CN116218678A - 一种用于涂抹法采样的微生物标准样品制备工艺及微生物标准样品 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物样品制备技术领域，具体为一种用于涂抹法采样微生物标准样品的新制备工艺及全新微生物标准样品。将一定种类和数量的微生物与特定保护剂混匀，保证微生物活性和均匀性，通过特定程序的真空干燥，使微生物能够稳定的附着在载体表面，采用真空包装，获得均匀性、稳定性符合要求的标准样品。使用时，打开真空包装，采用涂抹法采样进行质量控制。本发明提供的样品模拟含微生物的物体表面，便于储存、运输，适用于涂抹法采样微生物检验的质量控制活动。
Description
技术领域
本发明属于生物样品的制备技术领域，具体为一种用于涂抹法采样的微生物标准样品制备工艺及微生物标准样品。
背景技术
标准样品是具有一种或多种规定特性足够均匀且稳定的材料，用于对检测过程进行质量控制，即从样品处理开始就把标准样品和待测样品进行同步检测，从而评判检测数据是否有效。标准样品还可应用于实验人员的考核、实验室间比对和实验室内部质量控制，从而提高检测数据的科学性和有效性。
公共场所卫生、消毒餐饮具、医院消毒后的检验、生产环境工作台表面与工人手表面检测等前处理均采用涂抹法采集微生物，现有的微生物标准样品产品形式有冻干粉、冻干球、冻干饼及冻干柱等，使用方式为直接将产品溶解于适量复溶液或特定基质中作为待测液，均不适用此类微生物检测方法的采样需求，因此提供一种用于涂抹法采样的标准样品制备工艺及一种易于生产、保存、运输的用于涂抹法采样的微生物标准样品成为一种迫切要求。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供了一种用于表面涂抹法采样的标准样品制备工艺，同时提供微生物标准样品。
本发明要解决的技术问题的技术方案是：
首先是一种用于涂抹法采样的微生物标准样品制备工艺，包括以下步骤：
步骤1、微生物培养：将微生物接种到培养基中，对培养后的微生物进行浓度测定。
步骤2、保护剂配制：保护剂以糖类、蛋白胨和表面活性剂组成，其中糖类质量浓度分数为1%~5%，蛋白胨质量浓度分数为1%~12%，表面活性剂0.05~0.5%，其余为无菌水，121℃灭菌15min
步骤3、菌种负载：将培养好的微生物与保护剂混匀后，取适当体积滴加于载体上。
步骤4、真空干燥和包装：将附有微生物的载体放入冻干机中，采用特定程序干燥8~16h，当样品干燥结束后真空包装，样品为真空状态。
更好的，所述步骤1中，微生物可以是细菌、真菌、病毒之一或其组合。
更好的，所述步骤2中，糖类为葡萄糖、乳糖、海藻糖、蔗糖之一或其组合。
更好的，所述步骤2中，蛋白胨为酪蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、鱼蛋白胨、䏡蛋白胨、胃蛋白胨，且不限于上述蛋白胨。
更好的，所述步骤3中，微生物与保护剂混匀，其浓度为20~2 000 000 CFU/mL。
更好的，所述步骤4中，特定程序真空干燥的真空度由常压程序降压至0.001mbar，真空包装。
由上述微生物标准样品制备工艺制得的一种微生物标准样品的技术方案为：
微生物标准样品为：微生物附着在载体表面，采用密封容器真空包装。
更好的，所述微生物采用大肠埃希氏菌、产气肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、酿酒酵母、黑曲霉等细菌、酵母菌、霉菌之一或其任意组合。
更好的，所述载体可以是玻璃、金属、陶瓷、皮革、纺织品、纸制品。
更好的，所述密封容器可以是瓶、袋、盒。
更好的，微生物附着在载体表面，采用涂抹法对载体表面进行采样。
更好的，所述样品的均匀性和稳定性符合GB/T 15000.3-2008 《标准样品工作导则（3）标准样品定值的一般原则和统计方法》要求。
