KR20110132388A - 데옥시리보뉴클레아제 활성을 검출하기 위한 방법 및 용품 - Google Patents

Abstract

본 발명은 DNase 활성의 별개의 공급원을 검출하는 데 유용한 용품 및 방법을 제공한다. DNase-생성 미생물이 검출될 수 있다. 기구는 미생물 군 또는 종의 구별을 위한 선발제 및/또는 지시제를 추가로 포함할 수 있다. 사용 방법은 DNase-생성 미생물의 검출 또는 계수를 포함한다.

Description

데옥시리보뉴클레아제 활성을 검출하기 위한 방법 및 용품{METHODS AND ARTICLES FOR DETECTING DEOXYRIBONUCLEASE ACTIVITY}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 본 명세서에 참고로 포함된, 2009년 2월 26일자로 출원된 미국 가특허 출원 제61/155,666호의 이득을 주장한다.

DNA 뉴클레아제(DNase)는 생물 세포에서 편재적이며, 예를 들어 DNA 복제 및 복구를 비롯한 다수의 세포 기능에 연루되어 있다. 소정의 미생물(예를 들어, 브라나멜라 카타랄리스(Branhamella catarrhalis), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 스트렙토코커스 파이오게네스(Streptococcus pyogenes), 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis), 비브리오 알기노라이티쿠스(Vibrio alginolyticus), 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 푸사리움 솔라니(Fusarium solani))은 세포에서 배출되는 DNase를 생성한다.

DNA 뉴클레아제(DNase)는 다양한 연구 및 진단 응용에서 사용된다. DNase 활성 분석법이 이 효소의 모니터링을 위하여 개발되었다. 연구 응용에서, 빈번하게는 DNase 분석법에서는 방사성 동위원소 표지된 DNA 기질이 이용되며, 효소 활성의 정량화 전에 미반응 기질로부터의 반응 생성물의 분리를 필요로 한다. 톨룬(Tolun) 및 마이어스(Myers)는 DNA 염료 리간드의 시차 형광 출력을 기반으로 한 연속 DNase 분석법을 개발하였다(문헌[Nuc. Acid Res. 31:e111, 2003]). 이들의 분석법은 DNase 활성의 검출을 위하여 형광광도계를 필요로 한다.

DNA 뉴클레아제는 이 효소를 세포 또는 세포 콜로니 주위의 환경 내로 배출하는 스타필로코커스 아우레우스와 같은 미생물의 검출에 사용되어 왔다. 영양소, 한천, 및 DNA(전형적으로, 고분자량 DNA 또는 큰 올리고뉴클레오티드)와 100 ㎍/㎖의 톨루이딘 블루 O 또는 50 ㎍/㎖의 메틸 그린을 포함하는 지시 시스템을 포함하는 배양 배지가 에스. 아우레우스의 검출 방법에서 사용되어 왔다. 이 배양 방법은 전형적으로 한천 준비를 위하여 힘든 절차를 필요로 하는데, 상기 한천은 일단 준비되면 상대적으로 짧은 시간 내에 사용되어야 한다.

DNase 활성을 검출하는 그리고 DNase 효소를 생성하는 미생물을 검출하는 간단하고 저렴한 방법 및 안정한 용품에 대한 필요성이 존재한다.

정교한 기술 및/또는 고가의 장비를 필요로 하는, DNase 활성을 검출하는 현재의 일반적인 방법을 고려하여, 본 발명은 저비용 이미징 시스템을 이용하여 실시될 수 있는 간단한 방법을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 DNase 활성의 정량적 또는 반정량적 측정을 제공한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 미생물의 정량적 또는 반정량적 측정을 제공한다.

