して分
離する。
【００１６】（２）エンドファイトの窒素固定活性の測
定 窒素固定酵素であるニトロゲナーゼは、アセチレンをエ
チレンに還元する働きを持つことから、ニトロゲナーゼ
活性を推定する指標としてアセチレン還元活性を評価す
ることができる。そこで分離した菌を試験管の蓋を滅菌
した二重ゴム栓に変えて試験管を密閉し、気相体積の５
％になるようにアセチレンを封入し、２５℃暗所に２４
時間インキュベートした。その後気体を取出し、ガスク
ロマトグラフィーにより生成したエチレン量を測定し、
ニトロゲナーゼ活性の評価を実施する。
定 窒素固定酵素であるニトロゲナーゼは、アセチレンをエ
チレンに還元する働きを持つことから、ニトロゲナーゼ
活性を推定する指標としてアセチレン還元活性を評価す
ることができる。そこで分離した菌を試験管の蓋を滅菌
した二重ゴム栓に変えて試験管を密閉し、気相体積の５
％になるようにアセチレンを封入し、２５℃暗所に２４
時間インキュベートした。その後気体を取出し、ガスク
ロマトグラフィーにより生成したエチレン量を測定し、
ニトロゲナーゼ活性の評価を実施する。
【００１７】（３）エンドファイトの同定
エチレンの生成が確認された菌は１６ｓｒＲＮＡ遺伝子
の解析によって同定を行なう。１６ｓｒＲＮＡ遺伝子領
域内部の順方向または逆方法の数種類のプライマを用意
し、２種類の向い合うプライマを選択し、菌株を溶解さ
せて抽出したＤＮＡ溶液をテンプレートとし、ＰＣＲ法
で伸長増幅を行なう。増幅されたＤＮＡ断片を精製して
塩やプライマを除去した後、１６ｓｒＲＮＡ遺伝子内の
約１．５ｋｂの塩基配列を決定する。塩基配列はＤＤＢ
Ｊ／ＧｅｎｅＢａｎｋ／ＥＭＢＬデータベースを用いて
相同性検索を行ない、その後に決定した塩基配列、その
塩基配列と相同性の高い属、種の１６ｓｒＲＮＡ遺伝子
塩基配列、その他広範囲の菌属、種の１６ｓｒＲＮＡ遺
伝子塩基配列の系統関係を系統樹作成プログラムＣｌａ
ｓｔａｌＷを用いて解析する。
の解析によって同定を行なう。１６ｓｒＲＮＡ遺伝子領
域内部の順方向または逆方法の数種類のプライマを用意
し、２種類の向い合うプライマを選択し、菌株を溶解さ
せて抽出したＤＮＡ溶液をテンプレートとし、ＰＣＲ法
で伸長増幅を行なう。増幅されたＤＮＡ断片を精製して
塩やプライマを除去した後、１６ｓｒＲＮＡ遺伝子内の
約１．５ｋｂの塩基配列を決定する。塩基配列はＤＤＢ
Ｊ／ＧｅｎｅＢａｎｋ／ＥＭＢＬデータベースを用いて
相同性検索を行ない、その後に決定した塩基配列、その
塩基配列と相同性の高い属、種の１６ｓｒＲＮＡ遺伝子
塩基配列、その他広範囲の菌属、種の１６ｓｒＲＮＡ遺
伝子塩基配列の系統関係を系統樹作成プログラムＣｌａ
ｓｔａｌＷを用いて解析する。
【００１８】（４）エンドファイトの標識
種が同定されたエンドファイトは接種後に植物体内で感
染を確認するために、一部をＧＦＰ標識する。ＧＦＰ
（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ）はオワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｉａ ｖｉｃｔｏｒ
ｉａ）から単離されたタンパク質であって、青色光また
は紫外光を当てると緑色の蛍光を発する。このＧＦＰを
生産する遺伝子、すなわちｇｆｐ遺伝子を導入する。腸
内細菌株以外では複製不可能なプラスミドｐＵＴ上に、
ｇｆｐ遺伝子２つと、カナマイシン耐性遺伝子がミニト
ランスポゾンを構成して存在しているプラスミドｐＵＴ
ｇｆｐｘ２がある。このプラスミドを電気遺伝子導入法
によって菌に導入する。
染を確認するために、一部をＧＦＰ標識する。ＧＦＰ
（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ）はオワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｉａ ｖｉｃｔｏｒ
ｉａ）から単離されたタンパク質であって、青色光また
は紫外光を当てると緑色の蛍光を発する。このＧＦＰを
生産する遺伝子、すなわちｇｆｐ遺伝子を導入する。腸
内細菌株以外では複製不可能なプラスミドｐＵＴ上に、
ｇｆｐ遺伝子２つと、カナマイシン耐性遺伝子がミニト
ランスポゾンを構成して存在しているプラスミドｐＵＴ
ｇｆｐｘ２がある。このプラスミドを電気遺伝子導入法
によって菌に導入する。
【００１９】（５）エンドファイトの導入
ＮＢ液体培地で培養後、対数増殖期の菌体を８０００Ｇ
（Ｇ：重加速度）、１ｍｉｎ遠心することにより集菌
し、生理食塩水に懸濁し、再び集菌することを３回繰返
して洗滌する。洗滌した菌体を生理食塩水に２×１０
７ ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように懸濁し、表面殺菌し
た種子に対して菌懸濁液を１種子当り５０μｌ（１×１
０６ ｃｅｌｌｓ）になるように種子上に乗せて接種を
行なう。
（Ｇ：重加速度）、１ｍｉｎ遠心することにより集菌
し、生理食塩水に懸濁し、再び集菌することを３回繰返
して洗滌する。洗滌した菌体を生理食塩水に２×１０
７ ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように懸濁し、表面殺菌し
た種子に対して菌懸濁液を１種子当り５０μｌ（１×１
０６ ｃｅｌｌｓ）になるように種子上に乗せて接種を
行なう。
【００２０】（６）導入の確認
ｇｆｐ遺伝子を導入した植物の組織片を蛍光顕微鏡を使
用して観察することで、エンドファイトの感染を確認す
ることができる。また組織を表面殺菌し、ＮＢ培地上に
置床することによってエンドファイトが分離される。
用して観察することで、エンドファイトの感染を確認す
ることができる。また組織を表面殺菌し、ＮＢ培地上に
置床することによってエンドファイトが分離される。
【００２１】（７）植物体での窒素固定活性の測定
イネ植物体を通風乾燥機に入れ、８０℃で３日間乾燥さ
せる。その後に粉砕し、粉末を燃焼法により石英ガラス
管内で窒素ガス化させ、ガスをＲＭＩ−２質量分析計を
用いて分析し、１５−Ｎ％を測定する。
せる。その後に粉砕し、粉末を燃焼法により石英ガラス
管内で窒素ガス化させ、ガスをＲＭＩ−２質量分析計を
用いて分析し、１５−Ｎ％を測定する。
【００２２】
【実施例】（１）イネ窒素固定エンドファイトの単離
土壌に天然に生育しているイネ科植物を適宜採取すると
ともにその植物体を切断し、７０％エタノールに３０
秒、２％次亜塩素酸ナトリウムに５分浸すことにより表
面殺菌を行なった。その後植物体を、乳鉢で殺菌した生
理食塩水と海砂を加えながら磨砕し、試験管のレニー半
流動培地を接種し、３０℃で培養した。
