JPH0530995A - リステリア属の細菌を同定する方法及び媒質 - Google Patents
リステリア属の細菌を同定する方法及び媒質Info
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Abstract
含有し得る試料中の病原体の単球症(monocytogenes)菌
を識別する細菌学的分析方法、該方法の実施用媒質及び
単球症リステリア(Listeria monocytogenes)を同定す
る装置に関する。本法は、グリシンアミノペプチダーゼ
により加水分解され得る発色性基質又は螢光発生基質を
含有してなる同定用媒質に対して分析すべき試料を接触
させることに在る。
Description
属の種々の細菌を識別及び/又は同定し得る細菌学的同
定方法及び同定用媒質(medium)に関する。更に詳しく
言えば、本発明の主たる要旨はリステリア(listeria)
属の他の非病原性細菌(species)から病原性の単球症
(monocytogenes)細菌の識別に関する。
今日7種の細菌を含有してなり、そのうち単球症リステ
リア(Listeria monocytogenes)のみがヒトに対して病
原性である。微生物は、食品によって生起される汚染に
続いてヒトの重大な流行病の原因となる。リステリア
(listeria)の2種の細菌:非病原性のリステリアイノ
キュア(List eria innocua)及び病原性の単球症リステ
リア(Listeria monocytogenes)が食料主としてミルク
及び乳製品から主として単離される。
的特性を有し、それ故これら細菌同志の間で識別するの
が困難である。現在使用されている識別試験は次の如く
である。
の溶解を生起する物質(リステリオリシン)の細菌によ
る産生に関連するβ−溶血反応活性の測定に基づく。こ
の試験は羊又は馬の血液寒天について行なうが、応答反
応は個々に非連関であることが多い。それ故この試験は
きわめて信頼性がなく、主として出合う2種の細菌を識
別し得るが即ちリステリアイノキュア(Listeria innoc
ua)(陰性反応)から単球症リステリア(Listeriamono
cytogenes)(陽性反応)を識別し得るが、病原性細菌
に対しては特異的でない。
−溶血反応試験と組合せて行なう。この試験は5%の洗
浄済み羊の赤血球を含有するトリプチカーゼ(tryptica
se)大豆寒天について行なう。黄色ブドウ球菌(S.aure
us)のβ−溶血菌株を、試験すべきリステリア(lister
ia)菌株の培養物により形成された画線に垂直な画線中
に接種する。2個の帯域に接触しているブドウ球菌によ
る溶血反応の増大は陽性反応を示している。実際上CA
MP試験は実施するのが困難な技術でありしかも溶血反
応と同様に、常にきわめて信頼性がある訳ではない。
eria)属の単球症細菌を識別する方法に在り、該方法は
特に選択的で、鋭敏でしかも相対的にきわめて主観的で
ない。
eria)属の種々の細菌を同定する完全な媒質系に在る。
シダーゼ、ホスファターゼ、エステラーゼ等)、82回
の発酵試験及び278回の細菌生長検査用平板培養(au
xanogram)試験よりなる500回以上の種々の生化学試
験を使用して、リステリア属の7種の細菌を検査した後
に、本発明者は、病原性の細菌、単球症リステリア(L.
monocyto genes)を除いては全てのリステリア細菌はグリ
シンアミノペプチダーゼ酵素活性を有するという重要な
発見に到達した。
見から本発明はそれ故、発色性(chromogenic)又は螢光
発光性(fluorigenic)でありしかもグリシンアミノペプ
チダーゼの存在下に加水分解され得るグリシンアミノペ
プチダーゼ基質を含有してなる同定用媒質に対して、分
析すべき試料を培養反応下に接触させることからなる、
リステリア属の細菌を細菌学的分析する特に選択的な方
法を提供する。
性でありしかも単球症リステリア(L. monocytogenes)細
菌を含有し得る分析すべき試料と接触させて又は該試料
の存在下に加水分解され得るグリシンアミノペプチダー
ゼ基質を含有してなる、例えば脱水形で包装した、リス
テリア属の細菌の細菌学的同定用媒質を提供する。
細菌を特徴付ける目的のため、かゝる同定用媒質はまた
分析すべき試料中に存在する細菌種を特徴付け得る1種
又はそれ以上の転化基質を含有することもできる。これ
らの転化基質は次の群から選ぶのが好ましい: (イ)細菌発酵性の基質、即ち炭化水物(D−キシロー
ス、リボース、ラムノース、タガトース、α−メチル−
D−マンノシド、α−メチル−D−グルコシド、マンニ
トール等)、(ロ)細菌還元性の基質例えば硝酸塩、好
ましくは硝酸カリウム、(ハ)酵素加水分解性の基質例
えばα−マンノシダーゼ基質。
少なくとも1種の特異酵素の存在下では加水分解され得
るか又は2つの部分に切断され得る、即ち非発色性又は
