CN105820975A - 一种口腔幽门螺杆菌培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种口腔幽门螺杆菌(Hp)培养技术，本发明采取新型Hp培养基和人工“氨云”技术。培养基中的营养成分更适合于Hp生长繁殖，造成人工“氨云”的技术；先将唾液经过强酸特殊处理后产生人工“氨云”，这种人工“氨云”，保护在强酸的环境下Hp使它不被强酸损害。同时培养基采用模拟口腔生化环境，用“强酸”去杀灭唾液中其它细菌，让Hp能更好地生长，培养技术中不使用任何抗菌素。

Description

一种口腔幽门螺杆菌培养方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种对口腔螺旋杆菌培养的方法。

背景技术

幽门螺旋杆菌，Helicobacterpylori，简称HP，是慢性活动性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤和胃癌的主要致病因素。1994年世界卫生组织/国际癌症研究机构(WHO/IARC)将幽门螺旋杆菌定为I类致癌原。对于HP的传播途径，多数学者认为是通过消化道进行传播的，很多研究结果表明了HP存在通过口-口传播。本发明认为口腔是HP在人体内除胃部外又一个可能定居场所，即“HP二个定居点”的二点论。定植于口腔中的HP我们称之谓“口腔螺旋杆菌”。口腔定植螺旋杆菌是否存在，是国际医学界有争议的大问题。争议的焦点是口腔中发现的HP，是单纯由于胃液反流造成口腔中出现HP，还是口-口、胃-口传播时在口腔定植的HP。定植的HP分布在牙菌斑或牙周组织(如龈袋)中。再从定植于口腔中的HP源源不断地随唾液吞咽入胃，而在胃内定植。然而“HP二个定居点”的二点论必需在口腔内有幽门螺旋杆培养阳性的事实为依据。这就是本发明的理论价植。

一、口腔幽门螺杆菌培养技术的历史及其难度

1989年加拿大多伦多大学Krajden等(JClinMicrobiol.1989Jun；27(6)：1397-8.)首次报道从胃炎病人牙菌斑中培养出幽门螺杆菌(Hp)，但他们是在71名病人中只发现一人牙斑培养呈阳性结果，而全部71名患者的唾液培养中无1例呈现阳性。此后不少科学家做了口腔Hp(O-Hp)培养，但成功者很少。

目前各国发表的研究报告来看，O-Hp培养阳性率大多很低，尤其是唾液标本的培养阳性率更低。O-Hp培养技术的难度之所以大，不外乎口腔标本的采集、保存，Hp培养的菌落小，口腔中杂菌菌落与Hp菌落之间的竞争剧烈。看来原有常规胃Hp培养技术用于培养O-Hp已达到了极限。如果不从根本上改变O-Hp培养技术方法，O-Hp培养很难取得高阳性率。

二、O-Hp在其它技术领域的进展与O-Hp难以培养之间存在的矛盾

近年来O-Hp的诊断技术进展，从Hp受体的角度(Hp-MUC5B，MUC7)，口腔内Hp抗体的角度，口腔和胃Hp是否同一种细菌的角度(基因团电脑图谱排列法)，血Hp抗体的角度，呼出气体Hp培养等报道都支持口腔中存在Hp定植的观点。更为重要的是经典的Hp根除方案，没有包含清除口腔Hp的措施，Hp治疗的现状及其频繁复发越来越严峻。这些新进展和人们期待冲破老的思维框架和O-Hp培养成功率甚低之间所产生的矛盾尖锐地表现出来。

所以如何提高O-Hp培养阳性率具有重大的现实意义。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中O-Hp培养阳性率低的问题，提供一种口腔螺旋杆菌培养的方法解决一个全新的技术问题，建立口腔螺旋杆菌检测的金标准。该检测方法灵敏度高，特异性强，能有效对口腔螺旋杆菌检测作最终的判定，有助于对口腔和胃幽门螺旋杆菌的治疗和预防。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种口腔螺旋杆菌的培养方法，包括以下步骤：