ともにその植物体を切断し、７０％エタノールに３０
秒、２％次亜塩素酸ナトリウムに５分浸すことにより表
面殺菌を行なった。その後植物体を、乳鉢で殺菌した生
理食塩水と海砂を加えながら磨砕し、試験管のレニー半
流動培地を接種し、３０℃で培養した。
【００２３】菌が生育したものはアセチレン還元活性を
測定した。アセチレン還元活性を示した試験管培地の濁
りやペリクルをピペットで取り、生理食塩水を用いて１
０− １から１０−９までの希釈系列を作成した。希釈さ
れた菌液をそれぞれ試験管レニー半流動培地に再接種し
培養した。レニー培地は、現在知られている窒素固定菌
の総てが生育可能な培地として知られているが、それ以
外の菌でも生育可能なものが存在する。従って希釈段階
が低いものでは窒素固定菌以外の菌種もより多く含む可
能性がある。そこで菌が生育しアセチレン還元活性が検
出された試験管培地の内で、最も希釈段階の進んだ試験
管培地の濁りやペリクルから、レニー寒天培地上でシン
グルコロニーを単離した。そして観察されたシングルコ
ロニーからアセチレン還元活性を示すコロニーを選択し
た。
測定した。アセチレン還元活性を示した試験管培地の濁
りやペリクルをピペットで取り、生理食塩水を用いて１
０− １から１０−９までの希釈系列を作成した。希釈さ
れた菌液をそれぞれ試験管レニー半流動培地に再接種し
培養した。レニー培地は、現在知られている窒素固定菌
の総てが生育可能な培地として知られているが、それ以
外の菌でも生育可能なものが存在する。従って希釈段階
が低いものでは窒素固定菌以外の菌種もより多く含む可
能性がある。そこで菌が生育しアセチレン還元活性が検
出された試験管培地の内で、最も希釈段階の進んだ試験
管培地の濁りやペリクルから、レニー寒天培地上でシン
グルコロニーを単離した。そして観察されたシングルコ
ロニーからアセチレン還元活性を示すコロニーを選択し
た。
【００２４】（２）エンドファイトの導入
ＰＣＲ法によって１６ｓｒＲＮＡ遺伝子領域を伸長増幅
し、塩基配列決定を行なった。１６ｓｒＲＮＡ遺伝子領
域内部の順方向または逆方向の数種類のプライマを用意
した。２種類の向い合うプライマを選択し、菌株を溶解
させ、抽出したＤＮＡ溶液をテンプレートとしてＰＣＲ
法を行なった。増幅されたＤＮＡ断片を精製し、塩やプ
ライマを除去した後に、塩基配列を決定した。１６ｓｒ
ＲＮＡ遺伝子内の約１．５ｋｂの塩基配列を決定した。
し、塩基配列決定を行なった。１６ｓｒＲＮＡ遺伝子領
域内部の順方向または逆方向の数種類のプライマを用意
した。２種類の向い合うプライマを選択し、菌株を溶解
させ、抽出したＤＮＡ溶液をテンプレートとしてＰＣＲ
法を行なった。増幅されたＤＮＡ断片を精製し、塩やプ
ライマを除去した後に、塩基配列を決定した。１６ｓｒ
ＲＮＡ遺伝子内の約１．５ｋｂの塩基配列を決定した。
【００２５】決定した塩基配列をＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＢ
ａｎｋ／ＥＭＢＬデータベースを用いて相同性検索を行
なった。その後、決定した塩基配列、その塩基配列と相
同性の高い属、種の１６ｓｒＲＮＡ遺伝子塩基配列、そ
の他広範囲の菌属および菌種の１６ｓｒＲＮＡ遺伝子塩
基配列の系統関係を系統樹作成プログラムＣｌａｓｔａ
ｌＷを用いて解析した。それを基に系統樹を作成した。
その結果Ｂ５０２株はＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属
であって、Ｂ５１０ａ株はＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属
に属することが明らかになった。
ａｎｋ／ＥＭＢＬデータベースを用いて相同性検索を行
なった。その後、決定した塩基配列、その塩基配列と相
同性の高い属、種の１６ｓｒＲＮＡ遺伝子塩基配列、そ
の他広範囲の菌属および菌種の１６ｓｒＲＮＡ遺伝子塩
基配列の系統関係を系統樹作成プログラムＣｌａｓｔａ
ｌＷを用いて解析した。それを基に系統樹を作成した。
その結果Ｂ５０２株はＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属
であって、Ｂ５１０ａ株はＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属
に属することが明らかになった。
【００２６】（３）Ｂ５０２株、Ｂ６５株を用いた標識
株の作成 細菌は植物組織内で観察が困難なために、自己発色する
タンパク質を生産する遺伝子を組込んだ。ＧＦＰ（Ｇｒ
ｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）は
オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｉａ ｖｉｃｔｏｒｉａ）
から単離されたタンパクである。青色光または紫外光を
当てると緑色の蛍光を発する。このＧＦＰの遺伝子、す
なわちｇｆｐ遺伝子が単離され菌株の標識に用いられて
いる。腸内細菌科以外では複製不可能なプラスミドｐＵ
Ｔ上に、ｇｆｐ遺伝子２つと、カナマイシン耐性遺伝子
がミニトランスポゾンを構成して存在しているプラスミ
ドｐＵＴｇｆｐｘ２がある。このプラスミドを電気遺伝
子導入法によってＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓ
ｐ． Ｂ５０２株およびＢ６５株に導入し、カナマイシ
ン耐性菌を単離した。この菌に５００ｎｍ付近の光を照
射し、蛍光を発することを確認した。
株の作成 細菌は植物組織内で観察が困難なために、自己発色する
タンパク質を生産する遺伝子を組込んだ。ＧＦＰ（Ｇｒ
ｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）は
オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｉａ ｖｉｃｔｏｒｉａ）
から単離されたタンパクである。青色光または紫外光を
当てると緑色の蛍光を発する。このＧＦＰの遺伝子、す
なわちｇｆｐ遺伝子が単離され菌株の標識に用いられて
いる。腸内細菌科以外では複製不可能なプラスミドｐＵ
Ｔ上に、ｇｆｐ遺伝子２つと、カナマイシン耐性遺伝子
がミニトランスポゾンを構成して存在しているプラスミ
ドｐＵＴｇｆｐｘ２がある。このプラスミドを電気遺伝
子導入法によってＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓ
ｐ． Ｂ５０２株およびＢ６５株に導入し、カナマイシ
ン耐性菌を単離した。この菌に５００ｎｍ付近の光を照
射し、蛍光を発することを確認した。
【００２７】（４）菌株の培養
Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｐ． ＦＥＲＭ Ｐ
−１８５６３、ＦＥＲＭ ＢＰ−７９９８、ＦＥＲＭ
ＢＰ−７９９９、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍｓｐ． Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１８５６４、ＦＥＲＭ ＢＰ−８０００の
それぞれの株をともに同様な培養方法で培養を行なっ
た。菌株のシングルコロニーをＮＢ培地上に接種し、３
０℃で振とう培養を行なった。
−１８５６３、ＦＥＲＭ ＢＰ−７９９８、ＦＥＲＭ
ＢＰ−７９９９、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍｓｐ． Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１８５６４、ＦＥＲＭ ＢＰ−８０００の
それぞれの株をともに同様な培養方法で培養を行なっ
た。菌株のシングルコロニーをＮＢ培地上に接種し、３
０℃で振とう培養を行なった。
【００２８】（５）イネへの接種
１．種子への菌付着による接種
ＮＢ培地上で培養後、対数増殖期の菌体を８０００Ｇ
（Ｇ：重加速度）、１ｍｉｎ遠心することにより集菌し
た。菌体を生理食塩水に懸濁し再び集菌することを３回
繰返し洗滌した。洗滌した菌体を生理食塩水に２×１０
７ ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように懸濁した。野生イネ
Ｏｒｙｚａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ、栽培イネＯｒｙ
ｚａ ｓａｔｉｖａの種子は籾を剥離し、７０％エタノ
ール中に数秒間浸漬し、直ぐに滅菌水で洗滌後に、０．
５％次亜塩素酸ナトリウム溶液で３０秒間振とうし、表
面殺菌処理を行なった。その後に滅菌水で１５分間振と
うを１０回繰返して洗滌した。プラントボックスまたは
試験管内の軟寒天イネ水耕液上に表面殺菌した種子を置
いた。上記の菌懸濁液を１種子当り５０μｌ（１×１０
６ ｃｅｌｌｓ）になるように種子上に乗せることによ
り菌の接種を行なった。
（Ｇ：重加速度）、１ｍｉｎ遠心することにより集菌し
た。菌体を生理食塩水に懸濁し再び集菌することを３回
繰返し洗滌した。洗滌した菌体を生理食塩水に２×１０
７ ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように懸濁した。野生イネ
Ｏｒｙｚａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ、栽培イネＯｒｙ
ｚａ ｓａｔｉｖａの種子は籾を剥離し、７０％エタノ
ール中に数秒間浸漬し、直ぐに滅菌水で洗滌後に、０．
５％次亜塩素酸ナトリウム溶液で３０秒間振とうし、表
面殺菌処理を行なった。その後に滅菌水で１５分間振と
うを１０回繰返して洗滌した。プラントボックスまたは
試験管内の軟寒天イネ水耕液上に表面殺菌した種子を置
いた。上記の菌懸濁液を１種子当り５０μｌ（１×１０
６ ｃｅｌｌｓ）になるように種子上に乗せることによ
り菌の接種を行なった。
【００２９】２．スリットによる接種
野生イネＯｒｙｚａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ、栽培イ
ネＯｒｙｚａ ｓａｔｉｖａの種子は籾を剥離し、７０
％エタノール中に数秒間漬けた後に滅菌水で洗滌後、
２．５％次亜塩素酸ナトリウム溶液中にて２０分間の表
面殺菌を行なった。その後滅菌水で洗滌を３回行なっ
た。表面殺菌を行なったイネ種子を寒天培地上に置床
し、２８℃暗黒下で２〜４日間培養して発芽させた。
ネＯｒｙｚａ ｓａｔｉｖａの種子は籾を剥離し、７０
％エタノール中に数秒間漬けた後に滅菌水で洗滌後、
２．５％次亜塩素酸ナトリウム溶液中にて２０分間の表
面殺菌を行なった。その後滅菌水で洗滌を３回行なっ
た。表面殺菌を行なったイネ種子を寒天培地上に置床
し、２８℃暗黒下で２〜４日間培養して発芽させた。
【００３０】ＮＢ培地で培養後、対数増殖期の菌体を３
０００ｒｐｍで１０分間遠心することによって集菌し
た。そして菌体を生理食塩水に懸濁し、再び集菌するこ
とを３回繰返して洗滌した。洗滌した菌体を生理食塩水
に１．０×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように生理
食塩水に懸濁した。
０００ｒｐｍで１０分間遠心することによって集菌し
た。そして菌体を生理食塩水に懸濁し、再び集菌するこ
とを３回繰返して洗滌した。洗滌した菌体を生理食塩水
に１．０×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように生理
食塩水に懸濁した。
【００３１】予め培養して発芽させた幼植物体の成長点
近傍にメスによって切込みを入れ、生理食塩水に懸濁し
た菌体をメスの先に適量付着させて、植物体内に挿入し
た。菌体を挿入した後に、試験管内の軟寒天イネ水耕液
上に植物体を置床させた。
近傍にメスによって切込みを入れ、生理食塩水に懸濁し
た菌体をメスの先に適量付着させて、植物体内に挿入し
た。菌体を挿入した後に、試験管内の軟寒天イネ水耕液
上に植物体を置床させた。
【００３２】（６）エンドファイト感染イネの増殖
１．プラントボックスまたは試験管での栽培
プラントボックスまたは試験管内にイネ軟寒天水耕液を
入れた。軟寒天水耕液上でＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｉ
ｕｍ ｓｐ． ＦＥＲＭ Ｐ−１８５６３、ＦＥＲＭ
ＢＰ−７９９８、ＦＥＲＭ ＢＰ−７９９９、Ａｚｏｓ
ｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｐ． ＦＥＲＭ Ｐ−１８５６
４、ＦＥＲＭ ＢＰ−８０００のそれぞれの株を接種し
た野生イネＯｒｙｚａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓおよび
栽培イネＯｒｙｚａ ｓａｔｉｖａを２５℃で明期１６
時間、暗期８時間の条件に放置し、無菌的に１０日から
１４日間イネの栽培を行なった。
入れた。軟寒天水耕液上でＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｉ
ｕｍ ｓｐ． ＦＥＲＭ Ｐ−１８５６３、ＦＥＲＭ
ＢＰ−７９９８、ＦＥＲＭ ＢＰ−７９９９、Ａｚｏｓ
ｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｐ． ＦＥＲＭ Ｐ−１８５６
