CN106755278B - 人员防护装备防护性能评价用细菌标准物质及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人员防护装备微生物防护性能评价用细菌标准物质及其制备方法。该标准物质由含粘质沙雷氏菌菌体和保护剂的冻干物以及用于菌体冻干物复水的稳定剂水溶液组成。经实验证明，该标准物质具有良好的均匀性和稳定性，在用于人员防护装备防护性能评价中使用方便，可以节省人力和时间，大大提高人员防护装备防护性能评价效率。本发明还提供了该标准物质的定值方法，可以确保粘质沙雷氏菌活菌浓度精确，提高了人员防护装备性能评价的准确性。

Description

人员防护装备防护性能评价用细菌标准物质及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种用于评价人员防护装备防护性能的细菌标准物质及其制备方法，属于生物安全技术领域。
背景技术：
人员防护装备和设施在隔离传染源，阻断微生物气溶胶的传播途径和保护易感人群三方面均发挥着重要作用，生物安全柜、生物防护口罩、生物防护服等，都是防护和阻断呼吸道传染病病原传播感染最有效的常用人员防护装备。在这些防护装备的性能评价中，微生物防护性能评价最为关键。
粘质沙雷氏菌是一种传统的空气生物学模式菌，其粒谱集中在3.3-0.65μm。经过很多学者研究表明，粘质沙雷菌具有典型的菌落颜色、耐雾化能力强、容易消毒避免对环境造成污染等优点，适合作为生物检测指示菌，应用于生物安全柜等人员防护装备的防护性能评价中。
但是，在人员防护装备防护性能测试的实际现场实验中，检验人员往往只能根据工作经验配制指示细菌悬液，很难保证其量值完全一致。此外，配制指示细菌悬液的过程比较繁琐，而且浪费大量人力、物力和时间，从而大大影响了评价结果的准确性和评价工作的效率。因此，为保证人员防护装备防护性能评价的准确性和可比性，非常有必要制备一种人员防护装备防护性能评价用细菌标准物质。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种人员防护装备微生物防护性能评价的细菌标准物质，以及所述标准物质的制备方法。
为实施上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种人员防护装备微生物防护性能评价用细菌标准物质，其特征在于，包括有粘质沙雷氏菌。
所述粘质沙雷氏菌用2mL稳定剂水溶液复水后，粘质沙雷氏菌活菌浓度为0.5×1010～5.0×1010CFU/mL。
所述的标准物质，由两个组分组成：
1)粘质沙雷氏菌，为含粘质沙雷氏菌菌体和菌体保护剂的冻干物；
2)用于菌体冻干物复水的稳定剂水溶液。
所述菌体保护剂，其成分选自葡萄糖、明胶、卵黄中的一种或多种；
所述冻干物优选为饼状或球状；
所述稳定剂水溶液含无机盐、牛血清白蛋白和抗坏血酸。
制成所述菌体保护剂的原料组成为：葡萄糖0～10重量份，明胶0～10重量份，卵黄0～10重量份；优选的组成为：葡萄糖5～7重量份，明胶1～2重量份，卵黄2～3重量份。
所述稳定剂水溶液中各成分的质量体积百分比：0.1～1.0％的氯化钠、0.1～1.0％的牛血清白蛋白和0.2～2％的抗坏血酸，其余是水。
上述标准物质的制备方法，其特征是，用生理盐水将粘质沙雷氏菌菌体稀释至1010级，将配制成新鲜菌匀液与保护剂按照1:1的体积比混合，于-70℃下预冻4h后冻干，得到所述标准物质。
所用的粘质沙雷氏菌的培养方法是：挑取单菌落于已高压灭菌的营养肉汤中，30℃±1℃下，180×g摇床培养12h。
制备得到的标准物质于-20℃下保存。
所述标准物质的定值方法，为营养琼脂平板涂布法，具体操作如下：
用2mL稳定剂水溶液对标准物质进行复水溶解，充分混匀后制备成S0样品匀液；
