CN106337080A - 一种猪源大肠杆菌致病性试验方法 - Google Patents

一种猪源大肠杆菌致病性试验方法 Download PDF

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董发明
张炳亮
白喜婷
梁立钦
王文文
邱妍
杨国栋
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Abstract

本发明公开了一种猪源大肠杆菌致病性试验方法，属于生物技术领域。该方法包括攻毒菌株的增菌培养、试验动物攻毒与观察、细菌分离鉴定及结果判定三步操作，方法简单，耗时短，成本低，试验结果准确可靠。其中，增菌培养选用LB培养基能有效缩短攻毒菌株的培养时间，采用分光光度法检测菌液浓度灵敏度高；试验动物攻毒采用腹腔注射菌液的方法能快速制备染病模型，注射后6h即可观察到动物的发病和死亡情况；细菌分离鉴定依次采用营养肉汤培养基、麦康凯琼脂培养基和伊红美蓝琼脂培养基选择性培养，生长出的菌落形态清晰，便于挑取分离。

Description

一种猪源大肠杆菌致病性试验方法
技术领域
本发明涉及一种猪源大肠杆菌致病性试验方法，属于生物技术领域。
背景技术
大肠杆菌是一类广泛存在于自然界并能引起人和动物共同感染的人畜共患病病原，依其致病机制可分为3类：共生型、肠内致病型和肠外致病型。大肠杆菌病主要是由病原大肠埃希氏菌引起的一种急性、多形性、肠道型传染病。在兽医临床上，由于病源性大肠杆菌的血清型、免疫状态、生理机能以及染病猪只的日龄等存在差异，常见的猪大肠杆菌病分为3种：3日龄仔猪黄痢、7～10日龄仔猪白痢和30日龄仔猪水肿病。
猪大肠杆菌病在世界各地均有发生，其中仔猪黄、白痢是猪场中最为常见的传染病，发病率和死亡率均居仔猪疫病之首，已给养猪业带来极大的危害和严重的经济损失。目前，大肠杆菌病发生后多采用抗生素类药物进行治疗，但是抗生素类药物的滥用已使得细菌耐药性问题日益突出，特别是多重耐药性问题的出现加剧了这种矛盾。
了解和掌握各地区大肠杆菌病病原菌的致病性，在临床上筛选有效防治药物并给予针对性治疗是防控大肠杆菌病的有利措施。非专利文献《规模化养猪场仔猪黄痢病原菌优势血清型检测及其致病性试验》(山东农业大学学报(自然科学版)，2010,41(4):555-559)公开了一种猪源大肠杆菌致病性试验方法，包括：1)分组：选取2窝3日龄仔猪(母猪未进行大肠杆菌免疫)，每窝保留10头仔猪，每窝仔猪按两头仔猪为一组随机分为Ⅰ～Ⅴ组，Ⅰ～Ⅳ组为优势血清型试验组，Ⅴ组为对照组；2)优势血清型试验菌液制备：分别取4种优势血清型菌株的37℃、18h普通肉汤培养物，用普通肉汤稀释为5×108mL-1备用；3)接种优势血清型试验菌液：Ⅰ～Ⅳ组分别口服4种优势血清型菌液0.3mL，Ⅴ组口服生理盐水0.3mL；每次补入前后母猪乳房、乳头用0.1g/L高锰酸钾溶液消毒，哺乳后母子分开，各组仔猪单独饲养，防止交叉感染；感染后1周内观察病猪精神状态、呼吸、饮食欲、粪便及临床症状，对死亡仔猪进行剖检，记录发病率、致死率等指标。但是该方法操作复杂，工作量大，成本较高但准确性不高。
发明内容
本发明的目的是提供一种猪源大肠杆菌致病性试验方法。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
一种猪源大肠杆菌致病性试验方法，包括以下步骤：
1)攻毒菌株的增菌培养：将猪源大肠杆菌接种于LB培养基中，培养得到菌液；
2)攻毒与观察：取试验动物腹腔注射上述菌液，并观察动物的发病和死亡情况；
3)细菌分离鉴定及结果判定：对发病或死亡动物的病理部位进行细菌的分离鉴定，当与攻毒菌株相同时，判定攻毒菌株为致病性大肠杆菌。
