CN108690807A - 一种金黄色葡萄球菌标准物质及其制备方法和应用 - Google Patents

一种金黄色葡萄球菌标准物质及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种金黄色葡萄球菌标准物质及其制备方法和应用，所述金黄色葡萄球菌标准物质采用奶粉作为基质，奶粉基质来源广泛、不需进行二次加工，无抗生素残留，脂肪含量低，制备得到的金黄色葡萄球菌标准物质均匀性良好，在‑20℃和4℃环境中稳定性强，满足微生物标准物质的质量要求，在食品检测中可以保证检测结果的有效性、可比性及国际国内互认度，为其他微生物标准物质的研究提供了理论指导。

Description

一种金黄色葡萄球菌标准物质及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一种金黄色葡萄球菌标准物质及其制备方法和应用。
背景技术
微生物标准物质及其制备方法是生物安全和食品安全领域的重要研究方向。由于微生物的检测容易受到样本差异和环境因素的影响，检测重复性差，因此需要制备接近实际样品、具有明确量值的微生物标准物质，实现质量可控的微生物检测，保证检测结果的准确性和公正性。目前国内外关于微生物菌体标准物质(certified reference materials，CRM)的研究较少，我国关于微生物菌体标准物质的研究已从标准菌株向含基质的微生物标准物质的方向发展，然而尚未研制出含食品基质的致病菌标准物质，也鲜有关于此类标准物质均匀性和稳定性研究的报道。
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一种重要的食源性致病菌，可引起多种严重感染，在许多国家被认为是仅次于沙门氏菌的第二大食源性致病菌，我国卫生部公布的《人间传染的病原微生物名录》中将金黄色葡萄球菌列为第三类病原微生物。GB29921-2013《食品中致病菌限量》、GB4789.18-2010《食品安全国家标准微生物学检验乳与乳制品检验》和GB10765-2010《食品安全国家标准婴儿配方食品》等均对金黄色葡萄球菌的检测做出了明确规定，上述国家标准不仅强调了加大食品中金黄色葡萄球菌监测力度的重要性，而且改变了过去“不得检出”的定性判断，体现了我国食品安全微生物检验向限量测量方向发展的趋势。
CN 104140994A公开了一种含鸡肉基质的金黄色葡萄球菌标准物质，是经鸡肉肉糜的制备、鸡肉肉糜的灭菌、菌悬液的制备、混合菌液的制备、标准物质的制备、包装纸袋成品；再经标准物质的定值、均匀性试验、稳定性试验、不确定度评估得到所述标准物质，可用于生物特性物质的鉴定、评价、分析、安全监控等，可实现更简便、准确的生物特性物质检测。然而，鸡肉基质脂肪含量高、抗生素含量高，对金黄色葡萄球菌标准物质的均匀性、稳定性和检测准确性具有显著影响，该发明的鸡肉基质原料需要经过抗生素残留检测，并且用剪刀挑除脂肪及筋膜等组织，处理方法繁琐。
因此，制备一种均匀性好、稳定性强、准确性高的金黄色葡萄球菌标准物质，在微生物相关技术领域具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种金黄色葡萄球菌标准物质及其制备方法和应用，所述金黄色葡萄球菌标准物质采用奶粉作为储存基质，均匀性好、稳定性强、脂肪含量低、无抗生素残留，为微生物标准物质的制备提供了理论指导，保证了微生物检测的可靠性。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种奶粉在制备微生物标准物质中的应用。
本发明中，奶粉来源广泛、不需进行二次加工，脂肪含量适中，不影响微生物标准物质的检测，无抗生素残留，是一种良好的微生物标准物质的基质。
优选地，所述微生物包括金黄色葡萄球菌、大肠杆菌或乳酸杆菌中的任意一种或至少两种的组合，优选为金黄色葡萄球菌。
