CN111676212A - 一种用于微生物定量检测维生素的培养方法及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于微生物定量检测维生素的培养方法及试剂盒，培养方法通过以下步骤进行：（1）将微生物接种到固体培养基中，真空活化培养，菌落重悬于二价阳离子‑双糖溶液中，菌悬液注入凝胶混合液，获得微菌球；（2）将微菌球与复合营养增殖剂固定化于载体中；（3）使用缓冲剂溶解配制测试培养基。本培养方法确保不影响检测背景及非特异性增长的前提下，优化菌种活化方法及干燥菌种的制备，提高微生物稳定性利于休眠菌种快速恢复生长活性，打破限制生长因素增加菌体在有限培养体系中的生长密度，补充营养增殖成分提高菌种活力，缩短冻干微生物法应用于维生素检测的培养周期，同时提高微生物法对维生素的灵敏性。

Description

一种用于微生物定量检测维生素的培养方法及试剂盒
技术领域
本发明属于维生素检测技术领域，具体涉及一种用于微生物定量检测维生素的高活性高密度快速培养方法及试剂盒。
背景技术
微生物法作为一种活试剂，具有自身的特异性和高度的灵敏性。国标中规定，微生物法是作为测定食品中维生素B12、叶酸、生物素、泛酸、维生素B6、烟酸和烟酰胺等维生素的首选方法。微生物法检测维生素是通过绘制维生素含量与缺陷型测试菌生长浊度的标准曲线，间接测定样品中维生素的含量，国标微生物法检测维生素培养时间一般为16~24h，但国标法中将菌种接种至琼脂培养基，活化菌落较小，测试菌种需传2~3代增强活力。而已预先包埋冻干菌种的维生素检测试剂盒，省去了测试菌种的制备过程，但由于冻干菌的水分含量低，菌种处于休眠状态，且冻干过程造成菌种的生理性损伤，同时培养体系的整体缩小，均会使其再水化后的培养具有较长的延滞期，使得培养时间延长至44~48h。
在现有技术中，一般通过添加天然物质来促进微生物增殖，如番茄汁、土豆汁、香菇汁、牛肉浸膏、酵母粉等，天然物质对微生物的生长繁殖有较好的效果，但有效成分不完全明了且富含维生素，容易导致微生物在维生素检测应用中增加检测本底的干扰，不同批次制备的天然提取物还存在差异。微生物生长过程会产生有机酸（如乳酸、丁酸和醋酸等）、过氧化氢和细菌素等有抑活性的代谢物质，这些抑菌物质在培养环境中的积累会限制微生物的继续生长。而在发酵工业中，常通过在非封闭培养过程中不断补充新鲜营养液，优化生长环境来提高菌体的增殖速率，要保持各种设备无渗漏、无污染是极其困难的。
美国专利US8357504B2），中国专利（CN201611094901、CN201710001500、CN201710001918、CN201710001927及CN201910188685）等公开的维生素检测试剂盒，试剂盒检测的基本原理与国际标准完全相同，但上述专利技术方案仍存在如下问题：1）冻干保护剂的制备中，氯化钙与维生素测试培养基直接混合易形成沉淀，造成有效冻干保护成分的损失；2）菌种冻干状态为粘性颗粒物，不利于菌种的长期稳定贮存，开封后易吸潮；3)冻干菌种存在较长的延滞期，使得微生物测定维生素的培养时间由16~24h延长至44~48h；4）脱脂奶粉含大量维生素，作为菌种保护剂，易造成较高的检测本底。
因此，开发一种适用于定量检测维生素的微生物增殖方法至关重要。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供了一种用于微生物定量检测维生素的高活性高密度快速的培养方法及其试剂盒，本培养方法确保不影响检测背景及非特异性增长的前提下，优化菌种活化方法及干燥菌种的制备，提高微生物稳定性利于休眠菌种快速恢复生长活性，打破限制生长因素增加菌体在有限培养体系中的生长密度，补充营养增殖成分提高菌种活力，缩短冻干微生物法应用于维生素检测的培养周期，同时提高微生物法对维生素的灵敏性。