步骤1)中LB培养基的组成为：胰蛋白胨4～6g，酵母浸粉2～3g，氯化钠4～6g，水500mL，pH值6.8～7.2。优选组成为：胰蛋白胨5g，酵母浸粉2.5g，氯化钠5g，水500mL，pH值6.9～7.1。
步骤1)中培养的条件为：温度35～39℃，转速100～150rpm，时间12～24h。优选条件为：温度37℃，转速120rpm。培养至菌液OD625值达0.8～1.0。
步骤2)中试验动物为体重18～22g的雄性小白鼠，菌液的注射剂量为0.2mL/只。注射后6～72h观察小白鼠的发病和死亡情况。
步骤3)中病理部位如心脏、肝、脾等脏器。
步骤3)中细菌的分离鉴定包括以下步骤：
a)细菌分离培养：将采集的样品接种于营养肉汤培养基中，培养后取菌液划线接种于麦康凯琼脂培养基上，观察菌落生长情况，挑取单个或成对的红色菌落接种于伊红美蓝琼脂培养基上，观察菌落生长情况，再挑取单个或成对的紫黑色菌落备用；
营养肉汤培养基的组成为：蛋白胨7～8g，牛肉膏2～2.5g，氯化钠3.5～4g，蒸馏水750mL，pH值7.0～7.4；
麦康凯琼脂培养基的组成为：蛋白胨12～18g，牛胆盐3.5～4g，氯化钠3.5～4g，琼脂10～15g，乳糖7～8g，中性红0.01～0.03g，蒸馏水750mL，pH值7.0～7.4；
伊红美蓝琼脂培养基的组成为：蛋白胨7.5～8.5g，乳糖7～8g，磷酸氢二钾1.2～1.8g，琼脂15～20g，2％伊红水溶液12～18mL，0.5％美蓝水溶液10～15mL，蒸馏水750mL，pH值7.2～7.4；
b)革兰氏染色及镜检；
c)生化鉴定试验。
优选的，步骤a)中营养肉汤培养基的组成为：蛋白胨7.5g，牛肉膏2.3g，氯化钠3.8g，蒸馏水750mL，pH值7.2；麦康凯琼脂培养基的组成为：蛋白胨15g，牛胆盐3.8g，氯化钠3.8g，琼脂12g，乳糖7.5g，中性红0.02g，蒸馏水750mL，pH值7.2；伊红美蓝琼脂培养基的组成为：蛋白胨8g，乳糖7.5g，磷酸氢二钾1.5g，琼脂18g，2％伊红水溶液15mL，0.5％美蓝水溶液12mL，蒸馏水750mL，pH值7.3。
步骤a)中培养的温度为36～38℃，时间15～20h。
步骤b)中革兰氏染色主要包括初染、媒染、脱色、复染四步操作。具体操作为：将挑取的菌落涂片固定，先用草酸铵结晶紫初染，再用碘液媒染，脱色后用复红染液复染。
步骤b)中镜检为：用香柏油覆盖涂菌部位，显微镜下观察染色情况和细菌形态，挑取革兰氏阴性菌待用。
步骤c)中生化鉴定采用细菌微量生化反应管(如肠杆菌科细菌生化编码鉴定管，购自杭州天和微生物试剂有限公司)。具体操作见试剂盒说明书。
步骤3)中判定的指标为培养特性、菌落形态和生化鉴定结果。
本发明的有益效果：
本发明中猪源大肠杆菌致病性试验方法包括攻毒菌株的增菌培养、试验动物攻毒与观察、细菌分离鉴定及结果判定三步操作，该方法操作简单，耗时短，成本低，试验结果准确可靠。其中，增菌培养选用LB培养基能有效缩短攻毒菌株的培养时间，采用分光光度法检测菌液浓度灵敏度高；试验动物攻毒采用腹腔注射菌液的方法能快速制备染病模型，注射后6h即可观察到动物的发病和死亡情况；细菌分离鉴定依次采用营养肉汤培养基、麦康凯琼脂培养基和伊红美蓝琼脂培养基选择性培养，生长出的菌落形态清晰，便于挑取分离。
附图说明
图1为实施例1中菌落形态图；
图2为镜检细菌的形态图。
具体实施方式
下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
实施例1
猪源大肠杆菌致病性试验方法，包括以下步骤：
1)试验动物的准备
从河南省试验动物中心购买雄性小白鼠若干，体重均在20g左右；
2)攻毒菌株的增菌培养
