CN102888442B - 胃幽门螺杆菌快速培养、鉴别与药敏的试剂盒及其检查方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于胃幽门螺杆菌检查技术领域，具体公开了一种胃幽门螺杆菌快速培养、鉴别与药敏的试剂盒及其检测方法。该试剂盒包括第一培养管、鉴别试剂装置、以及药敏实验套组。本发明通过Hp培养管实现标本床边接种，省去传统的样本运输、保存等操作环节；还可实现普通恒温箱培养，解除对二氧化碳培养箱的依赖；并且，以颜色变化为Hp生长结果指标，使非专业人员也能准确判读结果；通过促生长剂和生长指示剂结合，缩短培养时间，实现Hp快速培养；本发明通过Hp鉴别试剂，实现Hp快速组合鉴别。本发明通过Hp药敏试验套组，实现Hp药敏性的快速准确测定。综上，通过本发明可快速、准确地检测出胃幽门螺杆菌。

Description

胃幽门螺杆菌快速培养、鉴别与药敏的试剂盒及其检查方法

技术领域

本发明属于胃幽门螺杆菌检查技术领域，具体涉及一种胃幽门螺杆菌快速培养、鉴别与药敏的试剂盒，以及使用该试剂盒检查胃幽门螺杆菌的方法。

背景技术

胃幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，简称Hp)是一种单极、多鞭毛、末端钝圆、螺旋形弯曲的革兰阴性菌，临床感染很普遍。Hp是慢性活动性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤和胃癌的主要致病因素，1994年世界卫生组织/国际癌症研究机构将Hp定为I类致癌原。

根据检测目的可将临床Hp检测分两类：诊断性检测和治疗性检测。“诊断性检测”目的是弄清是否Hp感染；“治疗性检测”实质是药敏试验，目的是弄清用什么药物治疗有效。

一、诊断性检测：

分离培养鉴别检测：以“分离出Hp”为诊断提供直接依据，是评价Hp其他诊断性检测的“金标准”，是治疗性检测(药敏试验)的唯一前提和基础。但样本采送、人员、设备、环境、试剂要求高，需时长。

Hp基因检测(聚合酶链反应技术)：本法以“查到Hp基因”为诊断提供直接依据，快速准确，但人员、设备、环境要求高。

涂片染色检查：染色方法多样，如革兰染色法、银染法、美兰染色法、H-E染色法等，以“看到Hp”为诊断提供直接依据。但操作复杂，对人员、设备要求较高。

尿素酶检测：具体有胃活检组织尿素酶试验、尿素13C/14C呼气试验、胃液尿素氮测定等，可实现非侵袭性检测，简易快速。由于Hp不是尿素酶唯一产生菌，其它细菌(如变形杆菌、克雷伯氏菌、耶尔森氏菌)也可产生，所以“查到尿素酶≠有Hp感染”。

血清Hp抗体检测：Hp抗体为人体受Hp感染刺激的产物，感染后数周才能检出，可维持存在数月至数年，因此，Hp抗体只能视为Hp曾经感染的依据，而不表示体内是否有Hp。

二、治疗性检测-药敏试验

纸片法：根据琼脂平板上药敏纸片周围的抑菌圈大小来计算Hp对药物的敏感性，方法简单，但结果易受培养基组分、琼脂层厚度、菌液涂布均匀度、纸片质量、抑菌圈大小测量方法等多种因素影响；

E-Test法：根据琼脂平板上E-Test试条周围抑菌圈大小直接读取最低抑菌浓度(MIC)，方法简便，较准确，但目前试条主要依赖进口，成本高；

琼脂稀释法：根据同一浓度菌液在不同浓度药物的培养平板上的生长情况判定Hp的MIC，是评价其它Hp药敏试验方法的金标准，但本法操作复杂，工作量极大，不适合临床使用；

肉汤稀释法：根据同一浓度菌液在不同浓度药物的培养液中的生长情况判定Hp的MIC，是评价其它Hp药敏试验方法的金标准，但本法操作复杂，工作量较大，不适合临床使用。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种胃幽门螺杆菌快速培养、鉴别与药敏的试剂盒、以及使用该试剂盒检查胃幽门螺杆菌的方法，使用该试剂盒和方法可快速、准确地检测出胃幽门螺杆菌。