再用无菌磷酸盐缓冲液对充分溶解后的样品S0进行10倍系列稀释；根据给出的粘质沙雷氏菌活菌浓度范围进行估算，选择三个稀释度的样品匀液，每个稀释度分别吸取0.2mL样品匀液涂布于营养琼脂平板，将平板静置10min后，倒置于培养箱，30℃±1℃下培养12～24h；
选择有典型的粘质沙雷氏菌菌落且菌落数在15CFU～150CFU之间的平板，计数典型菌落数和记录稀释因子；菌落计数以菌落形成单位CFU表示，实验结果以活菌浓度表示，计数该稀释度平板上的典型菌落，计算标准值；定值结果表示为：标准值±扩展不确定度。
所述计算标准值，按如下公式：
Figure BDA0001169859310000021
式中，
C为粘质沙雷氏菌活菌浓度，CFU/mL；
N为平板上粘质沙雷氏菌典型菌落的总数，CFU；
d为稀释因子，无量纲；
v为平板上粘质沙雷氏菌匀液的接种体积，mL。
本发明的优点如下：
1、本发明提供的保护剂配方可以有效降低粘质沙雷氏菌在冷冻干燥过程中的死亡率
通过对保护剂成分的筛选和优化，找到了适合粘质沙雷氏菌稳定保存的冻干保护剂配方。
2、本发明提供的用于菌体冻干物复水的稳定剂水溶液可以保证标准物质复水溶解后在4℃下稳定保存8小时。
3、制备的细菌标准物质在4℃下，可储存14天；在-20℃下可长期储存，且便于运输，其均匀性、稳定性符合人员防护装备防护性能评价工作的要求。
4、该标准物质使用方便，按照使用说明将第二组分加入第一组分中进行复水溶解后，即可使用，避免了每次现场测试评价前，人工配制指示菌匀液耗时和操作繁琐的缺点。
5、通过对平板计数方法的优化，建立了适合粘质沙雷氏菌标准物质的定值方法——营养琼脂平板涂布法，并建立了定值结果的计算公式。
附图说明：
图1粘质沙雷氏菌的生长曲线；
图2标准物质的短期稳定性考察结果；
图3标准物质的长期稳定性考察结果。
具体实施方式
以下结合具体实施方式详细说明本发明技术方案，并不以此限定本发明的实施范围。凡依照本发明公开内容所做的本领域等同替换，均属于本发明的保护范围。
实施例1人员防护装备防护性能评价用细菌标准物质(粘质沙雷氏菌标准物质)的制备
一、材料、仪器与方法
1.试验材料
粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)标准菌株ATCC8039(军事医学科学院微生物流行病研究所菌种保藏库)；营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、磷酸缓冲盐液(Phosphate Buffered Saline，PBS)、无菌生理盐水(0.85％)(北京陆桥技术有限责任公司)；氯化钠、牛血清白蛋白、抗坏血酸、葡萄糖、明胶、卵黄(美国Sigma公司)；棕色西林瓶(深圳市宝安区沙井博海玻璃制品厂)。
2.仪器与设备
Beta1-8LD plus冷冻干燥机(德国Christ公司)；CR21G高速冷冻离心机(日本Hitachi公司)；HVE-50高压灭菌锅(日本Hirayama公司)；HWS-400恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司)；Milli-Q Advantage纯水仪(美国Millipore公司)；CP225D电子天平(德国Sartorius公司)。
3.主要培养基的配制
(1)营养肉汤(NB)
称取10.0g蛋白胨，3.0g牛肉粉，1.0g葡萄糖，5.0g氯化钠于1L蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，调pH值至7.5±0.2，分装试管，121℃高压灭菌15min备用。
(2)营养琼脂(NA)