부가적으로, 본 발명은 DNase-생성 미생물의 검출을 위한 간단하고 저렴한 용품 및 방법을 포함한다. 본 발명자는 당업계에서 전형적으로 사용되는 메틸 그린의 농도에서 몇몇 DNase-생성 미생물의 성장이 유의하게 억제될 수 있음을 관찰하였다. 본 발명자는 놀랍게도 저농도의 메틸 그린을 이용하여 DNase-생성 미생물을 검출하는 방법을 발견하였다. 더욱 낮은 농도의 염료는 더욱 우수한 성장 및/또는 환경 또는 대사 스트레스로부터의 회복을 가능케 하며, 따라서 DNase-생성 미생물의 더욱 빠른 검출을 가능케 한다. 부가적으로, 이미징 시스템을 사용함으로써, 그리고 이미지의 수집, 분석 및/또는 디스플레이에 사용되는 광의 파장을 바이어스시킴으로써 본 발명의 방법은 DNase 활성의 더욱 간단하고, 더욱 용이하며, 더욱 일관된 측정을 제공한다.

따라서, 일 태양에서, 본 발명은 미생물의 검출 방법을 제공한다. 본 방법은 건조 조성물 및 미생물을 함유할 것으로 의심되는 샘플을 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 건조 조성물은 냉수-용해성 겔화제와, 메틸 그린 및 DNA를 포함하는 DNase 지시 시스템을 함유할 수 있다. 본 방법은 샘플을 포함하는 소정 부피의 수성 액체를 건조 조성물과 접촉시켜 하이드로겔을 형성하는 단계, 재수화 하이드로겔을 소정 기간 동안 인큐베이션하는 단계 및 미생물을 검출하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

일부 실시 형태에서, 건조 조성물은 영양소, 선발제(selective agent) 또는 지시제를 추가로 함유할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 방법은 영양소, 선발제, 지시제, 또는 전술한 것 중 2가지 이상의 임의의 조합을 제공하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서, 샘플을 포함하는 수성 액체는 영양소, 선발제, 지시제 또는 전술한 것 중 2가지 이상의 임의의 조합을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 선발제는 항생제를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항생제는 세팔로틴, 세파졸린, 세프라딘, 세팔렉신, 세파드록실, 세파만돌, 세폭시틴, 세파클로르, 세푸록심, 세푸록심 악세틸, 로라카르베프, 세포니시드 세포테탄, 세포라니드, 세포탁심, 세프포독심 프록세틸, 세프티족심, 세픽스메세프트리악손, 세포페라존, 세프타지딤, 목슬락탐, 세피핌, 세프피롬 및 옥사실린으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 실시 형태에서, 본 방법은 이미징 시스템을 제공하는 단계 및 이미징 시스템을 이용하여 하이드로겔의 이미지를 획득하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이들 실시 형태에서, 미생물의 검출은 하이드로겔의 이미지를 (예를 들어 컴퓨터 모니터 상에) 디스플레이하는 것, 인쇄하는 것 또는 분석하는 것을 포함할 수 있다.

일부 실시 형태에서, 본 방법은 하나 이상의 유형의 미생물을 계수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

다른 태양에서, 본 발명은 데옥시리보뉴클레아제 활성을 검출하는 방법을 제공한다. 본 방법은 메틸 그린 및 DNA를 포함하는 DNase 지시 시스템을 포함하는 하이드로겔과, 데옥시리보뉴클레아제 활성의 별개의 공급원을 포함할 것으로 의심되는 샘플을 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 메틸 그린은 하이드로겔 중에 약 5 ㎍/㎖ 이상, 49 ㎍/㎖ 이하일 수 있다. 본 방법은 소정의 시간 동안 샘플과 하이드로겔을 접촉시키는 단계, 및 데옥시리보뉴클레아제 활성을 검출하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

다른 태양에서, 본 발명은 데옥시리보뉴클레아제 활성을 검출하는 방법을 제공한다. 본 방법은 메틸 그린 및 DNA를 포함하는 DNase 지시 시스템을 포함하는 하이드로겔과, 데옥시리보뉴클레아제 활성의 별개의 공급원을 포함할 것으로 의심되는 샘플과, 이미징 시스템을 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 본 방법은 소정의 시간 동안 샘플과 하이드로겔을 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본 방법은 이미징 시스템을 이용하여 하이드로겔의 이미지를 획득하는 단계 및 데옥시리보뉴클레아제 활성의 별개의 공급원을 검출하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서, 데옥시리보뉴클레아제 활성의 검출은 하이드로겔의 이미지를 디스플레이하는 것, 인쇄하는 것 또는 분석하는 것을 포함한다.

