CN111705101A - 一种即用型微量成分检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种即用型微量成分检测试剂盒及其制备方法，该制备方法包括以下步骤：（1）将微量成分测试培养基与塑形填充剂混合，装入载体容器后冻干，获得微量成分测试培养基固定层；（2）将抗氧化阻隔液与塑形填充剂混合，装入载体容器后冻干，获得位于微量成分测试培养基固定层上的抗氧化阻隔层；（3）将已活化的测试菌种分散于凝胶保护剂中，取菌悬液黏附于载体容器中并固定化干燥。本发明将精准定量的测试菌种及微量成分测试培养基溶液重塑于容器中，确保菌种及培养基的稳定性，无需菌种复壮及培养基称量、溶解、灭菌、分装等繁琐的制备过程，检测时只需加入微量成分标准溶液或样品提取液即可完成实验，减少实验操作步骤，提高检测效率。

Description

一种即用型微量成分检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明属于微量成分检测试剂盒制备技术领域，具体涉及一种即用型微量成分检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
微生物法在微量成分检测领域应用广泛，可用于测定食品中泛酸、叶酸、维生素B12、生物素、维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、肌醇等微量成分。微生物法实验前准备主要包括三大步骤：测试菌种的制备、试样/标准品的制备和培养基的配制。其中，测试菌种的制备需传代2~3代增强活力，耗费时间长，染菌几率大。而正确制备培养基是微生物实验室检测工作的基础，事关检测工作的准确性、可靠性。国标微生物法测定水溶性维生素的培养体系为10mL，试剂用量大，检测成本较高。
因微生物的营养需求范围大，测试培养基营养成分种类多，部分试剂组分含量极少，称量及配制的工作繁重。而商品化干粉合成培养基在一定程度上解决培养基繁琐的配制过程，但干粉培养基贮存条件较高，开封后干粉易吸潮结块变质，且国内现有的干粉培养基生产技术亦难以保证干粉物料的均质性及不同批次间的重复性。无论实验室自配培养基，亦或购买商品化的干粉合成培养基，均需经过称量、溶解、灭菌、分装的制备过程，培养基的制备过程中也常出现待测物质带入的污染风险，导致无法达到实验方法的检测效果。
中国发明专利CN201710001918公开一种用于微生物法定量检测泛酸的微孔板、其试剂盒及其制备方法，美国发明专利US8357504B2公开一种微生物定量检测混合物中维生素的方法及试剂盒，上述发明专利方案中均提供了菌种、培养基、无菌水和标准品的制备方法，但仍存在以下问题：（1）测试菌种的制备使用脱脂奶粉培养菌种至凝乳状，菌种不易分离获得；（2）低真空室温的沸腾方式干燥菌种，易造成部分菌液喷出容器，导致容器中干燥菌量不一致；（3）微孔板上仅包含干燥菌种，使用时培养基需另外制备，培养基制备分装过程存在染菌风险。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供了一种即用型微量成分检测试剂盒及其制备方法，本发明将精准定量的测试菌种及微量成分测试培养基溶液重塑于容器中，确保菌种及培养基的稳定性，无需菌种复壮及培养基称量、溶解、灭菌、分装等繁琐的制备过程，该载体容器中包含微量成分测试培养基层、抗氧化阻隔层及干燥的测试菌种，检测时只需加入微量成分标准溶液或样品提取液即可完成实验，减少实验操作步骤，提高检测效率。
本发明的上述目的是通过以下技术方案予以实现的：
一种即用型微量成分检测试剂盒的制备方法，其包括以下步骤：
（1）将微量成分测试培养基与塑形填充剂充分混合，装入载体容器后冻干，获得微量成分测试培养基固定层；
（2）将抗氧化阻隔液与塑形填充剂充分混合，装入载体容器以覆盖在已冻干的微量成分测试培养基固定层上，冻干获得位于微量成分测试培养基固定层上的抗氧化阻隔层；
（3）将已活化的微量成分测试菌种分散于凝胶保护剂中，取菌悬液黏附于载体容器中并固定化干燥，即得即用型微量成分检测微孔板；
（4）制备微量成分标准品。
优选但不限定地，一种即用型微量成分检测试剂盒的制备方法，其包括以下步骤：
（1）将微量成分测试培养基与塑形填充剂充分混合，取70~200μL分装入微孔中，确保溶液体积浸满微孔底部，并置于-80℃~-48℃无菌冷冻设备中迅速冷冻固定0.5~3h，获得微量成分测试培养基固定层；
（2）将抗氧化阻隔液与塑形填充剂充分混合，取30~60μL覆盖在已冷冻固定的微量成分测试培养基表面上，确保溶液体积足够完全覆盖培养基固定层，再置于-80℃~-48℃无菌冷冻设备中迅速冷冻固定0.5~3h，获得微量成分测试培养基固定层与抗氧化阻隔层；
（3）将已活化的菌种分散于凝胶保护剂中，菌悬液透光率控制在40~80%范围内，取2~10μL菌悬液黏附于微孔中并固定化干燥；
（4）制备微量成分标准品；
（5）微量成分检测微孔板和标准品包装及贮存。
作为本发明的所述即用型微量成分检测试剂盒的制备方法的一种实施方式，步骤（1）（2）中，所述塑形填充剂组分包括：1~10wt%右旋糖酐5000~7500、1~10wt%聚乙二醇4000~8000、1~5wt%羟甲基纤维素及0.2~1.5wt%α-环状糊精中的一种或多种组合。
更优选地，
微量成分为泛酸时，所述塑形填充剂组分包括：2~8wt%右旋糖酐5000~7500、1~10wt%聚乙二醇4000~8000及0.5~1.5wt%α-环状糊精，余量为水。
微量成分为烟酸和烟酰胺时，所述塑形填充剂组分包括：2~8wt%右旋糖酐5000~7500、2~8wt%聚乙二醇4000~8000及1~4wt%羟甲基纤维素，余量为水。
微量成分为维生素B6时，所述塑形填充剂组分包括： 2~10wt%聚乙二醇4000~8000、3~5wt%羟甲基纤维素及1~1.5wt%α-环状糊精，余量为水。
微量成分为维生素B1时，所述塑形填充剂组分包括：1~8wt%右旋糖酐5000~7500、1~8wt%聚乙二醇4000~8000及0.2~1wt%α-环状糊精，余量为水。
微量成分为维生素B2时，所述塑形填充剂组分包括：1~8wt%右旋糖酐5000~7500、1~8wt%聚乙二醇4000~8000及0.2~1.5wt%α-环状糊精，余量为水。
微量成分为肌醇时，所述塑形填充剂组分包括：2~10wt%右旋糖酐5000~7500、2~10wt%聚乙二醇4000~8000及1~3wt%羟甲基纤维素，余量为水。
