CN105274187B - 一种含鸡肉基质的志贺氏菌标准物质 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种含鸡肉基质的志贺氏菌标准物质，其具体经保存液的配制、基质预处理、混悬液的配制、标准物质的制备及菌种鉴定、均匀性验证、定值、稳定性检验，制得含菌数为530±24 CFU/瓶的成品。所得含鸡肉基质的志贺氏菌标准物质具有良好的均匀性，可解决现有标准物质中鸡肉基质难溶于水的问题，且其品质稳定、质量可控，适用于微生物高效、准确的定量检测。

Description

一种含鸡肉基质的志贺氏菌标准物质

技术领域

本发明属于食品微生物技术领域，具体涉及一种含鸡肉基质的志贺氏菌标准物质。

背景技术

菌种标准物质是生物特性标准物质中较为特殊的一类，通过使用菌种标准物质能够有效保证微生物定量检测高效、准确地运行，但目前国内仅在出入境检验检疫系统内少数几个局在研制，大部分的标准物质都是靠国外引进。2006年，辽宁出入境检验检疫局所研制的食品中微生物菌落总数标准物质被批准为国家二级标准物质。该标准物质包含两种研制方法：一种是以模拟食品实物，添加肠杆菌、沙雷氏菌、芽孢杆菌等具有标准号、可溯源性的菌株经冷冻干燥制成的：另一种是以鱼粉为基质与上述细菌混合经冷冻干燥制成的，而我国在食品基质的食源性致病微生物标准物质领域仍是空白，因此研制添加基质的微生物定量标准物质有重要意义。

志贺氏菌（Shigella）是一类具有高度传染性的肠道致病菌，其广泛存在于各种食品中。人类对志贺氏菌的易感性较高，所以在食物和饮用水的卫生检验时，常以志贺氏菌作为指标菌。本发明以志贺氏菌为目标菌，通过添加无菌鸡肉粉，配合冻干保护剂，经冷冻干燥、不确定度评估以及对特性值进行均匀性检测和稳定性追踪，得到含一定菌数的志贺氏菌标准物质，并形成了一套食品基质的食源性致病微生物标准物质的制备工艺。

发明内容

本发明的目的在于提供一种含鸡肉基质的志贺氏菌标准物质，其具有良好的均匀性，且品质稳定、质量可控，适用于微生物高效、准确的定量检测。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种含鸡肉基质的志贺氏菌标准物质，其制备方法包括以下步骤：

1）保存液的配制：将志贺氏菌标准菌株冻干粉用志贺氏菌增菌肉汤溶解后，划线接种于志贺氏菌显色培养基上，36±1℃下培养20h-48h；然后挑取单菌落接种于志贺氏菌增菌肉汤中，41.5±1 ℃下培养16h-20h；吸取菌液于无菌离心管中，加入其体积1.5倍、质量浓度为40%的无菌甘油，混合，制成保存液；保存液于-20℃存储备用，使用前恢复至室温（22℃）后涡旋10s；

2）基质预处理：将鸡肉剔除脂肪组织后，冷冻干燥至脱水率为75%，然后将脱水鸡肉粉碎至组织细度为170目，采用⁶⁰Coγ辐射灭菌后分装备用；

3）混悬液的配制：按1g鸡肉基质加入7mL无菌水的比例，将预处理后的鸡肉基质与水混合成基质悬液，再加入其3倍体积的保护剂，混合制得混悬液；

4）标准物质的制备：取步骤1）制备的保存液2 μL于200 mL志贺氏菌增菌肉汤中，41.5±1 ℃下进行培养，并利用多功能酶标仪定时取样测定培养液的OD_{600 nm}值，当OD_{600 nm}为0.270±0.1时停止培养，得新鲜菌液，然后将新鲜菌液按混悬液体积浓度1%加入到步骤3）制得的混悬液中，于台式恒温振荡器上300r/min摇匀30min，再按2mL/瓶进行分装，其含菌量为8.4×10²~2.5×10³CFU/mL，最后经冷冻干燥，制得标准物质；

5）检验：将所得标准物质进行菌种鉴定、均匀性验证、定值、稳定性检验，制得成品。

步骤1）所得保存液的平均菌数为4.3×10⁷CFU/mL。

步骤2）所用鸡肉需先经检测不含抗生素；所用⁶⁰Coγ的辐射剂量为6KGY。

步骤3）所述保护剂是将脱脂乳、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、酪氨酸与水按体积比4:0.1:1:0.2:1混合而成。

