CN101914612A - β-内酰胺酶检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种β-内酰胺酶检测试剂盒及检测方法，属于食品安全检测试剂技术领域。本发明配制的检测试剂盒由包装盒、样品检测瓶、阳性对照瓶、阴性对照瓶、标准β-内酰胺酶溶液试剂瓶、淀粉溶液试剂瓶、碘-碘化钾溶液试剂瓶、取样移液器和托架组成，检测瓶中含有氨苄青霉素，阳性检测瓶和阴性检测瓶还含有辅料。本发明的试剂盒最低检测限度可以达到30-50U/ml(2-5ng/ml)。本发明还涉及应用上述检测试剂盒测定食品中β-内酰胺酶含量的方法。本发明尤其适用于乳制品中β-内酰胺酶的检测。

Description

β-内酰胺酶检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及食品安全检测试剂技术领域，尤其涉及一种β-内酰胺酶检测试剂盒以及β-内酰胺酶检测方法。

背景技术

自20世纪40年代第一个β-内酰胺类抗生素——青霉素问世以来，抗生素在细菌感染性疾病的治疗中发挥了重要作用，95％以上由细菌感染引起的疾病得到控制。然而随着β-内酞胺类抗生物药物的不断开发和在临床上的广泛应用，耐药菌株越来越多，其中最主要的耐药机制是这些菌株能产生β-内酸胺酶。

研究表明β-内酰胺酶是水解β-内酰胺类抗生素分子中β-内酰胺环结构的一类酶，根据酶蛋白的氨基酸序列的同源性分为A类、B类、C类及D类，其中超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases，ESBL)是分解β-内酰胺类抗生素底物范围比以往的A类β-内酰胺酶更广的酶。β-内酞胺酶水解抗生素，使之失去抗菌活性，从而导致临床抗菌治疗失败。葡萄球菌、流感嗜血杆菌、淋病奈瑟氏菌及部分肠球菌都是由此酶表现出抗药性。

经常使用抗生素会使病原菌产生耐药性，产生耐药性的后果相当严重，抗生素失去效果。对β-内酰胺类抗生素耐药的细菌感染应用β-内酰胺类抗生素治疗，不仅得不到治疗效果，而且还成为新的耐性菌蔓延的原因，引起病人住院时间延长、费用增加和死亡率上升。因此，在确定正确的治疗方案前必须迅速且正确地检测这些病原菌是否产生β-内酰胺酶，这对于快速识别耐药菌株及控制耐药菌株传播有重要作用，也有助于相应感染性疾病的治疗和预防。

赵旺胜等于1997年报道了四种β-内酰胺酶检测方法(四种检测β-内酰胺酶方法的实验比较，南京医科大学学报(中文版)，1997年11月第17卷第6期)：(1)碘测量法：溶解青霉素G于0.1mol/L磷酸盐缓冲液中(pH6.0)，制成6000mg/L，配制1％可溶性淀粉液和2％碘溶液，测定时取0.1ml青霉素溶液与2ml待测菌液混合，置室温30分钟，加2滴淀粉溶液，再加1滴碘液混合，10分钟内能使蓝色完全消退的菌株为β-内酰胺酶阳性株。(2)微生物法：将对青霉素敏感的指示菌接种在血平板上，平板中心贴每片1μg青霉素纸片，沿纸片周围垂直划线，接种待测菌，阳性和阴性对照菌，37℃孵育24小时，如待测菌产生β-内酰胺酶，则待测菌处的指示菌出现凹痕。(3)纸片法：取20张滤纸片(1cm×2cm)放入1ml青霉素溶液中浸湿，待纸片干后备用，用接种环挑取待检菌5～10个菌落涂于纸片上，放入带盖的平板内置37℃孵育30分钟，产β-内酰胺酶的菌株可使纸片的颜色由蓝紫色变黄。(4)酸测定法：取0.1ml青霉素酚红溶液与2ml待测菌悬液混合，10-15分钟内变为黄色为β-内酰胺酶阳性。张坚磊等1999年报道了应用碘试纸条法快速检测β-酞胺酶(陕西医学检脸，第14卷第1期1999年2月)，该法是在碘测量法的基础上建立以青霉素为底物的试纸条法，菌落涂于试纸条上，通过试纸条颜色的变化判断是否产生β-内酰胺酶。