非螢光性の不活性部分と、直接的に又は間接的に即ち指
示薬と呼ばれる追加の化学化合物の作用により肉眼で又
は紫外線の下で見える色を発現し得る発色性又は螢光性
の部分とに切断され得る何れかの標識(マーカー)を意
味すると解される。
されて生成物を生成し得る基質から選択でき:該基質は
直接的に螢光性であり、即ちグリシン−7−アミド−4
−メチルクマリン、グリシン−7−アミド−4−トリフ
ルオロメチルクマリンであり、該基質は直接的に発色性
であり即ちグリシン−4−ニトロアニリドであり、該基
質は間接的に発色性であり即ちグリシン−2−ナフチル
アミド及びグリシン−4−メトキシ−2−ナフチルアミ
ドであり、これにファーストブルーBB型のジアゾニウ
ム塩及びパラ−ジメチルアミノシンナムアルデヒドから
選んだ指示薬を添加する。
下で得られる。当然前記の基質は例としてのみ与えられ
ており、本発明を限定するものではない。
プチダーゼ基質の濃度は0.01mM〜10mMで変化
するのが好ましい。
緩衝剤及びペプトン培地から選んだ緩衝剤系を含有して
なる。同定用媒質のpH値を6〜9に調節させ得る。
と、同定用媒質は好ましくは0〜10gの含量の塩化ナ
トリウムを含有する。媒質はこれの1l当り好ましくは
0〜100mgの量でグリシンアミノペプチダーゼの少
なくとも1種の賦活剤を含有することもでき、該賦活剤
はMg2+、Ca2+、Mn2+等の2価カチオンから選ばれ
るのが好ましい。この特定の処方によると、同定用媒質
は、好ましくは媒質1l当り30mgの量でMnCl2
又はMnSO4 の溶液を含有できる。
を次の実施例により例示する。
要量 この組成物を24時間37℃で通気乾燥することにより
微量滴定板のたまり部(well)中で脱水した。蒸発すべ
き媒質の容量は1個のたまり部当り100μlであっ
た。かくして製造した媒質はそれらを使用するまで+4
℃で暗所で脱水剤の作用下に貯蔵した。
ることは明らかである。
%)上で単離体を用いて、研究すべきリステリア(list
eria)菌株の懸濁物を無菌蒸留水中に製造した。この懸
濁物をマクファーランドスケール(Mcfarland scale)の
No.4ポイントに調節した。この懸濁物100μl
を、実施例1により記載した脱水済み組成物を含有する
微量滴定板のたまり部に導入した。37℃で4時間反応
させた後に、1滴のファーストブルーBB試薬を反応媒
質に添加して遊離2−ナフチルアミンの存在を測定し
た。橙色の発現は陽性反応を示した。
細菌、単球症リステリア(L. monocy togenes)とリステリ
ア、イノキュア(L. innocua)とを識別するのに本発明の
媒質の使用 実施例2の方法の実施を次の菌株の識別に応用した: 41個の L.monocytogenes菌株 33個の L.innocua菌株 得られた結果は陽性菌株の個数として表わして次の如く
であった:L.monocytogenes :0/41 即ち0%L.innocua :33/33 即ち100% 本実施例は、何らの混同も生じない観察から得られる本
発明媒質の特異性及びその信頼性を証明するものであ
る。
のに他の検出媒質と組合せて本発明媒質の使用 提案される可能性を説明するための目的で、本発明の媒
質と組合せて選択した検出用媒質は次の媒質である: D−キシロースを発酵する細菌の検出用媒質 リボースを発酵する細菌の検出用媒質 α−メチル−D−マンノシドを発酵する細菌の検出用媒
質 硝酸塩を還元する細菌の検出用媒質。
る: (イ)本発明の媒質即ちA、実施例1の組成物 (ロ)発酵性の炭水化物を含有してなる媒質即ちB 蒸留水 1000ml 炭水化物:D−キシロース、リボース、α−メチル−D−マンノシド 10g バクト−ペプトン(Difco) 5g フェノールレッド 60mg pH 8.5に調節 (ハ)硝酸塩を含有してなる媒質即ちC 蒸留水 1000ml 硝酸カリウム 1g バクト−ペプトン(Difco) 10g pH 7.0に調節 種々の組成物を、0.22μのフィルター上でのろ過に
より消毒し、1個のたまり部当り100μlの量で前記
したグリシンアミノペプチダーゼ試験と並んで微量滴定
板のたまり部に分散させた。反応媒質を次いで24時間
37℃で通風乾燥により脱水した。
らを使用するまで+4℃で暗所で脱水剤の作用下に貯蔵
した。
(listeria)菌株を研究した: 41個の単球症リステリア(L.monocytogenes) 33個の無害性リステリア(L.innocua) 8個のリステリア イバノビ(L.ivanovii) 3個のリステリア ウェルシメリ(L.welshimeri) 14個のリステリア シーリゲリ(L.seeligeri) 3個のリステリア グレイ(L.grayi) 2個のリステリア ムレイ(L.murrayi) これらの種々の菌株を次の要領で試験した:羊血コロン
ビア寒天(5%)上に単離した各々の菌株については、
細菌の懸濁物を無菌蒸留水中に製造した。