为实现上述发明目的，本发明所采用技术方案如下：

一种胃幽门螺杆菌快速培养、鉴别与药敏的试剂盒，该试剂盒包括：

第一培养管，在所述第一培养管中盛装有：提供Hp生长基本营养的基础液、提高Hp生长速度的促生长剂、指示Hp生长进度的生长指示剂、抑制其他杂菌生长的杂菌抑制剂、吸附不利Hp生长物质的解毒剂、保证液体中含有足量的二氧化碳并降低氧气比例的气体发生剂；

鉴别试剂装置，所述鉴别试剂装置包括鉴别试验微孔板和四个分装有不同鉴别液的滴瓶；所述鉴别微孔板中设置有4个鉴别微孔，每个鉴别微孔内分别吸附上用于触酶、氧化酶、尿素酶、以及碱性磷酸酶检测底物；所述鉴别液包括作为触酶鉴别液的过氧化氢溶液、作为尿素酶鉴别液的酚红液、作为氧化酶鉴别液的α-萘酚溶液、以及作为碱性磷酸酶鉴别液的氯化硝基四氮唑蓝溶液；

药敏试验套组，所述药敏实验套组包括第二培养管、药敏微孔板、标准比浊管、稀释液组成；所述第二培养管与所述第一培养管相同；所述药敏微孔板包括有32个药敏微孔，将该32个药敏微孔以每4孔为一组分为8组，第1组为对照组，另外7组为药物鉴别组，在各个药物鉴别组中分别盛装浓度由小到大呈梯度关系的同一种鉴别药物，所述鉴别药物包括甲硝唑、阿莫西林、呋喃唑酮、克拉霉素、左氧氟沙星、庆大霉素、以及多西环素；所述标准比浊管由氯化钡溶液和硫酸铵溶液混合制成，该混合溶液的浊度为0.5个麦氏浊度；所述稀释液为0.85％浓度的氯化钠和0.1％浓度的牛血清白蛋白的混合溶液。

所述胃幽门螺杆菌快速培养、鉴别与药敏的试剂盒中，所述基础液包括培养基和7％～10％浓度的去纤维蛋白马血，所述培养基为脑心浸液琼脂、哥伦比亚琼脂、胰蛋白胨大豆琼脂、Wilkins-Chalgren琼脂中的任一种。

所述胃幽门螺杆菌快速培养、鉴别与药敏的试剂盒中，所述促生长剂包括主成分和添加成分，所述主成分为脱纤维羊血、脱纤维马血、马血清、以及小牛血清中任一种，所述添加成分为丙酮酸钠、半胱氨酸、亚硫酸钠、异抗坏血酸、以及氯化血红素中的一种或几种；

所述胃幽门螺杆菌快速培养、鉴别与药敏的试剂盒中，所述解毒剂为可溶性淀粉、活性炭、以及环糊精中任一种。

所述胃幽门螺杆菌快速培养、鉴别与药敏的试剂盒中，所述生长指示剂为氯化三苯基四氮唑盐(TTC)、碘硝基四唑紫(INT)、氯化硝基四氮唑蓝(NBT)、四硝基四氮唑蓝(TNBT)、噻唑蓝(MTT)中的任一种。

所述胃幽门螺杆菌快速培养、鉴别与药敏的试剂盒中，所述杂菌抑制剂包括万古霉素、啶酸、二性霉素B、多粘菌素B、以及甲氧苄氨嘧啶(TMP)。

所述胃幽门螺杆菌快速培养、鉴别与药敏的试剂盒中，所述气体发生剂由碳酸盐和酸组成，所述碳酸盐为碳酸钠和碳酸氢钠的一种，所述酸为柠檬酸、乳酸、乙酸、以及盐酸中的一种。