叶枫等对四种方法检测超广谱β-内酰胺酶进行了比较(四种方法检测超广谱β-内酰胺酶的敏感性比较，《广东医学》，2004年5月第25卷第5期)，采用了纸片扩散法、双纸片协同法、Etest法和VITEK全自动细菌分析法，这些方法需要通过培养耐药菌及判断抑菌圈，实验时间长，结果易受偶然因素影响，VITEK全自动细菌分析系统及其药敏卡检测方法快速简便，但需要特殊的机器。中国专利CN200380107185.6公开了一种β-内酰胺酶检测试剂组合物、β-内酰胺酶检测试剂盒以及β-内酰胺酶检测方法，在产色头孢菌素法中使用的β-内酰胺酶检测试剂组合物含有β-内酰胺酶检测底物与β-内酰胺酶抑制剂。

以上方法是在临床细菌培养的基础上检测细菌是否产生β-内酰胺酶来判断病原菌的耐药性，适合临床上检验微生物产生的内源性β-内酰胺酶。

另一方面，β-内酰胺类抗生素由于毒性小、化疗指数高、抗菌谱广、价格便宜，在非临床领域也获得了广泛的使用，比如畜牧业就大量使用β-内酰胺类抗生素治疗奶牛乳腺炎，结果使奶源的抗生素残留问题比较严重。郑颖等研究了TEM-116型超广谱β-内酰胺酶对牛奶中抗生素的清除(《中国抗生素杂志》，2008年2月第33卷第2期)，通过试验作者发现在不太苛刻的条件下β-内酰胺酶很容易清除牛奶中残留的青霉素G。中国专利(申请号；200610051915.0)公开了一种β-内酰胺酶、其制备方法及其应用，其中也对β-内酰胺酶对牛奶中残留抗生素的去除效果进行了研究，结果也表明β-内酰胺酶在奶制品中可以分解β-内酰胺类抗生素。这些结果似乎表明β-内酰胺酶可以完全降解牛奶中残留的抗生素，减少奶业的损失，有可能成为一种新型食品添加剂。

然而目前β-内酰胺酶的安全性还没有得到证实，β-内酰胺类抗生素经酶分解的产物与抗生素的毒副作用之间的关系没有进行深入的研究，食品中添加β-内酰胺酶虽然可以分解抗生素，但人体长期接触抗生素酶分解产物也存在很大的风险。

美国PANPACIFIC TECH COMPANY公司开发的UscnlifeTM人和鸡β-内酰胺酶酶联免疫检测试剂盒，使用的方法用到的抗体为针对一种β-内酰胺酶的抗体，而β-内酰胺酶种类很多，结构彼此不同，以一种β-内酰胺酶为抗原制备抗体后配制的检测试剂不能检测其他种类的β-内酰胺酶，这使得以酶联免疫原理为基础的检测试剂盒的应用受到限制。

因此本领域特别需要一种不依赖微生物培养、简单快速的检测试剂盒检测食品中添加的β-内酰胺酶。

发明内容

本发明的目的是提供可以迅速地检测食品中添加的β-内酰胺酶的一种β-内酰胺酶检测试剂盒及其检测方法。

本发明试剂盒是在酶活性分析原理的基础上开发的，对不同类型的β-内酰胺酶都能够检测。试剂盒由包装盒、样品检测瓶、阳性对照瓶、阴性对照瓶、标准β-内酰胺酶溶液试剂瓶、淀粉溶液试剂瓶、碘-碘化钾溶液试剂瓶、取样移液器和托架组成，样品检测瓶、阳性对照瓶、阴性对照瓶中含有氨苄青霉素，阳性对照瓶和阴性对照瓶中还含有脱脂奶粉。

本发明的标准β-内酰胺酶溶液每毫升含有50-5000万单位β-内酰胺酶、5-50％(v/v)甘油、1-50mg丙氨酸、1-100mg甘露醇，磷酸缓冲液5-100mmol/L，pH4.0-10.0。该条件下标准β-内酰胺酶溶液于2-8℃可稳定保存6个月。

本发明试剂盒碘-碘化钾溶液含有0.1-10％(w/v)碘和0.1-20％(w/v)的碘化钾，其中优选的碘-碘化钾溶液含有0.5-3％(w/v)碘和2-5％(w/v)的碘化钾。