称取10.0g蛋白胨，3.0g牛肉粉，5.0g氯化钠，15.0g琼脂于1L蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，调pH值至7.3±0.2，分装试管，121℃高压灭菌15min备用。
(3)磷酸盐(PBS)缓冲液
pH7.2～7.4PBS的磷酸盐储存液：磷酸二氢钾34.0g，氢氧化钠7.0g，加蒸馏水溶解，调节pH值后用容量瓶定容至1000mL，装入高压灭菌瓶，121℃高压灭菌30min；
pH7.2～7.4PBS的磷酸盐稀释液：取1.25mL磷酸盐储存液加入蒸馏水，调节pH值后用容量瓶定容至1000mL，装入高压灭菌瓶，121℃高压灭菌30min；
4.菌种复活、鉴定与培养
吸取1mL无菌生理盐水于标准粘质沙雷氏菌菌种冻存管中，待其溶解后，用无菌接种环沾取少量菌液，接种于营养琼脂平板上，37℃±1℃培养18-24h，复苏菌种。挑取单菌落接种于营养肉汤培养基37℃±1℃下培养12h。
5.粘质沙雷氏菌标准菌株生长曲线的绘制
将培养好的液态菌种100μl加入100mL已灭菌的营养肉汤中，30℃摇床，180×g培养，每隔1h取一次样，以粘质沙雷氏菌菌液的培养时间为横坐标,每次所测得的菌液的平均A600值为纵坐标，绘制出其生长曲线。
6.保护剂的配制
选择葡萄糖、明胶、卵黄中的一种或多种作为菌体保护剂成分。其重量百分比分别为5～7％的葡萄糖、1～2％的明胶、2～3％的卵黄。冻干保护剂用磷酸盐缓冲液溶解；且保护剂和磷酸盐缓冲液均需要灭菌；灭菌方法为辐照灭菌或高压灭菌；比如，冷冻干燥保护剂经过4kGy的Co60进行辐照灭菌，磷酸盐缓冲液采用高温高压灭菌121℃，20min。
7.冻干
挑取单菌落于已高压灭菌的营养肉汤中，30℃±1℃下，180×g摇床培养12h后，用高速冷冻离心机离心收集菌体，用生理盐水稀释至1010级，将保护剂与生理盐水稀释至1010级的新鲜菌匀液按照1:1比例配制混合液，用移液器分装2mL至棕色西林瓶中，共制备200个单元。将制备好的样品于-70℃下预冻4h后冻干。冻干采用的参数主要为冷阱温度-50℃，冻干温度-40℃，隔板最终温度25℃，冻干压力0.037mbar。
8.冻干存活率检测
取3份冻干前粘质沙雷氏菌与冻干保护剂的混合液，每份各2mL，采用经验证的营养琼脂平板涂布法测定其活菌浓度。随即取3个单元粘质沙雷氏菌冻干标准物质，用2mL磷酸盐缓冲液作为稀释液将粘质沙雷氏菌冻干样品进行复溶后，同样采用经验证的营养琼脂平板涂布法测定其活菌浓度。采用公式①计算冻干存活率(freeze-drying viability,FDV)。
Figure BDA0001169859310000041
式中，FDV为粘质沙雷氏菌冻干存活率；C1为冻干前粘质沙雷氏菌活菌浓度；C2为冻干后粘质沙雷氏菌活菌浓度。
9.标准物质的定值
每批次至少抽取9个单元的标准物质进行定值实验。每个单元均按照以下步骤完成实验：用2mL稳定剂水溶液对标准物质进行复水溶解，充分混匀后制备成S0样品匀液；再用无菌磷酸盐缓冲液对充分溶解后的样品S0进行10倍系列稀释；根据给出的粘质沙雷氏菌活菌浓度范围进行估算，选择三个稀释度的样品匀液，每个稀释度分别吸取0.2mL样品匀液涂布于营养琼脂平板，将平板静置10min后，倒置于培养箱，30℃±1℃下培养12～24h；选择有典型的粘质沙雷氏菌菌落且菌落数在15CFU～150CFU之间的平板，计数典型菌落数和记录稀释因子。菌落计数以菌落形成单位(colony-forming units，CFU)表示，实验结果以活菌浓度(CFU/mL)表示，计数该稀释度平板上的典型菌落，按公式②计算结果。
Figure BDA0001169859310000051
式中，C为粘质沙雷氏菌活菌浓度；N为平板上粘质沙雷氏菌典型菌落的总数；m为典型菌落数在15CFU～150CFU范围的平板数；d为稀释因子；v为平板上粘质沙雷氏菌匀液接种体积。