本发明的上述目的是通过以下技术方案予以实现的。
一种用于微生物定量检测维生素的培养方法，其通过以下步骤进行：
（1）将微生物接种到固体培养基中，再将已接种的培养皿进行真空活化培养，挑取培养皿上的菌落重悬于二价阳离子-双糖溶液中，当菌悬液注入凝胶混合液，菌悬液表面形成一层凝胶膜包埋于凝胶包裹层，获得微菌球；
（2）将步骤（1）的微菌球与复合营养增殖剂固定化于载体中；
（3）根据维生素测试粉末培养基的配制比，使用缓冲剂溶解配制培养基。
上述微菌球制备过程用到的二价阳离子-双糖溶液和凝胶混合液可帮助菌种吸附并固定于容器中，并对菌种保护作用。所述复合营养增殖剂具有缩短菌种延滞期以达到菌种快速恢复活性的效果，利于检测效率的提高。所述缓冲剂可消除菌种生长过程中酸性代谢物质的积累，抑制菌种的生长保证微生物生长过程对营养物质高效的吸收利用，加快微生物增殖速度的同时提高空间内的生长密度。
本发明人意外发现，通过上述三者的协同作用，该培养方法在不影响定量检测本底的前提下，增大微生物对待测维生素的灵敏性，提高微生物在有限培养体系中的增殖速度及生长密度（至少提高20%的菌种生长密度），从而实现检测培养周期的缩短（将培养时间44~48h缩短至16~24h），该培养方法适用于莱氏蔓士乳酸杆菌及其变异菌株、植物乳酸杆菌及其变异菌株、鼠李糖乳酸杆菌及其变异菌株、发酵乳酸杆菌及其变异菌株、卡尔斯伯酵母菌及其变异菌株、酿酒酵母及其变异菌株等微生物检测不同维生素中的应用。
作为本发明提供的所述的用于微生物定量检测维生素的培养方法的一种实施方式，所述真空活化培养是指将已接种的培养皿置入透明袋中，抽真空后密封活化培养。
作为本发明提供的所述的用于微生物定量检测维生素的培养方法的一种实施方式，在步骤（1）所述真空活化培养中，活化温度为35~42℃，活化时间为16~24h，菌悬液透光率为60~80%。
作为本发明提供的所述的用于微生物定量检测维生素的培养方法的一种实施方式，在步骤（1）中，所述二价阳离子-双糖溶液通过0.05~0.2M氯化钙/氯化镁/氯化锰溶液与0.1M~0.5M海藻糖/蔗糖/乳糖溶液按体积比1:1混合，过滤除菌获得。
作为本发明提供的所述的用于微生物定量检测维生素的培养方法的一种实施方式，在步骤（1）中，所述微菌球通过取5~50μL凝胶混合液滴入载体中，再取2.5~25μL菌悬液注入凝胶混合液中获得。
优选但不限定地，所述载体类型包括：微孔板（200~450μL）、离心管（300~5000μL）、培养试管（1mL~10mL）。
作为本发明提供的所述的用于微生物定量检测维生素的培养方法的一种实施方式，在步骤（1）中，所述凝胶混合液通过0.5~2倍维生素测试培养基与0.05~0.2wt%黄原胶/卡拉胶/瓜尔胶/聚丙烯酸钠/海藻酸钠溶液按体积比1:1混合，过滤除菌获得。
作为本发明提供的所述的用于微生物定量检测维生素的培养方法的一种实施方式，在步骤（2）中，所述复合营养增殖剂包括黄嘌呤、抗坏血酸、天门冬酰胺、盐酸吡哆醛、盐酸吡哆胺、L-半胱氨酸盐酸盐、血清白蛋白、卵清蛋白或卵粘蛋白中的一种或多种组合。
优选地，1L复合营养增殖剂组分为1~5g黄嘌呤、5~50g抗坏血酸、5~50g天门冬酰胺、0.2~0.5g盐酸吡哆醛、0.2~0.5g盐酸吡哆胺、5~50g L-半胱氨酸盐酸盐、10~50g血清白蛋白、1~5g卵清蛋白、2~20g卵粘蛋白中的一种或多种组合，通过121℃高压灭菌15min或0.22~0.45μm滤膜过滤除菌。