No.4ポイントに調節した。
に100μlの懸濁物を分散させた。
応物を次の要領で解釈した: 媒質A:(実施例3参照) 媒質B: 黄色の着色:陽性反応 赤色の着色:陰性反応 媒質C:BIO MERIEUX社により市販されしか
も酢酸中の溶液としてそれぞれスルファニル酸及びN,
N−ジメチル−1−ナフチルアミンよりなる試薬NIT
1及びNIT2の各々1滴を添加した後、 赤色の着色:陽性反応 着色なし:陰性反応 得られた結果は次の如くであった: −:陽性反応の0% +:陽性反応の100% この表は、リステリア(listeria)属を構成する7種の
菌株が5種の選択した媒質の少なくとも1種によって全
て2種ずつ分離されることを示している。
テリア属の細菌が属する種類が何であろうとも何れかの
リステリア菌株を簡単に且つ正確に同定することができ
る。
Claims (21)
- 【請求項1】 少なくとも1種の細菌種の代謝と関連す
る少なくとも1種の酵素の存在下で加水分解され得る発
色性基質又は螢光発生基質を含有してなる同定用媒質に
対して、分析すべき試料を接触させる細菌学的分析方法
において、リステリア(listeria)属の細菌を含有し得
る試料中の単球症(monocytogenes)菌を識別するのに、
グリシンアミノペプチダーゼ基質を同定用媒質に添加す
ることを特徴とする、リステリア属の細菌を同定する方
法。 - 【請求項2】 グリシンアミノペプチダーゼ基質の濃度
は0.01mM〜10mMである請求項1記載の方法。 - 【請求項3】 緩衝剤系を基質に導入してpH値を6〜
9に調節する請求項2記載の方法。 - 【請求項4】 少なくとも1種のグリシンアミノペプチ
ダーゼ賦活剤を同定用媒質に添加する請求項1〜3の何
れかに記載の方法。 - 【請求項5】 賦活剤はMn++、Mg++及びCa++より
なる群から選んだ2価のカチオンである請求項4記載の
方法。 - 【請求項6】 少なくとも1種の細菌種の代謝と関連す
る少なくとも1種の酵素の存在下で加水分解され得る発
色性基質又は螢光発生基質を含有してなる細菌学的同定
用の媒質において、リステリア(listeria)属の細菌を
含有できしかも同定用媒質と接触させた分析すべき試料
中の単球症(monocytogenes)菌を識別するのに、同定用
媒質はグリシンアミノペプチダーゼ基質を含有してなる
ことを特徴とする、リステリア属の細菌を同定する媒
質。 - 【請求項7】 基質は直接的に螢光発生性であり次の化
合物:グリシン−7−アミド−4−メチルクマリン及び
グリシン−7−アミド−4−トリフルオロメチルクマリ
ンから選ばれる請求項6記載の媒質。 - 【請求項8】 基質は直接的に発色性であり、特にグリ
シン−4−ニトロアニリドである請求項6記載の媒質。 - 【請求項9】 基質は指示薬を添加することにより間接
的に発色性であり、次の化合物:グリシン−2−ナフチ
ルアミド、グリシン−4−メトキシ−2−ナフチルアミ
ドから選ばれる請求項6記載の媒質。 - 【請求項10】 指示薬は“ファーストブルーBB”の
如きジアゾニウム塩又はパラ−ジメチルアミノシンナム
アルデヒドである請求項9記載の媒質。 - 【請求項11】 pH値を6〜9に維持するため緩衝剤
系を含有してなる請求項6〜10の何れかに記載の媒
質。 - 【請求項12】 基質のモル濃度は0.01mM〜10
mMである請求項6〜11の何れかに記載の媒質。 - 【請求項13】 塩化ナトリウムに加えて、少なくとも
1種のグリシンアミノペプチダーゼ賦活剤を含有してな
る請求項6〜12の何れかに記載の媒質。 - 【請求項14】 賦活剤はMn++、Mg++及びCa++よ
りなる群から選んだ2価のカチオンである請求項13記
載の媒質。 - 【請求項15】 賦活剤の量は0〜100mg/lであ
る請求項14記載の媒質。 - 【請求項16】 媒質を脱水する請求項6〜15の何れ
かに記載の媒質。 - 【請求項17】 更に、少なくとも1種の発酵基質及び
/又は1種の還元性基質及び/又は1種の酵素基質を含
有してなり、その化学的転化によって分析すべき試料中
に存在するリステリア(listeria)属細菌を特徴付け得
る請求項6記載の媒質。 - 【請求項18】 発酵基質はD−キシロース、リボー
ス、α−メチル−マンノシド、ラムノース、タガトー
ス、α−メチル−D−グルコシド及びマンニトールより
なる群から選ばれる請求項17記載の媒質。 - 【請求項19】 還元性基質は硝酸塩類から選ばれ、好
ましくは硝酸カリウムである請求項17記載の媒質。 - 【請求項20】 合成酵素基質はα−マンノシダーゼ基
質である請求項17記載の媒質。 - 【請求項21】 請求項6〜20の何れかに記載の媒体
の包袋を含有してなる、単球症リステリア(Listeria m
onocytogenes)を同定する装置。
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