本发明使用的塑形填充剂可使培养基溶液冻干后提供‘骨架’，保证干燥的培养基疏松稳定的结构，利于复水时能快速完全溶解。
具体实现时，塑形填充剂使用高压灭菌锅121℃±3℃灭菌5~15min后迅速水浴冷却备用。
作为本发明的所述即用型微量成分检测试剂盒的制备方法的一种实施方式，步骤（1）所述的微量成分测试培养基与塑形填充剂混合体积比为（1~5）：1。
作为本发明的所述即用型微量成分检测试剂盒的制备方法的一种实施方式，步骤（2）中，所述抗氧化阻隔液组分包括：2~12wt%聚乙烯吡咯烷酮10k~40k、0.1~3wt%维生素E、2~4wt%抗坏血酸钠、0.01~0.1wt%维生素D、0.05~0.15wt%硫代硫酸钠及0.005~0.05wt%谷胱甘肽中的一种或多种组合。
更优选地，
微量成分为泛酸时，所述抗氧化阻隔液组分包括：2~12wt%聚乙烯吡咯烷酮10k~40k、0.1~2wt%维生素E、2~4wt%抗坏血酸钠及0.005~0.05wt%谷胱甘肽，余量为水。
微量成分为烟酸和烟酰胺时，所述抗氧化阻隔液组分包括：2~8wt%聚乙烯吡咯烷酮10k~40k、2~4wt%抗坏血酸钠、0.01~0.06wt%维生素D及0.005~0.01wt%谷胱甘肽，余量为水。
微量成分为维生素B6时，所述抗氧化阻隔液组分包括：2~12wt%聚乙烯吡咯烷酮10k~40k、0.1~3wt%维生素E、0.05~0.15wt%硫代硫酸钠及0.01~0.05wt%谷胱甘肽，余量为水。
微量成分为维生素B1时，所述抗氧化阻隔液组分包括：1~8wt%聚乙烯吡咯烷酮10k~40k、2~4wt%抗坏血酸钠及0.01~0.05wt%谷胱甘肽，余量为水。
微量成分为维生素B2时，所述抗氧化阻隔液组分包括：1~8wt%聚乙烯吡咯烷酮10k~40k、2~4wt%抗坏血酸钠及0.005~0.02wt%谷胱甘肽，余量为水。
微量成分为肌醇时，所述抗氧化阻隔液组分包括：1~8wt%聚乙烯吡咯烷酮10k~40k、2~4wt%抗坏血酸钠及0.01~0.1wt%维生素D，余量为水。
具体实现时，抗氧化阻隔液使用孔径为0.22~0.45μm的无菌滤膜过滤除菌备用，为了达到有效过滤，应事先将滤膜用无菌水润湿。因培养基成分中含有大量的糖及还原性组分，而且存在易吸潮及易氧化的问题，所以针对这两问题，本发明使用抗氧化阻隔液及分层冻干的隔绝保护方法，保证固定化培养基的稳定性。
作为本发明的所述即用型微量成分检测试剂盒的制备方法的一种实施方式，步骤（2）所述的抗氧化阻隔液与塑形填充剂混合体积比为（2~4）：1。
作为本发明的所述即用型微量成分检测试剂盒的制备方法的一种实施方式，步骤（3）所述凝胶保护剂组分包括：2~6wt%甘露醇、0.1~1M氯化镁、0.2~2wt%牛奶酪蛋白、0.5~5wt%可溶性淀粉及0.02~0.2wt%瓜尔胶/卡拉胶/黄原胶中的一种或多种组合。本发明使用的凝胶保护剂可保护冻干菌种经冷冻和干燥的胁迫条件依然保持较高的存活率，且保证菌种长期储存活力的稳定性。
更优选地，
微量成分为泛酸时，所述凝胶保护剂组分包括：2~6wt%甘露醇、0.1~0.8M氯化镁、0.2~2wt%牛奶酪蛋白及0.02~0.2wt%瓜尔胶/卡拉胶/黄原胶，余量为水。
微量成分为烟酸和烟酰胺时，所述凝胶保护剂组分包括： 0.5~1M氯化镁、0.2~2wt%牛奶酪蛋白、0.5~4wt%可溶性淀粉及0.02~0.2wt%瓜尔胶/卡拉胶/黄原胶，余量为水。
微量成分为维生素B6时，所述凝胶保护剂组分包括： 0.5~1M氯化镁、2~5wt%可溶性淀粉及0.02~0.2wt%瓜尔胶/卡拉胶/黄原胶，余量为水。
微量成分为维生素B1时，所述凝胶保护剂组分包括：2~6wt%甘露醇、0.5~1M氯化镁0.02~0.2wt%瓜尔胶/卡拉胶/黄原胶，余量为水。
微量成分为维生素B2时，所述凝胶保护剂组分包括：2~6wt%甘露醇、0.1~0.8M氯化镁及0.02~0.2wt%瓜尔胶/卡拉胶/黄原胶，余量为水。
微量成分为肌醇时，所述凝胶保护剂组分包括：2~6wt%甘露醇、0.1~1M氯化镁及0.02~0.2wt%瓜尔胶/卡拉胶/黄原胶，余量为水。
具体实现时，凝胶保护剂使用高压灭菌锅121℃±3℃灭菌5~15min后迅速水浴冷却备用。
作为本发明的所述即用型微量成分检测试剂盒的制备方法的一种实施方式，步骤（3）所述已活化的菌种是将菌粉或菌珠加入0.4~4mL微量成分测试培养基中，再加入10~100ng/mL微量成分标准溶液0.4~4mL进行活化获得。
优选但不限定地，活化过程中，活化温度控制在28~38℃，活化时间为12~20h。
所述微量成分测试菌种包含植物乳酸杆菌及其变异菌株、发酵乳酸杆菌及其变异菌株、卡尔斯伯酵母菌及其变异菌株、鼠李糖乳酸杆菌及其变异菌株、葡萄汁酵母菌及其变异菌株、柠檬克勒克酵母菌及其变异菌株的一种或多种。
作为本发明的所述即用型微量成分检测试剂盒的制备方法的一种实施方式，步骤（3）所述固定化干燥程序为：预冻阶段为温度控制在-80℃~-48℃，保持0.5~3h；一次升华干燥阶段为温度控制在-60℃~-35℃，将真空度降至0.35~0.55mbar，达到最终真空度时间为8~12h；二次升华干燥阶段为-60℃~-35℃→0℃，真空度控制在0.35~0.55mbar，达到最终温度时间为 10~16h；解析干燥阶段为温度控制在24℃，真空度控制在0.010~0.020mbar，达到最终温度时间为 8~12h。
因固定化培养基浓度较高，且糖类及蛋白质占比大，快速升温及抽真空均不利于培养基的固定化，因此分一次升华控制真空度，二次升华控制升温速度，以及解析使用接近常温及更低真空度，有利于残余水分的升华，保证菌种及培养基的干燥性。
根据容器体积及检测方法所需培养体积，可适当浓缩或稀释培养基进行进一步固定化。
作为本发明的所述即用型微量成分检测试剂盒的制备方法的一种实施方式，步骤（4）所述的微量成分标准品，微量成分包括泛酸、烟酸和烟酰胺、维生素B1、维生素B2、维生素B6的任一种，粉末状微量成分标准物质纯度≥98%，根据实验所需标准品浓度精确称取粉末状微量成分标准物质、溶解、梯度稀释后分装入微孔板条内进行20~40h冻干，获得微量成分标准品；
作为本发明的所述即用型微量成分检测试剂盒的制备方法的一种实施方式，步骤（5）所述包装及贮存是指将已固定微量成分测试培养基及测试菌种的载体容器和标准品分别用铝箔袋密封保存，并在其中均放置无菌干燥剂及抗氧剂，置于≤8℃环境下贮存。