作为本发明提供的所述的用于微生物定量检测维生素的培养方法的一种实施方式，在步骤（2）中，所述固定化微菌球与复合营养增殖剂是指取1~10μL复合营养增殖剂滴在载体中所述微菌球的对角处，采用真空冷冻干燥技术将微菌球与复合营养增殖剂进行固定化干燥24~48h。
作为本发明提供的所述的用于微生物定量检测维生素的培养方法的一种实施方式，在步骤（3）中，所述缓冲剂包括磷酸氢二钾（钠）、磷酸二氢钾（钠）、吗啉乙磺酸、碳酸氢钠、柠檬酸或柠檬酸钠中的一种或至少两种的组合。
作为本发明提供的所述的用于微生物定量检测维生素的培养方法的一种实施方式，1L所述缓冲剂组分为10~30g磷酸氢二钾、0.3~3g磷酸二氢钾、5~40g 吗啉乙磺酸、1~5g碳酸氢钠、0.5~3g柠檬酸或5~30g柠檬酸钠中的一种或至少两种的组合，经90~95℃加热助溶完全后，过滤除菌备用。
在本发明中，上述过滤除菌是指通过121℃高压灭菌15min或0.22~0.45μm滤膜过滤除菌，但并不局限于此。
于本发明中，对于测试培养基并没有特别的限定，测试培养基可以包括国标法内提供的测试培养基，商品化已有的测试培养基，但不局限于此，只要满足测试培养基内不含有待测组分，且能够满足测试菌种对待测组分浓度的生长具有相关性的均可使用。
与现有技术相比，本发明有益效果在于：
本发明提供的一种用于微生物定量检测维生素的高活性高密度快速培养方法及其应用，由于低氧环境利于兼性厌氧菌的生长，本技术方案通过利用透明袋等简易耗材抽真空密封活化菌种，再利用含阳离子-双糖溶液的菌悬液注入凝胶混合液中形成一层凝胶膜，使得微菌球包埋于凝胶包裹层中，凝胶包裹层干燥后具有多孔结构，具备良好的吸附性及干燥性，利于微菌球的固定及长期稳定贮存，使得干燥菌种复水后可快速恢复生长活性。
本发明培养方法适用于微生物法检测多种维生素，根据不同微生物的生长需求，调整增殖因子添加量，可明显缩短或消除延滞期，同时提高菌株对待测维生素的灵敏性，将冻干微生物法检测维生素的培养周期缩短1倍以上，有效提高检测效率。
本发明培养方法提高培养环境缓冲能力，保证微生物适宜生长的酸碱环境，维持渗透压作用，以调节细菌胞膜状态，降低代谢产物对菌体的抑制作用，保证微生物生长过程对营养物质高效的吸收利用，加快微生物增殖速度的同时至少提高20%的菌种生长密度。
本发明培养方法适用于莱氏蔓士乳酸杆菌及其变异菌株、植物乳酸杆菌及其变异菌株、鼠李糖乳酸杆菌及其变异菌株、发酵乳酸杆菌及其变异菌株、卡尔斯伯酵母菌及其变异菌株、酿酒酵母菌及其变异菌株等微生物法检测不同维生素，在确保不增加检测背景的前提下，制备高稳定性的干燥微菌球，同时优化培养体系，在有限体积的培养体系中，提高微生物的增殖速度和生长密度，将培养时间44~48h缩短至16~24h，有效提高冻干微生物法定量检测维生素检测效率。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明培养方法中固定化微菌球与复合营养增殖剂于微孔载体的示意图；
图2为本发明培养方法中固定化微菌球与复合营养增殖剂于培养管载体的示意图；
图3为本发明培养方法中高密度培养效果对比实验获得菌浊度与生物素浓度的关系图；
图4为本发明培养方法中高活性培养效果对比实验获得的莱氏蔓士乳酸杆菌的生长曲线图。
