CN107607719A - 一种测定样品中β‑内酰胺酶方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种测定样品中β‑内酰胺酶方法，用检测样品中β‑内酰胺酶的试剂盒来实现对样本的检测，所述试剂盒包括：具有β‑内酰胺酶检测孔的反应基板，以及样品稀释液；其中，所述检测孔包被有β‑内酰胺酶底物(如头孢硝噻吩)、稳定剂和氧化剂等。本发明试剂盒制备方法简单，性能稳定，易保存，便于判定临床样品中是否含有β‑内酰胺酶耐药菌株，是诊断、鉴别诊断和疗效评价的辅助指标，指导临床用药，同时适用于医院检验科及非专业检验人员使用，同时亦可延伸至食品环境样品的检测。

Description

一种测定样品中β-内酰胺酶方法

技术领域

本发明属于医学检验测定技术领域，具体地说，涉及一种测定样品中β-内酰胺酶方法。

背景技术

自20世纪40年代第一个β-内酰胺类抗生素—青霉素问世以来，抗生素在细菌感染性疾病的治疗中发挥了重要作用，95％以上由细菌感染引起的疾病得到控制。然而随着β-内酰胺类抗生物药物的不断开发和在临床上的广泛应用，耐药菌株越来越多，其中最主要的耐药机制是这些菌株能产生β-内酰胺酶。

研究表明β-内酰胺酶是水解β-内酰胺类抗生素分子中β-内酰胺环结构的一类酶，根据酶蛋白的氨基酸序列的同源性分为A类、B 类、C类及D类，其中超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrumβ -lactamases，ESBL)是分解β-内酰胺类抗生素底物范围比以往的A类β-内酰胺酶更广的酶。β-内酰胺酶水解抗生素，使之失去抗菌活性，从而导致临床抗菌治疗失败。葡萄球菌、流感嗜血杆菌、淋病奈瑟氏菌及部分肠球菌都是由此酶表现出抗药性。

经常使用抗生素会使病原菌产生耐药性，产生耐药性的后果相当严重，抗生素失去效果。对β-内酰胺类抗生素耐药的细菌感染应用β-内酰胺类抗生素治疗，不仅得不到治疗效果，而且还成为新的耐性菌蔓延的原因，引起病人住院时间延长、费用增加和死亡率上升。因此，在确定正确的治疗方案前必须迅速且正确地检测这些病原菌是否产生β-内酰胺酶，这对于快速识别耐药菌株及控制耐药菌株传播有重要作用，也有助于相应感染性疾病的治疗和预防。

赵旺胜等于1997年报道了四种β-内酰胺酶检测方法：(1)碘测量法：溶解青霉素G于0.1mol/L磷酸盐缓冲液中(pH 6.0)，制成 6000mg/L，配制1％可溶性淀粉液和2％碘溶液，测定时取0.1ml青霉素溶液与2ml待测菌液混合，置室温30分钟，加2滴淀粉溶液，再加1滴碘液混合，10分钟内能使蓝色完全消退的菌株为β-内酰胺酶阳性株。(2)微生物法：将对青霉素敏感的指示菌接种在血平板上，平板中心贴每片1μg青霉素纸片，沿纸片周围垂直划线，接种待测菌，阳性和阴性对照菌，37℃孵育24小时，如待测菌产生β-内酰胺酶，则待测菌处的指示菌出现凹痕。(3)纸片法：取20张滤纸片 (1cm×2cm)放入1ml青霉素溶液中浸湿，待纸片干后备用，用接种环挑取待检菌5～10个菌落涂于纸片上，放入带盖的平板内置37℃孵育 30分钟，产β-内酰胺酶的菌株可使纸片的颜色由蓝紫色变黄。(4)酸测定法：取0.1ml青霉素酚红溶液(每毫升中含青霉素G 80万单位)与 2ml待测菌悬液(大于4号麦氏浊度)混合，10～15分钟内变为黄色为β-内酰胺酶阳性。张坚磊等1999年报道了应用碘试纸条法快速检测β-酞胺酶，该法是在碘测量法的基础上建立以青霉素为底物的试纸条法，菌落涂于试纸条上，通过试纸条颜色的变化判断是否产生β- 内酰胺酶。

