CN110982718B - 一种白色念珠菌的稳定剂及其应用 - Google Patents

一种白色念珠菌的稳定剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种白色念珠菌的稳定剂，溶剂为水，其溶质包含植酸、肌醇、海藻糖、脱脂奶粉和聚乙烯吡咯烷酮。本发明的白色念珠菌质控菌的稳定剂，可使质控菌冻干存活率达到80％以上，且能够在长期储存过程中保持菌含量的稳定性。

Description

一种白色念珠菌的稳定剂及其应用
技术领域
本发明属于微生物领域，尤其涉及一种白色念珠菌的稳定剂及其应用。
背景技术
白色念珠菌是一种常见的条件致病性真菌，广泛存在于正常人口腔，上呼吸道，肠道及阴道，当机体免疫功能或一般防御力下降或正常菌群相互制约作用失调，该菌会大量繁殖侵入深层组织，可引起黏膜感染或严重的系统性感染。现行药典中无菌检查及微生物限度检查和食品化妆品等微生物检验中均需进行白色念珠菌的检验。而质控菌株作为微生物检验中的阳性对照，能够验证检验方法、对检验人员进行能力验证、验收微生物培养基，保证微生物实验过程的质量控制，是微生物检验过程中的标准物质。定量质控菌株由于其使用方便，快速，提高检验效率等多种优点，是目前微生物检验过程质控标准物质的发展趋势。
稳定剂是菌株在冷冻干燥过程保护细胞的有效物质，不同的菌株生理代谢特性不同，在冷冻干燥过程中抗逆能力不同，因此在保护剂选择上有各自的偏好，因此需对不同种类的菌株进行筛选，以便得到效果最好的稳定剂。目前还没有针对白色念珠菌定量质控菌株的制备方法，且缺乏能够定量储存白色念珠菌的稳定剂。现有技术中有定量的白色念珠菌质控菌种产品，因为技术有限，保质期较短，无法避免在运输和储存期间菌细胞数量发生变化，影响微生物检验过程质量的控制。因此提供一种定量储存白色念珠菌的稳定剂及其质控菌的制备方法，能够弥补该领域的技术空白。
发明内容
为克服现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种白色念珠菌的稳定剂及其应用。
本发明所采取的技术方案为：
本发明的第一个方面，提供：
一种白色念珠菌的稳定剂，溶剂为水，其溶质包含以下原料：植酸、肌醇、海藻糖、脱脂奶粉、聚乙烯吡咯烷酮。
在一些实施例中，上述稳定剂中溶质的质量组成为：3-5份植酸，0.5-3份肌醇，5-10份海藻糖，3-5份脱脂奶粉、0.05-0.3份聚乙烯吡咯烷酮。
在一些实施例中，上述稳定剂中溶质的质量组成为：3％-5％植酸，0.5％-3％肌醇，5％-10％海藻糖，3％-5％脱脂奶粉、0.05％-0.3％聚乙烯吡咯烷酮。
本发明的第二个方面，提供：
一种白色念珠菌定量化质控品，由白色念珠菌菌液上述的稳定剂混匀后，定量后分装、冻干得到。
在一些实施例中，白色念珠菌与稳定剂(干重)的混合比为300-1000CFU/(0.1-0.3)g稳定剂(干重)。这样可以保证细菌可以充分被稳定剂保护，同时也不会过于浪费稳定剂。
在一些实施例中，上述的定量化质控品中白色念珠菌的含量为300-1000CFU/瓶。当然，也可以根据实际的需要，选择其他的含量。该菌含量的偏差不大于20％。
本发明的第三个方面，提供：
一种白色念珠菌定量质控品的制备方法，包括如下步骤：
(1)菌株复苏：白色念珠菌接种至复苏培养基，复苏传代；
(2)增菌：复苏的白色念珠菌接种至增殖培养基中，培养增殖，得白色念珠菌菌液；
(3)计数：将白色念珠菌菌液与上述稳定剂混匀，计数后分装，得定量化白色念珠菌菌液；
(4)冻干：将定量化白色念珠菌菌液冷冻干燥，密封得到白色念珠菌定量质控品。