其中，1-复合营养增殖剂，2-凝胶包裹层，3-微菌球。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。本发明所述实施例使用的材料的和试剂等，均为市购。
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
实施例1：
生物素是植物乳杆菌ATCC 8014生长所必需的营养素。在生物素测定培养基中，植物乳杆菌的生长与梯度浓度生物素含量呈线性关系，根据植物乳酸杆菌OD630nm与标准工作曲线进行比较，即可计算出试样中生物素的含量。
一种用于植物乳酸杆菌定量检测生物素的高活性高密度快速培养方法，通过以下步骤进行：
（1）将植物乳酸杆菌接种到MRS固体培养基中，再将已接种的培养皿置入透明袋中，抽真空后密封活化培养，挑取培养皿上的菌落重悬于钙离子-海藻糖溶液中，当菌悬液注入凝胶混合液，菌悬液表面形成一层凝胶膜包埋于凝胶包裹层，获得植物乳酸杆菌微菌球；
（2）植物乳酸杆菌微菌球复合营养增殖剂的配制；固定化植物乳酸杆菌微菌球与复合营养增殖剂；
（3）配制生物素测试培养基缓冲剂，根据生物素测试粉末培养基的配制比，使用上述缓冲剂溶解配制生物素测试培养基。
其中，步骤（1）所述的植物乳酸杆菌活化温度为37℃，活化时间为24h，菌悬液透光率为80%。
其中，步骤（1）所述的钙离子-海藻糖溶液是将钙离子-海藻糖溶液为0.2M氯化钙溶液与0.2M海藻糖溶液按体积比1:1混合，通过121℃高压灭菌15min获得。
其中，步骤（1）中，所述的凝胶混合液是指将1倍生物素测试培养基（根据生物素测试培养基配制比）与0.05wt%黄原胶溶液按体积比1:1混合，通过121℃高压灭菌15min获得。
其中，步骤（1）中，所述的植物乳酸杆菌微菌球是指使用移液枪取5μL凝胶混合液滴入400μL微孔板载体中，再取2.5μL菌悬液精确注入凝胶混合液中，获得植物乳酸杆菌微菌球。
其中，步骤（2）中，所述的植物乳酸杆菌微菌球复合营养增殖剂的配制，复合营养增殖剂包括黄嘌呤、抗坏血酸、天门冬酰胺、盐酸吡哆醛、盐酸吡哆胺、L-半胱氨酸盐酸盐和血清白蛋白。
其中，步骤（2）中，所述的固定化植物乳酸杆菌微菌球与复合营养增殖剂是指：使用移液枪取2μL复合营养增殖剂滴在微孔板中植物乳酸杆菌微菌球的对角处（如图1所示），采用真空冷冻干燥技术将植物乳酸杆菌微菌球与复合营养增殖剂进行固定化干燥28h。
其中，1L复合营养增殖剂组分为将2g黄嘌呤、10g抗坏血酸、20g天门冬酰胺、0.5g盐酸吡哆醛、0.5g盐酸吡哆胺、10g L-半胱氨酸盐酸盐、10g血清白蛋白混合后，通过121℃高压灭菌15min获得。
其中，步骤（3）所述的生物素测试培养基缓冲剂的配制，缓冲剂包括磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、吗啉乙磺酸。
其中，1L缓冲剂组分为20g磷酸氢二钾、0.5g磷酸二氢钾、5g吗啉乙磺酸。根据GB5009.259中1L生物素测试培养基组分包含：维生素测定用酪蛋白氨基酸12 g、葡萄糖40g、乙酸钠20 g、L-胱氨酸0.2 g、DL-色氨酸0.2g、硫酸腺嘌呤20 mg、盐酸鸟嘌呤20 mg、尿嘧啶20 mg、盐酸硫胺素2 mg、核黄素2 mg、烟酸2 mg、泛酸钙2 mg、盐酸吡哆醇4 mg、 p-氨基苯甲酸200 μg、磷酸氢二钾1 g、磷酸二氢钾1 g、硫酸镁0.4 g、氯化钠20 mg、硫酸亚铁20mg、硫酸锰20 mg。即生物素测试培养基为75g:1L的配制比，使用上述缓冲剂溶解配制生物素测试培养基，经95℃加热助溶完全后，0.22μm滤膜过滤除菌备用，最终培养基初始pH为6.4±0.1（25℃）。