将17株猪源大肠杆菌分别接种于LB培养基中，于温度37℃、转速120rpm下(摇床)培养，至菌液的OD625值达0.9；
LB培养基的组成为：胰蛋白胨5g，酵母浸粉2.5g，氯化钠5g，水500mL，pH值7.0；
3)试验动物攻毒与观察
分别取上述菌液对小白鼠进行腹腔注射，剂量为0.2mL/只，10只/组，每株菌菌液注射一组，共17组，再随机选取2只小白鼠作空白对照，腹腔注射0.2mL无菌LB培养基，注射后观察小白鼠的发病和死亡情况；
注射6h后，试验组小白鼠精神萎靡，行动减少，个别出现颤抖等症状，12～24h内试验组小白鼠全部死亡；
4)细菌分离鉴定及结果判定
对出现急性和慢性死亡小白鼠进行剖检，急性死亡的小白鼠可见脾脏肿大，内脏严重充血并伴有出血现象，慢性死亡的小白鼠可见肠壁变薄，肠粘膜脱落，并有小白鼠出现胸腔积液、心包积液；
分别采集17组死亡小鼠的心脏、肝脏和脾脏，进行细菌的分离鉴定，操作为：
a)细菌分离培养：将采集的均质后样品分别接种到营养肉汤培养基中，于摇床上37℃、150rpm培养18h，培养后用无菌接种棒挑取少量的菌液划线接种于麦康凯琼脂培养基上，于37℃培养箱中培养18h，观察菌落的生长情况，并挑取粉红色、单个或成对的菌落接种于伊红美蓝琼脂培养基上，于37℃培养箱中培养18h，观察菌落的生长情况，挑取紫黑色、单个或成对的菌落备用；
营养肉汤培养基的组成为：蛋白胨7.5g，牛肉膏2.3g，氯化钠3.8g，蒸馏水750mL，pH值7.2；麦康凯琼脂培养基的组成为：蛋白胨15g，牛胆盐3.8g，氯化钠3.8g，琼脂12g，乳糖7.5g，中性红0.02g，蒸馏水750mL，pH值7.2；伊红美蓝琼脂培养基的组成为：蛋白胨8g，乳糖7.5g，磷酸氢二钾1.5g，琼脂18g，2％伊红水溶液15mL，0.5％美蓝水溶液12mL，蒸馏水750mL，pH值7.3；
结果表明：分离培养的菌落均符合大肠杆菌的菌落形态(见图1，图中A为麦康凯培养基上的菌落形态，B为伊红美蓝培养基上得菌落形态)；
b)革兰氏染色及镜检：将挑取的菌落通过火焰进行涂片固定，在玻片上滴加2滴草酸铵结晶紫溶液，染色1min，用自来水冲洗，再滴加2滴碘液，染色1min，用自来水冲洗，并用吸水纸吸干玻片，连续滴加95％乙醇溶液脱色，30s后水洗，用吸水纸吸干玻片，最后滴加2滴复红染液，复染1min，用自来水冲洗；染色后用香柏油覆盖涂菌部位，并将玻片置于显微镜下观察，先用低倍镜找到菌，再换用高倍物镜观察染色情况和细菌形态；
结果表明：细菌均为革兰氏阴性菌，镜检均符合大肠杆菌的细菌形态(见图2)，两端钝圆、单个或成对，微小短杆状；
c)采用肠杆菌科细菌生化编码微量鉴定管(购自杭州天和微生物试剂有限公司)对上述菌株进行鉴定，具体操作为：分别取细菌生化鉴定管用砂轮划痕从鉴定管中间折断，鉴定管两端分别作为空白组和试验组，用无菌棒挑取单个或成对的疑似大肠杆菌菌落接种于鉴定管试验组的一端，使菌落与生化鉴定管中的检测液充分混合均匀，断口处用封口胶密封；将密封好的鉴定管置于37℃培养箱中，培养18h后，观察生化管两端颜色变化，根据编码值检索肠杆菌科细菌生化编码册；
结果表明：分离鉴定的17株菌均符合大肠杆菌的基本生化特性(见下表1)，即葡萄糖反应为产酸产气，葡萄糖、鸟氨酸、硫化氢、靛基质、乳糖等反应结果均呈阳性，赖氨酸、卫矛醇、苯丙氨酸、尿素、枸橼酸盐等反应结果大多呈阴性；
表1生化鉴定结果
注：表中+代表阳性，-代表阴性。
结果判定：结合细菌的培养特性、菌落形态和生化鉴定结果，分离菌株各判定指标均与攻毒菌株相同，判定17株菌为致病性大肠杆菌。
在本发明的其他实施例中，LB培养基、营养肉汤培养基、麦康凯琼脂培养基和伊红美蓝琼脂培养基的组成均可在各组分取值范围内任意调整，培养的温度、时间也可在相应范围内任意调整。