10.标准物质的保存
制备好的标准物质于-20℃下保存。
二、实验结果
1.粘质沙雷氏菌生长曲线测定结果
将培养好的液态菌种100μl加入100mL已灭菌的营养肉汤中，30℃摇床，180×g培养，每隔1h取一次样，以粘质沙雷氏菌菌液的培养时间为横坐标,每次所测得的菌液的平均吸光值A600为纵坐标，绘制出其生长曲线(图1)，粘质沙雷氏菌的生长曲线分为四个时期，即起始期、对数期、稳定期和凋亡期。该菌大约在3～4h后进入对数生长期；大约在16h左右进入稳定期，最后进入衰亡期。当菌液培养到对数期的中后期时，此阶段的菌液活性最佳，因此选择培养12h为菌体收获期。
2.冻干存活率检测结果
取3份冻干前粘质沙雷氏菌与冻干保护剂的混合液，每份各2mL，采用经验证的营养
琼脂平板涂布法测定其活菌浓度。随即取3个单元粘质沙雷氏菌冻干标准物质，用2mL磷酸盐缓冲液作为稀释液将粘质沙雷氏菌冻干样品进行复溶后，同样采用经验证的营养琼脂平板涂布法测定其活菌浓度。采用公式①计算冻干存活率为92.14％，检测数据与计算结果见表1，证明该粘质沙雷氏菌与保护剂混合后具有极高的存活率。
Figure BDA0001169859310000061
表1粘质沙雷氏菌冻干存活率检测结果
Figure BDA0001169859310000062
3.标准物质的定值结果
将随机抽取的9个单元的标准物质分别采用营养琼脂平板涂布法进行测试，每个单元标准物质重复3次。
将培养后的平板放置在生物安全柜中观察，选择有典型的粘质沙雷氏菌菌落且菌落数在15CFU～150CFU之间的S8平板(稀释因子为10-8)计数，根据平板上的菌落数按照公式②计算粘质沙雷氏菌样品的活菌浓度(见表2)。
按照JJF1343《标准物质定值的通用原则及统计学原理》对定值数据进行正态分布检验、可疑值检验和等精度检验合格后，取算数平均值作为标准物质的标准值，量值为
1.09×1010CFU/mL，相对标准偏差为6.15％(见表2)。
表2粘质沙雷氏菌标准物质的定值结果(m＝9，n＝3)
Figure DEST_PATH_IMAGE001
以上实验证明，通过加入保护剂，可以有效的降低菌体在冷冻干燥过程中的死亡率，本发明的标准物质冻干存活率92.14％，冻干保护效果很好；本发明得到的人员防护装备防护性能评价用细菌标准物质的标准值为1.09×1010CFU/mL，符合人员防护装备防护性能评价工作的要求。
以下各实验所用粘质沙雷氏菌标准物质样品为按实施例1方法制备。
实施例2标准物质的均匀性检验
一、实验方法
1.均匀性检验方法
根据单元样品抽取原则，抽取单元数以及每个样品的重复测量次数应适合所采用的统计检验要求。总体单元数为N<200时，抽取单元数不少于11个；当200＜N<500时，抽取单元数不少于15个；当500＜N<1000时，抽取单元数不少于30个；当总体单元数N＞1000时，按
Figure BDA0001169859310000072
来计算出抽取样品数。对于均匀性好的样品，当N＜500时，抽取单元数可不少于10个；当N＞500时，抽取单元数可不少于15个[18,19]。因此，从200瓶粘质沙雷氏菌标准物质样品中随机抽取15瓶，每瓶样品中加入2mL磷酸盐缓冲液复水后，采用营养琼脂平板涂布法按照实施例1中的步骤9中的操作进行检验，每瓶样品重复检测3次。最后，将计算结果通过F检验法进行均匀性检验。
2.均匀性分析方法
为检验样品均匀性，设抽取了m个样品，采用经验证的营养琼脂平板涂布法按照3.1，在相同条件下得m组测量数据如下：
1.
Figure BDA00011698593100000815
平均值
Figure BDA00011698593100000812
2.