进行植物乳酸杆菌定量检测生物素实验时，取150μL上述培养基加入已固定化植物乳酸杆菌微菌球与复合营养增殖剂的微孔中，再加入150μL生物素标准溶液或待测样品提取溶液，于37℃恒温培养箱内避光培养24h，即可进行测定读值。
实施例2：
一种用于莱氏蔓士乳酸杆菌（ATCC 7830）定量检测维生素B12的高活性高密度快速培养方法，通过以下步骤进行：
（1）将莱氏蔓士乳酸杆菌接种到MRS固体培养基中，再将已接种的培养皿置入透明袋中，抽真空后密封活化培养，挑取培养皿上的莱氏蔓士乳酸杆菌菌落重悬于镁离子-蔗糖溶液中，当菌悬液注入凝胶混合液，菌悬液表面形成一层凝胶膜包埋于凝胶包裹层，获得莱氏蔓士乳酸杆菌微菌球；
（2）莱氏蔓士乳酸杆菌微菌球复合营养增殖剂的配制；固定化莱氏蔓士乳酸杆菌微菌球与复合营养增殖剂；
（3）配制维生素B12测试培养基缓冲剂，根据维生素B12测试粉末培养基的配制比，使用上述缓冲剂溶解配制维生素B12测试培养基。
其中，步骤（1）中，所述的莱氏蔓士乳酸杆菌的活化温度为37℃，活化时间为24h，菌悬液透光率为70%。
其中，步骤（1）中，所述的镁离子-蔗糖溶液，镁离子-蔗糖溶液为0.1M氯化镁溶液与0.2M蔗糖溶液按体积比1:1混合，通过121℃高压灭菌15min。
其中，步骤（1）中，所述的凝胶混合液是指将1倍维生素B12测试用培养基（根据维生素B12测试养基配制比）与0.1wt%瓜尔胶溶液按体积比1:1混合，通过121℃高压灭菌15min获得。
其中，步骤（1）中，所述的莱氏蔓士乳酸杆菌微菌球是指使用移液枪取50μL凝胶混合液滴入10mL培养管载体中（如图2所示），再取25μL菌悬液精确注入凝胶混合液中，获得莱氏蔓士乳酸杆菌微菌球。
其中，步骤（2）莱氏蔓士乳酸杆菌微菌球复合营养增殖剂的配制，复合营养增殖剂包括黄嘌呤、L-半胱氨酸盐酸盐、血清白蛋白、卵清蛋白、卵粘蛋白。
具体地，1L复合营养增殖剂组分为2g黄嘌呤、10g L-半胱氨酸盐酸盐、10g血清白蛋白、1g卵清蛋白、4g卵粘蛋白，通过0.45μm滤膜过滤备用。
其中，步骤（2）中，所述的固定化莱氏蔓士乳酸杆菌微菌球与复合营养增殖剂，使用移液枪取10μL复合营养增殖剂滴在载体中微菌球的对角处，采用真空冷冻干燥技术将莱氏蔓士乳酸杆菌微菌球与复合营养增殖剂进行固定化干燥44h。
其中，步骤（3）所述的维生素B12测试培养基缓冲剂的配制，缓冲剂包括柠檬酸和柠檬酸钠。具体地，1L缓冲剂包括1g柠檬酸和9g柠檬酸钠。
根据GB 5413.14中1L维生素B12测试培养基组分包含：无维生素酸水解酪蛋白15g，葡萄糖40 g，天门冬酰胺0.2 g，醋酸钠20 g，抗环血酸4 g，L-胱氨酸0.4 g，DL-色氨酸0.4 g，硫酸腺嘌呤20 mg，盐酸鸟嘌呤20 mg，尿嘧啶20 mg，黄嘌呤20 mg，核黄素1 mg，盐酸硫胺素1 mg，生物素10 μg，烟酸2 mg，p-氨基苯甲酸2 mg，泛酸钙1 mg，盐酸吡哆醇4 mg，盐酸吡哆醛4 mg，盐酸吡哆胺800 μg，叶酸200 μg，磷酸二氢钾1 g，磷酸氢二钾1 g，硫酸镁0.4 g，氯化钠20 mg，硫酸亚铁20 mg，硫酸锰20 mg，聚山梨糖单油酸酯（吐温80）2 g，即维生素B12测试培养基为85g:1L的配制比，使用上述缓冲剂溶解配制维生素B12测试培养基，经90~95℃加热助溶完全后，通过0.45μm滤膜过滤除菌备用，最终培养基初始pH为6.4±0.1（25℃）。