상기 실시 형태들 중 임의의 것에서, 하이드로겔은 영양소, 선발제, 항생제 및/또는 지시제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 실시 형태들 중 임의의 것에서, 본 방법은 영양소, 선발제, 지시제, 또는 전술한 것 중 2가지 이상의 임의의 조합을 제공하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서, 소정의 시간 동안의 접촉은 샘플 및 하이드로겔을 영양소, 선발제, 지시제 또는 전술한 것 중 2가지 이상의 임의의 조합과 접촉시키는 것을 포함한다. 상기 실시 형태들 중 임의의 것에서, 선발제는 항생제를 포함할 수 있다. 상기 실시 형태들 중 임의의 것에서, 항생제는 세팔로틴, 세파졸린, 세프라딘, 세팔렉신, 세파드록실, 세파만돌, 세폭시틴, 세파클로르, 세푸록심, 세푸록심 악세틸, 로라카르베프, 세포니시드 세포테탄, 세포라니드, 세포탁심, 세프포독심 프록세틸, 세프티족심, 세픽스메세프트리악손, 세포페라존, 세프타지딤, 목슬락탐, 세피핌, 세프피롬 및 옥사실린으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

이미징 시스템을 포함하는 상기 실시 형태들 중 임의의 것에서, 이미징 시스템은 조사원을 포함할 수 있으며, 하이드로겔의 이미지를 획득하는 단계는 하이드로겔을 조사하는 것을 포함할 수 있다. 이미징 시스템을 포함하는 상기 실시 형태들 중 임의의 것에서, 하이드로겔의 조사는 제한된 밴드의 가시 파장을 이용하여 하이드로겔을 조사하는 것을 포함할 수 있다. 이미징 시스템을 포함하는 상기 실시 형태들 중 임의의 것에서, 하이드로겔은 약 625 ㎚ 내지 약 740 ㎚의 범위의 파장으로부터 선택되는 가시 파장으로 조사될 수 있다. 이미징 시스템을 포함하는 상기 실시 형태들 중 임의의 것에서, 용품의 이미지를 획득하는 것은 하이드로겔의 조사를 위하여 또는 이미지의 수집을 위하여 바이어스 필터를 사용하는 것을 포함할 수 있다. 이미징 시스템을 포함하는 상기 실시 형태들 중 임의의 것에서, 이미지의 분석은 선택된 파장의 이미지를 분석하는 것을 포함할 수 있다.

다른 태양에서, 본 발명은 검출용품을 제공한다. 검출용품은 상부 및 하부 표면을 갖는 자기 지지형 방수 기재를 포함하는 몸체 부재를 포함할 수 있다. 냉수-용해성 겔화제 및 DNase 지시 시스템을 포함하는 건조 코팅이 몸체 부재의 적어도 하나의 표면의 일부분 상에 균일하게 부착될 수 있다. DNase 지시 시스템은 DNA 및 메틸 그린을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 소정의 부피의 액체와의 접촉 후, 겔화제는 하이드로겔을 형성할 수 있으며, 이때 하이드로겔 중 메틸 그린의 농도는 적어도 약 5 ㎍/㎖ 내지 약 100 ㎍/㎖이다.

일부 실시 형태에서, 코팅은 영양 배지, 지시제, 선발제 또는 전술한 것 중 임의의 2가지 이상의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 선발제는 스타필로코커스 아우레우스의 성장에 대하여 선발할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 선발제는 항생제를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항생제는 세팔로틴, 세파졸린, 세프라딘, 세팔렉신, 세파드록실, 세파만돌, 세폭시틴, 세파클로르, 세푸록심, 세푸록심 악세틸, 로라카르베프, 세포니시드 세포테탄, 세포라니드, 세포탁심, 세프포독심 프록세틸, 세프티족심, 세픽스메세프트리악손, 세포페라존, 세프타지딤, 목슬락탐, 세피핌, 세프피롬 및 옥사실린으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

다른 태양에서, 본 발명은 키트를 제공한다. 본 키트는 냉수-용해성 겔화제, DNA 및 메틸 그린을 포함하는 건조 코팅을 포함하는 검출용품을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 검출용품은 영양소, 지시제, 선발제 또는 전술한 것 중 임의의 2가지 이상의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 키트는 항생제를 추가로 포함할 수 있다.