Figure BDA00011698593100000816
平均值
Figure BDA00011698593100000813
…………
Figure BDA00011698593100000817
平均值
Figure BDA00011698593100000814
设
Figure BDA0001169859310000081
Figure BDA0001169859310000082
则组间差方和
Figure BDA0001169859310000083
组内差方和
Figure BDA0001169859310000084
记ν1＝m-1(组间自由度)
ν2＝N-m(组内自由度)
Figure BDA0001169859310000085
Figure BDA0001169859310000086
作统计量F；
Figure BDA0001169859310000087
由此可见，该统计量是自由度(ν1,ν2)的F分布变量。
根据自由度(ν1,ν2)及给定的显著性水平α，可由F表查得临界的Fα值。若F<Fα,则认为组内与组间无明显差异，样品是均匀的，若F≥Fα,则怀疑各组间有系统差异，即样品之间存在差异，若记这个差异的标准偏差为Sbb，则有
Figure BDA0001169859310000088
若各ni均相同均为n时，则上式变成：
Figure BDA0001169859310000089
如果
Figure BDA00011698593100000810
此时均匀性产生的标准偏差可按下式计算：
Figure BDA00011698593100000811
二、实验结果
采用方差分析法对人员防护装备防护性能评价用细菌标准物质进行均匀性检验，根据自由度为(vl＝14，v2＝30)及给定的显著性水平α＝0.05，可由表查得的F临界值为2.04，经过公式计算得F值＝1.76<F查表值，组内与组间无明显差异，因此样品是均匀的瓶间标准偏差Sbb为0.05×1010CFU/mL(详见表3)。
表3标准物质均匀性检验结果(m＝15，n＝3)
Figure DEST_PATH_IMAGE002
以上实验证明，本发明得到的人员防护装备防护性能评价用细菌标准物质的均匀性良好。实施例3标准物质的稳定性考察
一、实验方法
1.短期稳定性考察方法
短期稳定性考察，主要涉及标准物质在运输过程中的稳定性，因此对标准物质在不同温度下进行短期稳定性统计评估。短期稳定性考察选取不同温度(-20℃、4℃，25℃和37℃)，不同时间点(0，7，14，21和28天)，采用营养琼脂平板涂布法进行测试，每次随机选取3瓶样品，每瓶重复测3次(N＝3，n＝3)，取平均值得出人员防护装备防护性能评价用细菌标准物质短期稳定性考察实验数据。根据人员防护装备防护性能评价用细菌标准物质在不同温度下其活菌浓度随时间的变化来描绘出活菌浓度Y与时间X的关系，拟合成一条直线。
2.长期稳定性考察方法
将实施例1中制备得到的人员防护装备防护性能评价用细菌标准物质储存在-20℃下，分别在0、1、2、3、4、5、6个月时每次随机抽取3个单元的标准物质，采用营养琼脂平板涂布法进行测试，每个单元标准物质重复测3次(N＝3，n＝3)，取平均值得出粘质沙雷氏菌标准物质长期稳定性考察实验数据，描绘出特性活菌浓度Y与时间X的关系，拟合成一条直线。
3.稳定性考察分析方法
通过如下公式计算斜率b1及其不确定度s(b1)：
Figure BDA0001169859310000101
Figure BDA0001169859310000102
式中，
Figure BDA0001169859310000103
为时间平均值；
Figure BDA0001169859310000104
为稳定性检验时测定数据的平均值；b0为拟合直线的截距。通过查表得置信水平0.95的t分布因子，同计算斜率b1不确定度s(b1)相乘后与斜率b1的绝对值比较，若|b1|<t0.95,n-2·s(b1)则表明斜率是不显著的，标准物质样品稳定性良好。
二、实验结果
1.短期稳定性考察结果
采用稳定性考察分析方法中的公式分析标准物质在不同温度(-20℃、4℃，25℃和37℃)和不同时间点(0，7，14，21和28天)的短期稳定性考察实验数据(表4)，结果显示(见图2)：当标准物质在-20℃保存时，通过公式计算斜率b1值为-25714285，t0.95,n-2·s(b1)值为70181874，可得|b1|<t0.95,n-2·s(b1)，所以粘质沙雷氏菌标准物质在-20℃温度下，可以稳定保存28天；而在4℃温度下，可以稳定保存14天；在25℃和37℃温度下，标准物质不稳定。