步骤4）经冷冻干燥后所得标准物质中含菌量为530±24 CFU/瓶。

目前含鸡肉基质的标准物质都存在一个重要的问题，即鸡肉基质难溶于水，这使得标准物质难以达到满意的均匀性。本发明通过在预处理过程中将鸡肉基质冷冻干燥、粉碎，使所得标准物质能达到良好的均匀性。同时，本发明所得鸡肉基质的志贺氏菌标准物质品质稳定、质量可控，适用于微生物高效、准确的定量检测。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

材料与方法

1.1 材料与试剂

菌源：宋氏志贺氏菌Shigella sonnei，ATCC25931，购自上海汉尼生物技术有限公司。

基质：鸡胸脯肉，购自福建圣农集团，低温运输，-20℃存储备用。

志贺氏菌增菌肉汤-新生霉素、志贺氏菌显色培养基、木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂、菌落计数琼脂，北京陆桥有限公司。蔗糖（分析纯），上海试一化学剂有限公司；聚乙烯吡咯烷酮（优级纯），国药集团化学试剂有限公司；酪氨酸（优级纯），上海百赛生物技术有限公司；德运脱脂牛奶，富祺仕贸易（上海）有限公司。

1.2 仪器与设备

KD-TBC-300M电子天平，福建科迪技术有限公司；MODULYO-4K冷冻干燥机（配有真空泵），美国edword公司；FW100高速万能粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；M37610-33振荡器，金华雷琪实验器材有限公司；Stomacher3500拍击式均质器，英国SEWARD；SpectraMaxM5多功能酶标仪，Molecular Devices公司；SHKE4450台式恒温振荡器，美国Thermo公司；VXE380超低温冰箱，JOUAN/德国公司；Vitek2COMPACT30微生物鉴定仪（配套GP鉴定卡） 生物梅里埃公司；BOX389微生物鉴定仪配套麦氏比浊仪，HACH COMPANY公司；5mL西林瓶（配套丁基胶塞），安徽华欣药用玻璃制品有限公司。

1.3 方法

1.3.1 制备保存液

标准菌株冻干粉用志贺氏菌增菌肉汤溶解后划线接种于志贺氏菌显色培养基，36±1℃下培养20h-48h，挑取单菌落接种100mL志贺氏菌增菌肉汤中，41.5±1℃下培养16h-20h；吸取400μL新鲜菌液（OD₆₀₀=0.264）于无菌1.5mL聚乙烯离心管，再吸取600μL、质量浓度为40%无菌甘油与之混合，即为保存液；保存液中平均菌数为4.3×10⁷CFU/mL，-20℃保存备用。使用前恢复室温至（22℃）后涡旋10s。

1.3.2 菌液OD₆₀₀值对应的菌数范围

加保存液2μL于200mL志贺氏菌增菌肉汤增菌液中，设计10个平行，41.5±1℃下进行培养，并分别于培养8、12、16、18h时利用多功能酶标仪测定培养液的OD₆₀₀值，同时按照GB4789.2-2010《动物源性食品中抗生素类药物残留检测方法：微生物抑制法》进行菌落计数。

1.3.3 基质的前处理

鸡肉（无抗生素残留）剔除脂肪组织（因动物脂肪较易氧化酸败，使得干粉质量下降，保存状态不稳定，因此尽量剔除脂肪），冷冻干燥后脱水率为73.029%；将脱水鸡肉用高速万能粉碎机粉碎，至基质组织细度为170目，其呈疏松粉末状，易分散于热水中，有少量的沉淀，⁶⁰Coγ辐射剂量选择6KGY，灭菌后按100g/袋分装于自封袋中，于玻璃干燥锅中存储待用。

1.3.4 保护剂的设计

将脱脂乳、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、酪氨酸分别记为M、P、S、T，设计单因素试验，其水平设计见表1，并选用L₉（3⁴）正交表安排试验，实验设计见表2。每种保护剂配方液加入体积浓度为1%的新鲜菌液（OD₆₀₀=0.215），于台式恒温振荡器上混匀（300r/min，30min），分别按2mL/瓶分装于无菌西林瓶中进行冷冻干燥，冷冻干燥参数见表3。以保护率为指标，得出保护率最高的保护剂配方。