第二方面，本发明提供了一种金黄色葡萄球菌标准物质的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)向金黄色葡萄球菌菌悬液中加入冻干保护剂进行冻干，得到金黄色葡萄球菌菌粉；
(2)将步骤(1)所述金黄色葡萄球菌菌粉与奶粉混合，得到所述金黄色葡萄球菌标准物质。
优选地，步骤(1)所述金黄色葡萄球菌菌悬液与所述冻干保护剂的体积比为1:(95～105)，例如可以是1:95、1:96、1:97、1:98、1:99、1:100、1:101、1:102、1:103、1:104或1:105，优选为1:(99～100)。
优选地，步骤(1)所述冻干保护剂包括脱脂牛奶、聚乙烯吡咯烷酮、酪氨酸或蔗糖中的任意一种或至少两种的组合，优选为脱脂牛奶、聚乙烯吡咯烷酮、酪氨酸和蔗糖的组合。
根据本发明，细菌在冷冻干燥的过程中由于温度降低和水分蒸发，容易在细菌菌体内形成冰晶体，对菌种活性具有显著影响。为了提高菌种在冷冻干燥过程中的存活率，需要向菌液中加入保护剂，常用的保护剂主要分四类：渗透型抗冻剂、非渗透型抗冻剂、抗氧化剂和胶体。研究表明，不同组成的保护剂，对菌株的作用显著不同。
本发明中，根据金黄色葡萄球菌的特性，将冻干保护剂设计为脱脂牛奶、聚乙烯吡咯烷酮、酪氨酸和蔗糖的组合，其中，脱脂牛奶和蔗糖经115℃灭菌30min，聚乙烯吡咯烷酮和酪氨酸经121℃高压蒸汽灭菌30min。
优选地，所述脱脂牛奶在所述冻干保护剂中的重量百分比为12.5％～50％，例如可以是12.5％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％，优选为25％～50％。
优选地，所述聚乙烯吡咯烷酮在所述冻干保护剂中的重量百分比为0.5％～1.5％，例如可以是0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％或1.5％，优选为0.5～1.0％。
优选地，所述酪氨酸在所述冻干保护剂中的重量百分比为0.5％～1.5％，例如可以是0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％或1.5％，优选为0.5～1.0％。
优选地，所述蔗糖在所述冻干保护剂中的重量百分比为1％～4％，例如可以是1％、2％、3％或4％，优选为2％～4％。
优选地，所述冻干保护剂按质量百分比包括：
余量为去离子水。
优选地，所述冻干保护剂按质量百分比包括：
余量为去离子水。
优选地，步骤(1)所述冻干具体为：将金黄色葡萄球菌菌悬液和冻干保护剂的混合液预冷后，进行真空冷冻干燥。
优选地，所述预冷的温度为-80℃～-85℃，例如可以是-80℃、-81℃、-82℃、-83℃、-84℃或-85℃。
优选地，所述预冷的时间不小于8小时，例如可以是8小时、9小时或10小时。
优选地，所述真空冷冻干燥的压力为0.010mbar～0.015mbar，例如可以是0.010mbar、0.011mbar、0.012mbar、0.013mbar、0.014mbar或0.015mbar。
优选地，所述真空冷冻干燥的时间为36h～48h，例如可以是36h、37h、38h、39h、40h、41h、42h、43h、44h、45h、46h、47h或48h。
优选地，步骤(1)所述金黄色葡萄球菌菌粉中的细菌数为4000CFU/g～6000CFU/g，例如可以是4000CFU/g、4500CFU/g、5000CFU/g、5500CFU/g或6000CFU/g。
优选地，步骤(1)所述金黄色葡萄球菌菌粉的脱水率为90％～95％，例如可以是90％、91％、92％、93％、94％或95％。
优选地，步骤(2)所述金黄色葡萄球菌菌粉与所述奶粉的重量份比为(8～10):1，例如可以是8:1、9:1或10:1。
优选地，步骤(2)所述奶粉采用60Coγ辐射灭菌。
第三方面，本发明提供了一种如第二方面所述的方法制备得到的金黄色葡萄球菌标准物质。