４、ＦＥＲＭ ＢＰ−８０００のそれぞれの株を接種し
た野生イネＯｒｙｚａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓおよび
栽培イネＯｒｙｚａ ｓａｔｉｖａを２５℃で明期１６
時間、暗期８時間の条件に放置し、無菌的に１０日から
１４日間イネの栽培を行なった。
【００３３】２．ワグネルポットを用いた水耕栽培
プラントボックスで生育したイネの幼植物をイネ水耕液
を入れた１／５０００ａワグネルポットに移植し、明期
１１時間：２８℃、暗期１３時間：２２℃で登熟期まで
栽培を行なった。
を入れた１／５０００ａワグネルポットに移植し、明期
１１時間：２８℃、暗期１３時間：２２℃で登熟期まで
栽培を行なった。
【００３４】（７）感染の確認
１．蛍光顕微鏡による感染の確認
Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｐ． Ｂ５０２ ｇ
ｆｐ 変異株およびＢ６５株を接種した野生イネＯｒｙ
ｚａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓおよび栽培イネＯｒｙｚ
ａ ｓａｔｉｖａの幼植物を、蛍光実態顕微鏡で観察す
ることにより検討した。さらにイネ組織内のどこに定着
するか、野生イネＯｒｙｚａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ
幼植物の葉身を共焦点レーザ顕微鏡を用いて観察した。
その結果、Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｐ． Ｂ
５０２ ｇｆｐ変異株およびＢ６５株は野生イネＯｒｙ
ｚａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓの地上部および地下部へ
の多量の定着が観察され、また栽培イネＯｒｙｚａ ｓ
ａｔｉｖａにおいては、野生イネＯｒｙｚａ ｏｆｆｉ
ｃｉｎａｌｉｓよりも少ないが、主に地下部に定着が観
察された。またＨｅｒｂａｓｐｒｉｒｉｌｌｕｍ ｓ
ｐ． Ｂ５０２ ｇｆｐ変異株およびＢ６５株は、野生
イネＯｒｙｚａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓの細胞間隙に
定着することが明らかになった。
ｆｐ 変異株およびＢ６５株を接種した野生イネＯｒｙ
ｚａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓおよび栽培イネＯｒｙｚ
ａ ｓａｔｉｖａの幼植物を、蛍光実態顕微鏡で観察す
ることにより検討した。さらにイネ組織内のどこに定着
するか、野生イネＯｒｙｚａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ
幼植物の葉身を共焦点レーザ顕微鏡を用いて観察した。
その結果、Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｐ． Ｂ
５０２ ｇｆｐ変異株およびＢ６５株は野生イネＯｒｙ
ｚａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓの地上部および地下部へ
の多量の定着が観察され、また栽培イネＯｒｙｚａ ｓ
ａｔｉｖａにおいては、野生イネＯｒｙｚａ ｏｆｆｉ
ｃｉｎａｌｉｓよりも少ないが、主に地下部に定着が観
察された。またＨｅｒｂａｓｐｒｉｒｉｌｌｕｍ ｓ
ｐ． Ｂ５０２ ｇｆｐ変異株およびＢ６５株は、野生
イネＯｒｙｚａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓの細胞間隙に
定着することが明らかになった。
【００３５】さらにＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓ
ｐ． Ｂ５０２ ｇｆｐ変異株およびＢ６５株を接種し
た野生イネＯｒｙｚａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ、栽培
イネＯｒｙｚａ ｓａｔｉｖａを登熟期まで栽培した。
出穂期、開花期におけるイネ植物体を根部、茎と葉鞘
部、葉身部、穂部に分け、上述と同様に磨砕、ＮＢ寒天
培地に塗布を行ない、組織内定着性について検討を行な
った。その結果生育中後期においてもＨｅｒｂａｓｐｉ
ｒｉｌｌｕｍ ｓｐ． Ｂ５０２ ｇｆｐ変異株および
Ｂ６５株はイネ植物体内に多数定着し、それは主に根
部、茎と葉鞘部であることが明らかになった。
ｐ． Ｂ５０２ ｇｆｐ変異株およびＢ６５株を接種し
た野生イネＯｒｙｚａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ、栽培
イネＯｒｙｚａ ｓａｔｉｖａを登熟期まで栽培した。
出穂期、開花期におけるイネ植物体を根部、茎と葉鞘
部、葉身部、穂部に分け、上述と同様に磨砕、ＮＢ寒天
培地に塗布を行ない、組織内定着性について検討を行な
った。その結果生育中後期においてもＨｅｒｂａｓｐｉ
ｒｉｌｌｕｍ ｓｐ． Ｂ５０２ ｇｆｐ変異株および
Ｂ６５株はイネ植物体内に多数定着し、それは主に根
部、茎と葉鞘部であることが明らかになった。
【００３６】２．分離法による感染の確認
菌接種したイネを１０日間から１４日間栽培を行ない、
この幼植物全体を７０％エタノールに数秒間、１％次亜
塩素酸ナトリウムに３０秒間浸すことによって表面殺菌
を行なった。表面殺菌後に滅菌した乳鉢にて滅菌した生
理食塩水と海砂を加えながら植物体を磨砕し、ＮＢ寒天
培地に塗布した。生ずるコロニーを計数し接種菌の組織
内定着性について検討を行なった。その結果エンドファ
イトが分離され、Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓ
ｐ． Ｂ５０２株およびＢ６５株は野生イネＯｒｙｚａ
ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓと栽培イネＯｒｙｚａ ｓａ
ｔｉｖａに定着し、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｐ．
Ｂ５１０ａ株は栽培イネＯｒｙｚａ ｓａｔｉｖａに
定着することが明らかになった。
この幼植物全体を７０％エタノールに数秒間、１％次亜
塩素酸ナトリウムに３０秒間浸すことによって表面殺菌
を行なった。表面殺菌後に滅菌した乳鉢にて滅菌した生
理食塩水と海砂を加えながら植物体を磨砕し、ＮＢ寒天
培地に塗布した。生ずるコロニーを計数し接種菌の組織
内定着性について検討を行なった。その結果エンドファ