进行莱氏蔓士乳酸杆菌定量检测维生素B12实验时，取5mL上述培养基加入已固定化莱氏蔓士乳酸杆菌微菌球与复合营养增殖剂的培养管中，再加入5mL维生素B12标准溶液或待测样品提取溶液，于37℃恒温培养箱内避光培养16h，即可进行测定读值。
实施例3：
一种用于鼠李糖乳酸杆菌（ATCC7469）定量检测叶酸的高活性高密度快速培养方法，其通过以下步骤进行：
（1）将鼠李糖乳酸杆菌接种到MRS固体培养基中，再将已接种的培养皿置入透明袋中，抽真空后密封活化培养，挑取培养皿上的鼠李糖乳酸杆菌菌落重悬于镁离子-乳糖溶液中，当菌悬液注入凝胶混合液，菌悬液表面形成一层凝胶膜包埋于凝胶包裹层，获得鼠李糖乳酸杆菌微菌球；
（2）鼠李糖乳酸杆菌微菌球复合营养增殖剂的配制；固定化鼠李糖乳酸杆菌微菌球与复合营养增殖剂；
（3）配制叶酸测试培养基缓冲剂，根据叶酸测试粉末培养基的配制比，使用上述缓冲剂溶解配制叶酸测试培养基。
其中，步骤（1）中，所述的鼠李糖乳酸杆菌的活化温度为37℃，活化时间为16h，菌悬液透光率为60%。
其中，步骤（1）中，所述的镁离子-乳糖溶液是将镁离子-乳糖溶液为0.2M氯化镁溶液与0.2M乳糖溶液按体积比1:1混合，通过121℃高压灭菌15min获得。
其中，步骤（1）中，所述的凝胶混合液是将1倍叶酸测定用培养基（根据叶酸测定用培养基配制比）与0.15wt%黄原胶溶液按体积比1:1混合，通过121℃高压灭菌15min获得。
其中，步骤（1）中，所述的鼠李糖乳酸杆菌微菌球是使用移液枪取50μL凝胶混合液滴入1000μL培养试管载体中，再取25μL菌悬液精确注入凝胶混合液中，获得鼠李糖乳酸杆菌微菌球。
其中，步骤（2）中，鼠李糖乳酸杆菌微菌球复合营养增殖剂的配制，复合营养增殖剂包括黄嘌呤、盐酸吡哆胺、盐酸吡哆醛、卵清蛋白。
具体地，1L复合营养增殖剂组分为3g黄嘌呤、0.5g盐酸吡哆胺、0.5g盐酸吡哆醛、2g卵清蛋白，通过0.45μm滤膜过滤备用。
其中，步骤（2）中，所述的固定化鼠李糖乳酸杆菌微菌球与复合营养增殖剂，使用移液枪取10μL复合营养增殖剂滴在载体中微菌球的对角处，采用真空冷冻干燥技术将鼠李糖乳酸杆菌微菌球与复合营养增殖剂进行固定化干燥30h。
其中，步骤（3）所述的叶酸测试培养基缓冲剂的配制，缓冲剂包括柠檬酸和柠檬酸钠。具体地，1L缓冲剂包括 2g碳酸氢钠。
根据GB5009.211中1L叶酸测试培养基组分包含：酪蛋白胨10 g，葡萄糖40 g，乙酸钠40 g，磷酸氢二钾1 g，磷酸二氢钾1g，DL-色氨酸0.2 g，L-天门冬氨酸0.6 g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5 g，硫酸腺嘌呤10 mg，盐酸鸟嘌呤10mg，尿嘧啶10 mg，黄嘌呤20 mg，聚山梨糖0.1 g，谷光甘肽5 mg，硫酸镁0.4 g，氯化钠20 mg，硫酸亚铁20 mg，硫酸锰15 mg，核黄素1mg，p-氨基苯甲酸2 mg，维生素B6 4mg，盐酸硫胺素400 μg，泛酸钙800 μg，烟酸800 μg，生物素20 μg，即叶酸测试培养基为94g:1L的配制比，使用上述缓冲剂溶解配制叶酸测试培养基，经90~95℃加热助溶完全后，通过0.45μm滤膜过滤除菌备用，最终培养基初始pH为6.8±0.1（25℃）。
进行鼠李糖乳酸杆菌定量检测叶酸实验时，取500μL上述培养基加入已固定化鼠李糖乳酸杆菌微菌球与复合营养增殖剂的试管中，再加入500μL叶酸标准溶液或待测样品提取溶液，于37℃恒温培养箱内避光培养24h，即可进行测定读值。
对比例1