表4标准物质的短期稳定性考察实验数据
Figure BDA0001169859310000111
2.长期稳定性考察结果
采用稳定性考察分析方法中的公式分析标准物质在-20℃下，储存0、1、2、3、4、5、6个月的长期稳定性考察实验数据(表5)，结果显示(见图3)：当标准物质在-20℃储存时，通过公式计算斜率b1值为-120000000，t0.95,n-2·s(b1)值为136191630，可得|b1|<t0.95,n-2·s(b1)，所以粘质沙雷氏菌标准物质长期稳定性考察结果显示：粘质沙雷氏菌标准物质在-20℃下可以稳定保存6个月。
表5标准物质的长期稳定性考察实验数据
Figure BDA0001169859310000112
以上实验证明，本发明得到的人员防护装备防护性能评价用细菌标准物质，在4℃下，可储存14天，便于运输；在-20℃下，可储存6个月以上，具有优异的长期稳定性。
实施例4标准物质的不确定度评定
一、实验方法
标准物质的总不确定度由4部分组成。第1部分是通过定值数据的标准偏差、测试次数及所要求的置信水平按统计学方法计算出A类相对标准不确定度urel(A)；第2部分是定值过程中B类相对标准不确定度urel(B)，它的主要来源包括：移液器带来的不确定度、样品稀释因子带来的不确定度；第3部分是标准物质均匀性引入的相对标准不确定度urel(bb)；第3部分是标准物质的稳定性引入的相对标准不确定度urel(s)。将这4部分相对标准不确定度合成后计算得到标准值的合成不确定度uC和扩展不确定度U＝kuC(k＝2，置信概率95％)。
1.A类相对标准不确定度评定urel(A)
将随机抽取的9个单元的标准物质分别采用营养琼脂平板涂布法进行测试，每个单元标准物质重复3次，将3次重复测试结果取平均值得出每个单元标准物质的实验数据按如下贝塞尔公式计算出标准偏差
Figure BDA0001169859310000121
再通过公式计算得出A类相对标准不确定度urel(A)。
Figure BDA0001169859310000122
式中，uA为A类标准不确定度；
Figure BDA0001169859310000123
为平均值的标准偏差；
Figure BDA0001169859310000124
为平均值；Xi为每个单元标准物质测量结果的平均值；m为测量的标准物质数量。
Figure BDA0001169859310000125
式中，urel(A)为A类相对标准不确定度；uA为A类标准不确定度；
Figure BDA0001169859310000126
为平均值。
2.B类相对标准不确定度urel(B)
由营养琼脂平板涂布法结果计算公式②以及对测量过程的分析，B类相对标准不确定度主要来源包括：a)移液器带来的相对标准不确定度urel(v)，通过查询证书获得；b)样品稀释因子带来的相对标准不确定度urel(d)。样品稀释是由1mL菌液加入9mL无菌磷酸盐缓冲液进行稀释，因此设菌液体积为a，稀释液体积为b，1mL移液器的相对标准不确定度通过查询证书获得urel(a)，9mL移液器的相对标准不确定度通过查询证书获得urel(b)，ub＝urel(b)*b，稀释倍数k。按照公式如下计算得到为urel(d)。
Figure BDA0001169859310000127
式中，urel(d)为样品稀释因子的相对标准不确定度；k为稀释倍数；a为菌液体积(1mL)；b为稀释液体积(9mL)；ub为稀释液体积的标准不确定度；urel(a)为菌液体积的相对标准不确定度。
再通过如下公式计算合成B类相对标准不确定度urel(B)。
Figure BDA0001169859310000128
3.均匀性引入的相对标准不确定度评定urel(bb)
均匀性引入的标准不确定度ubb是将实施例2中的均匀性检验数据通过如下公式计算标准偏差为Sbb获得。
组间差方和
Figure BDA0001169859310000131
组内差方和
Figure BDA0001169859310000132
记ν1＝m-1(组间自由度)
ν2＝N-m(组内自由度)
Figure BDA0001169859310000133