イトが分離され、Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓ
ｐ． Ｂ５０２株およびＢ６５株は野生イネＯｒｙｚａ
ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓと栽培イネＯｒｙｚａ ｓａ
ｔｉｖａに定着し、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｐ．
Ｂ５１０ａ株は栽培イネＯｒｙｚａ ｓａｔｉｖａに
定着することが明らかになった。
【００３７】（８）接種菌の窒素固定能の検討
１．アセチレン還元法による窒素固定能力の評価
窒素固定酵素、ニトロゲナーゼは、アセチレンをエチレ
ンに還元する働きを持つことから、ニトロゲナーゼ活性
を推定する指標としてアセチレン還元活性を評価するこ
とが可能である。Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓ
ｐ． Ｂ５０２株およびＢ６５株を接種した野生イネＯ
ｒｙｚａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓと栽培イネＯｒｙｚ
ａ ｓａｔｉｖａ、およびＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ
ｓｐ． Ｂ５１０ａ株を接種した栽培イネＯｒｙｚａ
ｓａｔｉｖａを試験管で１０日間培養した。菌無接種の
イネ個体をコントロールとして用いた。
ンに還元する働きを持つことから、ニトロゲナーゼ活性
を推定する指標としてアセチレン還元活性を評価するこ
とが可能である。Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓ
ｐ． Ｂ５０２株およびＢ６５株を接種した野生イネＯ
ｒｙｚａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓと栽培イネＯｒｙｚ
ａ ｓａｔｉｖａ、およびＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ
ｓｐ． Ｂ５１０ａ株を接種した栽培イネＯｒｙｚａ
ｓａｔｉｖａを試験管で１０日間培養した。菌無接種の
イネ個体をコントロールとして用いた。
【００３８】その後試験管の蓋をオートクレーブ滅菌し
た二重ゴム栓に変え、試験管を密閉した。そして気相体
積の５％になるようにアセレチレンを封入し、２５℃暗
所に２４時間インキュベートした。その後に気体を取出
し、ガスクロマトフィーにより生成したアセチレン量を
測定し、ニトロゲナーゼ活性の評価を行なった。その結
果、これら３種類の総ての組合わせでアセチレン還元活
性が観測された。従って接種菌がイネ植物体に定着し、
接種菌のニトロゲナーゼ活性が発現することが明らかに
なった。活性はＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｐ．
Ｂ５０２株を接種した野生イネＯｒｙｚａ ｏｆｆｉ
ｃｉｎａｌｉｓ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｐ．
Ｂ５１０ａ株を接種した栽培イネＯｒｙｚａ ｓａｔｉ
ｖａ、Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｐ． Ｂ５０
２株を接種した栽培イネＯｒｙｚａ ｓａｔｉｖａの順
であった。
た二重ゴム栓に変え、試験管を密閉した。そして気相体
積の５％になるようにアセレチレンを封入し、２５℃暗
所に２４時間インキュベートした。その後に気体を取出
し、ガスクロマトフィーにより生成したアセチレン量を
測定し、ニトロゲナーゼ活性の評価を行なった。その結
果、これら３種類の総ての組合わせでアセチレン還元活
性が観測された。従って接種菌がイネ植物体に定着し、
接種菌のニトロゲナーゼ活性が発現することが明らかに
なった。活性はＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｐ．
Ｂ５０２株を接種した野生イネＯｒｙｚａ ｏｆｆｉ
ｃｉｎａｌｉｓ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｐ．
Ｂ５１０ａ株を接種した栽培イネＯｒｙｚａ ｓａｔｉ
ｖａ、Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｐ． Ｂ５０
２株を接種した栽培イネＯｒｙｚａ ｓａｔｉｖａの順
であった。
【００３９】またＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓ
ｐ． Ｂ５０２株およびＢ６５株を接種した野生イネＯ
ｒｙｚａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓと栽培イネＯｒｙｚ
ａ ｓａｔｉｖａをプラントボックスで無菌的に１４日
間栽培した。イネ植物体を採取し、１％次亜塩素酸ナト
リウムに３０秒間浸漬して表面殺菌を行なった後、バイ
アル瓶に入れて栓をした。そして上記と同様にアセチレ
ンを封入し、インキュベートを行ない、アセチレン還元
活性を測定した。その結果上記と同様に菌接種区のイネ
はアセチレン還元活性を示した。従って植物体表面では
なく、内部に定着した接種菌によりアセチレン還元活性
を示していることが明らかになった。
ｐ． Ｂ５０２株およびＢ６５株を接種した野生イネＯ
ｒｙｚａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓと栽培イネＯｒｙｚ
ａ ｓａｔｉｖａをプラントボックスで無菌的に１４日
間栽培した。イネ植物体を採取し、１％次亜塩素酸ナト
リウムに３０秒間浸漬して表面殺菌を行なった後、バイ
アル瓶に入れて栓をした。そして上記と同様にアセチレ
ンを封入し、インキュベートを行ない、アセチレン還元
活性を測定した。その結果上記と同様に菌接種区のイネ
はアセチレン還元活性を示した。従って植物体表面では
なく、内部に定着した接種菌によりアセチレン還元活性
を示していることが明らかになった。
【００４０】２．Ｎ−１５を用いた窒素固定能力の評価
サンプリングしたイネ植物体を通風乾燥機に入れ、８０
℃で３日間乾燥させた。その後粉砕し、粉末を燃焼法に
よって石英ガラス管内で窒素ガス化させた。ガスをＲＭ
Ｉ−２質量分析計を用いて分析し、１５−Ｎ％を測定し
た。Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｐ． Ｂ５０２
ｇｆｐ変異株無接種の植物と比較し、接種区の植物中