附图说明
图1为本发明工艺流程图。
图2为玻璃瓶载体样品示意图。
图3为钢片载体样品示意图。
图4为皮革载体样品示意图。
具体实施方式
为使本发明的技术方案和效果更佳清楚，下面结合附图及具体实施例做进一步详细描述，但本发明并不局限于具体实施例。
实施例1
一种用于涂抹法采样的微生物标准样品制备工艺及制得的细菌总数标准样品，具体步骤如下：
（1）目标菌由大肠埃希氏菌（Escherichia coli）、枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）组成，分别接种至营养琼脂培养基，于36℃培养，并对培养后的菌种进行浓度测定。
（2）保护剂的配制：2%乳糖、5%大豆蛋白胨和0.05%表面活性剂，其余为无菌水，121℃灭菌15min。
（3）菌种负载：所用载体为西林瓶（参见图2）。将培养好的3株目标菌分别梯度稀释至20 000 CFU/mL，按1：1：1体积比混合，并加入保护剂中，形成目标菌悬液，充分搅拌混匀后分装到玻璃瓶中，每瓶0.5 mL，旋转瓶体，使菌液均匀附着于瓶内壁，加上瓶塞，注意留有通气孔，用于水分挥发。
（4）真空干燥和包装：将混有菌悬液的玻璃瓶放入冻干机中，真空干燥程序设置如下：
真空度降至4 mbar，维持2 h，降至0.4 mbar维持2 h，降至0.04 mbar维持2 h，降至0.001 mbar维持2 h，共运行8h，结束后压盖封口，玻璃瓶中样品为真空状态。
（5）样品的均匀性和稳定性试验：对样品中细菌总数的均匀性和稳定性试验按照GB/T 15000.3-2008 《标准样品工作导则（3）标准样品定值的一般原则和统计方法》进行。所得样品均匀性和稳定性检测方法及结果如下：
分别随机抽取10个样品，在重复条件下测试2×10份样品的细菌总数。结果数据用方差分析法进行统计处理，统计步骤及结果如下：
表1 样品均匀性检测结果
表2 均匀性研究-方差分析(ANOVA)结果
结论：在95%置信概率下，与其它因素对测试结果的影响相比，样品的不均匀性是可接受的。
采用两种类型的稳定性试验：一种是储存稳定性，也称为长期稳定性，即在储存温度（-18℃~-33℃）下的稳定性试验；另一种是运输稳定性，也称为短期稳定性，即在模拟样品的运输条件下的稳定性试验。针对不同条件、不同保存时间测试3个样品，将3个样品结果的均值（对数转换后）用趋势分析法进行统计处理，说明标准样品的稳定性符合要求，同时确定样品的保存时间，稳定性试验结果见表3和表4。
表3 样品长期稳定性检验结果
样品长期稳定性趋势分析结果如下：
斜率：
截距：
直线上的点的标准偏差：
与斜率相关的不确定度：
表4 样品短期稳定性检验结果
样品短期稳定性趋势分析结果如下：
斜率：
截距：
直线上的点的标准偏差：
与斜率相关的不确定度：
（6）标准样品定值：
按照GB/T 15000.3-2008《标准样品工作导则（3）标准样品 定值的一般原则和统计方法》相关规定进行。
实施例2
本实施例中所述的一种用于涂抹法采样的真菌总数标准样品制备方法步骤均与实施例1中相同，不同的技术参数有：
（1）目标菌采用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），培养基用PDA培养3 d。
（2）所述样品载体为钢片（参见图3），表面积为25 cm2。
（3）保护剂为4%海藻糖、4%胰蛋白胨和0.5%表面活性剂，其余为无菌水，121℃灭菌15min。
（4）目标菌稀释至2 000 CFU/mL加入至保护剂中。
（5）将制备好的菌液均匀涂载于钢片上，放入冻干机中，设定程序，每小时调整一次真空度为上一次的10%并保持稳定运行1h，当真空度达到0.001mbar时再继续运行8h，共运行14h，结束后真空包装并封口，样品为真空状态。