Figure BDA0001169859310000134
(1)如果
Figure BDA0001169859310000135
则均匀性的标准偏差Sbb和标准不确定度ubb按如下公式计算：
Figure BDA0001169859310000136
(2)如果
Figure BDA0001169859310000137
则均匀性的标准偏差Sbb和标准不确定度ubb按如下公式计算：
Figure BDA0001169859310000138
均匀性引入的相对标准不确定度urel(bb)按如下公式计算：
Figure BDA0001169859310000139
式中，
Figure BDA00011698593100001310
为平均值。
4.稳定性引入的相对标准不确定度评定urel(s)
将实施例3中的长期稳定性考察数据通过在不同温度下其活菌浓度随时间的变化来描绘出活菌浓度Y与时间X的关系，拟合成一条直线，通过如下公式计算斜率b1不确定度s(b1)，再通过如下公式计算稳定性的标准偏差Ss和稳定性的标准不确定度us。
Figure BDA0001169859310000141
us＝Ss＝s(b1)·t
式中，t为给定的保存期限。
Figure BDA0001169859310000142
式中，
Figure BDA0001169859310000143
为平均值。
5.合成相对标准不确定度urel(c)和扩展不确定度U
将A类相对标准不确定度urel(A)、B类相对标准不确定度urel(B)、均匀性引入的相对标准不确定度urel(bb)和稳定性引入的相对标准不确定度urel(s)，按照如下公式合成得出标准物质的合成相对标准不确定度urel(c)和扩展不确定度U。
合成相对标准不确定度urel(c)为：
Figure BDA0001169859310000144
扩展不确定度U为：
Figure BDA0001169859310000145
(k＝2，置信概率95％)
式中，
Figure BDA0001169859310000146
为标准物质的标准值。
二、实验结果
1.A类相对标准不确定度评定urel(A)评定结果
将随机抽取的9个单元的标准物质分别采用营养琼脂平板涂布法进行测试，每个单元标准物质重复3次，将3次重复测试结果取平均值得出每个单元标准物质的实验数据按贝塞尔公式计算出标准偏差
Figure BDA0001169859310000147
为6.7×108CFU/mL，再通过公式计算得出A类相对标准不确定度urel(A)为2.05％，结果见表6。
表6标准物质A类相对标准不确定度评定结果(m＝9)
Figure DEST_PATH_IMAGE003
2.B类相对标准不确定度urel(B)评定结果
B类相对标准不确定度主要来源包括：
(1)移液器带来的相对标准不确定度urel(v)，查询证书得1％(k＝2)，urel(v)＝uv/k＝1％/2＝0.5％；
(2)样品稀释因子带来的相对标准不确定度urel(d)。样品稀释是由1mL菌液加入9mL无菌磷酸盐缓冲液进行稀释，因此设菌液体积为a，稀释液体积为b，1mL移液器的相对标准不确定度查证书Urel(a)为1％(k＝2)，urel(a)＝1％/2＝0.5％；9mL移液器的的相对标准不确定度查证书Urel(b)为1％(k＝2)，urel(b)＝1％/2＝0.5％，ub＝urel(b)*b＝0.5％*9mL＝0.045mL，稀释液体积的标准不确定度实际检测经过是经过8次稀释，稀释倍数k为8。按照公式计算得到为urel(d)为1.79％。
Figure BDA0001169859310000152
式中，urel(d)为样品稀释因子的相对标准不确定度；k为稀释倍数；a为菌液体积(1mL)；b为稀释液体积(9mL)；ub为稀释液体积的标准不确定度；urel(a)为菌液体积的相对标准不确定度。
按照公式如下公式合成B类相对标准不确定度为1.86％。
Figure BDA0001169859310000153
3.均匀性引入的相对标准不确定度urel(bb)评定结果
将实施例2中的均匀性检验数据通过公式计算标准偏差为Sbb为5.0×108CFU/mL，均匀性引入的相对标准不确定度urel(bb)为4.59％，结果见表7。
表7标准物质均匀性引入的相对标准不确定度评定结果
Figure DEST_PATH_IMAGE004