第四方面，本发明提供了一种如第三方面所述的金黄色葡萄球菌标准物质在食品检测中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明的奶粉基质来源广泛、不需进行二次加工，无抗生素残留，脂肪含量低，适于金黄色葡萄球菌标准物质的制备；
(2)本发明的冻干保护剂包括12.5％～50％脱脂牛奶、0.5％～1.5％聚乙烯吡咯烷酮、0.5％～1.5％酪氨酸和1％～4％蔗糖，适于金黄色葡萄球菌的生物特性，具有较好的冻干保护率；
(3)本发明采用奶粉作为金黄色葡萄球菌的基质，同时采用12.5％～50％脱脂牛奶、0.5％～1.5％聚乙烯吡咯烷酮、0.5％～1.5％酪氨酸和1％～4％蔗糖的组合作为金黄色葡萄球菌的，制备得到的金黄色葡萄球菌标准物质均匀性良好，在-20℃和4℃环境中稳定性强，满足微生物标准物质的质量要求，在食品检测中可以保证检测结果的有效性、可比性及国际国内互认度，为其他微生物标准物质的研究提供了理论指导。
附图说明
图1为奶粉中金黄色葡萄球菌标准物质在4℃和-20℃的细菌数变化趋势图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
主要仪器与试剂：
生物安全柜(美国Labconco公司)；冷冻干燥机(美国Labconco公司)；恒温培养箱(上海慧泰仪器制造有限公司)；高压灭菌锅(上海申安医疗器械厂)；Milli-Q纯水仪(美国默克公司)；麦氏比浊仪(法国梅里埃公司)；电子天平(美国Mettler Toled公司)；超低温冰箱(美国thermo公司)。
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)标准菌株(ATCC菌株编号25923)；Baird-Parker培养基(北京陆桥技术有限责任公司)；营养琼脂(北京陆桥技术有限责任公司)；营养肉汤(北京陆桥技术有限责任公司)；磷酸盐缓冲液(北京陆桥技术有限责任公司)；0.85％无菌生理盐水(北京陆桥技术有限责任公司)；奶粉(京东商城购买的六个品牌)；脱脂牛奶(德运公司)；聚乙烯吡咯烷酮(PVP，国药集团)；酪氨酸(国药集团)；蔗糖(国药集团)。
实施例1菌种复活、鉴定与培养
将冷冻保存的金黄色葡萄球菌标准菌株在营养琼脂上划线复活，37℃培养18h～24h；从平板上挑取单个金黄色葡萄球菌菌落接种到营养肉汤中，37℃培养18h～24h；将菌液接种到Baird-Parker培养基上，37℃培养至菌落形成，随机挑取10个菌落进行革兰氏染色后进行显微镜观察。
细菌呈葡萄球状排列，无芽胞，无荚膜，直径约为0.5μm～1μm的初步鉴定为金黄色葡萄球菌；通过进行血浆凝固酶实验，出现凝固或凝固体积大于原体积一半的细菌确定为金黄色葡萄球菌。
实施例2菌株冻干
将新鲜培养的金黄色葡萄球菌菌悬液按1％体积比添加到冻干保护剂中混合均匀，置于台式恒温振荡器上混合10min(300r/min)，独立重复实验A、B、C三次，用无菌移液器分装至冻干瓶中，在-80℃±2℃环境中预冻8h以上，在0.015mbar真空环境下冷冻干燥36h～48h；
将冻干的金黄色葡萄球菌菌粉采用拍打式均质器拍碎混匀后，随机抽取8次样品，每次1g，测定冷冻干燥前后的活菌数量，根据式(1)得出冻干保护剂的冻干保护率。
冻干保护率(％)＝冷冻干燥后活菌数/冷冻干燥前活菌数×100％ (1)
将冻干保护剂的组成设计单因素试验，其水平设计见表1，选择L9(34)正交表安排实验，实验设计见表2。
表1冻干保护剂单因素添加水平设计
水平 脱脂牛奶(％) PVP(％) 酪氨酸(％) 蔗糖(％)
1 12.5 0.5 0.5 1
2 25 1 1 2
3 50 1.5 1.5 4
表2 L9(34)正交试验设计
试验序号 脱脂牛奶 PVP 酪氨酸 蔗糖
1 1 1 1 1
2 1 2 2 2
3 1 3 3 3
4 2 1 3 2
5 2 2 1 3
6 2 3 2 1
7 3 1 2 3
8 3 2 3 1
9 3 3 1 2