在一些实施例中，步骤(2)中所述增殖培养基包含以下质量分数的原料为0.5％-2％蛋白胨，0.5％-2％酵母粉，1％-3％葡萄糖，0.1％-0.4％甘油磷酸钠，0.1％-1％肌醇。
在一些实施例中，步骤(2)中所述增殖培养基包含以下质量分数的原料为1％蛋白胨，1％酵母粉，2％葡萄糖，0.2％甘油磷酸钠，0.5％肌醇。
在一些实施例中，步骤(4)中所述冷冻干燥为采用液氮快速冷冻后，置于已预冷至-30℃至-40℃的冷冻干燥箱中平衡，真空干燥后解析干燥至样品含水量为0-3％。
在一些实施例中，上述真空干燥的条件为：真空度10Pa-100Pa，干燥温度-35℃至-15℃，干燥时间20h-48h；所述解析干燥条件为：干燥温度0℃-25℃。
在一些实施例中，步骤(3)中所述计数方法为细胞计数仪计数。
本发明的有益效果为：
本发明的白色念珠菌质控菌的稳定剂，可使质控菌冻干存活率达到80％以上，且能够在长期储存过程中保持菌含量的稳定性。
附图说明
图1为实施例和对比例中各组成中白色念珠菌含量随时间的变化图。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
方便比较起见，菌株复苏、增菌、计数和冻干的操作如下：
菌株复苏
白色念珠菌(编号：ATCC10231，购买自：美国模式菌种保藏中心)划线接种至SDA培养基，复苏传代，培养温度为30±1℃，并进行鉴定。
增菌
复苏并鉴定后的白色念珠菌接种至白色念珠菌增殖培养基中，增殖培养基的组成为以下质量百分数的原料：1％蛋白胨，1％酵母粉，2％葡萄糖，0.2％甘油磷酸钠，pH 5.6±0.2，接菌量为2％，置于30℃恒温振荡器中培养增殖，转速为150rpm/min，培养32h。
计数
吸取适量的白色念珠菌菌液按照1:9比例加入稳定剂，用细胞计数仪测定溶液中白色念珠菌细胞数。
冻干
用稳定剂将白色念珠菌菌液稀释至合适的浓度，分装至西林瓶，半加塞后采用液氮进行快速冷冻，置于已预冷至-40℃的冷冻干燥箱中，平衡30min后，开启真空泵，真空干燥条件为：真空度15Pa，干燥温度-25℃，干燥时间20h，真空干燥后进行解析干燥，解析干燥条件为：干燥温度25℃，干燥时间约10h，干燥至样品含水量小于3％，真空压塞。
当然，上述操作也可以使用本领域周知的方法进行。
表1不同组成的稳定剂(质量百分数，％)
Figure BDA0002355837540000041
白色念珠菌定量质控菌的均匀性和稳定性检验：
将上述冻干好的定量质控白色念珠菌置于2-8℃的冰箱内储存。每个月随机抽取其中3瓶，每瓶涂布两个平板计数，其平均数为每个月的活菌数。
按照GB/T15000.3-2008《标准样品工作导则(3)标准样品定值的一般原则和统计方法》对实施例所制备的白色念珠菌定量质控菌均匀性和稳定性进行检验，采用SPSS单因素方差分析验证数据是否有显著性差异。其中均匀性检验随机抽取10瓶样品进行计数，稳定性选取12个月检验数据进行检验，在95％的置信区间下，P值均>0.05，表明数据没有统计学差异，即所制备的质控菌均匀性和稳定性符合要求。
不同组成稳定剂对白色念珠菌冻干及储存的影响
采用不同组成稳定剂对白色念珠菌进行稳定保护。各稳定剂组成如表1所示。
采用平板计数法，分别计算冻干前和冻干后西林瓶内白色念珠菌含量，并计算冻干存活率，其中冻干前白色念珠菌含量计算方法：吸取西林瓶内100uL白色念珠菌细胞悬液，涂布至琼脂培养基上，30℃下培养24h-48h后进行计数；冻干后白色念珠菌含量计算方法：添加冻干前等体积的无菌生理盐水进行溶解并振荡均匀，吸取100uL菌悬液涂布于对应琼脂培养基上培养后进行计数。