优选但不限定地，所述载体类型包括：微孔板（200~450μL）、离心管（300~5000μL）、培养试管（1mL~10mL）。
需要说明的是，步骤（1）所述的微量成分测定试培养基为配制浓度为2倍浓缩培养基。根据容器体积及检测方法所需培养体积，可适当浓缩或稀释培养基进行进一步固定化。于本发明中，对于测试培养基并没有特别的限定，测试培养基可以包括国标法内提供的测试培养基，商品化已有的测试培养基，但不局限于此，只要满足测试培养基内不含有待测组分，且能够满足测试菌种对待测组分浓度的生长具有相关性的均可使用。
一种即用型微量成分检测试剂盒，其通过任一上述的即用型微量成分检测试剂盒的制备方法制得。
与现有技术相比，本发明有益效果在于：
本发明提供的一种即用型微量成分检测试剂盒，适用于微生物法定量检测微量成分，微孔板中已预先分别固定化测试菌种、微量成分测试培养基及微量成分标准品，检测载体容器中包含微量成分测试培养基层、抗氧化阻隔层及干燥的测试菌种，标准品载体容器中包含干燥微量成分标准物质，检测微量成分时，只需将微量成分标准溶液或样品提取液加入至检测载体容器中，即可完成实验操作，省去测试菌种、测试培养基及标准品制备的繁琐过程，也减少添加菌种及培养基的实验操作步骤，提高检测效率。
本发明的即用型微量成分检测试剂盒包括即用型检测微孔板和标准品。本发明检测载体包埋的菌种、培养基和标准品兼具结构稳定性高和复水性佳的优点，可实现大批量菌种、培养基及标准品的固定化，检测微量成分时，只需加入微量成分标准溶液或样品提取液即可完成实验，无需菌种、培养基及标准曲线梯度溶液制备的繁琐过程，也省去添加菌种及培养基的实验步骤，提高微孔板法检测微量成分的实验效率。
经本发明技术方案的制备的即用型微量成分检测载体，干燥菌种存活率≥92%，批次内微孔板变异系数<5%；且采取抗氧化阻隔液覆盖培养基分层固定化，有效防止培养基吸潮及氧化褐变等问题，干燥固体测试培养基复水即溶，培养效果与液体培养基基本无差异。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
实施例1
一种即用型泛酸检测试剂盒的制备方法，其包括以下步骤：
（1）将泛酸测试培养基与塑形填充剂充分混合，取120μL分装入微孔中，确保溶液体积浸满微孔底部，并置于-50℃无菌冷冻设备中迅速冷冻固定2.5h，获得泛酸测试培养基固定层；
（2）将抗氧化阻隔液与塑形填充剂充分混合，取60μL覆盖在已冷冻固定的泛酸测试培养基表面上，确保溶液体积足够完全覆盖培养基固定层，再置于-50℃无菌冷冻设备中迅速冷冻固定2.5h，获得泛酸测试培养基固定层与抗氧化阻隔层；
（3）将已活化的植物乳酸杆菌分散于凝胶保护剂中，菌悬液透光率控制在50%，取2μL菌悬液黏附于微孔中并固定化干燥；
（4）制备泛酸标准品；
（5）泛酸检测微孔板和泛酸标准品包装及贮存。
其中，步骤（1）所述的泛酸测试培养基，1L泛酸测试培养基含：维生素测试用酪蛋白氨基酸20.0 g，葡萄糖80.0 g，乙酸钠40.0 g，L-胱氨酸0.84 g，DL-色氨酸0.2g，硫酸腺嘌呤40.0 mg，盐酸鸟嘌呤40.0 mg，尿嘧啶40.0 mg，盐酸硫胺素400.0 μg，烟酸2.0 mg，盐酸吡哆醇1.60 mg， p-氨基苯甲酸400.0 μg，磷酸氢二钾2.0 g，磷酸二氢钾2.0 g，硫酸镁0.8 g，氯化钠40.0 mg，硫酸亚铁40.0 mg，硫酸锰40.0 mg，胡萝卜素800.0 μg，聚山梨糖单油酸酯0.2g，溶解于去离子水或蒸馏水中，使用微波炉或电热炉加热助溶完全后，通过高压灭菌锅120℃灭菌5min，并及时水浴冷却（以防加热过度），获得泛酸测试培养基。
其中，步骤（1）（2）所述的塑形填充剂组分包括：2wt%右旋糖酐7500、4wt%聚乙二醇6000及0.2wt%α-环状糊精，余量为水，塑形填充剂使用高压灭菌锅120℃灭菌5min后迅速水浴冷却备用。
其中，步骤（1）所述的泛酸测试培养基与塑形填充剂充分混合，混合体积比为2：1。
其中，步骤（2）所述的抗氧化阻隔液组分包括：4wt%聚乙烯吡咯烷酮40k、0.5wt%维生素E、3wt%抗坏血酸钠及0.01wt%谷胱甘肽，余量为水，抗氧化阻隔液使用孔径为0.45μm的无菌滤膜过滤除菌备用，为了达到有效过滤，应事先将滤膜用无菌水润湿。
其中，步骤（2）所述的抗氧化阻隔液与塑形填充剂充分混合，混合体积比为3：1。
其中，步骤（3）所述的凝胶保护剂组分包括：4wt%甘露醇、0.5M氯化镁、0.5wt%牛奶酪蛋白、0.1wt%瓜尔胶，余量为水，凝胶保护剂使用高压灭菌锅120℃灭菌5min后迅速水浴冷却备用。
其中，步骤（3）所述的菌种活化方式是指将植物乳酸杆菌菌珠加入4mL泛酸测试培养基中，再加入60ng/mL泛酸标准溶液4mL，活化温度36℃，活化时间为14h。
其中，步骤（3）所述的固定化干燥，冻干程序为：预冻阶段为-50℃，保持1h；一次升华干燥阶段为-38℃，将真空度降至0.45mbar，达到最终真空度时间为8h；二次升华干燥阶段为-38℃→0℃，真空度控制在0.45 mbar，达到最终温度时间为12h；解析干燥阶段最终温度为24℃，真空度控制在0.015mbar，达到最终温度时间为 8h。
其中，步骤（4）所述的泛酸标准品的制备，精确称取40.8mg粉末状泛酸标准物质（≥98%，Sigma-Aldrich），溶解于1L的0.02mol/L乙酸钠和0.002mol/L的乙酸溶液中，获得40μg/mL泛酸标准储备液，再将泛酸标准储备液梯度稀释成0、12.5、25、50、75、100、150ng/mL泛酸标准曲线系列浓度，取27μL泛酸标准曲线系列浓度由低浓度到高浓度分装入微孔板条内进行28h冻干，获得泛酸标准品。
其中，步骤（5）所述的微孔板包装及贮存，将已固定泛酸测试培养基及植物乳酸杆菌的微孔板和泛酸标准品分别用铝箔袋密封保存，并在其中均放置无菌干燥剂及抗氧剂，置于≤8℃环境下贮存。
进行泛酸定量检测实验时，取360μL无菌水溶解泛酸标准品后，再移取320μL泛酸标准曲线溶液或样品提取液加入至泛酸检测微孔板孔中，置于37℃恒温培养箱内避光培养，即完成实验操作。
经活菌计数，上述方法制备的即用型泛酸检测微孔板中固定化的干燥植物乳酸杆菌活性菌种数，为所添加菌液中菌种总数的94%。
实施例2
一种即用型烟酸和烟酰胺检测试剂盒的制备方法，其包括以下步骤：