冻干保护剂的冻干保护率见表3，冻干保护率单因素方差的统计分析结果见表4。
表3冻干保护率
表4冻干保护率单因素方差统计分析结果
由此可知，由脱脂牛奶、PVP、酪氨酸和蔗糖组成的冻干保护剂对金黄色葡萄球菌具有较好的冻干保护功能，其中，当冻干保护剂包括50％脱脂牛奶、0.5％PVP、0.5％酪氨酸、4％蔗糖和45％去离子水时，冻干保护率最高，制备的金黄色葡萄球菌菌粉约200g。
实施例3金黄色葡萄球菌菌粉与奶粉混合
将实施例2获得的冻干的金黄色葡萄球菌菌粉平均分装在不同的奶粉基质中(约7000CFU/瓶)，-20℃下保存3个月，依据涂干时间(长＝3分，中＝2分，短＝1分)、菌落大小(大＝3分，中＝2分，小＝1分)、菌落数变化及奶粉是否结块等因素打分，结果见表5。
表5奶粉基质的选择
由此可知，“诺优能诺贝能婴幼儿配方奶粉”和“伊利奶粉金领冠珍护系列幼儿配方奶粉”可优选为金黄色葡萄球菌标准物质的基质。
将上述两种奶粉经过60Coγ辐射灭菌后进行1:1比例混合，分装在冻干瓶中，每瓶9g，每瓶中加入1g冻干脱水率为90％的金黄色葡萄球菌菌粉(约5000CFU/g)，混合10min(300r/min)，制备得到10g/瓶的金黄色葡萄球菌标准物质。
实施例4均匀性检验
本实施例依据JJF1343-2012《标准物质定值的通用原则及统计学原理》技术规范要求，采用方差分析法统计检验瓶间均匀性。
具体方法为：抽取15瓶金黄色葡萄球菌标准物质，在相同条件下检测15组等精度测量数据，每瓶重复检测3次，采用金黄色葡萄球菌平板计数法进行均匀性测定，并采用单因素方差分析法(one way ANOVA)分析实验数据。如果测定方差满足式(2)的统计要求，则无显著性差异。
其中组间差方和的计算公式为式(3)：
组内差方和的计算公式为式(4)：
组间自由度的计算公式为式(5)：
v1＝m-1 (5)
组内自由度的计算公式为式(6)：
v2＝N-m (6)
金黄色葡萄球菌标准物质的瓶间均匀性的检验统计结果见表6。在95％置信水平下，两种密度菌体的统计F值均小于F0.05(14,30)，证明标准物质的均匀性良好，符合JJG1006-1994《一级标准物质技术规范》均匀性检验要求。
表6奶粉中金黄色葡萄球菌的均匀性统计结果
样品名称 Q1 Q2 F值 F0.05(14,30)
奶粉中金黄色葡萄球菌 13905777.78 27566666.67 1.081 2.04
实施例5稳定性考察
稳定性是标准物质的基本属性，用于描述标准物质的特性值随时间变化的性质。稳定性评估不但能评估与材料稳定性相关的测量不确定度，而且能明确合适的保存和运输条件。长期稳定性指的是在规定的贮存条件下，在较长周期内定期地进行标准物质待定特性值的稳定性评估，考察标准物质的特性值保持在规定范围内的能力。短期稳定性指的是依据样品包装盒运输的形式，选择短期稳定性评估的温度，考察标准物质的特性量值保持在规定范围内的能力。
本实施例将金黄色葡萄球菌标准物质贮存在4℃和-20℃环境中进行标准物质的稳定性考察。具体步骤为：分别在不同时间随机选取3瓶金黄色葡萄球菌标准物质，采用金黄色葡萄球菌平板计数法测定标准物质的活菌数的变化情况，监测频率以天为单位，监测第0、1、3、7、10和15天的稳定性，描绘特性量值Y与时间X的关系，拟合成一条直线，通过式(7)计算斜率b1，通过式(8)计算斜率b1的不确定度s(b1)。
其中，为时间平均值，为稳定性考察测定数据的平均值，b0为拟合直线的截距。通过查表得置信水平0.95的t分布因子，与s(b1)相乘后，计算t×s(b1)与b1的绝对值大小。
当b1不显著，表明标准物质的稳定性良好。
结果见表7和图1，奶粉中金黄色葡萄球菌标准物质的活菌数量在-20℃和4℃环境中15天稳定，而-20℃下数值波动更小，因此，标准物质一般进行加冰袋冷链运输或干冰运输。同时，本实施例对标准物质的长期稳定性进行了考察，发现在-20℃和-80℃储存条件下标准物质保持两个月稳定。
表7奶粉中金黄色葡萄球菌标准物质的稳定性统计结果