叶枫等对四种方法检测超广谱β-内酰胺酶进行了比较(四种方法检测超广谱β-内酰胺酶的敏感性比较)，采用了纸片扩散法、双纸片协同法、Etest法和VITEK全自动细菌分析法，这些方法需要通过培养耐药菌及判断抑菌圈，实验时间长，结果易受偶然因素影响，VITEK全自动细菌分析系统及其药敏卡检测方法快速简便，但需要特殊的机器。CN 1729299A公开了一种β-内酰胺酶检测试剂组合物、β-内酰胺酶检测试剂盒以及β-内酰胺酶检测方法，在产色头孢菌素法中使用的β-内酰胺酶检测试剂组合物中含有β-内酰胺酶检测底物与β-内酰胺酶抑制剂。

以上方法是在临床细菌培养的基础上检测细菌是否产生β-内酰胺酶来判断病原菌的耐药性，适合临床上检验微生物产生的内源性β -内酰胺酶。

另一方面，β-内酰胺类抗生素由于毒性小、化疗指数高、抗菌谱广、价格便宜，在非临床领域也获得了广泛的使用，比如畜牧业就大量使用β-内酰胺类抗生素治疗奶牛乳腺炎，结果使奶源的抗生素残留问题比较严重。郑颖等研究了TEM-116型超广谱β-内酰胺酶对牛奶中抗生素的清除，通过试验作者发现在不太苛刻的条件下β-内酰胺酶很容易清除牛奶中残留的青霉素G。CN 101089178B公开了一种β-内酰胺酶、其制备方法及其应用，其中也对β-内酰胺酶对牛奶中残留抗生素的去除效果进行了研究，结果也表明β-内酰胺酶在奶制品中可以分解β-内酰胺类抗生素。这些结果似乎表明β-内酰胺酶可以完全降解牛奶中残留的抗生素，减少奶业的损失，有可能成为一种新型食品添加剂。

然而目前β-内酰胺酶的安全性还没有得到证实，β-内酰胺类抗生素经酶分解的产物与抗生素的毒副作用之间的关系没有进行深入的研究，食品中添加β-内酰胺酶虽然可以分解抗生素，但人体长期接触抗生素酶分解产物也存在很大的风险。

美国PANPACIFIC TECH COMPANY公司开发的UscnlifeTM人和鸡β-内酰胺酶酶联免疫检测试剂盒，使用的方法用到的抗体为针对一种β-内酰胺酶的抗体，而β-内酰胺酶种类很多，结构彼此不同，以一种β-内酰胺酶为抗原制备抗体后配制的检测试剂不能检测其他种类的β-内酰胺酶，这使得以酶联免疫原理为基础的检测试剂盒的应用受到限制。

因此亟需开发一种不依赖微生物培养、简单快速的检测试剂盒检测样品中的β-内酰胺酶。

发明内容

本发明的目的是提供一种测定样品中β-内酰胺酶方法。

为了实现本发明目的，本发明提供一种用于检测样品中β-内酰胺酶的试剂盒，其包括：

1)具有β-内酰胺酶检测孔的反应基板，所述检测孔包被有β-内酰胺酶底物；

2)样品稀释液；

其中，所述β-内酰胺酶底物选自头孢硝噻吩、PADAC、CENTA 中的至少一种，优选头孢硝噻吩。其中，PADAC和CENTA均为头孢菌素发色合成物，可购自Merck、Sigma、BioVision、湖北信康医药化工有限公司、上海倍卓生物科技有限公司等。

前述的试剂盒，所述检测孔还包被有稳定剂和/或抗氧化剂。

其中，所述稳定剂选自D-海藻糖、蔗糖、葡聚糖T70、β-环糊精、甲基纤维素、牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、甘露醇、α-乳糖、聚乙二醇、明胶、肌醇、木糖或阿拉伯糖醇等中的至少一种，优选甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。