一种使用所述试剂盒检测胃幽门螺杆菌的方法，包括以下步骤：

Hp分离培养：将样本直接投入到第一培养管内盖紧，轻摇以确保样本完全浸入培养液中，放置37℃恒温培养，逐日观察培养液颜色变化，变红表明有细菌生长，不变表明无细菌生长；

快速鉴别：从第一培养管中取有细菌生长的培养物分别滴入各个鉴别微孔中，再加入对应的鉴别液，触酶孔产生气泡、尿素酶孔变红、氧化酶孔变蓝则表明为Hp，否则为其它细菌；

药敏试验：用稀释液将有细菌生长的培养物进行稀释至标准比浊管的浊度水平，再按1∶1000的比例稀释到第二培养管的培养液中，然后按100微升每孔的量加至每个药敏微孔内，并按照1滴每孔的量滴加矿物油后在37℃条件下恒温培养24小时，若微孔变红表明该浓度药物不能抑制Hp生长，不变色则能抑制Hp生长。

本发明的有益效果如下：

1、本发明通过Hp培养管实现标本床边接种，省去传统的样本运输、保存等操作环节；还可实现普通恒温箱培养，解除对二氧化碳培养箱的依赖；并且，以颜色变化为Hp生长结果指标，使非专业人员也能准确判读结果；通过促生长剂和生长指示剂结合，缩短培养时间，实现Hp快速培养；

2、本发明通过Hp鉴别试剂，实现Hp快速组合鉴别。

3、本发明通过Hp药敏试验套组，实现Hp药敏性的快速准确测定。

具体实施方式

下面将结合具体实施方法来详细说明本发明，在本发明的示意性实施及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。

本发明公开了公开了一种胃幽门螺杆菌快速培养、鉴别与药敏的试剂盒，该试剂盒由培养管、鉴别试剂、药敏试验套组组成，具体如下：

1、第一培养管，在所述第一培养管中盛装有：提供Hp生长基本营养的基础液、提高Hp生长速度的促生长剂、指示Hp生长进度的生长指示剂、抑制其他杂菌生长的杂菌抑制剂、吸附不利Hp生长物质的解毒剂、保证液体中含有足量的二氧化碳并降低氧气比例的气体发生剂；

(1)基础液：目的是为Hp生长提供基本营养。可选脑心浸液琼脂、哥伦比亚琼脂、胰蛋白胨大豆琼脂、Wilkins-Chalgren琼脂，比例按产品说明书进行；培养基中需加7％～10％的去纤维蛋白马血。

(2)促生长剂：目的是提高Hp生长速度，缩短培养时间。主成分可选脱纤维羊血、脱纤维马血、马血清、小牛血清中任一种；添加成分可选用丙酮酸钠、半胱氨酸、亚硫酸钠、异抗坏血酸、氯化血红素等成分，可单一或组合添加；

(3)解毒剂：目的是吸附不利Hp生长物质，可选可溶性淀粉、活性炭、环糊精等，用量为0.1～0.5％。

(4)生长指示剂：目的是使Hp浓度很低的情况下，非专业人员也可观察判断，缩短检测时间。可从氯化三苯基四氮唑盐(TTC)、碘硝基四唑紫(INT)、氯化硝基四氮唑蓝(NBT)、四硝基四氮唑蓝(TNBT)、噻唑蓝(MTT)等脱氢酶显色底物中选择；

(5)杂菌抑制剂：目的是抑制污染的杂菌生长但不影响Hp生长。由万古霉素、啶酸、二性霉素B、多粘菌素B、甲氧苄氨嘧啶(TMP)等配伍而成；

(6)气体发生剂：目的是保证液体中含足量的CO2，降低O2比例，从而实现床边接种，摆脱对二氧化碳培养箱的依赖。由碳酸盐和酸组成，碳酸盐可选碳酸钠、碳酸氢钠，酸可选柠檬酸、乳酸、乙酸、盐酸；