の１５−Ｎがどの程度１４−Ｎに置き換わっているかを
検討することによって、接種菌の窒素固定能の推定を行
なった。
℃で３日間乾燥させた。その後粉砕し、粉末を燃焼法に
よって石英ガラス管内で窒素ガス化させた。ガスをＲＭ
Ｉ−２質量分析計を用いて分析し、１５−Ｎ％を測定し
た。Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｐ． Ｂ５０２
ｇｆｐ変異株無接種の植物と比較し、接種区の植物中
の１５−Ｎがどの程度１４−Ｎに置き換わっているかを
検討することによって、接種菌の窒素固定能の推定を行
なった。
【００４１】Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｐ．
Ｂ５０２株を接種した野生イネＯｒｙｚａ ｏｆｆｉｃ
ｉｎａｌｉｓと栽培イネＯｒｙｚａ ｓａｔｉｖａを１
／５０００ａワグネルポットに移植し、環境制御装置を
用い、明期３０℃で１１時間、暗期２４℃で１３時間の
条件で、登熟期まで栽培を行なった。このときに出穂期
まではイネ水耕液の窒素養分として硝酸態窒素、アンモ
ニア態窒素ともに重窒素で置換された（９９．３ａｔｏ
ｍ％）硝酸アンモニウムを用いた。
Ｂ５０２株を接種した野生イネＯｒｙｚａ ｏｆｆｉｃ
ｉｎａｌｉｓと栽培イネＯｒｙｚａ ｓａｔｉｖａを１
／５０００ａワグネルポットに移植し、環境制御装置を
用い、明期３０℃で１１時間、暗期２４℃で１３時間の
条件で、登熟期まで栽培を行なった。このときに出穂期
まではイネ水耕液の窒素養分として硝酸態窒素、アンモ
ニア態窒素ともに重窒素で置換された（９９．３ａｔｏ
ｍ％）硝酸アンモニウムを用いた。
【００４２】出穂期から登熟期にかけての約１カ月間
は、無窒素水耕液で栽培を行ない、その間にイネ植物体
中の重窒素が水耕液以外を由来とする大気中の窒素等の
他の窒素により希釈される割合、すなわちＮＤＦＡ％
（Ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｏｔ
ｈｅｒ ｓｏｕｒｃｅｓ ｓｕｃｈ ａｓ ｓｅｅｄ
ａｎｄ ａｉｒ）を測定した。菌接種区および無接種区
でその割合を比較することにより、接種菌による窒素固
定を検討した。その結果栽培イネＯｒｙｚａ ｓａｔｉ
ｖａにおいて、菌接種区のＮＤＦＡ％が有意に増加して
いた。従って生育中後期においても接種菌が内生したイ
ネが窒素固定を行なうことが明らかになった。また植物
体の生育にも差が見られ、菌接種区の植物の生育が促進
された。またさらに種子生産量も増加したことが確認さ
れた。
は、無窒素水耕液で栽培を行ない、その間にイネ植物体
中の重窒素が水耕液以外を由来とする大気中の窒素等の
他の窒素により希釈される割合、すなわちＮＤＦＡ％
（Ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｏｔ
ｈｅｒ ｓｏｕｒｃｅｓ ｓｕｃｈ ａｓ ｓｅｅｄ
ａｎｄ ａｉｒ）を測定した。菌接種区および無接種区
でその割合を比較することにより、接種菌による窒素固
定を検討した。その結果栽培イネＯｒｙｚａ ｓａｔｉ
ｖａにおいて、菌接種区のＮＤＦＡ％が有意に増加して
いた。従って生育中後期においても接種菌が内生したイ
ネが窒素固定を行なうことが明らかになった。また植物
体の生育にも差が見られ、菌接種区の植物の生育が促進
された。またさらに種子生産量も増加したことが確認さ
れた。
【００４３】
【発明の効果】本願の主要な発明は、細菌から成る共生
菌が存在しない植物体に細菌から成る共生菌を導入して
成るイネおよびイネに対する共生菌の導入方法に関す
る。従ってこのイネに導入された細菌が窒素固定を行な
うことによって、生育促進効果と種子収量増加効果が現
われる。また栽培イネに適用することによって、肥料の
削減と収量の増加が期待できるとともに、化学合成肥料
の使用量を少なくすることによって、環境への負担や稲
作のコストの低減を図ることが可能になる。
菌が存在しない植物体に細菌から成る共生菌を導入して
成るイネおよびイネに対する共生菌の導入方法に関す
る。従ってこのイネに導入された細菌が窒素固定を行な
うことによって、生育促進効果と種子収量増加効果が現
われる。また栽培イネに適用することによって、肥料の
削減と収量の増加が期待できるとともに、化学合成肥料
の使用量を少なくすることによって、環境への負担や稲
作のコストの低減を図ることが可能になる。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
(Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:01
Ｃ１２Ｒ 1:01）
(72)発明者 比留間 直也
静岡県富士宮市万野原新田3278番地26号サ
ングリーン荻原Ａ−201号
(72)発明者 今田 隆弘
静岡県富士宮市淀師270番地３号ヴェルデ
淀師Ａ304号
(72)発明者 野田 宗弘
静岡県富士宮市北山5018番地１号
(72)発明者 栗原 庸輔
東京都杉並区方南１丁目32番１号
(72)発明者 金 まどか
静岡県富士宮市大岩177番地２号コーポ桑
山202号
Ｆターム(参考） 2B030 AA07 AB03 AD08 AD20 CA28
CB01 CD07
4B065 AA01X AB01 AC14 AC20
BA01 BA22 CA53
Claims (11)
- 【請求項１】細菌から成る共生菌が存在しない植物体に
細菌から成る共生菌を人為的に導入して成るイネ。 - 【請求項２】前記イネに導入された共生菌がイネに対し
て窒素固定を行なう共生菌であることを特徴とする請求
項１に記載のイネ。 - 【請求項３】前記イネに導入された共生菌が特許生物寄
託センターに寄託されたＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ
ＦＥＲＭ Ｐ−１８５６３、ＦＥＲＭ ＢＰ−７９９
８、ＦＥＲＭ ＢＰ−７９９９、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌ
ｕｍ ＦＥＲＭ Ｐ−１８５６４またはＦＥＲＭ ＢＰ
−８０００であることを特徴とする請求項１に記載のイ
ネ。 - 【請求項４】共生菌が導入されるイネが栽培イネＯｒｙ
ｚａ ｓａｔｉｖａまたは野生イネＯｒｙｚａ ｏｆｆ
ｉｃｉｎａｌｉｓの何れかの植物であることを特徴とす
る請求項１に記載のイネ。 - 【請求項５】植物に共生している細菌から成る共生菌を
分離して増殖する工程と、人工増殖させた共生菌をイネ
に人工接種する工程と、人工接種した共生菌をイネに感
染させて共生する工程と、を具備するイネへの共生菌の
導入方法。 - 【請求項６】前記イネに導入された共生菌が特許生物寄