（1）将烟酸和烟酰胺测试培养基与塑形填充剂充分混合，取100μL分装入微孔中，确保溶液体积浸满微孔底部，并置于-80℃无菌冷冻设备中迅速冷冻固定2h，获得烟酸和烟酰胺测试培养基固定层；
（2）将抗氧化阻隔液与塑形填充剂充分混合，取30μL覆盖在已冷冻固定的烟酸和烟酰胺测试培养基表面上，确保溶液体积足够完全覆盖培养基固定层，再置于-80℃无菌冷冻设备中迅速冷冻固定1h，获得烟酸和烟酰胺测试培养基固定层与抗氧化阻隔层；
（3）将已活化的植物乳酸杆菌分散于凝胶保护剂中，菌悬液透光率控制在40%，取2μL菌悬液黏附于微孔中并固定化干燥；
（4）制备烟酸标准品；
（4）烟酸和烟酰胺检测微孔板和烟酸标准品包装及贮存。
其中，步骤（1）所述的烟酸测试培养基，1L烟酸测试培养基含：酪蛋白氨基酸24g，葡萄糖80g，乙酸钠40g，L-胱氨酸0.8g，DL-色氨酸0.4g，盐酸腺嘌呤40mg，盐酸鸟嘌呤40mg，尿嘧啶40mg，盐酸硫胺素400μg，泛酸钙400μg，盐酸吡哆醇800μg，核黄素800μg，p-氨基苯甲酸200μg，生物素1.6μg，磷酸氢二钾2g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.8g，氯化钠40mg，硫酸亚铁40mg，硫酸锰40mg，溶解于去离子水或蒸馏水中，使用微波炉或电热炉加热助溶完全后，通过高压灭菌锅120℃灭菌10min，并及时水浴冷却（以防加热过度），获得烟酸和烟酰胺测试培养基。
其中，步骤（1）（2）所述的塑形填充剂，塑形填充剂组分包括：4wt%右旋糖酐5000、4wt%聚乙二醇6000及1wt%羟甲基纤维素，余量为水，塑形填充剂使用高压灭菌锅120℃灭菌10min后迅速水浴冷却备用。
其中，步骤（1）所述的烟酸和烟酰胺测试培养基与塑形填充剂充分混合，混合体积比为4：1。
其中，步骤（2）所述的抗氧化阻隔液组分包括：4wt%聚乙烯吡咯烷酮10k、0.05wt%维生素D、2wt%抗坏血酸钠及0.005wt%谷胱甘肽，余量为水，抗氧化阻隔液使用孔径为0.45μm的无菌滤膜过滤除菌备用，为了达到有效过滤，应事先将滤膜用无菌水润湿。
其中，步骤（2）所述的抗氧化阻隔液与塑形填充剂充分混合，混合体积比为4：1。
其中，步骤（3）所述的凝胶保护剂，凝胶保护剂组分包括：1wt%可溶性淀粉、0.8M氯化镁、0.5wt%牛奶酪蛋白、0.1wt%黄原胶，余量为水，凝胶保护剂使用高压灭菌锅120℃灭菌10min后迅速水浴冷却备用。
其中，步骤（3）所述的菌种活化方式是指将植物乳酸杆菌菌珠加入0.6mL烟酸和烟酰胺测试培养基中，再加入60ng/mL烟酸标准溶液0.6mL，活化温度37℃，活化时间为18h。
其中，步骤（3）所述的固定化干燥，冻干程序为：预冻阶段为-80℃，保持1h；一次升华干燥阶段为-55℃，将真空度降至0.45mbar，达到最终真空度时间为11h；二次升华干燥阶段为-55℃→0℃，真空度控制在0.45 mbar，达到最终温度时间为14h；解析干燥阶段最终温度为24℃，真空度控制在0.015mbar，达到最终温度时间为 8h。
其中，步骤（4）所述的烟酸标准品的制备，精确称取51.0mg粉末状烟酸标准物质（≥98%，Sigma-Aldrich），溶解于1L的25wt%的乙醇溶液中，获得100μg/mL烟酸标准储备液，再将烟酸标准储备液梯度稀释成0、10、20、40、60、80、100ng/mL烟酸标准曲线系列浓度，取27μL烟酸标准曲线系列浓度由低浓度到高浓度分装入微孔板条内进行26h冻干，获得烟酸标准品。
其中，步骤（5）所述的微孔板包装及贮存，将已固定烟酸和烟酰胺测试培养基及植物乳酸杆菌的微孔板和烟酸标准品用铝箔袋密封保存，并在其中均放置无菌干燥剂及抗氧剂，置于≤8℃环境下贮存。
进行烟酸和烟酰胺定量检测实验时，取360μL无菌水溶解烟酸标准品后，再取320μL烟酸标准曲线溶液或样品提取液加入至微孔中，置于37℃恒温培养箱内避光培养，即完成实验操作。
经活菌计数，上述方法制备的即用型烟酸检测微孔板中固定化的干燥植物乳酸杆菌活性菌种数，为所添加菌液中菌种总数的93%。
实施例3
一种即用型维生素B6检测试剂盒的制备方法，其包括以下步骤：
（1）将维生素B6测试培养基与塑形填充剂充分混合，取160μL分装入微孔中，确保溶液体积浸满微孔底部，并置于-80℃无菌冷冻设备中迅速冷冻固定2h，获得维生素B6测试培养基固定层；
（2）将抗氧化阻隔液与塑形填充剂充分混合，取60μL覆盖在已冷冻固定的维生素B6测试培养基表面上，确保溶液体积足够完全覆盖培养基固定层，再置于-80℃无菌冷冻设备中迅速冷冻固定1.5h，获得维生素B6测试培养基固定层与抗氧化阻隔层；
（3）将已活化的卡尔斯伯酵母菌分散于凝胶保护剂中，菌悬液透光率控制在50%，取3μL菌悬液黏附于微孔中并固定化干燥；
（4）制备维生素B6标准品；
（5）维生素B6检测微孔板和维生素B6标准品包装及贮存。
其中，步骤（1）所述的维生素B6测试培养基，1L维生素B6测试培养基含：葡萄糖80.0g，L-天冬酰胺8.0g，硫酸铵8.0g，磷酸二氢钾6.0g，硫酸镁2.0g，氯化钙0.98g，DL-蛋氨酸80.0mg，DL-色氨酸80.0mg，DL-异亮氨酸80.0mg，DL-缬氨酸80.0mg，盐酸组氨酸40.0mg，核黄素40.0mg，生物素16.0mg，肌醇10.0mg，硫酸亚铁1mg，盐酸硫胺素800.0μg，泛酸钙800.0μg，胆碱酸800.0μg，硼酸400.0μg，碘化钾400.0μg，钼酸铵80.0μg，硫酸锰160.0μg，硫酸铜180.0μg，硫酸锌160.0μg，溶解于去离子水或蒸馏水中，使用微波炉或电热炉加热助溶完全后，通过高压灭菌锅120℃灭菌5min，并及时水浴冷却（以防加热过度），获得维生素B6测试培养基。
其中，步骤（1）（2）所述的塑形填充剂，塑形填充剂组分包括：4.5wt%羟甲基纤维素、9wt%聚乙二醇8000及1wt%α-环状糊精，余量为水，塑形填充剂使用高压灭菌锅120℃灭菌5min后迅速水浴冷却备用。
其中，步骤（1）所述的维生素B6测试培养基与塑形填充剂充分混合，混合体积比为2：1。
其中，步骤（2）所述的抗氧化阻隔液组分包括：8wt%聚乙烯吡咯烷酮40k、2wt%维生素E、0.05wt%硫代硫酸钠及0.05wt%谷胱甘肽，余量为水，抗氧化阻隔液使用孔径为0.45μm的无菌滤膜过滤除菌备用，为了达到有效过滤，应事先将滤膜用无菌水润湿。
其中，步骤（2）所述的抗氧化阻隔液与塑形填充剂充分混合，混合体积比为3：1。