冻干存活率的计算公式为：
Figure BDA0002355837540000042
结果如表2所示：
表2不同组成稳定剂中的白色念珠菌冻干存活率
Figure BDA0002355837540000051
由表2可看出，采用实施例的稳定剂，可使冻干存活率提高至80％以上，而采用组成B或组成C的稳定剂，冻干存活率也比采用组成D的稳定剂明显较高。
不同组成稳定剂对白色念珠菌冻干储存的影响
使用不同组成稳定剂对白色念珠菌进行稳定保护，各稳定剂组成如表1所示。为使对比试验初期的菌细胞数量接近，保持对比基础状态一致，根据表2测得的不同组成稳定剂中白色念珠菌的冻干存活率，用细胞计数仪对冻干前活菌数进行即时测定，按冻干存活率计算冻干前白色念珠菌的用量，并配制成冻干后含活菌数约为1000CFU/瓶的白色念珠菌产品。
对使用不同稳定剂制备而成的白色念珠菌冻干产品进行长期储存(储存温度：2℃-8℃，储存时间：12个月)，每月测定各冻干产品中菌含量，各组成中白色念珠菌含量随时间的变化如图1所示。
从图1可看出，使用组成A1(实施例)、A2(实施例2)制备得到的白色念珠菌产品在12个月的储存期内，其菌含量在1000CFU/瓶上下摆动，变化范围较小；而组成B-D则在储存初期(第1-3个月)菌含量能保持在较高的水平，但在储存第4个月后，白色念珠菌含量开始显著下降。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种白色念珠菌的稳定剂，溶剂为水，其特征在于：其溶质的质量百分数为：3%-5%植酸，0.5%-3%肌醇，5%-10%海藻糖，3%-5%脱脂奶粉、0.05%-0.3%聚乙烯吡咯烷酮。
2.一种白色念珠菌定量化质控品，其特征在于：由白色念珠菌菌液与权利要求1所述的稳定剂混匀后，定量后分装、冻干得到。
3.根据权利要求2所述的定量化质控品，其特征在于：所述白色念珠菌的含量为300-1000CFU/瓶。
4.一种如权利要求2或3所述的白色念珠菌定量化质控品的制备方法，包括如下步骤：
（1）菌株复苏：白色念珠菌接种至复苏培养基，复苏传代；
（2）增菌：复苏的白色念珠菌接种至增殖培养基中，培养增殖，得白色念珠菌菌液；
（3）计数：将白色念珠菌液与权利要求1所述的稳定剂混匀，计数后分装，得定量化白色念珠菌菌液；
（4）冻干：将定量化白色念珠菌菌液冷冻干燥，密封得到白色念珠菌定量化质控品。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述增殖培养基包含以下质量分数的原料为0.5%-2%蛋白胨，0.5%-2%酵母粉，1%-3%葡萄糖，0.1%-0.4%甘油磷酸钠，0.1%-1%肌醇。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤（4）中所述冷冻干燥为采用液氮快速冷冻后，置于已预冷至-30℃至-40℃的冷冻干燥箱中平衡，真空干燥后解析干燥至样品含水量为0-3%。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述真空干燥的条件为：真空度10Pa-100Pa，干燥温度-35℃至-15℃，干燥时间20h-48h；所述解析干燥的条件为：干燥温度0℃-25℃。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）中的计数方法为细胞计数仪计数。
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