託センターに寄託されたＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ
ＦＥＲＭ Ｐ−１８５６３、ＦＥＲＭ ＢＰ−７９９
８、ＦＥＲＭ ＢＰ−７９９９、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌ
ｕｍ ＦＥＲＭ Ｐ−１８５６４またはＦＥＲＭ ＢＰ
−８０００であることを特徴とする請求項５に記載のイ
ネへの共生菌の導入方法。 - 【請求項７】細菌が共生していると推定される植物を磨
砕し、培地上に接種して培養により細菌を分離すること
を特徴とする請求項５に記載のイネへの共生菌の導入方
法。 - 【請求項８】分離した菌をアセチレンを封入した容器内
に入れて密封し、前記アセチレンが還元されて生成した
エチレンの量により分離された菌の窒素固定活性を測定
して細菌を選抜することを特徴とする請求項５に記載の
イネへの共生菌の導入方法。 - 【請求項９】分離した菌のＤＮＡをＰＣＲ法により増幅
するとともに、増幅されたＤＮＡを相同性検索を行なっ
て菌の特定をすることを特徴とする請求項５に記載のイ
ネへの共生菌の導入方法。 - 【請求項１０】識別手段を発現するような外来遺伝子を
前記細菌に導入し、植物体に感染した前記細菌の定着を
前記外来遺伝子による識別手段によって確認することを
特徴とする請求項５に記載のイネへの共生菌の導入方
法。 - 【請求項１１】細菌を接種して共生させた植物体をアセ
チレンを封入した容器に入れて密封し、前記アセチレン
が還元されて生成したエチレンの量により細菌が導入さ
れた植物体の窒素固定能を評価することを特徴とする請
求項５に記載のイネへの共生菌の導入方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003006988A JP2003274779A (ja) | 2002-01-15 | 2003-01-15 | イネおよびイネへの共生菌の導入方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002-6534 | 2002-01-15 | ||
| JP2002006534 | 2002-01-15 | ||
| JP2003006988A JP2003274779A (ja) | 2002-01-15 | 2003-01-15 | イネおよびイネへの共生菌の導入方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003274779A true JP2003274779A (ja) | 2003-09-30 |
Family
ID=29217912
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003006988A Pending JP2003274779A (ja) | 2002-01-15 | 2003-01-15 | イネおよびイネへの共生菌の導入方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003274779A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007100162A1 (ja) * | 2006-03-03 | 2007-09-07 | Mayekawa Mfg. Co., Ltd. | 新規細菌及びそれを用いた植物病害の防除方法 |
| JP2009051771A (ja) * | 2007-08-27 | 2009-03-12 | Mayekawa Mfg Co Ltd | Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属細菌の新規用途 |
| JP2015502751A (ja) * | 2011-12-13 | 2015-01-29 | モンサント テクノロジー エルエルシー | 植物成長促進微生物およびその使用 |
-
2003
- 2003-01-15 JP JP2003006988A patent/JP2003274779A/ja active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007100162A1 (ja) * | 2006-03-03 | 2007-09-07 | Mayekawa Mfg. Co., Ltd. | 新規細菌及びそれを用いた植物病害の防除方法 |
| JP5120849B2 (ja) * | 2006-03-03 | 2013-01-16 | 株式会社前川製作所 | 新規細菌及びそれを用いた植物病害の防除方法 |
| US8728459B2 (en) | 2006-03-03 | 2014-05-20 | Mayekawa Mfg. Co., Ltd. | Bacteria and method for controlling plant disease using the same |
| JP2009051771A (ja) * | 2007-08-27 | 2009-03-12 | Mayekawa Mfg Co Ltd | Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属細菌の新規用途 |
| JP2015502751A (ja) * | 2011-12-13 | 2015-01-29 | モンサント テクノロジー エルエルシー | 植物成長促進微生物およびその使用 |
| JP2018011600A (ja) * | 2011-12-13 | 2018-01-25 | モンサント テクノロジー エルエルシー | 植物成長促進微生物およびその使用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7084331B2 (en) | Rice containing endophytic bacteria and method of producing it | |
| Wei et al. | Endophytic nitrogen-fixing Klebsiella variicola strain DX120E promotes sugarcane growth | |
| Stoltzfus et al. | Isolation of endophytic bacteria from rice and assessment of their potential for supplying rice with biologically fixed nitrogen | |