本发明试剂盒淀粉溶液含有0.1-20％(w/v)的淀粉，其中优选的淀粉溶液含有1-2％(w/v)的淀粉。

本发明试剂盒每个检测瓶含有氨苄青霉素粉末0.1-50mg，其中优选的每个检测瓶含有氨苄青霉素粉末1-3mg。氨苄青霉素粉末可以是称量法分装，也可以采用溶解后冻干的方法使每个检测瓶中的氨苄青霉素含量达到1-3mg，并且水分含量小于3％。对比文献中氨苄青霉素每次反应用量是0.6每个，而试纸条法氨苄青霉素用量更低，本发明在实验基础上确定的氨苄青霉素用量及保存状态确保了检测的灵敏度和准确性。粉末状氨苄青霉素可使其保持稳定，克服氨苄青霉素在有水情况下容易分解影响检测结果的局限性。经过试验确定的氨苄青霉素用量避免假阴性结果产生，提高检测的灵敏度和准确性。

为了防止少量氨苄青霉素粉末黏附到整个瓶壁或瓶塞，可加入对检测反应惰性的辅料，比如甘露醇、脱脂奶粉、蔗糖、氨基酸、纤维素、聚乙二醇等。

本发明β-内酰胺酶检测方法：取阳性对照瓶和阴性对照瓶各一支及样品检测瓶，分别取1.5ml蒸馏水加入阳性对照瓶和阴性对照瓶，再向阳性对照瓶中加入1～2滴β-内酰胺酶溶液，样品检测瓶中加入样品1.5ml，各检测瓶混合均匀后盖好瓶塞，将各检测瓶卡入托架放入37℃恒温水浴保温30-180分钟；然后向各检测瓶加入4滴淀粉溶液，混合均匀后再加入碘-碘化钾溶液2滴，混合均匀，放置2分钟，根据样品检测瓶颜色与阳性对照瓶和阴性对照瓶的比较确定样品中是否含有β-内酰胺酶。其中优选的检测瓶在37℃恒温水浴保温时间为60-90分钟，滴加碘液后在37℃水浴保温2-5分钟观察结果.

本发明通过下述方法定量测定样品中β-内酰胺酶含量：将检测样品梯度稀释，获得呈阳性结果的最大稀释倍数，检测限乘以稀释倍数即为样品中β-内酰胺酶含量。检测限的测定是通过将标准β-内酰胺酶溶液按标示的活性单位稀释，使检测管酶含量分别为90U/ml、70U/ml、50U/ml、30U/ml、10U/ml，同时做不含酶的空白对照，按上述方法进行酶反应及显色，以反应管颜色由白色发生转变显示蓝色的酶含量为检测最低限度，结果本发明的试剂盒最低检测限度可以达到30-50U/ml。β-内酰胺酶的比活性为1500-2000U/mg，因此本法可检出的β-内酰胺酶含量可达2-5ng/ml。

具体实施方式

实施例一、最低检测限的测定

1、溶液配制

1％淀粉溶液：称取1g可溶性淀粉溶解于100ml加热的蒸馏水，过滤后备用。

1％碘-碘化钾溶液：称取碘化钾4g，碘1g溶解于100ml蒸馏水，保存于棕色试剂瓶备用。

标准β-内酰胺酶溶液：1000万单位/支。

2、实验方法

根据标示的β-内酰胺酶活性单位，用牛奶将酶液分别稀释不同的倍数，使其含量分别为90U/ml、70U/ml、50U/ml、30U/ml、10U/ml。取多个干净的试管，分别加入1mg青霉素钠粉末，然后阴性对照管中加入1.5ml纯牛奶，阳性对照管中加入1.5ml纯牛奶和100μl酶液充分混匀，其他试管依次加入梯度稀释含酶牛奶样品，混匀后放在37℃水浴锅中加热80分钟。保温结束后每个反应管中加入4滴淀粉溶液，混匀，再加入2滴碘-碘化钾溶液，混匀后观察结果。

阳性反应管呈白色，阴性反应管蓝色，稀释后样品酶活性为50U/ml的反应管颜色出现变化，发生有白色向蓝色的转变，表明该方法能检测出酶含量为50U/ml的β-内酰胺酶，既最低检测限可达到50U/ml。

实施例二、碘量对检测限的影响

1、溶液配制

1％淀粉溶液：称取1g可溶性淀粉溶解于100ml加热的蒸馏水，过滤后备用。

0.6％碘-碘化钾溶液：称取碘化钾2.4g，碘0.6g溶于100ml蒸馏水，保存于棕色试剂瓶备用。

标准β-内酰胺酶溶液：750万单位/支。

2、实验方法

根据标示的β-内酰胺酶活性单位，用牛奶将酶液分别稀释不同的倍数，使其含量分别为90U/ml、70U/ml、50U/ml、30U/ml、10U/ml。取多个干净的试管，分别加入1mg青霉素钠粉末，然后阴性对照管中加入1.5ml纯牛奶，阳性对照管中加入1.5ml纯牛奶和100μl酶液充分混匀，其他试管依次加入梯度稀释含酶牛奶样品，混匀后放在37℃水浴锅中加热80分钟。保温结束后每个反应管中加入4滴淀粉溶液，混匀，再加入2滴碘-碘化钾溶液，混匀后观察结果。