步骤1：取试管，加500微升的0.4Mol/L的尿素水溶液；

步骤2：加1mL的0.15Mol/L的HCl到步骤1中的试管内，然后再加1mL的唾液到步骤1的试管内，此时尿素的最后浓度是0.08Mol/L，HCl浓度是0.06mol/L，用吸管将试管内溶液混合均匀；

步骤3：将步骤2试管放入孵化器在37℃保持5分钟；

步骤4：取步骤3中溶液0.5ml加4.5ml的PBS溶液混合得混合液；

步骤5：将步骤4中混合液吸取500微升放在培养基和TSA表面上；

步骤6：将步骤5处理后的培养基放在密封的培养瓶中在37℃下培养5-7天，所述培养瓶内放有盛有蒸馏水的开口烧杯提供一定湿度，培养瓶中还包括化学试剂GasPak-EZ以吸收空气中的氧，使培养瓶中空气只含7％氧，当放入培养基后拆开GasPak-EZ包装；

所述0.4Mol/L尿素水溶液的配制方法如下：取0.48g尿素溶于20mL重蒸馏水中即得；

所述0.15Mol/L的HCl配制方法如下：取12mol/L的浓盐酸0.1mL与7.9mL重蒸馏水混合即得；

所述PBS的配制方法如下：10mMNa₂HPO₄、1.7mMKH₂PO₄、2.7mMKCl、137mMNaCl，加重蒸馏水至1000毫升；

所述培养基由人的红细胞、人白蛋白和多种微量矿物质组成。

本发明采用人的红细胞、人白蛋白和多种微量矿物质作为培养基的成分；因为Hp定植在人的口腔中，是依赖它们作为营养原料，有了这些合适的营养原料之后，Hp菌落在培养基中才能取得和其它细菌兢争的有利生存条件；

本发明中的微量矿物质为常规培养方法中的微量矿物质。

幽门螺旋杆所分泌的代谢产物在强酸溶液中在细菌四周产生大量氨的气体将细菌团团包围不让强酸溶液接触到细菌体，本发明中称为人工“氨云”。

采用由本发明制备的新型O-Hp培养基和人工“氨云”技术进行唾液Hp培养，并用氧化酶法、过氧化氢酶测定法、抗原抗体胶体金方法、幽门螺杆菌革兰氏染色法等5种国际通用的方法鉴定培养皿上的细菌菌落，结果如下：

(1)本发明的培养皿上的菌落呈透明无色，无其它细菌生长，见图1。

(2)氧化酶试验，显示蓝色，见图2。

(3)过氧化氢试验，有气泡产生，见图3。

(4)Hp检定卡(胶体金法)测试(Hp菌体蛋白的单克隆抗体和胶体金技术)，显示红色，说明呈阳性，见图4。

(5)革兰氏染色后显微镜观察，见到细菌染色后呈粉红色，说明是革兰氏阴性菌，可以看见螺旋形杆菌，见图5。

现有技术通常是将胃/牙斑、唾液标本运输到指定的Hp培养实验室去作培养，这样就有可能因为运输时间、温度、含氧条件等因素会损失一部分阳性率。我们的步骤设计是在采集标本的当地、当时直接进行Hp培养，不必通过第2手。

传统的Hp培养通常是在培养基中加入抗生素，这在一定程度上可抑制其它细菌的生长，但Hp菌群仍无法与其它细菌兢争，取得良好的生存繁殖权。新型Hp培养基和人工“氨云”技术，是使培养基中的营养成分更适合于Hp生长繁殖，应用人工“氨云”技术是先将唾液经过特殊强酸处理，让人工“氨云”去保护Hp，同时培养基采用模拟胃内的低pH环境，用“强酸”去杀灭唾液中其它细菌，让Hp能更好地生长。

附图说明：

图1：本发明培养的Hp菌落；

图2：本发明培养的Hp菌落氧化酶法试验结果；

图3：本发明培养的Hp菌落过氧化氢酶测定结果；

图4：本发明培养的Hp菌落抗原抗体胶体金方法测定结果；

图5：本发明培养的Hp菌落幽门螺杆菌革兰氏染色法测定结果，1000倍显微镜下观察。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。