| Duhoux et al. | Angiosperm Gymnostoma trees produce root nodules colonized by arbuscular mycorrhizal fungi related to Glomus | |
| US4599312A (en) | Method of producing endomycorrhizian fungi with arbuscules and vesicles in vitro | |
| Gantar et al. | Colonization of wheat (Triticum vulgare L.) by N2‐fixing cyanobacteria: IV. Dark nitrogenase activity and effects of cyanobacteria on natural 15N abundance in the plants | |
| CN109429971B (zh) | 丛枝菌根真菌菌剂的制备方法 | |
| CN108260470A (zh) | 一种提高松茸菌根化育苗的方法及应用 | |
| Chaurasia et al. | Hordeum vulgare: a suitable host for mass production of arbuscular mycorrhizal fungi from natural soil | |
| Puri et al. | A new system using Solanum tuberosum for the co-cultivation of Glomus intraradices and its potential for mass producing spores of arbuscular mycorrhizal fungi | |
| Sharma et al. | Mass multiplication of arbuscular mycorrhizal fungi | |
| Lesueur et al. | Improvement of forage production in Calliandra calothyrsus: methodology for the identification of an effective inoculum containing Rhizobium strains and arbuscular mycorrhizal isolates | |
| CN111849837A (zh) | 一种促进植物种子萌发和/或幼苗生长的方法 | |
| JP2003274779A (ja) | イネおよびイネへの共生菌の導入方法 | |
| Lestari et al. | Microscopic Characterization of Fusarium sp. associated with yellow disease of pepper (Piper nigrum L.) in South Bangka Regency | |
| KOBAYASHI et al. | Two-year survival of Tricholoma matsutake ectomycorrhizas on Pinus densiflora seedlings after outplanting to a pine forest | |
| Souza et al. | Strains of Paraburkholderia originated from rupestrian fields promote the growth of Mimosa foliolosa | |
| US11363820B2 (en) | Method for selecting plant symbiotic microbes, and microbial mixture | |
| Rodrigues et al. | Arbuscular mycorrhizae: Natural ecological engineers for agro-ecosystem sustainability | |
| Ladha et al. | Opportunities for Biological Nitrogen Fixation in Rice and Other Non-legumes: Papers Presented at the Second Working Group Meeting of the Frontier Project on Nitrogen Fixation in Rice Held at the National Institute for Biotechnology and Genetic Engineering (NIBGE), Faisalabad, Pakistan, 13-15 October 1996 | |
| Jeon et al. | First description of crown gall disease on ginseng | |
| WO2003034807A1 (fr) | Bouture racinee et procede d'inoculation de bouture racinee avec une souche microbienne | |
| Sampaio et al. | Morphophysiological characterization of rhizobia isolated from wild genotypes of the common bean. | |
| CN109439590B (zh) | 一株决明属根瘤菌wys3r1 及其应用 | |
| Ndobe | Fungi associated with roots of healthy-looking Scots pines and Norway spruce seedlings grown in nine Swedish forest nurseries |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20051013 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090225 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090427 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20090427 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20090624 |