阳性反应管呈白色，阴性反应管蓝色，稀释后样品酶活性为30U/ml的反应管颜色出现变化，发生有白色向蓝色的转变，该条件下最低检测限可达到30U/ml。

实施例三、青霉素量对检测限的影响

1、溶液配制

1％淀粉溶液：称取1g可溶性淀粉溶解于100ml加热的蒸馏水，过滤后备用。

1％碘-碘化钾溶液：称取碘化钾4g，碘1g溶解于100ml蒸馏水，保存于棕色试剂瓶备用。

标准β-内酰胺酶溶液：1500万单位/支。

2、实验方法

根据β-内酰胺酶活性单位，用牛奶将酶液分别稀释不同的倍数，使其含量分别为90U/ml、70U/ml、50U/ml、30U/ml、10U/ml。取多个干净的试管，分别加入5mg青霉素钠粉末，然后阴性对照管中加入1.5ml纯牛奶，阳性对照管中加入1.5ml纯牛奶和100μl酶液充分混匀，其他试管依次加入梯度稀释含酶牛奶样品，混匀后放在37℃水浴锅中加热80分钟。保温结束后每个反应管中加入4滴淀粉溶液，混匀，再加入2滴碘-碘化钾溶液，混匀后观察结果。

阳性反应管呈白色，阴性反应管呈白色，稀释后样品反应管白色，表明青霉素含量提高阴性对照产生阳性结果，使检测结果无法判断。

如上述方法测定，减少青霉素量，每个检测管加入新鲜配制的青霉素使其加入量为0.5mg，反应结束后观察结果，阳性反应管呈蓝色，稀释后样品反应管蓝色，表明青霉素含量降低阳性对照产生阴性结果，使检测结果无法判断。

实施例四、试剂盒的配制

1％淀粉溶液：称取1g可溶性淀粉溶解于100ml加热的蒸馏水，过滤后分装于10ml试剂瓶中。

1％碘-碘化钾溶液：称取碘化钾4g，碘1g溶解于100ml蒸馏水，分装于10ml棕色试剂瓶。

标准β-内酰胺酶溶液：取β-内酰胺酶原料(2000万单位/g)50g，pH7.0磷酸缓冲液储备液(500mmol/L)1ml，50％(v/v)甘油25ml、丙氨酸1.5g、甘露醇2g，试剂用少量水溶解后液体试剂，混合均匀后加酶，最后定溶至100ml，分装使酶含量为1000万单位/支。

检测瓶中青霉素粉末的分装：采用称重法在干燥的环境中称取1mg青霉素粉末于每一个检测瓶。也可以采用溶解后冻干方法，用20mmol/L的磷酸缓冲液溶解青霉素使其含量为1mg/mL，按1ml装量分装，迅速于-20℃预冻2小时或更长时间，然后于-15℃冷冻干燥冻干，这样可保证检测管青霉素的含量准确均一。配制青霉素溶液时也可以添加甘露醇使其浓度为5mg/ml，这样冻干时可防止压塞时青霉素漂浮引起含量的减少。当然也可以采用其他使青霉素含量准确的分装方式。

称取脱脂奶粉18g于阳性对照瓶和阴性检测品。

实施例五、样品中β-内酰胺酶含量测定

从检测盒中取阳性对照检测瓶和阴性对照检测瓶各一支，除去铝塑盖，打开瓶塞。取标有“纯净水”的滴管，分别向两个瓶中加入1.5ml纯净水。再取标有“+”号的滴管和阳性对照品液瓶，吸取阳性对照品液后，向阳性对照检测瓶(+)中加入1～2滴β-内酰胺酶阳性对照品液。将两个对照检测瓶分别盖好瓶塞，振荡使溶解均匀，备用。

从检测盒中取供试品检测瓶6支，除去铝塑盖，打开瓶塞。取标有“供试品”的滴管6支，分别吸取6个待检测样品各1.5ml，分别加入到6个供试品检测瓶中，将供试品检测瓶盖好瓶塞，振荡使溶解均匀。