단어 "바람직한" 및 "바람직하게는"은 소정의 환경 하에서 소정의 이득을 제공할 수 있는 본 발명의 실시 형태를 말한다. 그러나, 동일한 또는 다른 상황 하에서 다른 실시 형태가 또한 바람직할 수 있다. 또한, 하나 이상의 바람직한 실시 형태의 설명은 다른 실시 형태가 유용하지 않다는 것을 의미하지 않으며, 본 발명의 범주로부터 다른 실시 형태를 배제하고자 하는 것은 아니다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 단수형("a", "an", "the"), "적어도 하나", 및 "하나 이상"은 서로 바꾸어서 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어 "미생물"을 함유할 것으로 의심되는 샘플은 당해 액체가 "하나 이상의" 미생물을 포함할 수 있음을 의미하는 것으로 해석될 수 있다.

"및/또는"이라는 용어는 열거된 요소 중 하나 또는 전부, 또는 열거된 요소의 임의의 둘 이상의 조합을 의미한다.

또한, 본 명세서에서 종점(endpoint)에 의한 수치 범위의 설명은 그 범위 이내에 포함된 모든 수를 포함한다(예를 들어, 1 내지 5는 1, 1.5, 2, 2.75, 3, 3.80, 4, 5 등을 포함함).

상기 발명의 내용은 본 발명의 각각의 개시된 실시 형태 또는 모든 구현예를 설명하도록 의도된 것은 아니다. 이하의 기재는 더 구체적으로 예시적인 실시 형태를 예시한다. 본 출원 전체에 걸쳐 여러 곳에서, 예들의 목록을 통하여 지침이 제공되며, 상기 예들은 다양한 조합으로 사용될 수 있다. 각각의 경우에, 열거된 목록은 단지 대표적인 그룹으로서의 역할을 하며, 배타적인 목록으로 해석되어서는 안 된다.

아래에 열거된 도면을 참조하여 본 발명이 추가로 설명될 것이며, 유사한 구성은 여러 도면에 걸쳐 유사한 도면 부호로 참조된다.
<도 1>
도 1은 스페이서를 포함하는 박막 배양 기구의 일 실시 형태의, 일 부분이 단면인 상부 사시도.
<도 2>
도 2는 격자 패턴을 포함하는 자기 지지형 기재의 일 실시 형태의 평면도.
<도 3>
도 3은 박막 배양 기구의 일 실시 형태의, 일 부분이 단면인 상부 사시도.
<도 4>
도 4는 스페이서를 포함하는 박막 배양 기구의 일 실시 형태의, 일 부분이 단면인 상부 사시도.
<도 5>
도 5는 본 발명에 따른 스페이서를 포함하는 검출용품의 일 실시 형태의 부분적으로 분해된 상부 사시도.
<도 6>
도 6은 본 발명에 따른 검출 시스템의 일 실시 형태의 블록 다이어그램.
<도 7a>
도 7a는 라인 A로 나타낸 관심있는 선택된 영역을 갖는, 녹색광-방출 다이오드로 조사한 페트리필름(PETRIFILM) 플레이트의 흑백 이미지의 도면.
<도 7b>
도 7b는 도 7a의 라인 A 상에 위치하는 픽셀에 대한 픽셀 강도 데이터의 그래프.
<도 8a>
도 8a는 라인 A로 나타낸 관심있는 선택된 영역을 갖는, 적색광-방출 다이오드로 조사한 페트리필름 플레이트의 흑백 이미지의 도면.
<도 8b>
도 8b는 도 8a의 라인 A 상에 위치하는 픽셀에 대한 픽셀 강도 데이터의 그래프.