保护率B ₁ 计算公式：

……………（1）

式中：C ₁ 为冻干前菌数（CFU/mL）；C ₂ 为冻干后菌数（CFU/mL）

表1 单因素水平设计

表2 正交试验设计

表3 冷冻干燥参数设计

1.3.5 混悬液的配制

将预处理后的鸡肉基质与无菌水混合成基质悬液，再加入保护剂混合后得混悬液。根据基质脱水率（估为75%）设计混悬液的配制方案，其方法见表4。将新鲜菌液（OD₆₀₀=0.270）按混悬液体积1%添加至混悬液中，于台式恒温振荡器上300r/min振荡30min，2mL/瓶分装于西林瓶中进行冷冻干燥，冷冻干燥参数见表5。根据混悬液保护率B ₂ （计算参见公式1）得出最优配制方式。

冻干后样品复原方法：样品于室温（22℃）下放置10min，然后加2mL生理盐水涡旋10s，静置10min。

表4 混悬液的配制设计

表5 冷冻干燥参数设计

1.3.6 混悬液含菌数的确定

1.3.6.1 冻干样品含菌数短期下降率

按照1.3.5得出的最优混悬液配制方式配制100mL混悬液，根据保护率B ₂ 及新鲜菌液含菌数，设计混悬液含菌数（添加混悬液体积1%的菌液）。充分混匀后按2mL/瓶分装于西林瓶中进行冷冻干燥，冷冻干燥参数见表5。

冻干后样品于-20℃条件保存，并分别于0、7、14、28、40天时取样计数，计算冻干样品菌数的短期下降率X _n 。

菌数下降率X _n 的计算公式为：

……………（2），

式中：C ₀ 为冻干后当日菌数（CFU/瓶）；C _n 为-70℃条件下存储n天后的菌数（CFU/瓶）；X _n 为第n天菌数下降率（%）

1.3.6.2 混悬液菌数的确定

标准物质含菌数预期值为：200~600CFU/瓶（即100~300CFU/mL）。根据保护率B ₂ 及X ₄₀ ，计算混悬液最小含菌数Y ₁及最大含菌数Y ₂。

最小含菌数Y ₁的计算公式为：

……………（3）；

最大含菌数Y ₂的计算公式为

……………（4），

则添加新鲜菌液的量应保证Y ₁≤混悬液含菌数≤Y ₂。

1.3.7 批量制备标准物质冻干样品

按照上述工艺流程制备6个批次，每批次100个样品，共计540个样品，批次编号为：SH1~SH6，固定铝盖后存于-20℃待测。

1.3.8 志贺氏菌的验证

对制备后的冻干样品利用VITEK2程序进行志贺氏菌的鉴定。

1.3.9 均匀性验证

按随机表抽样，每批样品抽取15瓶，在控制同样实验条件下进行检测样品的含菌数（CFU/瓶），对结果进行方差分析。

1.3.10 冻干样品的定值

定值结果表示为：标准值±总不确定度。标准值参考1.3.8 结果。

1.3.10.1 菌落总数计数方法的不确定度评估

将新鲜培养菌液根据OD₆₀₀值估计浓度约为2.0×10⁸CFU/mL~3.0×10⁸CFU/mL，稀释至适当浓度，吸取1mL于平板计数，平行两次，以结果的对数值进行验证，用合并样本标准差来评估计数带来的不确定度。