其中，步骤（3）所述的凝胶保护剂组分包括： 4wt%可溶性淀粉、0.6M氯化镁、0.1wt%卡拉胶，余量为水，凝胶保护剂使用高压灭菌锅120℃灭菌10min后迅速水浴冷却备用。
其中，步骤（3）所述的菌种活化方式是指将卡尔斯伯酵母菌菌珠加入2mL维生素B6测试培养基中，再加入30ng/mL维生素B6标准溶液2mL，活化温度30℃，活化时间为20h。
其中，步骤（3）所述的固定化干燥，冻干程序为：预冻阶段为-80℃，保持1h；一次升华干燥阶段为-48℃，将真空度降至0.45mbar，达到最终真空度时间为10h；二次升华干燥阶段为-48℃→0℃，真空度控制在0.45 mbar，达到最终温度时间为14h；解析干燥阶段最终温度为24℃，真空度控制在0.015mbar，达到最终温度时间为 12h。
其中，步骤（4）所述的维生素B6标准品的制备，精确称取51.0mg粉末状吡哆素标准物质（≥98%，Sigma-Aldrich），溶解于50mL的0.01mol/L的盐酸溶液中，获得1mg/mL维生素B6标准储备液，再将维生素B6标准储备液梯度稀释成0、1.25、2.5、3.75、5、6.25、7.5ng/mL维生素B6标准曲线系列浓度，取33.75μL维生素B6标准曲线系列浓度由低浓度到高浓度分装入微孔板条内进行24h冻干，获得维生素B6标准品。
其中，步骤（5）所述的微孔板包装及贮存，将已固定维生素B6测试培养基及卡尔斯伯酵母菌的微孔板和维生素B6标准品分别用铝箔袋密封保存，并在其中均放置无菌干燥剂及抗氧剂，置于≤8℃环境下贮存。
进行维生素B6定量检测实验时，取450μL无菌水溶解维生素B6标准品，再取400μL维生素B6标准曲线溶液或样品提取液加入至微孔中，置于30℃恒温培养箱内避光培养，即完成实验操作。
经活菌计数，上述方法制备的即用型维生素B6检测微孔板中固定化的干燥卡尔斯伯酵母菌活性菌种数，为所添加菌液中菌种总数的94%。
实施例4
一种即用型维生素B1检测试剂盒的制备方法，其包括以下步骤：
（1）将维生素B1测试培养基与塑形填充剂充分混合，取160μL分装入微孔中，确保溶液体积浸满微孔底部，并置于-80℃无菌冷冻设备中迅速冷冻固定2h，获得维生素B1测试培养基固定层；
（2）将抗氧化阻隔液与塑形填充剂充分混合，取60μL覆盖在已冷冻固定的维生素B1测试培养基表面上，确保溶液体积足够完全覆盖培养基固定层，再置于-80℃无菌冷冻设备中迅速冷冻固定1.5h，获得维生素B1测试培养基固定层与抗氧化阻隔层；
（3）将已活化的发酵乳杆菌分散于凝胶保护剂中，菌悬液透光率控制在50%范围内，取3μL菌悬液黏附于微孔中并固定化干燥；
（4）制备维生素B1标准品；
（5）维生素B1检测微孔板和维生素B1标准品包装及贮存。
其中，步骤（1）所述的维生素B1测试培养基，1L维生素B1测试培养基含：无硫胺素胰蛋白胨44.0 g，维生素测试酪蛋白氨基酸10.0 g，葡萄糖80.0g，醋酸钠 30.0g，L-胱氨酸0.4g，腺嘌呤硫酸盐40.0mg，盐酸鸟嘌呤40.0 mg，尿嘧啶40.0mg，核黄素400.0μg，泛酸钙400.0μg，烟酸400.0μg，盐酸吡哆醇400.0μg，对氨基苯甲酸400.0μg，叶酸10.0μg，生物素1.6μg，磷酸二氢钾2.0 g，磷酸氢二钾1.0g，硫酸镁0.8g，氯化钠40.0mg，硫酸亚铁40.0mg，锰硫酸盐40.0mg溶解于去离子水或蒸馏水中，使用微波炉或电热炉加热助溶完全后，通过高压灭菌锅120℃灭菌5min，并及时水浴冷却（以防加热过度），获得维生素B1测试培养基。
其中，步骤（1）（2）所述的塑形填充剂，塑形填充剂组分包括：6wt%右旋糖酐5000、6wt%聚乙二醇4000及0.2wt%α-环状糊精，余量为水，塑形填充剂使用高压灭菌锅120℃灭菌10min后迅速水浴冷却备用。
其中，步骤（1）所述的维生素B1测试培养基与塑形填充剂充分混合，混合体积比为2：1。
其中，步骤（2）所述的抗氧化阻隔液组分包括：6wt%聚乙烯吡咯烷酮40k、2wt%抗坏血酸钠及0.05wt%谷胱甘肽，余量为水，抗氧化阻隔液使用孔径为0.45μm的无菌滤膜过滤除菌备用，为了达到有效过滤，应事先将滤膜用无菌水润湿。
其中，步骤（2）所述的抗氧化阻隔液与塑形填充剂充分混合，混合体积比为3：1。
其中，步骤（3）所述的凝胶保护剂组分包括：4wt%甘露醇、0.6M氯化镁、0.1wt%卡拉胶，余量为水，凝胶保护剂使用高压灭菌锅120℃灭菌10min后迅速水浴冷却备用。
其中，步骤（3）所述的菌种活化方式是指将发酵乳杆菌菌珠加入2mL维生素B1测试培养基中，再加入80ng/mL维生素B1标准溶液2mL，活化温度37℃，活化时间为22h。
其中，步骤（3）所述的固定化干燥，冻干程序为：预冻阶段为-80℃，保持1h；一次升华干燥阶段为-48℃，将真空度降至0.45mbar，达到最终真空度时间为10h；二次升华干燥阶段为-48℃→0℃，真空度控制在0.45 mbar，达到最终温度时间为14h；解析干燥阶段最终温度为24℃，真空度控制在0.015mbar，达到最终温度时间为 12h。
其中，步骤（4）所述的维生素B1标准品的制备，精确称取102.0mg粉末状维生素B1标准物质（≥98%），溶解于100mL的0.1mol/L的盐酸溶液中，获得1mg/mL维生素B1标准储备液，再将维生素B1标准储备液梯度稀释成0、7.5、15、22.5、30、37.5、45ng/mL维生素B1标准曲线系列浓度，取33.75μL维生素B1标准曲线系列浓度由低浓度到高浓度分装入微孔板条内进行32h冻干，获得维生素B1标准品。
其中，步骤（5）所述的微孔板包装及贮存，将已固定维生素B1测试培养基及发酵乳杆菌的微孔板和维生素B1标准品分别用铝箔袋密封保存，并在其中均放置无菌干燥剂及抗氧剂，置于≤8℃环境下贮存。
进行维生素B1定量检测实验时，取450μL无菌水溶解维生素B1标准品，再取400μL维生素B1标准曲线溶液或样品提取液加入至微孔中，置于37℃恒温培养箱内避光培养，即完成实验操作。
经活菌计数，上述方法制备的即用型维生素B1检测微孔板中固定化的干燥发酵乳杆菌活性菌种数，为所添加菌液中菌种总数的92%。
实施例5
一种即用型维生素B2检测试剂盒的制备方法，其包括以下步骤：
（1）将维生素B2测试培养基与塑形填充剂充分混合，取120μL分装入微孔中，确保溶液体积浸满微孔底部，并置于-50℃无菌冷冻设备中迅速冷冻固定2h，获得维生素B2测试培养基固定层；