所述抗氧化剂选自维生素C、没食子酸丙酯、L-半胱氨酸、亚硫酸钠、焦亚硫酸钠柠檬酸、BHA(丁基羟基茴香醚)、BHG(2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚)等中的至少一种，优选L-半胱氨酸和柠檬酸。

β-内酰胺酶底物头孢硝噻吩由于本身的化学结构极易被氧化水解，导致底物失活变色，出现与检测后相同的颜色，因此抗氧化剂的加入能够有效防止底物失活现象从而保证产品的有效性。

前述的试剂盒，样品稀释液选自0.9％生理盐水、0.9％KCl溶液或蒸馏水等，优选0.9％生理盐水或蒸馏水。

本发明用于检测样品中β-内酰胺酶的检测试剂盒，可按照如下方法制备得到：

(1)反应基板的制备：

反应基板由ABS工程塑料制成，其上设有β-内酰胺酶检测孔，在检测孔内填入反应垫载体，所采用的载体为滤纸、玻璃纤维或层析纸；检测孔的尺寸为

(2)β-内酰胺酶反应垫的制备：

从检测孔底部向上依次叠放有底物垫和缓冲垫；

所述底物垫由底物溶液滴加在载体上制备而成；其中，底物溶液以异丙醇为溶剂，制成含有0.001-0.1g/mLβ-内酰胺酶底物、 0.005-5g/mL稳定剂和0.005-5g/mL抗氧化剂的底物溶液；

所述缓冲垫由pH6-8浓度200-600mmol/L的缓冲溶液滴加在载体上制备而成；其中，缓冲溶液选自磷酸钾缓冲液、Tris-HCl缓冲液、 PIPES或磷酸钠缓冲液中的至少一种；

(2)样品稀释液的配制：以水为溶剂，配制0.9％生理盐水、0.9％ KCl溶液。

优选地，步骤(2)中所用β-内酰胺酶底物为头孢硝噻吩，所用稳定剂为甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮，所用抗氧化剂为L-半胱氨酸和柠檬酸。

在本发明的一个具体实施方式中，所述检测试剂盒的制备方法如下：

(1)反应基板的制备：

反应基板由ABS工程塑料制成，其上设有β-内酰胺酶检测孔；检测孔的尺寸为

(2)β-内酰胺酶检测孔中底物垫和缓冲垫的制备：

从检测孔底部向上依次叠放有底物垫和缓冲垫，二者构成反应垫；

底物垫由底物溶液1μL滴加在层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；

底物溶液以异丙醇为溶剂，配制含有1mg/L头孢硝噻吩、0.01g/mL 甲基纤维素、0.1g/mL聚乙烯吡咯烷酮、0.01g/mL柠檬酸和0.01g/mL L- 半胱氨酸的底物溶液；

缓冲垫由缓冲溶液1μL滴加在层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制备而成，密封保存在4℃；

缓冲溶液为pH 7.0、200mmol/L的PBNa溶液；

(3)将步骤(2)制备的反应垫填入检测孔中，用冲压机压实，然后贴上铝箔贴条，装入铝箔袋中；

(4)配制0.9％生理盐水作为样品稀释液。

本发明还提供提供一种非诊断目的检测样品中β-内酰胺酶的方法，利用上述试剂盒进行检测。具体如下：

样品用稀释液进行稀释后，加至反应基板的检测孔内，在温度为 35-50℃的干浴器上反应5-10min(优选7min)，观测反应结果：淡黄色为阴性，红色为阳性。

本发明提供了上述方法在检测样品中β-内酰胺酶含量中的应用。考虑到试剂盒保存的需要，所制备的反应垫必须具备相当高的稳定性，在大量实验研究的基础上，最终确定了上述底物液和缓冲液的组成及其配方，使得试剂盒具有理想的稳定性，能够在实际应用中推广。