实施例1

口腔螺旋杆菌的培养方法：

步骤1：取试管，加500微升的0.4Mol/L的尿素水溶液；

步骤2：加1mL的0.15Mol/L的HCl到步骤1中的试管内，然后再加1mL的唾液到步骤1的试管内，此时尿素的最后浓度是0.08Mol/L，HCl浓度是0.06mol/L，用吸管将试管内溶液混合均匀；

步骤3：将步骤2试管放入孵化器在37℃保持5分钟；

步骤4：取步骤3中溶液0.5ml加4.5ml的PBS溶液混合得混合液；

步骤5：将步骤4中混合液吸取500微升放在培养基和TSA表面上；

步骤6：将步骤5处理后的培养基放在密封的培养瓶中在37℃下培养5-7天，所述培养瓶内放有盛有蒸馏水的开口烧杯提供一定湿度，培养瓶中还包括化学试剂GasPak-EZ以吸收空气中的氧，使培养瓶中空气只含7％氧，当放入培养基后拆开GasPak-EZ包装；

所述培养基由人的红细胞、人白蛋白和多种微量矿物质组成，微量矿物质中包括含铜矿物质。

下列试剂配制方法：

(1)0.4Mol/L尿素水溶液的配制：取0.48g尿素溶于20mL重蒸馏水中即得；

(2)0.15Mol/L的HCl配制：取12mol/L的浓盐酸0.1mL与7.9mL重蒸馏水混合即得；

(3)PBS(磷酸盐水溶液)的配制：10mMNa₂HPO₄、1.7mMKH₂PO₄、2.7mMKCl、137mMNaCl，加重蒸馏水至1000毫升。

本发明中使用的化学试剂GasPak-EZ，它吸收空气中的氧，使培养瓶中空气只含7％氧，因为Hp只在低氧中生存，用时将铝包纸拆开，否则没有效果。

采取以下国际公认的方法鉴定本发明培养的Hp菌落，分别是氧化酶法、过氧化氢酶测定法、抗原抗体胶体金方法、幽门螺杆菌革兰氏染色法。

A.Oxidaseassay

氧化酶法：氧化酶试验能确定细菌内是否存在细胞色素c氧化酶的活性。存在有活性的细胞色素c氧化酶，并作为自己呼吸链的一部分，滴入试剂时会出现深蓝色，证明这细菌是活的，即Hp阳性出现深蓝色。

试验步骤如下：

1.打开BBLDryslide氧化酶袋，取出所需数的量；

2.挑选培养皿中的菌落；

3.将菌落直接涂于测试板的反应区上；

4.在20秒内，观察是否出现深蓝的颜色，深蓝色是阳性，20秒后出现的颜色变化不能作为诊断依据。

B.Catalaseassay

过氧化氢酶测定：大多数含有色素的生物，体内具有过氧化氢酶。可将过氧化氢分解成氧和水。当有少量过氧化氢酶的细菌引入过氧化氢时，即可产生氧，形成气泡，这表明细菌体内存在有活性的过氧化氢酶。