（2）将抗氧化阻隔液与塑形填充剂充分混合，取60μL覆盖在已冷冻固定的维生素B2测试培养基表面上，确保溶液体积足够完全覆盖培养基固定层，再置于-50℃无菌冷冻设备中迅速冷冻固定2h，获得维生素B2测试培养基固定层与抗氧化阻隔层；
（3）将已活化的鼠李糖乳酸杆菌分散于凝胶保护剂中，菌悬液透光率控制在45%，取3μL菌悬液黏附于微孔中并固定化干燥；
（4）制备维生素B2标准品；
（5）维生素B2检测微孔板和维生素B2标准品包装及贮存。
其中，步骤（1）所述的维生素B2测试培养基，1L维生素B2测试培养基含：酪蛋白20.0 g，葡萄糖40.0g，乙酸钠30.0g，磷酸氢二钾2.0 g，磷酸二氢钾2.0 g，L-天门冬氨酸1.2 g，L-胱氨酸0.4 g，DL-色氨酸0.4 g，硫酸镁0.8 g，硫酸腺嘌呤40.0 mg，盐酸鸟嘌呤40.0 mg，尿嘧啶40.0mg，黄嘌呤40 mg，硫酸铁40.0 mg，硫酸锰40.0 mg，氯化钠40.0mg，盐酸吡多醇8.0 mg，盐酸吡哆醛8.0 mg，对氨基苯甲酸4.0 mg，泛酸钙1.6mg，叶酸1.6mg，烟酸1.6mg，盐酸硫胺素800μg，生物素2.0μg，溶解于去离子水或蒸馏水中，使用微波炉或电热炉加热助溶完全后，通过高压灭菌锅120℃灭菌5min，并及时水浴冷却（以防加热过度），获得维生素B2测试培养基。
其中，步骤（1）（2）所述的塑形填充剂组分包括：6wt%右旋糖酐7500、6wt%聚乙二醇6000及0.2wt%α-环状糊精，余量为水，塑形填充剂使用高压灭菌锅120℃灭菌5min后迅速水浴冷却备用。
其中，步骤（1）所述的维生素B2测试培养基与塑形填充剂充分混合，混合体积比为2：1。
其中，步骤（2）所述的抗氧化阻隔液组分包括：2wt%聚乙烯吡咯烷酮40k、3wt%抗坏血酸钠及0.01wt%谷胱甘肽，余量为水，抗氧化阻隔液使用孔径为0.45μm的无菌滤膜过滤除菌备用，为了达到有效过滤，应事先将滤膜用无菌水润湿。
其中，步骤（2）所述的抗氧化阻隔液与塑形填充剂充分混合，混合体积比为3：1。
其中，步骤（3）所述的凝胶保护剂组分包括：4wt%甘露醇、0.5M氯化镁、0.1wt%瓜尔胶，余量为水，凝胶保护剂使用高压灭菌锅120℃灭菌5min后迅速水浴冷却备用。
其中，步骤（3）所述的菌种活化方式是指将鼠李糖乳酸杆菌菌珠加入4mL维生素B2测试培养基中，再加入60ng/mL维生素B2标准溶液4mL，活化温度37℃，活化时间为18h。
其中，步骤（3）所述的固定化干燥，冻干程序为：预冻阶段为-50℃，保持2h；一次升华干燥阶段为-48℃，将真空度降至0.48mbar，达到最终真空度时间为8h；二次升华干燥阶段为-48℃→0℃，真空度控制在0.48 mbar，达到最终温度时间为12h；解析干燥阶段最终温度为24℃，真空度控制在0.012mbar，达到最终温度时间为 8h。
其中，步骤（4）所述的维生素B2标准品的制备，精确称取10.2mg粉末状维生素B2标准物质（≥98%，Sigma-Aldrich），溶解于100mL的0.002mol/L盐酸溶液中，获得100μg/mL维生素B2标准储备液，再将维生素B2标准储备液梯度稀释成0、20、50、75、100、125、150ng/mL维生素B2标准曲线系列浓度，取27μL维生素B2标准曲线系列浓度由低浓度到高浓度分装入微孔板条内进行28h冻干，获得维生素B2标准品。
其中，步骤（5）所述的微孔板包装及贮存，将已固定维生素B2测试培养基及鼠李糖乳酸杆菌的微孔板和维生素B2标准品分别用铝箔袋密封保存，并在其中均放置无菌干燥剂及抗氧剂，置于≤8℃环境下贮存。
进行维生素B2定量检测实验时，取360μL无菌水溶解维生素B2标准品后，再移取320μL维生素B2标准曲线溶液或样品提取液加入至维生素B2检测微孔板孔中，置于37℃恒温培养箱内避光培养，即完成实验操作。
经活菌计数，上述方法制备的即用型维生素B2检测微孔板中固定化的干燥鼠李糖乳酸杆菌活性菌种数，为所添加菌液中菌种总数的94%。
实施例6
一种即用型肌醇检测试剂盒的制备方法，其包括以下步骤：
（1）将肌醇测试培养基与塑形填充剂充分混合，取100μL分装入微孔中，确保溶液体积浸满微孔底部，并置于-80℃无菌冷冻设备中迅速冷冻固定2h，获得肌醇测试培养基固定层；
（2）将抗氧化阻隔液与塑形填充剂充分混合，取30μL覆盖在已冷冻固定的肌醇测试培养基表面上，确保溶液体积足够完全覆盖培养基固定层，再置于-80℃无菌冷冻设备中迅速冷冻固定1h，获得肌醇测试培养基固定层与抗氧化阻隔层；
（3）将已活化的葡萄汁酵母菌分散于凝胶保护剂中，菌悬液透光率控制在60%，取3μL菌悬液黏附于微孔中并固定化干燥；
（4）制备肌醇标准品；
（5）肌醇检测微孔板和肌醇标准品包装及贮存。
其中，步骤（1）所述的肌醇测试培养基，1L肌醇测试培养基含：葡萄糖200g，柠檬酸钾20g，柠檬酸4g，磷酸二氢钾2.2g，氯化钾1.7g，硫酸镁0.5g，氯化钙0.5g，硫酸锰100mg，DL-色氨酸0.2g，L-胱氨酸0.2g，L-异亮氨酸1.0g，L-亮氨酸1.0g，L-赖氨酸1.0g，L-蛋氨酸0.4g，DL-苯基丙氨酸0.4g，L-酪氨酸0.4g，L-天门冬氨酸1.6g，DL-天门冬氨酸0.4g，DL-丙氨酸0.8g，L-谷氨酸1.2g，L-精氨酸0.96g，盐酸硫胺素1.0mg，生物素32μg，泛酸钙10mg，盐酸吡哆醇2mg，溶解于去离子水或蒸馏水中，使用微波炉或电热炉加热助溶完全后，通过高压灭菌锅120℃灭菌5min，并及时水浴冷却（以防加热过度），获得肌醇测试培养基。
其中，步骤（1）（2）所述的塑形填充剂，塑形填充剂组分包括：8wt%右旋糖酐5000、8wt%聚乙二醇6000及1wt%羟甲基纤维素，余量为水，塑形填充剂使用高压灭菌锅120℃灭菌10min后迅速水浴冷却备用。
其中，步骤（1）所述的肌醇测试培养基与塑形填充剂充分混合，混合体积比为4：1。
其中，步骤（2）所述的抗氧化阻隔液组分包括：2wt%聚乙烯吡咯烷酮10k、0.05wt%维生素D及2wt%抗坏血酸钠，余量为水，抗氧化阻隔液使用孔径为0.45μm的无菌滤膜过滤除菌备用，为了达到有效过滤，应事先将滤膜用无菌水润湿。
其中，步骤（2）所述的抗氧化阻隔液与塑形填充剂充分混合，混合体积比为4：1。
其中，步骤（3）所述的凝胶保护剂，凝胶保护剂组分包括：4wt%甘露醇、0.5M氯化镁、0.1wt%瓜尔胶，余量为水，凝胶保护剂使用高压灭菌锅120℃灭菌10min后迅速水浴冷却备用。