1.3.10.2 样品定值方法不确定度评估

按随机表取样品15份，每份样品平行测量2次，用结果的对数值进行验证。

1.3.10.3 电子天平及移液器的不确定度评估

参照文献及校准所依据的JJG 646-2006 《移液器检定规程》、JJG 1036-2008 《电子天平检定规程》对电子天平及移液器精选校准。

1.3.11 冻干样品稳定性统计检验

分别将样品存储在-20℃、4℃、25℃环境中，于存储0、1、6、9、12个月时分别取出6瓶进行分析。

结果与分析

2.1 菌液OD₆₀₀值及对应的菌数范围

表6 OD₆₀₀值对应的菌数

对新鲜菌液进行OD₆₀₀值检测，根据表6评估菌液的含菌数以方便实验安排。

2.2 保护剂正交试验结果

表7 正交试验结果

由表7结果可知，7号保护剂配方的保护率最高，B ₁为32.39%，标准差为0.074%，选择该保护剂配方作为冻干保护剂。

2.3 混悬液的保护率

表8 混悬液的保护率

由表8结果可知，9号配制结果：B ₂为36.67%，标准差为0.048%，选用9号方案配制混悬液。

2.4 混悬液菌数短期下降率

根据B ₂为36.67%和新鲜菌液含菌数（4.0×10⁸ CFU/mL ~5.0×10⁸CFU/mL）设计混悬液菌数水平见表9。

表9 混悬液菌数设计

根据表9配制混悬液后，按2mL/瓶分装，按照表5冷冻干燥参数进行冻干，冻干样品含菌数检测结果见表10。

表10 混悬液菌数测定（CFU/瓶）

根据公式2计算菌数下降率X _n ，结果见表11。

表11 菌数下降率（%）

由表11结果可知高、中、低菌数的样品冻干后菌数从第14天到第40天相对稳定，计算X ₄₀的平均值为67.66%。将值带入公式（3）、（4），计算得混悬液的菌数应在8.4×10² CFU/mL~2.5×10³ CFU/m内。

2.5 志贺氏菌验证

VITEK2生化鉴定结果是97%为Shigella sonnei，结果判定为Excellentidentifiation。

2.6 均匀性验证

将样品于制备完成的第40天在同一试验条件下进行检测，6个批次记为：m₁~m ₆，每批次抽取15个样品，记为：n₁~n₁₅，检测结果见表12。

表12 样品的含菌数（CFU/瓶）

由表12结果可知：

测试总平均值：，测试总次数：，

批次间方差和：，组间自由度：，

批次间方差无偏估计：，

批次内差方和：，组内自由度：，

批次内方差无偏估计：，

将值带入公式后得统计量：=444.44/202.93=2.19，

该统计量是自由度的F分布变量。根据自由度及给定的显著性水平α=0.05，查得F=2.19<F _α=2.201，则组内和组间无显著性差异，即样品均匀。

2.7 冻干样品的定值

2.7.1 冻干样品的标准值

样品的标准值采用均匀性实验的计数结果，即标准值=530 CFU/瓶。

2.7.2 样品的不确定度评估

2.7.2.1 菌落计数方法不确定度的评估结果

表13 计数方法不确定度的检测结果

根据贝塞尔计算公式，计算出检测结果对数值标准偏差合并样本的标准差S _p ，以评估计数方法带来的不确定度。

根据公式：计算每个样品检测结果的残差值，并进一步计算样品检测结果的残差平方及残差平方和，计算结果见表14。

表14 检测结果的残差平方及残差平方和

根据贝塞尔计算公式，可计算出检测结果对数值标准偏差合并样本的标准差：

……………（5），

其中，m为检测的样本数，即m=10；n为每个样品重复检测的次数，即n=2；

总体合成的样本差：，则扩展不确定度：U ₁ =t×U _c ；取置信水平95%，f（自由度）=10，经过查t分布表得：t _0.05(10)=2.228；

得出U ₁ =2.228×0.0093=0.021。

当检测结果以2次测量对数值的平均值表示时，其值区间分布于±0.021之间。由于菌数最小基数为1，因此该不确定度可忽略不计。

2.7.2.2 标准物质定值的不确定度评估结果

取不同批次的冻干标准物质10份（于-70℃存储40天），每份样品平行测量2次，计数结果见表15。

表15 定值方法不确定度的计数结果

……………（6），

其中，m为检测的样本数，即m=10；n为每个样品重复检测的次数，即n=2，则标准偏差合并样本样品标准差：S _p =15.16575089 CFU/瓶，则总体合成的样本差=10.72380529 CFU/瓶。取置信水平95%，f（自由度）=10，经过查t分布表得：t _0.05(10)=2.228，扩展不确定度：U ₂ =t×U _c =2.228×10.72380529=23.8926382，取整数则U=24 CFU/瓶。

当测量检验结果用2次测量值平均值表示结果时，其值分布区间至±24 CFU/瓶之间。这个取值的区间适用于每一次测量。

2.7.2.3 移液器和电子天平的不确定度

移液器本次校准容量相对误差测量结果的扩展不确定度：U=0.1%（k=2）；电子天平扩展不确定度U=2.7934mg。故本标准物质定值中移液器和电子天平的不确定度可忽略不计。