该对比例与实施例1相比，缺少植物乳酸杆菌微菌球复合营养增殖剂的使用，其余条件与实施例1相同。
对比例2
该对比例与实施例1相比，缺少生物素测试培养基缓冲剂的使用，使用无菌水代替配制生物素测试培养基，其余条件与实施例1相同。
对比例3
该对比例与实施例1相比，缺少植物乳酸杆菌微菌球复合营养增殖剂及生物素测试培养基缓冲剂的使用，其余条件与实施例1相同。
对比例4
该对比例与实施例2相比，不同在于步骤（1）所述的莱氏蔓士乳酸杆菌微菌球的获得，菌落直接重悬于二价阳离子-双糖溶液及凝胶混合液中，不分层包裹制备微菌球，其余与实施例2相同。
将莱氏蔓士乳酸杆菌接种到MRS固体培养基中，再将已接种的培养皿置入透明袋中，抽真空后密封活化培养，挑取培养皿上的莱氏蔓士乳酸杆菌菌落重悬于镁离子-蔗糖及凝胶混合液中，获得莱氏蔓士乳酸杆菌微菌球。
其中，所述的镁离子-蔗糖及凝胶混合液为0.1M氯化镁溶液、0.2M蔗糖溶液、1倍维生素B12测试培养基（根据维生素B12测试培养基配制比）以及0.1wt%瓜尔胶溶液，4种试剂按体积比1:1:2:2混合后，通过121℃高压灭菌15min。
将莱氏蔓士乳酸杆菌菌落重悬于上述镁离子-蔗糖及凝胶混合液中，菌悬液透光率为70%，取25μL菌悬液滴入10mL培养试管载体中，获得莱氏蔓士乳酸杆菌微菌球。
对比例5
该对比例与实施例2相比，不同在于步骤（1）所述的莱氏蔓士乳酸杆菌微菌球的获得，缺少凝胶混合液的配制与应用，其余与实施例2相同。
将莱氏蔓士乳酸杆菌接种到MRS固体培养基中，再将已接种的培养皿置入透明袋中，抽真空后密封活化培养，挑取培养皿上的莱氏蔓士乳酸杆菌菌落重悬于镁离子-蔗糖溶液中，菌悬液透光率为70%，取25μL菌悬液滴入10mL培养试管载体中，获得莱氏蔓士乳酸杆菌微菌球。
高密度培养效果对比实验
在实施例1及对照例1-3制备好的微孔中，加入150μL生物素测定培养基，再加入150μL相同浓度的生物素标准溶液，经37℃恒温培养24h后，使用630nm波长测量实验例各浓度的标准溶液相应菌浊度，结果如下表和图3所示：
生物素浓度（ng/mL） 实施例1 对比例1 对比例2 对比例3
0 0.073 0.069 0.059 0.055
0.02 0.320 0.228 0.230 0.185
0.08 0.661 0.615 0.598 0.458
0.16 0.975 0.843 0.888 0.711
0.24 1.202 0.991 1.104 0.868
0.32 1.331 1.108 1.218 0.948
0.4 1.433 1.171 1.272 0.994
上述图3和表1可见，如在0.4ng/mL生物素标准溶液培养条件下，未使用营养增殖剂和缓冲剂（对比例3）的植物乳酸杆菌菌浊度达到0.994，使用测定用培养基缓冲剂（对比例2）的植物乳酸杆菌菌浊度达到1.272，使用营养增殖剂（对比例1）的植物乳酸杆菌菌浊度达到1.171，同时使用营养增殖剂和缓冲剂（实施例1）的植物乳酸杆菌菌浊度达到1.433。因此，本发明的植物乳酸杆菌微菌球复合营养增殖剂和生物素测试培养基缓冲剂的应用，均对植物乳酸杆菌有提高生长密度的作用。
高活性培养效果对比实验
在将实施例2及对照例4-5制备好的培养试管中，加入5mL的B12测定培养基，再加入5mL的0.09ng/mL的B12标准溶液，于37℃恒温温箱中避光培养，每隔2h使用630nm波长测量菌浊度，直至获得最大浑浊度，即再培养2h后OD值无明显变化，然后绘制出莱氏蔓士乳酸杆菌的生长曲线，结果如图4所示。