4.稳定性引入的相对标准不确定度urel(s)评定结果
将实施例3中的长期稳定性考察数据通过在不同温度下其活菌浓度随时间的变化来描绘出活菌浓度Y与时间X的关系，拟合成一条直线，通过公式计算斜率b1不确定度s(b1)，再通过公式计算稳定性的标准偏差Ss为3.0×108CFU/mL和稳定性的标准不确定度us为2.75％，结果见表8。
表8标准物质稳定性引入的相对标准不确定度评定结果
Figure DEST_PATH_IMAGE005
5.合成相对标准不确定度urel(c)和扩展不确定度U评定结果
将A类相对标准不确定度、B类相对标准不确定度、均匀性引起的相对标准不确定度和稳定性引起的相对标准不确定度按照公式合成得出标准物质的合成相对标准不确定度为6.02％，再按照公式计算得扩展不确定度为0.14×1010CFU/mL(k＝2)，结果见表9。
合成标准不确定度urel(c)为：
Figure BDA0001169859310000163
扩展不确定度U为：
Figure BDA0001169859310000164
(k＝2，置信概率95％)
表9标准物质不确定度评定结果
Figure DEST_PATH_IMAGE006
以上实验证明，本发明得到的人员防护装备防护性能评价用细菌标准物质定值结果的不确定度来源包括：A类标准不确定度、B类标准不确定度、均匀性引起的标准不确定度和稳定性引起的标准不确定度。标准物质的扩展不确定度为0.14×1010CFU/mL(k＝2)。
通过实施例1-4的实验证明，本发明得到的人员防护装备防护性能评价用细菌标准物质分装在棕色西林瓶中，呈饼状或球状，1个/瓶；当使用时，吸取2mL复水的水溶液加入棕色西林瓶中复溶标准物质，其标准值为：(1.09±0.14)×1010CFU/mL，符合人员防护装备防护性能评价工作的要求；该标准物质均匀性良好；在4℃下，可储存14天，便于运输；在-20℃下，可储存6个月以上，具有优异的长期稳定性。

Claims (6)

1.一种人员防护装备微生物防护性能评价用细菌标准物质，其特征在于，由两个组分组成：
1)含粘质沙雷氏菌的菌体和菌体保护剂的冻干物；
2)用于菌体冻干物复水的稳定剂水溶液；
制成所述菌体保护剂的原料的重量百分比为：5～7％的葡萄糖、1～2％的明胶、2～3％的卵黄；冻干保护剂用磷酸盐缓冲液溶解；
所述稳定剂水溶液中各成分的质量体积百分比：0.1～1.0％的氯化钠、0.1～1.0％的牛血清白蛋白和0.2～2％的抗坏血酸，其余是水；
所述标准物质的制备方法，其特征是，用生理盐水将粘质沙雷氏菌菌体稀释至1010级，制成新鲜菌匀液，再与保护剂按照1:1的体积比混合，于-70℃下预冻4h后冻干，得到所述标准物质。
2.权利要求1所述的标准物质，其特征在于，所述粘质沙雷氏菌用稳定剂水溶液复水后，粘质沙雷氏菌活菌浓度为0.5×1010～5.0×1010CFU/mL。
3.权利要求1所述的标准物质，所述冻干物为饼状或球状。
4.权利要求1所述的标准物质，其中所述的制备方法，所用的粘质沙雷氏菌的培养方法是：挑取单菌落于已高压灭菌的营养肉汤中，30℃±1℃下，180×g摇床培养12h。
5.权利要求1所述的标准物质，制备得到的标准物质于-20℃下保存。
6.权利要求1所述标准物质的定值方法，具体操作如下：
用2mL稳定剂水溶液对标准物质进行复水溶解，充分混匀后制备成S0样品匀液；
再用无菌磷酸盐缓冲液对充分溶解后的样品S0进行10倍系列稀释；根据给出的粘质沙雷氏菌活菌浓度范围进行估算，选择三个稀释度的样品匀液，每个稀释度分别吸取0.2mL样品匀液涂布于营养琼脂平板，将平板静置10min后，倒置于培养箱，30℃±1℃下培养12～24h；
选择有典型的粘质沙雷氏菌菌落且菌落数在15CFU～150CFU之间的平板，计数典型菌落数和记录稀释因子；菌落计数以菌落形成单位CFU表示，实验结果以活菌浓度表示，计数该稀释度平板上的典型菌落，计算标准值；定值结果表示为：标准值±扩展不确定度；
所述计算标准值按如下公式：
Figure FDA0002533864590000021
式中，
C为粘质沙雷氏菌活菌浓度，CFU/mL；
N为平板上粘质沙雷氏菌典型菌落的总数，CFU；
d为稀释因子，无量纲；
v为平板上粘质沙雷氏菌匀液的接种体积，mL。
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