本试剂盒中检测β-内酰胺酶的指标，用来检测样品中含有的敏感性β-内酰胺类抗生素耐药菌代谢产生的β-内酰胺酶活性，用于β-内酰胺类抗生素耐药菌筛选和鉴别，以指导临床医生选择合适抗生素。同时，此方法亦可延伸应用于其他食品或环境中采集的样本。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明解决了液体试剂的不稳定问题，通过加入稳定剂、表面活性剂等物质，对试剂进行了最优的配比，在此条件下，有效提高反应的灵敏度和准确性，使液体试剂能够在试纸垫上稳定保存；操作简便快速，准确性高，适用于临床常规检测特别是临床病人床旁检测使用，进而指导合理临床用药。只需将收集的样本进行稀释，加到对应反应孔中，反应一段时间进行比色，操作简便，可在医院急诊室、基层医疗与保健单位及病人家庭使用。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1用于检测样品中β-内酰胺酶的试剂盒的制备

本实施例的用于检测样品中β-内酰胺酶的试剂盒包括：①具有β-内酰胺酶检测孔的反应基板；②阴道分泌物稀释液。

所述检测试剂盒的制备方法如下：

(1)反应基板的制备：

反应基板由ABS工程塑料制成，其上设有β-内酰胺酶检测孔；检测孔的尺寸为

(2)β-内酰胺酶检测孔中底物垫和缓冲垫的制备：

从检测孔底部向上依次叠放有底物垫和缓冲垫，二者构成反应垫；

底物垫由底物溶液1μL滴加在层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；

底物溶液以异丙醇为溶剂，配制含有1mg/L头孢硝噻吩、0.01g/mL 甲基纤维素、0.1g/mL聚乙烯吡咯烷酮、0.01g/mL柠檬酸和0.01g/mL L- 半胱氨酸的底物溶液；

缓冲垫由缓冲溶液1μL滴加在层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制备而成，密封保存在4℃；

缓冲溶液为pH 7.0、200mmol/L的PBNa溶液；

(3)将步骤(2)制备的反应垫填入检测孔中，用冲压机压实，然后贴上铝箔贴条，装入铝箔袋中；

(4)配制0.9％生理盐水作为样品稀释液,分装在滴瓶中保存。

实施例2阴道分泌物中含有β-内酰胺酶活性耐药菌株的检测方法

本实施例提供一种检测样品中是否含有β-内酰胺酶活性耐药菌株的方法，可以对临床上待测病人的阴道分泌物样本进行检测，也可对健康人群的样本进行检测，以检查待测人群的阴道分泌物中是否含有β-内酰胺酶活性耐药菌，可作为阴道感染患者的诊断、鉴别诊断和疗效评价的辅助指标，指导后续的临床用药。

本发明实施例1制备的试剂盒的具体使用方法如下：

1)在使用时，首先将装置从保存温度下取出，平衡到室温开始使用；

2)撕掉铝箔包装，取出反应基板；

3)阴道分泌物样本处理：用棉签从阴道后穹窿取分泌物后加入 400μl稀释液稀释分泌物；

4)吸取上述阴道分泌物稀释液25μl滴加至反应孔(检测孔)内；

5)在干浴器(设置温度为48℃)上反应7min，观测反应结果。淡黄色为阴性，红色即为阳性。本领域技术人员应当理解，根据本领域的现有技术，在使用其他保温容器如培养箱、烘箱、水浴容器等的设置温度为35-50℃的条件下反应后，也能够实现结果的对比判断。

本发明的试剂盒性能稳定，保质期为18个月。

本发明试剂盒的检测结果准确率高达95％以上。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

参考文献

1.赵旺胜and吴桂荣,四种检测β—内酰胺酶方法的实验比较.南京医科大学学报:自然科学版,1997(6):p.648-648.

2.张坚磊and刘国琳,应用碘试纸条法快速检测β—内酰胺酶.现代检验医学杂志,1999(1): p.63-64.

3.叶枫,et al.,四种方法检测超广谱β-内酰胺酶的敏感性比较.广东医学,2004.25(5):p. 521-523.

4.村田敦,β-内酰胺酶检测试剂组合物、检测试剂盒及检测方法,2006.