根据图4可见，在相同培养体系条件下，莱氏蔓士乳酸杆菌菌落直接重悬于二价阳离子-双糖溶液制备微菌球（对比例5），莱氏蔓士乳酸杆菌生长延滞期达12h；莱氏蔓士乳酸杆菌菌落直接重悬于二价阳离子-双糖溶液及凝胶混合液制备微菌球（对比例4），莱氏蔓士乳酸杆菌生长延滞期达8h；将莱氏蔓士乳酸杆菌菌落重悬于二价阳离子-双糖溶液，再经凝胶混合液包裹制备微菌球（实施例2），莱氏蔓士乳酸杆菌生长延滞期缩短至6h，本发明方案制备的微菌球可快速恢复生长活性。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种用于微生物定量检测维生素的高活性高密度快速培养方法及试剂盒，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种用于微生物定量检测维生素的培养方法，其特征在于，通过以下步骤进行：
（1）将微生物接种到固体培养基中，再将已接种的培养皿进行真空活化培养，挑取培养皿上的菌落重悬于二价阳离子-双糖溶液中，当菌悬液注入凝胶混合液，菌悬液表面形成一层凝胶膜包埋于凝胶包裹层，获得微菌球；
（2）将步骤（1）的微菌球与复合营养增殖剂固定化于载体中；
（3）根据维生素测试粉末培养基的配制比，使用缓冲剂溶解配制培养基。
2.根据权利要求1所述的用于微生物定量检测维生素的培养方法，其特征在于，所述真空活化培养是指将已接种的培养皿置入透明袋中，抽真空后密封活化培养。
3.根据权利要求1或2所述的用于微生物定量检测维生素的培养方法，其特征在于，在步骤（1）所述真空活化培养中，活化温度为35~42℃，活化时间为16~24h，菌悬液透光率为60~80%。
4.根据权利要求1所述的用于微生物定量检测维生素的培养方法，其特征在于，在步骤（1）中，所述二价阳离子-双糖溶液通过0.05~0.2M氯化钙/氯化镁/氯化锰溶液与0.1M~0.5M海藻糖/蔗糖/乳糖溶液按体积比1:1混合，过滤除菌获得。
5.根据权利要求1或4所述的用于微生物定量检测维生素的培养方法，其特征在于，在步骤（1）中，所述凝胶混合液通过0.5~2倍维生素测试用培养基与0.05~0.2wt%黄原胶/卡拉胶/瓜尔胶/聚丙烯酸钠/海藻酸钠溶液按体积比1:1混合，过滤除菌获得。
6.根据权利要求1所述的用于微生物定量检测维生素的培养方法，其特征在于，在步骤（1）中，所述微菌球通过取5~50μL凝胶混合液滴入载体中，再取2.5~25μL菌悬液注入凝胶混合液中获得。
7.根据权利要求1所述的用于微生物定量检测维生素的培养方法，其特征在于，在步骤（2）中，所述复合营养增殖剂包括黄嘌呤、抗坏血酸、天门冬酰胺、盐酸吡哆醛、盐酸吡哆胺、L-半胱氨酸盐酸盐、血清白蛋白、卵清蛋白或卵粘蛋白中的一种或多种组合。
8.根据权利要求1或7所述的用于微生物定量检测维生素的培养方法，其特征在于，在步骤（2）中，所述固定化微菌球与复合营养增殖剂是指取1~10μL复合营养增殖剂滴在载体中所述微菌球的对角处，采用真空冷冻干燥技术将微菌球与复合营养增殖剂进行固定化干燥24~48h。
9.根据权利要求1所述的用于微生物定量检测维生素的培养方法，其特征在于，在步骤（3）中，所述缓冲剂包括磷酸氢二钾（钠）、磷酸二氢钾（钠）、吗啉乙磺酸、碳酸氢钠、柠檬酸或柠檬酸钠中的一种或至少两种的组合。
10.一种用于微生物定量检测维生素的试剂盒，其特征在于，其包括固化有如权利要求1所述的微菌球与复合营养增殖剂的载体和培养基配制用缓冲剂。
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