其中，步骤（3）所述的菌种活化方式是指将葡萄汁酵母菌菌珠加入0.6mL肌醇测试培养基中，再加入60ng/mL肌醇标准溶液0.6mL，活化温度30℃，活化时间为18h。
其中，步骤（3）所述的固定化干燥，冻干程序为：预冻阶段为-80℃，保持1h；一次升华干燥阶段为-55℃，将真空度降至0.38mbar，达到最终真空度时间为11h；二次升华干燥阶段为-55℃→0℃，真空度控制在0.38 mbar，达到最终温度时间为14h；解析干燥阶段最终温度为24℃，真空度控制在0.011mbar，达到最终温度时间为 8h。
其中，步骤（4）所述的肌醇标准品的制备，精确称取50.5mg粉末状肌醇标准物质（≥99%），溶解于50mL的双蒸水中，获得0.2mg/mL肌醇标准储备液，再将肌醇标准储备液梯度稀释成0、12.5、25、50、75、100、125ng/mL肌醇标准曲线系列浓度，取27μL肌醇标准曲线系列浓度由低浓度到高浓度分装入微孔板条内进行24h冻干，获得肌醇标准品。
其中，步骤（5）所述的微孔板包装及贮存，将已固定肌醇测试培养基及葡萄汁酵母菌的微孔板和肌醇标准品用铝箔袋密封保存，并在其中均放置无菌干燥剂及抗氧剂，置于≤8℃环境下贮存。
进行肌醇定量检测实验时，取360μL无菌水溶解肌醇标准品后，再取320μL肌醇标准曲线溶液或样品提取液加入至微孔中，置于30℃恒温培养箱内避光培养，即完成实验操作。
经活菌计数，上述方法制备的即用型肌醇检测微孔板中固定化的干燥葡萄汁酵母菌活性菌种数，为所添加菌液中菌种总数的93%。
对比例1
该对比例与实施例1相比，缺少塑形填充剂及抗氧化阻隔液的使用，直接取80μL分装入微孔中，并置于-50℃无菌冷冻设备中迅速冷冻固定2.5h，获得泛酸测试培养基固定层，无抗氧化阻隔层的固定，其余条件与实施例1相同。
对比例2
该对比例与实施例1相比，缺少步骤（2）的抗氧化阻隔层，将泛酸测试培养基与塑形填充剂充分混合，取120μL分装入微孔中，确保溶液体积浸满微孔底部，并置于-50℃无菌冷冻设备中迅速冷冻固定2.5h，获得泛酸测试培养基固定层，无抗氧化阻隔层的固定，其余条件与实施例1相同。
对比例3
该对比例与实施例1相比，缺少塑形填充剂的使用。取80μL泛酸测试培养基分装入微孔中，并置于-50℃无菌冷冻设备中迅速冷冻固定2.5h，获得泛酸测试培养基固定层。取45μL抗氧化阻隔液覆盖在已冷冻固定的泛酸测试培养基表面上，确保溶液体积足够完全覆盖培养基固定层，再置于-50℃无菌冷冻设备中迅速冷冻固定2.5h，获得泛酸测试培养基固定层与抗氧化阻隔层，其余条件与实施例1相同。
对比例4
该对比例与实施例1相比，不同在于步骤（1）（2）所述的培养基固定化，将泛酸测试培养基、塑形填充剂与抗氧化阻隔液按16:9:11的体积比混合均匀后，取180μL分装入微孔中，并置于-50℃无菌冷冻设备中迅速冷冻固定5h，获得泛酸测试培养基固定层，其余条件与实施例1相同。
对比例5
该对比例与实施例1相比，无培养基固定层及抗氧化阻隔层，仅将已活化的植物乳酸杆菌分散于凝胶保护剂中，菌悬液透光率控制在50%，取2μL菌悬液黏附于微孔中并固定化干燥，缺少步骤（1）和步骤（2）的实施，其余条件与实施例1相同。
对比例6
该对比例与实施例2相比，无培养基固定层及抗氧化阻隔层，仅将将已活化的植物乳酸杆菌分散于凝胶保护剂中，菌悬液透光率控制在40%，取2μL菌悬液黏附于微孔中并固定化干燥，缺少步骤（1）和步骤（2）的实施，其余条件与实施例2相同。
对比例7
该对比例与实施例3相比，无培养基固定层及抗氧化阻隔层，仅将已活化的卡尔斯伯酵母菌分散于凝胶保护剂中，菌悬液透光率控制在50%，取3μL菌悬液黏附于微孔中并固定化干燥，缺少步骤（1）和步骤（2）的实施，其余条件与实施例3相同。
对比例8
该对比例与实施例4相比，无培养基固定层及抗氧化阻隔层，仅将已活化的发酵乳杆菌分散于凝胶保护剂中，菌悬液透光率控制在50%，取3μL菌悬液黏附于微孔中并固定化干燥，缺少步骤（1）和步骤（2）的实施，其余条件与实施例4相同。
对比例9
该对比例与实施例5相比，无培养基固定层及抗氧化阻隔层，仅将已活化的鼠李糖乳酸杆菌分散于凝胶保护剂中，菌悬液透光率控制在45%，取3μL菌悬液黏附于微孔中并固定化干燥，缺少步骤（1）和步骤（2）的实施，其余条件与实施例5相同。
对比例10
该对比例与实施例6相比，无培养基固定层及抗氧化阻隔层，仅将已活化的葡萄汁酵母菌分散于凝胶保护剂中，菌悬液透光率控制在60%，取3μL菌悬液黏附于微孔中并固定化干燥，缺少步骤（1）和步骤（2）的实施，其余条件与实施例6相同。
将依照实施例1-6与对比例1-10制备的微量成分检测微孔板进行测试，对其结构稳定性、颜色变化、复溶性、培养基成分损失率进行比较，其测试方法为：
（1）固定化培养基结构稳定性
对实施例1-6及对比例1-4制备的微量成分检测微孔板进行培养基冻干结构分析，考察冻干培养基形状、有无喷瓶、有无塌陷、有无吸潮等主要指标。
（2）固定化培养基颜色变化的测试
将实施例1-6及对比例1-4制备的微量成分检测微孔板用铝箔袋密封，并置于37℃、50±10%RH的环境下放置7天后，观察培养基有无发生褐变。
（3）固定化培养基复溶性
对实施例1-6及对比例1-4制备的微量成分检测微孔板，使用移液枪移取320μL 的25~30℃水至微孔中，吹打10~15次后观察溶解情况。
（4）固定化培养基成分损失率的测试
将实施例1-6及对比例1-10制备的微孔板用铝箔袋密封，并置于37℃、50±10%RH的环境下放置7天。于实施例1及对比例1-4制备的泛酸检测微孔中，加入320μL的30 ng/mL泛酸标准溶液；于对比例5制备的干燥植物乳酸杆菌微孔中，加入160μL的现配1倍泛酸测试培养基，再加入160μL的60 ng/mL泛酸标准溶液，置于37℃恒温温箱培养24h。于实施例2制备的烟酸检测微孔中，加入320μL的20 ng/mL烟酸标准溶液，于对比例6制备的干燥植物乳酸杆菌微孔中，加入160μL的现配1倍烟酸测试培养基，再加入160μL的40 ng/mL烟酸标准溶液，置于37℃恒温温箱培养48h。于实施例3制备的维生素B6检测微孔中，加入400μL的1.5 ng/mL维生素B6标准溶液，于对比例7制备的干燥卡尔斯伯酵母菌微孔中，加入200μL的现配1倍维生素B6测试培养基，再加入200μL的3 ng/mL维生素B6标准溶液，置于30℃恒温温箱培养48h。于实施例4制备的维生素B1检测微孔中，加入400μL的9 ng/mL维生素B1标准溶液，于对比例8制备的干燥植物乳酸杆菌微孔中，加入200μL的现配1倍维生素B1测试培养基，再加入200μL的18 ng/mL维生素B1标准溶液，置于37℃恒温温箱培养48h。于实施例5制备的维生素B2检测微孔中，加入320μL的30 ng/mL维生素B2标准溶液，于对比例9制备的干燥发酵乳杆菌微孔中，加入160μL的现配1倍维生素B2测试培养基，再加入160μL的60 ng/mL维生素B2标准溶液，置于37℃恒温温箱培养48h。于实施例6制备的肌醇检测微孔中，加入320μL的25ng/mL肌醇标准溶液，于对比例10制备的干燥葡萄汁酵母菌微孔中，加入160μL的现配1倍肌醇测试培养基，再加入160μL的50 ng/mL肌醇标准溶液，置于30℃恒温温箱培养48h，计算固定化测试培养基的成分损失率。