试验步骤如下：

1.加入500微升的蒸馏水到1.5毫升试管内；

2.加入500微升30％双氧水(W/W)到试管内；

3.混合成为15％wt过氧化氢溶液；

4.用塑料取样环挑选培养皿中的菌落，不要使用金属环，因为这往往会导致假阳性反应；

5.将细菌转移到一个干净的、干燥的载玻片上；

6.立即滴入15％wt的过氧化氢溶液在菌落上；

7.20到30秒后可看见气泡形成，气泡形成是阳性反应，存在Hp。

C.抗原抗体胶体金方法：

取幽门螺杆菌的菌落一小块放在抗原抗体胶体金纸的圆心中，5分钟后圆心出现红色是阳性。

D.幽门螺杆菌革兰氏染色法

所需材料：水晶紫、革兰氏碘溶液、脱色剂、番红染色

试验步骤如下：

1)清洁玻璃片上，用油脂铅笔在玻璃片稍微偏离中心区，画一个小的圆圈标志。滴一小滴蒸馏水在这个小圆圈中心，滴水靠近但不要超越油脂铅笔的圆圈标志，圆圈标志中的水滳会逐渐风干；2).用无菌接种环在培养基上取得Hp菌落，将Hp菌落转移到玻璃片上的水滴中心，让菌落轻轻与水滴接触2-3次，直到水变得明显混浊；然后把混浊水溶液均匀涂抹于玻璃片上；3)等候涂片自然风干；4).在玻璃片下放一个酒精灯，玻璃片慢慢通过火焰4-5次；让细菌蛋白质变性，固定在玻璃片上，同时也杀死细菌；5.等候玻璃片冷却，再染色；6)把玻璃片放在水槽上；7)小心将结晶紫溶液倒在玻璃片上；8)等候玻璃片染色1分鈡；9)将染好色的玻璃片在自来水中冲洗一下；10)再用革兰氏碘溶液塗在玻璃片上；11)等候玻璃片染色1分鈡；12)将染好色的玻璃片在自来水中冲洗一下；13)滴加脱色剂到玻璃片上，脱色后，脱色剂的颜色变无色；14)将脱好色的玻璃片在自来水中冲洗一下；15)滴加番红染色剂到玻璃片上；16)等候玻璃片染色1分钟；17)将染好色的玻璃片在自来水中冲洗一下；18)小心用吸水纸吸干每张玻璃片，而不破坏涂片染色；19)用蒸馏水或PBS滴在涂片和显微镜盖片上，这液体会帮助按住玻璃盖片，以进行显微镜观察；20)把涂片和显微镜盖片放在显微镜下；21)先用10X物鏡；22)再调用40x物鏡；23)移动一下显微镜鏡头，滴一小滴油在盖片上；24)调100x油鏡头；25)观察塗片。

紫色是革兰氏阳性细菌菌体，粉红色菌体是革兰阴性细菌，本发明结果为粉红色，即为革兰阴性细菌。

O-Hp培养新技术临床试验研究

(1)受试者选择：胃Hp感染患者(¹³C-UBT阳性)、口腔科患者(HPS阳性)、健康者(无胃病史、¹³C-UBT阴性、HPS阴性)共120例，均经本人同意接受检测。

(2)分组：

A1组27例，男12例，女15例，平均年龄42.7(23～71)岁。同步检测¹³C-UBT、HPS均阳性。

A2组为A1组经抗Hp标准治疗后4周复查，同步检测¹³C-UBT、HPS。

B1组4例，男、女各2例，平均年龄50.5(43～59)岁。同步检测¹³C-UBT阳性，HPS阴性。

B2组为B1经抗Hp标准治疗后4周复查，同步检测¹³C-UBT、HPS。

C1组18例，男8例，女10例，平均年龄45.9(23～69)岁。同步检测¹³C-UBT阴性，HPS阳性。

C2组为C1经抗Hp标准治疗后4周复查，同步检测¹³C-UBT、HPS。D组71例，男29例，女42例，平均年龄48.1(23～71)岁。

各组均采用本发明O-Hp培养新方法同步进行唾液Hp培养。

(3)结果：

A1组27例UBT阳性、HPS阳性者中，唾液Hp培养阳性25例，阴性2例；

A2组UBT阳性3例、HPS阳性26例，唾液Hp培养阳性24例、阴性3例。

B1组4例UBT阳性、HPS阴性者中，唾液Hp培养阳性3例，阴性1例；

B2组UBT阳性1例、HPS阴性4例，唾液Hp培养阳性0例、阴性4例。

C1组18例UBT阴性、HPS阳性者中，唾液Hp培养阳性15例，阴性3例；

C2组UBT阴性18例、HPS阳性17例，唾液Hp培养阳性14例、阴性4例。

D组71例UBT阴性、HPS阴性者中，唾液Hp培养阳性1例，阴性70例。

进一步分析显示：(1)抗Hp治疗前，UBT阳性率为25.83％(31/120)；31例在抗Hp治疗后，UBT转阴27例，根除率为87.10％。(2)HPS阳性率为37.50％(45/120)；45例在抗Hp治疗后，HPS转阴2例，阴转率为4.44％。(3)唾液Hp培养阳性率为35.83％(43/120)；43例在抗Hp治疗后，转阴5例，阴转率为11.63％。(4)以唾液Hp培养为对照(以A1、B1，C1、D共4组计算)，HPS诊断口腔Hp感染的敏感度为90.91％，特异度为93.42％，准确度为92.50％，阳性预测值(阳性符合率)为88.89％，阴性预测值(阴性符合率)为94.67％。