본 발명의 임의의 실시 형태를 상세히 설명하기 전에, 본 발명은 그의 응용에 있어서 하기의 설명에 개시된 또는 첨부된 도면에 예시된 구성요소들의 구성 및 배열의 상세 사항에 한정되지 않음을 이해해야 한다. 본 발명은 다른 실시 형태가 가능할 수 있으며, 다양한 방법으로 실시되거나 수행될 수 있다. 또한, 본 명세서에 사용되는 어법 및 용어법은 설명을 목적으로 하는 것으로서, 제한적인 것으로 간주되어서는 안 됨을 이해해야 한다. 본 명세서에서 "포함하는", "함유하는", "함유하고 있는" 또는 "갖는", 및 이들의 변형의 사용은 이후에 열거된 항목 및 그의 등가물과, 추가의 항목을 포함하고자 한다. 달리 명시되거나 제한되지 않으면, "지지된" 및 "커플링된 "이라는 용어 및 그 변형이 널리 사용되며, 직접과 간접 둘 모두의 지지 및 커플링을 포괄한다. 다른 실시 형태가 이용될 수 있으며, 구조적 또는 논리적 변화가 본 발명의 범주로부터 벗어남이 없이 이루어질 수 있음을 이해하여야 한다. 더욱이, "전방", "후방", "상부", "기저부" 등과 같은 용어는, 단지 요소들이 서로 관련될 때 요소들을 설명하기 위해 사용되지만, 결코 장치의 특정 배향을 말하거나, 필요한 또는 요구되는 장치의 배향을 암시 또는 나타내거나, 본 명세서에 설명된 본 발명이 사용 중에 어떻게 사용, 장착, 디스플레이 또는 배치될 것인지를 명시함을 의미하지 않는다.

일반적으로 본 발명은 샘플 중 미생물의 검출 및 구별을 위한 방법 및 용품에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 DNase-생성 미생물의 검출 및 구별에 관한 것이다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 방법 및 용품은 서모뉴클레아제(thermonuclease; TNase)로 공지된 열안정성 DNase를 생성하는 미생물의 검출에 사용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, DNase-생성 미생물의 검출은 샘플 중 DNase-생성 미생물의 계수를 포함한다. 적합한 샘플은 다양한 공급원으로부터 얻어지거나 그로부터 유래될 수 있다.

용어 "공급원"은 일반적으로 미생물에 대하여 검사하기를 원하는 식품 또는 비식품을 말하기 위하여 사용된다. 공급원은 고형물, 액체, 반고형물, 젤라틴성 물질 및 그의 조합일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 공급원은 예를 들어 관심있는 표면으로부터 또는 공기로부터 공급원을 수집하기 위하여 사용된 포착 요소에 의해 제공될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 액체 조성물은 포착 요소를 포함할 수 있으며, 상기 포착 요소는 관심있는 임의의 미생물 및 공급원의 회수를 향상시키기 위하여 (예를 들어, 교반 또는 용해 과정 동안) 추가로 파쇄될 수 있다. 관심있는 표면은 (문을 포함하는) 벽, 바닥, 천장, 배수구, 냉동 시스템, 덕트(예를 들어, 통풍관), 통기구, 변좌, 핸들, 문 손잡이, 핸드레일(handrail), (예를 들어 병원에서의) 베드레일(bedrail), 조리대, 테이블 표면(tabletop), 식사 표면(eating surface)(예를 들어, 트레이, 접시 등), 작업 표면, 장비 표면, 의류 등, 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 표면의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 상기 공급원 전부 또는 일부분이 본 방법에서 사용될 수 있다. 공급원의 일부분이 사용될 때, 때로 이것은 공급원의 "샘플"로 지칭될 수 있다. 그러나, 용어 "샘플"은 일반적으로 본 명세서에서 상기 공급원으로부터 얻어지며 미생물의 검출을 위한 배양 플레이트 기구 내로 도입되는 부피 또는 질량의 물질의 부분을 말하기 위하여 사용된다.