固定化培养基成分损失率=（现配培养基培养OD值-实施例培养OD值）/现配培养基培养OD值×100%。
以上实施例及对比例制备的检测微孔板培养基固定评价结果如下表所示：
Figure 699612DEST_PATH_IMAGE002
由上表1可见，本发明使用塑形填充剂、抗氧化阻隔剂及分层冻干方式固定化微量成分测试培养基，固定化培养基成分损失率<5%，相比于对比例1-10，在培养基冻干结构及成分的稳定性方面具有突出的优势。
即用型微量成分检测试剂盒精密度测试
Figure 554435DEST_PATH_IMAGE004
由上表2可见，本发明实施例1-6制备的即用型微量成分检测微孔板，6个平行孔间的变异系数均＜5%，表明微孔板孔间精密度高。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种即用型微量成分检测试剂盒及其制备方法，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种即用型微量成分检测试剂盒的制备方法，该试剂盒包括即用型检测微孔板和标准品，其特征在于，制备方法包括以下步骤：
（1）将微量成分特定测试培养基与塑形填充剂混合，装入载体容器后冻干，获得微量成分测试培养基固定层；
（2）将抗氧化阻隔液与塑形填充剂混合，装入载体容器以覆盖在已冻干的微量成分测试培养基固定层上，冻干获得位于微量成分测试培养基固定层上的抗氧化阻隔层；
（3）将已活化的菌种分散于凝胶保护剂中，取菌悬液黏附于载体容器中并固定化干燥，即得即用型微量成分检测微孔板；
（4）制备微量成分标准品。
2.根据权利要求1所述的即用型微量成分检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤（1）（2）中，所述塑形填充剂组分包括：1~10wt%右旋糖酐5000~7500、1~10wt%聚乙二醇4000~8000、1~5wt%羟甲基纤维素及0.2~1.5wt%α-环状糊精中的一种或多种组合。
3.根据权利要求1或2所述的即用型微量成分检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述的微量成分测试培养基与塑形填充剂混合体积比为（1~5）：1。
4.根据权利要求1所述的即用型微量成分检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述抗氧化阻隔液组分包括：2~12wt%聚乙烯吡咯烷酮10k~40k、0.1~3wt%维生素E、2~4wt%抗坏血酸钠、0.01~0.1wt%维生素D、0.05~0.15wt%硫代硫酸钠及0.005~0.05wt%谷胱甘肽中的一种或多种组合。
5.根据权利要求1或4所述的即用型微量成分检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述的抗氧化阻隔液与塑形填充剂混合体积比为（2~4）：1。
6.根据权利要求1所述的即用型微量成分检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述凝胶保护剂组分包括：2~6wt%甘露醇、0.1~1M氯化镁、0.2~2wt%牛奶酪蛋白、0.5~5wt%可溶性淀粉及0.02~0.2wt%瓜尔胶/卡拉胶/黄原胶中的一种或多种组合。
7.根据权利要求1所述的即用型微量成分检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述已活化的微量成分测试菌种是将微量成分测试菌粉或菌珠加入0.4~4mL微量成分测试培养基中，再加入10~100ng/mL微量成分标准溶液0.4~4mL进行活化获得，微量成分测试菌种包含植物乳酸杆菌及其变异菌株、发酵乳酸杆菌及其变异菌株、卡尔斯伯酵母菌及其变异菌株、鼠李糖乳酸杆菌及其变异菌株、葡萄汁酵母菌及其变异菌株、柠檬克勒克酵母菌及其变异菌株的一种或多种。
8.根据权利要求1所述的即用型微量成分检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述固定化干燥程序为：预冻阶段为温度控制在-80℃~-48℃，保持0.5~3h；一次升华干燥阶段为温度控制在-60℃~-35℃，将真空度降至0.35~0.55mbar，达到最终真空度时间为8~12h；二次升华干燥阶段为温度控制在0℃，真空度控制在0.35~0.55 mbar，达到最终温度时间为10~16h；解析干燥阶段为温度控制在24℃，真空度控制在0.010~0.020mbar，达到最终温度时间为 8~12h。
9.根据权利要求1所述的即用型微量成分检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤（4）所述的制备微量成分标准品，微量成分包括泛酸、烟酸和烟酰胺、维生素B1、维生素B2、维生素B6和肌醇中的任一种，粉末状微量成分标准物质纯度≥98%，根据实验所需标准品浓度精确称取粉末状微量成分标准物质、溶解、梯度稀释后分装入微孔板条内进行20~40h冻干，获得微量成分标准品。
10.一种即用型微量成分检测试剂盒，其特征在于，其通过如权利要求1至9任一所述的即用型微量成分检测试剂盒的制备方法制得，微量成分包含泛酸、烟酸和烟酰胺、维生素B1、维生素B2、维生素B6和肌醇的任一种。
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