5.郑颖,et al.,TEM-116型超广谱β-内酰胺酶对牛奶中抗生素的清除.中国抗生素杂志,2008. 33(2):p.122-124.

6.侯垠伏,et al.,一种β-内酰胺酶、其制备方法及其应用,2012,CN。

Claims (10)

1.用于检测样品中β-内酰胺酶的试剂盒，其特征在于，其包括：

1)具有β-内酰胺酶检测孔的反应基板，所述检测孔包被有β-内酰胺酶底物；

2)样品稀释液；

其中，所述β-内酰胺酶底物选自头孢硝噻吩、PADAC、CENTA中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述β-内酰胺酶底物为头孢硝噻吩。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述检测孔还包被有稳定剂和/或抗氧化剂；其中，所述稳定剂选自D-海藻糖、蔗糖、葡聚糖T70、β-环糊精、甲基纤维素、牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、甘露醇、α-乳糖、聚乙二醇、明胶、肌醇、木糖或阿拉伯糖醇中的至少一种；所述抗氧化剂选自维生素C、没食子酸丙酯、L-半胱氨酸、亚硫酸钠、焦亚硫酸钠柠檬酸、BHA、BHG中的至少一种。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述稳定剂为甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮，所述抗氧化剂为L-半胱氨酸和柠檬酸。

5.根据权利要求1-4任一项所述的试剂盒，其特征在于，样品稀释液选自0.9％生理盐水、0.9％KCl溶液或蒸馏水，优选0.9％生理盐水或蒸馏水。

6.权利要求1-5任一项所述试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)反应基板的制备：

反应基板由ABS工程塑料制成，其上设有β-内酰胺酶检测孔，在检测孔内填入反应垫载体，所采用的载体为滤纸、玻璃纤维或层析纸；检测孔的尺寸为

(2)β-内酰胺酶反应垫的制备：

从检测孔底部向上依次叠放有底物垫和缓冲垫；

所述底物垫由底物溶液滴加在载体上制备而成；其中，底物溶液以异丙醇为溶剂，制成含有0.001-0.1g/mLβ-内酰胺酶底物、0.005-5g/mL稳定剂和0.005-5g/mL抗氧化剂的底物溶液；

所述缓冲垫由pH6-8浓度200-600mmol/L的缓冲溶液滴加在载体上制备而成；其中，缓冲溶液选自磷酸钾缓冲液、Tris-HCl缓冲液、PIPES或磷酸钠缓冲液中的至少一种；

(2)样品稀释液的配制：以水为溶剂，配制0.9％生理盐水、0.9％KCl溶液。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所用β-内酰胺酶底物为头孢硝噻吩，所用稳定剂为甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮，所用抗氧化剂为L-半胱氨酸和柠檬酸。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)反应基板的制备：

反应基板由ABS工程塑料制成，其上设有β-内酰胺酶检测孔；检测孔的尺寸为

(2)β-内酰胺酶检测孔中底物垫和缓冲垫的制备：

从检测孔底部向上依次叠放有底物垫和缓冲垫，二者构成反应垫；

底物垫由底物溶液1μL滴加在层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；

底物溶液以异丙醇为溶剂，配制含有1mg/L头孢硝噻吩、0.01g/mL甲基纤维素、0.1g/mL聚乙烯吡咯烷酮、0.01g/mL柠檬酸和0.01g/mL L-半胱氨酸的底物溶液；

缓冲垫由缓冲溶液1μL滴加在层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制备而成，密封保存在4℃；

缓冲溶液为pH 7.0、200mmol/L的PBNa溶液；

(3)将步骤(2)制备的反应垫填入检测孔中，用冲压机压实，然后贴上铝箔贴条，装入铝箔袋中；

(4)配制0.9％生理盐水作为样品稀释液。

9.一种非诊断目的检测样品中β-内酰胺酶的方法，其特征在于，利用权利要求1-5任一项所述试剂盒进行检测。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，样品用稀释液进行稀释后，加至反应基板的检测孔内，在温度为35-50℃的干浴器上反应5-10min，观测反应结果：淡黄色为阴性，红色为阳性。