统计项目 b1 b0 s(b1) t0.95,n-2×s(b1)
4℃稳定性计算值 -60.238 6093.929 36.341 77.421
-20℃稳定性计算值 31.944 6036.111 33.225 70.836
对比例
对比例为CN 104140994 A制备的金黄色葡萄球菌标准物质，采用鸡肉作为基质，20％脱脂乳、8％PVP、1％L-谷氨酸和12％蔗糖加水后作为冻干保护剂。鸡肉基质原料需要经过抗生素残留检测，并且用剪刀挑除脂肪及筋膜等组织，处理方法繁琐。
制备得到的金黄色葡萄球菌标准物质在前两周内菌数大幅度下降，从最初的277CFU/瓶下降到184CFU/瓶，稳定性不如本申请实施例奶粉基质的金黄色葡萄球菌标准物质。
综上所述，本发明采用奶粉作为金黄色葡萄球菌的基质、采用12.5％～50％脱脂牛奶、0.5％～1.5％聚乙烯吡咯烷酮、0.5％～1.5％酪氨酸和1％～4％蔗糖的组合作为金黄色葡萄球菌的冻干保护剂，制备得到的金黄色葡萄球菌标准物质均匀性良好，在-20℃和4℃环境中稳定性强，满足微生物标准物质的质量要求，在食品检测中可以保证检测结果的有效性、可比性及国际国内互认度，为其他微生物标准物质的研究提供了理论指导。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种奶粉在制备微生物标准物质中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述微生物包括金黄色葡萄球菌、大肠杆菌或乳酸杆菌中的任意一种或至少两种的组合，优选为金黄色葡萄球菌。
3.一种金黄色葡萄球菌标准物质的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)向金黄色葡萄球菌菌悬液中加入冻干保护剂进行冻干，得到金黄色葡萄球菌菌粉；
(2)将步骤(1)所述金黄色葡萄球菌菌粉与奶粉混合，得到所述金黄色葡萄球菌标准物质。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述金黄色葡萄球菌菌悬液与所述冻干保护剂的体积比为1:(95～105)，优选为1:(99～100)。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述冻干保护剂包括脱脂牛奶、聚乙烯吡咯烷酮、酪氨酸或蔗糖中的任意一种或至少两种的组合，优选为脱脂牛奶、聚乙烯吡咯烷酮、酪氨酸和蔗糖的组合；
优选地，所述冻干保护剂按质量百分比包括：
优选地，所述冻干保护剂按质量百分比包括：
6.根据权利要求3～5任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述冻干具体为：将金黄色葡萄球菌菌悬液和冻干保护剂的混合液预冷后，进行真空冷冻干燥；
优选地，所述预冷的温度为-80℃～-85℃；
优选地，所述预冷的时间不小于8小时；
优选地，所述真空冷冻干燥的压力为0.010mbar～0.015mbar；
优选地，所述真空冷冻干燥的时间为36h～48h。
7.根据权利要求3～6任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述金黄色葡萄球菌菌粉中的细菌数为4000CFU/g～6000CFU/g；
优选地，步骤(1)所述金黄色葡萄球菌菌粉的脱水率为90％～95％。
8.根据权利要求3～7任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述金黄色葡萄球菌菌粉与所述奶粉的重量份比为(8～10):1；
优选地，步骤(2)所述奶粉采用60Coγ辐射灭菌。
9.一种如权利要求3～8任一项所述的方法制备得到的金黄色葡萄球菌标准物质。
10.一种如权利要求9所述的金黄色葡萄球菌标准物质在食品检测中的应用。
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