实施例3
本实施例中所述的一种用于涂抹法采样的大肠菌群标准样品的制备方法步骤均与实施例1中相同，不同的技术参数有：
（1）所述载体为皮革（参见图4），表面积50 cm2。
（2）保护剂为5%海藻糖、3%䏡蛋白胨和0.05%表面活性剂，其余为无菌水，121℃灭菌15min。
（3）目标菌稀释至200 CFU/mL加入至保护剂中。
（4）将制备好的菌液均匀涂载于皮革上，放入冻干机中，设定程序，每小时调整一次真空度为上一次的10%并保持稳定运行2h，共运行12h，结束后真空包装并封口，样品为真空状态。
Claims (12)
1.一种用于涂抹法采样的微生物标准样品制备工艺，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、微生物培养：将微生物接种到培养基中，对培养后的微生物进行浓度测定；
步骤2、保护剂配制：保护剂以糖类、蛋白胨和表面活性剂组成，其中糖类质量浓度分数为1%~5%，蛋白胨质量浓度分数为1%~12%，表面活性剂0.05~0.5%，其余为无菌水，121℃灭菌15min；
步骤3、菌种负载：将培养好的微生物与保护剂混匀后，取适当体积滴加于载体上；
步骤4、真空干燥和包装：将附有微生物的载体放入冻干机中，采用特定程序真空干燥8~16 h，当样品干燥结束后真空包装，样品为真空状态。
2.根据权利要求1所述的一种用于涂抹法采样的微生物标准样品制备工艺，其特征在于：
所述步骤1中，微生物可以是细菌、真菌、病毒之一或其组合。
3.根据权利要求1所述的一种用于涂抹法采样的微生物标准样品制备工艺，其特征在于：
所述步骤2中，糖类为葡萄糖、乳糖、海藻糖、蔗糖之一或其组合，且不限于上述糖类。
4.根据权利要求1或3所述的一种用于涂抹法采样的微生物标准样品制备工艺，其特征在于：
所述步骤2中，蛋白胨为酪蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、鱼蛋白胨、䏡蛋白胨、胃蛋白胨，且不限于上述蛋白胨。
5.根据权利要求1所述的一种用于涂抹法采样的微生物标准样品制备工艺，其特征在于：
所述步骤3中，微生物与保护剂混匀，其浓度为20~2 000 000 CFU/mL。
6.根据权利要求1所述的一种用于涂抹法采样的微生物标准样品制备工艺，其特征在于：
所述步骤4中，特定程序真空干燥的真空度由常压程序降压至0.001mbar，真空包装。
7.一种微生物标准样品，其特征在于：
微生物附着在载体表面，采用密封容器真空包装。
8.根据权利要求7所述的一种微生物标准样品，其特征是：所述微生物采用大肠埃希氏菌、产气肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、酿酒酵母、黑曲霉等细菌、酵母菌、霉菌之一或其任意组合。
9.根据权利要求7所述的一种微生物标准样品，其特征是：所述载体可以是玻璃、金属、陶瓷、皮革、纺织品、纸制品。
10.根据权利要求7所述的一种微生物标准样品，其特征是：所述密封容器可以是瓶、袋、盒。
11.根据权利要求7-10任一所述的一种微生物标准样品，其特征是：微生物附着在载体表面，采用涂抹法对载体表面进行采样。
12.根据权利要求7-11任一所述的一种微生物标准样品，其特征是：所述样品的均匀性和稳定性符合GB/T 15000.3-2008 《标准样品工作导则（3）标准样品定值的一般原则和统计方法》要求。
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- 2023-04-14 CN CN202310399659.8A patent/CN116218678A/zh active Pending
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