2、鉴别试剂装置，所述鉴别试剂装置包括鉴别试验微孔板和四个分装有不同鉴别液的滴瓶；所述鉴别微孔板中设置有4个鉴别微孔，每个鉴别微孔内分别吸附上用于触酶、氧化酶、尿素酶、以及碱性磷酸酶检测底物；所述鉴别液包括作为触酶鉴别液的过氧化氢溶液、作为尿素酶鉴别液的酚红液、作为氧化酶鉴别液的α-萘酚溶液、以及作为碱性磷酸酶鉴别液的氯化硝基四氮唑蓝溶液；

3、药敏试验套组，所述药敏实验套组包括第二培养管、药敏微孔板、标准比浊管、稀释液组成；

所述第二培养管与所述第一培养管相同；

所述药敏微孔板包括有32个药敏微孔，将该32个药敏微孔以每4孔为一组分为8组，第1组为对照组，另外7组为药物鉴别组，在各个药物鉴别组中分别盛装浓度由小到大呈梯度关系的同一种鉴别药物，所述鉴别药物包括甲硝唑、阿莫西林、呋喃唑酮、克拉霉素、左氧氟沙星、庆大霉素、以及多西环素；

所述标准比浊管由氯化钡溶液和硫酸铵溶液混合制成，该混合溶液的浊度为0.5个麦氏浊度；

所述稀释液为0.85％浓度的氯化钠和0.1％浓度的牛血清白蛋白的混合溶液。

一种使用所述试剂盒检测胃幽门螺杆菌的方法，包括以下步骤：

step1、Hp分离培养：将样本直接投入到第一培养管内盖紧，轻摇以确保样本完全浸入培养液中，放置37℃恒温培养，逐日观察培养液颜色变化，变红表明有细菌生长，不变表明无细菌生长；

step 2、快速鉴别：从第一培养管中取有细菌生长的培养物分别滴入各个鉴别微孔中，再加入对应的鉴别液，触酶孔产生气泡、尿素酶孔变红、氧化酶孔变蓝则表明为Hp，否则为其它细菌；

step 3、药敏试验：用稀释液将有细菌生长的培养物进行稀释至标准比浊管的浊度水平，再按1∶1000的比例稀释到第二培养管的培养液中，然后按100微升每孔的量加至每个药敏微孔内，并按照1滴每孔的量滴加矿物油后在37℃条件下恒温培养24小时，若微孔变红表明该浓度药物不能抑制Hp生长，不变色则能抑制Hp生长。

以下举例介绍详细的制备方法：

一、第一培养管的制备

先分别配制各组分，后将各组分混合，3ml/瓶分装到西林瓶内即得。各组分配制方法为：

脑心浸液肉汤：称脑心浸液干粉38g，加蒸馏水850ml，溶解，调节pH7.4±0.2，0.22um孔径的微孔滤膜过滤；

促生长剂：半胱氨酸溶于10ml蒸馏水中，0.22um孔径的微孔滤膜过滤，与100ml小牛血清混合；

生长指示剂：TTC 200mg溶解于10ml蒸馏水中，0.22um孔径的微孔滤膜过滤；

杂菌抑制剂：取万古霉素10mg、二性霉素B5mg、多粘菌素B 25000U、甲氧苄氨嘧啶5mg溶解于10ml蒸馏水中，0.22um孔径的微孔滤膜过滤；

解毒剂：称β环糊精5g溶解于10ml蒸馏水中，0.22um孔径的微孔滤膜过滤；

气体发生剂：1mol/L盐酸5ml，0.22um孔径的微孔滤膜过滤；碳酸氢钠0.42g，5ml双蒸水溶解，孔径为0.22um的微孔滤膜过滤；

二、鉴别试剂的制备

1、制备鉴别微孔板

分别溶解盐酸二甲基对苯二胺、尿素、5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐，5mg/ml；

加至第2、3、4微孔中，10ul/孔，抽干，装到铝箔袋内封口。

2、配制鉴别液

配制3％的过氧化氢溶液作为触酶鉴别液，分装到塑料滴瓶中；

配制0.04％的酚红液作为尿素酶鉴别液，分装到塑料滴瓶中；

配制α-萘酚溶液作为氧化酶鉴别液，分装到塑料滴瓶中；

配制0.03％的NBT液作为碱性磷酸酶鉴别液，分装到塑料滴瓶中；

三、药敏试验套组的制备

1、第二培养管制备同第一培养管；

2、药敏微孔板的制备

确定药物浓度：以国家临床实验室标准化委员会(NCCLS)公布的判定药物耐受MIC值(R)、敏感MIC值(S)为标准，每种药物有4个浓度值(100ul/孔时的终浓度)，分别为2R、R、S、0.5S；