2.8 样品的稳定性

样品存储在-20℃、4℃、25℃，每个时间取6瓶检测，以平均值作为检测数值，结果见表16。

表16 冻干样品的稳定性测量数据

表16中数据显示，保存第1个月，由于冷冻干燥后，样品性状不稳定，细菌对环境温度的变化敏感，样品含菌数下降幅度大，因此除去第0个月数值，以x代表时间，y代表冻干样品的特性值（菌含量），拟合成一条直线，-20℃、4℃、25℃斜率分别记为b ₁、b ₂、b ₃。以-20℃为例，计算如下：

，

式中，，

截距b₀：

，

直线的标准偏差s²：

，

取其平方根s=31.35，斜率的不确定度s(b₁)计算：

，

自由度为n-2，p=0.95（95%置信水平），则t=4.30。

因：<，

故斜率是不显著的，因而样品在-20℃保存第1个月起至第12个月未观测到不稳定性。

4℃及25℃的稳定性结果见表17。

表17 冻干样品的稳定性

由表17结果显示，样品在4℃保存第1个月起至第12个月未观测到不稳定性。在25℃保存第1个月起至第9个月未观测到不稳定性。

结论

3.1 冻干配方保护剂的配制方案

通过正交试验获得配方保护剂的最佳配制方案：设定纯水体积为N₁，蔗糖体积为N₂=N₁，脱脂奶体积为N₃=4N₂，聚乙烯吡咯烷酮和酪氨酸的体积分别为2%(N₂+N₃) 和4%(N₂+N₃)，其冻干保护率为32.39%。

3.2 混悬液的配制方案

以冻干后保护率为指标获得混悬液的最佳配制方案：鸡肉基质与无菌水按1g/7mL的比例配制后再与保护剂按体积比1:3混匀，加入体积浓度为1%的新鲜菌液，使所得混悬液中含菌数在8.4×10²~2.5×10³CFU/mL，其保护率为36.67%；-20℃保存40天时菌数下降率为67.66%。

3.3 稳定性跟踪

追踪样品保存于-20℃、4℃以及25℃下12个月的特性值稳定性，其-20℃和4℃保存下12个月未观测到不稳定性，25℃保存9个月稳定性良好。60℃运输温度下短期稳定性较差。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (3)

1.一种含鸡肉基质的志贺氏菌标准物质，其特征在于：其制备方法包括以下步骤：

1）保存液的配制：将志贺氏菌标准菌株冻干粉用志贺氏菌增菌肉汤溶解后，划线接种于志贺氏菌显色培养基上，36±1℃下培养20h-48h；然后挑取单菌落接种于志贺氏菌增菌肉汤中，41.5±1℃下培养16h-20h；吸取菌液于无菌离心管中，加入其体积1.5倍、质量浓度为40%的无菌甘油，混合，制成保存液；

2）基质预处理：将鸡肉剔除脂肪组织后，冷冻干燥至脱水率为75%，然后将脱水鸡肉粉碎至组织细度为170目，采用⁶⁰Coγ辐射灭菌后分装备用；

3）混悬液的配制：按1g鸡肉基质加入7mL无菌水的比例，将预处理后的鸡肉基质与水混合成基质悬液，再加入其3倍体积的保护剂，混合制得混悬液；

4）标准物质的制备：取步骤1）制备的保存液2 μL于200 mL志贺氏菌增菌肉汤中，41.5±1 ℃下进行培养，并利用多功能酶标仪定时取样测定培养液的OD_{600 nm}值，当OD_{600 nm}为0.270±0.1时停止培养，得新鲜菌液，然后将新鲜菌液按混悬液体积浓度1%加入到步骤3）制得的混悬液中，于恒温振荡器上300r/min摇匀30min，再按2mL/瓶进行分装，其含菌量为8.4×10²~2.5×10³CFU/mL，最后经冷冻干燥，制得标准物质；

5）检验：将所得标准物质进行菌种鉴定、均匀性验证、定值、稳定性检验，制得成品；

步骤3）所述保护剂是将脱脂乳、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、酪氨酸与水按体积比4:0.1:1:0.2:1混合而成；

步骤4）经冷冻干燥后所得标准物质中含菌量为530±24 CFU/瓶。

2.根据权利要求1所述含鸡肉基质的志贺氏菌标准物质，其特征在于：步骤1）所得保存液的平均菌数为4.3×10⁷CFU/mL。

3.根据权利要求1所述含鸡肉基质的志贺氏菌标准物质，其特征在于：步骤2）所用鸡肉需先经检测不含抗生素；所用⁶⁰Coγ的辐射剂量为6KGY。