从检测盒中取出浮漂，将阳性对照检测瓶、阴性对照检测瓶和供试品检测瓶卡入浮漂中，放入37℃恒温水浴中，计时，加热80分钟；

加热80分钟后，取出上述步骤4中的阳性对照检测瓶、阴性对照检测瓶和供试品检测瓶。分别向上述阳性对照检测瓶、阴性对照检测瓶和供试品检测瓶中加入4滴淀粉溶液，振荡；再加入2滴碘-碘化钾溶液，振荡；分别盖好瓶塞，放置37度水浴2分钟。

2分钟后，摇匀并观察结果，阳性对照检测瓶白色，阴性对照检测瓶蓝色，供试品1、2、4、5号白色，说明含有β-内酰胺酶，含量大于50U/ml，3号检测瓶蓝色，说明不含β-内酰胺酶，6号管颜色介于阴性和白色之间，说明β-内酰胺酶含量低于30-50U/ml。

实施例六、样品中β-内酰胺酶的定量测定

取实施例五经测定含有β-内酰胺酶的4样品，用不含抗生素的牛奶分别稀释2、4、6、8、16、32、64倍，按实施例五的方法进行β-内酰胺酶含量的测定，结果样品64倍稀释后结果为阴性，而2、4、6、8、16、32倍稀释后检测结果阳性，则样品β-内酰胺酶含量为32*(30-50U/ml)＝960-1600U/ml。

Claims (11)

1.β-内酰胺酶检测试剂盒，由包装盒、样品检测瓶、取样移液器和托架组成，其特征在于还包括阳性对照瓶、阴性对照瓶、标准β-内酰胺酶、淀粉溶液、碘-碘化钾溶液，样品检测瓶、阳性对照瓶和阴性对照瓶中含有氨苄青霉素，阳性对照品瓶和阴性对照瓶还含有脱脂奶粉。

2.如权利要求1所述的β-内酰胺酶检测试剂盒，其特征是标准β-内酰胺酶是溶液，每毫升含有50-5000万单位β-内酰胺酶、5-50％(v/v)甘油、1-50mg丙氨酸、1-100mg甘露醇，磷酸缓冲液5-100mmol/L，pH4.0-10.0。

3.如权利要求1或2所述的β-内酰胺酶检测试剂盒，其特征是碘-碘化钾溶液含有0.1-10％(w/v)碘和0.1-20％(w/v)的碘化钾。

4.如权利要求3所述的β-内酰胺酶检测试剂盒，其特征是碘-碘化钾溶液含有1-3％(w/v)碘和2-5％(w/v)的碘化钾。

5.如权利要求1、2、4任一项权利要求所述的β-内酰胺酶检测试剂盒，其特征是淀粉溶液含有0.1-20％(w/v)的淀粉。

6.如权利要求5所述的β-内酰胺酶检测试剂盒，其特征是淀粉溶液含有1-2％(w/v)的淀粉。

7.如权利要求1、2、4、6任一项权利要求所述的β-内酰胺酶检测试剂盒，其特征是每个检测瓶含有氨苄青霉素粉末0.1-50mg。

8.如权利要求7所述的β-内酰胺酶检测试剂盒，其特征是每个检测瓶含有氨苄青霉素粉末1-3mg。

9.β-内酰胺酶检测方法，其特征在于：取阳性检测瓶和阴性检测瓶各一支及样品检测瓶，分别取1.5ml蒸馏水加入阳性检测瓶和阴性检测瓶，再向阳性检测瓶中加入1～2滴β-内酰胺酶溶液，样品检测瓶中加入样品1.5ml，各检测瓶混合均匀后盖好瓶塞，将各检测瓶卡入托架放入37℃恒温水浴保温30-180分钟；然后向各检测瓶加入4滴淀粉溶液，混合均匀后再加入碘-碘化钾溶液2滴，混合均匀，放置2分钟，根据样品检测瓶颜色与阳性检测瓶和阴性检测瓶的比较确定样品中是否含有β-内酰胺酶。

10.如权利要求9的β-内酰胺酶检测方法，其特征在于通过下述方法定量测定样品中β-内酰胺酶含量：将检测样品梯度稀释，获得呈阳性结果的最大稀释倍数，检测限乘以稀释倍数即为样品中β-内酰胺酶含量。

11.如权利要求9的β-内酰胺酶检测方法，其特征是检测瓶在37℃恒温水浴保温60-90分钟，滴加碘液后37℃水浴保温2-5分钟观察结果。