药物稀释：每种药物分别按4个浓度要求稀释；

加入微孔中，快速抽干；

装入铝箔袋封口。

3、标准比浊管的配制

0.048mol/L氯化钡0.5ml，加到99.5ml的0.18mol/L硫酸(1％V/V)溶液中制成。

4、稀释液的配制

称氯化钠8.5g，牛血清白蛋白1g，蒸馏水1000ml溶解，0.22um孔径的微孔滤膜过滤。

综上，本发明通过对试剂盒的设计和使用，解决Hp分离培养、鉴别、药敏试验检测中的以下问题：

样本不易运送、保存问题；

对昂贵设备的依赖问题；

对操作人员的高专业技术要求问题；

检测时间过长问题；

快速组合鉴别问题；

操作简便而准确的药敏试验问题。

以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (1)

1.一种胃幽门螺杆菌快速培养、鉴别与药敏的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括：第一培养管，在所述第一培养管中盛装有：提供Hp生长基本营养的基础液、提高Hp生长速度的促生长剂、指示Hp生长进度的生长指示剂、抑制其他杂菌生长的杂菌抑制剂、吸附不利Hp生长物质的解毒剂、保证液体中含有足量的二氧化碳并降低氧气比例的气体发生剂；鉴别试剂装置，所述鉴别试剂装置包括鉴别试验微孔板和四个分装有不同鉴别液的滴瓶；所述鉴别微孔板中设置有4个鉴别微孔，每个鉴别微孔内分别吸附上用于触酶、氧化酶、尿素酶、以及碱性磷酸酶检测底物；所述鉴别液包括作为触酶鉴别液的过氧化氢溶液、作为尿素酶鉴别液的酚红液、作为氧化酶鉴别液的α-萘酚溶液、以及作为碱性磷酸酶鉴别液的氯化硝基四氮唑蓝溶液；药敏试验套组，所述药敏实验套组包括第二培养管、药敏微孔板、标准比浊管、稀释液组成；所述第二培养管与所述第一培养管相同；所述药敏微孔板包括有32个药敏微孔，将该32个药敏微孔以每4孔为一组分为8组，第1组为对照组，另外7组为药物鉴别组，在各个药物鉴别组中分别盛装浓度由小到大呈梯度关系的同一种鉴别药物，所述鉴别药物包括甲硝唑、阿莫西林、呋喃唑酮、克拉霉素、左氧氟沙星、庆大霉素、以及多西环素；所述标准比浊管由氯化钡溶液和硫酸铵溶液混合制成，该混合溶液的浊度为0.5个麦氏浊度；所述稀释液为0.85％浓度的氯化钠和0.1％浓度的牛血清白蛋白的混合溶液；所述解毒剂为可溶性淀粉、活性炭、以及环糊精中任一种；所述气体发生剂由碳酸盐和酸组成，所述碳酸盐为碳酸钠和碳酸氢钠的一种，所述酸为柠檬酸、乳酸、乙酸、以及盐酸中的一种；

所述促生长剂包括主成分和添加成分，所述主成分为脱纤维羊血、脱纤维马血、马血清、以及小牛血清中任一种，所述添加成分为丙酮酸钠、半胱氨酸、亚硫酸钠、异抗坏血酸、以及氯化血红素中的一种或几种；

所述生长指示剂为氯化三苯基四氮唑盐(TTC)、碘硝基四唑紫(INT)、氯化硝基四氮唑蓝(NBT)、四硝基四氮唑蓝(TNBT)、噻唑蓝(MTT)中的任一种；

所述杂菌抑制剂包括万古霉素、二性霉素B、多粘菌素B、以及甲氧苄氨嘧啶(TMP)。