以上结果显示，应用新型O-Hp培养基和人工“氨云”技术，可显著提高唾液Hp培养的阳性率，以唾液Hp培养为对照，HPS诊断口腔Hp感染的效能指标也堪称满意。O-Hp培养新技术还需扩大临床试验，开展对有口腔Hp感染(HPS阳性)而无胃Hp感染(UBT/SAT/RUT阴性)者，以及胃Hp感染合并口腔Hp感染经Hp根除治疗4周后复查，胃内Hp已经根除(UBT/SAT/RUT阴性)，口腔Hp尚未清除(HPS阳性)者，进行唾液Hp培养。在排除Hp的胃食管反流情况下，对他们的唾液采用O-Hp培养新技术进行Hp培养，此项研究结果或可争取最终解决国际医学界至今仍存在重大争议的口腔Hp定植问题。确定Hp可以在口腔中定植，具有重大的临床意义和流行病学意义，它将改变我们对目前Hp感染诊断检测方法和Hp根除治疗方案的认识，为Hp感染诊断、治疗和预防开创全新的局面。

以唾液Hp培养为对照，HPS的敏感度为90.91％，特异度为93.42％，准确度为92.50％，阳性预测值为88.89％，阴性预测值为94.67％。

120例成年志愿者，结论：(1)胃Hp感染率在25％左右，口腔Hp感染率则在37％左右。(2)抗Hp药物治疗胃Hp根除率在87％左右，但口腔Hp阴转率只有10％左右。(3)HPS法与唾液Hp培养法比较，HPS诊断口腔Hp感染的敏感度为90.91％，特异度为93.42％，准确度为92.50％，阳性预测值(阳性符合率)为88.89％，阴性预测值(阴性符合率)为94.67％。(4)口腔存在Hp定植现象。应用新型口腔Hp培养基和人工“氨云”技术，可显著提高唾液Hp培养的阳性率，以唾液Hp培养为对照，HPS诊断口腔Hp感染的效能指标也堪称满意。

尽管已经详细描述了本发明的实施方式，但是应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明的实施方式做出各种改变、替换和变更。

Claims (2)

1.一种口腔幽门螺杆菌培养方法，包括以下步骤：

步骤1：取试管，加500微升的0.4Mol/L的尿素水溶液；

步骤2：加1mL的0.15Mol/L的HCl到步骤1中的试管内，然后再加1mL的唾液到步骤1的试管内，此时尿素的最后浓度是0.08Mol/L，HCl浓度是0.06mol/L，用吸管将试管内溶液混合均匀；

步骤3：将步骤2试管放入孵化器在37℃保持5分钟；

步骤4：取步骤3中溶液0.5ml加4.5ml的PBS溶液混合得混合液；

步骤5：将步骤4中混合液吸取500微升放在培养基和TSA表面上；

步骤6：将步骤5处理后的培养基放在密封的培养瓶中在37℃下培养5-7天，所述培养瓶内放有盛有蒸馏水的开口烧杯提供一定湿度，培养瓶中还包括化学试剂GasPak-EZ以吸收空气中的氧，使培养瓶中空气只含7％氧，当放入培养基后拆开GasPak-EZ包装；

所述0.4Mol/L尿素水溶液的配制方法如下：取0.48g尿素溶于20mL重蒸馏水中即得；

所述0.15Mol/L的HCl配制方法如下：取12mol/L的浓盐酸0.1mL与7.9mL重蒸馏水混合即得；

所述PBS的配制方法如下：10mMNa₂HPO₄、1.7mMKH₂PO₄、2.7mMKCl、137mMNaCl，加重蒸馏水至1000毫升；

所述培养基由人的红细胞、人白蛋白和多种微量矿物质组成。

2.根据权利要求1所述的一种口腔幽门螺杆菌培养方法，其特征在于：所述多种微量矿物质中包括铜的矿物质。