Claims (10)

1.一种猪源大肠杆菌致病性试验方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)攻毒菌株的增菌培养：将猪源大肠杆菌接种于LB培养基中，培养得到菌液；
2)攻毒与观察：取试验动物腹腔注射上述菌液，并观察动物的发病和死亡情况；
3)细菌分离鉴定及结果判定：对发病或死亡动物的病理部位进行细菌的分离鉴定，当与攻毒菌株相同时，判定攻毒菌株为致病性大肠杆菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中LB培养基的组成为：胰蛋白胨4～6g，酵母浸粉2～3g，氯化钠4～6g，水500mL，pH值6.8～7.2。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤1)中培养的条件为：温度35～39℃，转速100～150rpm，时间12～24h。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)中试验动物为体重18～22g的雄性小白鼠，菌液的注射剂量为0.2mL/只。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3)中细菌的分离鉴定包括以下步骤：
a)细菌分离培养：将采集的样品接种于营养肉汤培养基中，培养后取菌液划线接种于麦康凯琼脂培养基上，观察菌落生长情况，挑取单个或成对的红色菌落接种于伊红美蓝琼脂培养基上，观察菌落生长情况，再挑取单个或成对的紫黑色菌落备用；
营养肉汤培养基的组成为：蛋白胨7～8g，牛肉膏2～2.5g，氯化钠3.5～4g，蒸馏水750mL，pH值7.0～7.4；
麦康凯琼脂培养基的组成为：蛋白胨12～18g，牛胆盐3.5～4g，氯化钠3.5～4g，琼脂10～15g，乳糖7～8g，中性红0.01～0.03g，蒸馏水750mL，pH值7.0～7.4；
伊红美蓝琼脂培养基的组成为：蛋白胨7.5～8.5g，乳糖7～8g，磷酸氢二钾1.2～1.8g，琼脂15～20g，2％伊红水溶液12～18mL，0.5％美蓝水溶液10～15mL，蒸馏水750mL，pH值7.2～7.4；
b)革兰氏染色及镜检；
c)生化鉴定试验。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤a)中营养肉汤培养基的组成为：蛋白胨7.5g，牛肉膏2.3g，氯化钠3.8g，蒸馏水750mL，pH值7.2；麦康凯琼脂培养基的组成为：蛋白胨15g，牛胆盐3.8g，氯化钠3.8g，琼脂12g，乳糖7.5g，中性红0.02g，蒸馏水750mL，pH值7.2；伊红美蓝琼脂培养基的组成为：蛋白胨8g，乳糖7.5g，磷酸氢二钾1.5g，琼脂18g，2％伊红水溶液15mL，0.5％美蓝水溶液12mL，蒸馏水750mL，pH值7.3。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：步骤a)中培养的温度为36～38℃，时间15～20h。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤b)中革兰氏染色的操作为：将挑取的菌落涂片固定，先用草酸铵结晶紫初染，再用碘液媒染，脱色后用复红染液复染。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤b)中镜检为：用香柏油覆盖涂菌部位，显微镜下观察染色情况和细菌形态。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3)中判定的指标为培养特性、菌落形态和生化鉴定结果。
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