일반적으로 용어 "식품"은 고형물, 액체(예를 들어, 용액, 분산물, 유화물, 현탁물 등 및 그의 조합을 포함하지만, 이에 한정되지 않음) 및/또는 반고형 식용 조성물을 말하기 위하여 사용된다. 식품의 예에는 육류, 가금류, 난류, 생선, 해산물, 야채류, 과일류, 조리 식품(예를 들어, 수프, 소스, 페이스트), 곡물 제품(예를 들어, 곡분, 시리얼, 빵), 통조림, 밀크, 기타 유제품(예를 들어, 치즈, 요구르트, 사워 크림(sour cream)), 지방, 오일, 디저트, 양념류, 향신료, 파스타, 음료, 물, 동물 사료, 기타 적합한 식용 물질 및 그의 조합을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

일반적으로 용어 "비식품"은 "식품"의 정의 내에 들지 않으며 일반적으로 식용으로 간주되지 않는 관심있는 공급원을 말하기 위하여 사용된다. 비식품 공급원의 예에는 임상 샘플, 세포 분해물, 전혈 또는 그의 일부(예를 들어, 혈청), 기타 체액 또는 체분비물(예를 들어, 타액, 땀, 피지, 소변), 대변, 세포, 조직, 기관, 생검체, 식물 물질, 비음용수, 목재, 흙, 퇴적물, 약, 화장품, 건강 보조 식품(dietary supplement)(예를 들어, 인삼 캡슐), 의약품, 감염 매개물, 기타 적합한 비-식용 물질 및 그의 조합이 포함될 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.

"샘플 획득 기구"는 본 명세서에서 가장 넓은 의미로 사용되며, 액체, 반고형물, 또는 고형 샘플 물질을 수집하기 위하여 사용되는 도구를 말한다. 샘플 획득 기구의 비제한적인 예에는 면봉, 와이프(wipe), 스펀지, 스쿠프(scoop), 스패튤라, 압설자, 필터, 피펫, 피펫 팁 및 사이펀 호스가 포함된다.

용어 "감염 매개물"은 일반적으로 전염성 유기체를 운반하고/하거나 그를 옮길 수 있는 무생물 물체 또는 기재를 말하기 위하여 사용된다. 감염 매개물은 천, 몹 헤드(mop head), 수건, 스펀지, 와이프, 식기, 동전, 지폐, 핸드폰, (신발류를 포함하는) 의류, 문 손잡이, 여성용 제품, 기저귀 등, 이들의 일부, 및 이들의 조합을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.

일반적으로 용어 "미생물"은 배양 배지에서 성장 및 번식할 수 있는 임의의 원핵 또는 진핵 미세 유기체를 말하기 위하여 사용되며, 이는 한정됨이 없이 박테리아(예를 들어, 운동성 또는 영양형, 그람(Gram) 양성 또는 그람 음성), 박테리아 포자 또는 내생포자, 진균류(예를 들어, 효모, 사상 진균류, 진균류 포자) 중 하나 이상을 포함한다. 몇몇 경우, 특히 관심있는 미생물은 병원성인 것이며, 용어 "병원체"는 임의의 병원성 미생물을 말하기 위하여 사용된다. 병원체의 예에는 장내세균과(Enterobacteriaceae)의 구성원 또는 소구균과(Micrococcaceae)의 구성원, 또는 스타필로코커스 spp. 속, 스트렙토코커스 spp. 속, 슈도모나스(Pseudomonas) spp. 속, 엔테로코커스(Enterococcus) spp. 속, 살모넬라(Salmonella) spp. 속, 레지오넬라(Legionella) spp. 속, 시겔라(Shigella) spp. 속, 예르시니아(Yersinia) spp. 속, 엔테로박터(Enterobacter) spp. 속, 에스케리키아(Escherichia) spp. 속, 바실러스 spp. 속, 리스테리아(Listeria) spp. 속, 캄필로박터(Campylobacter) spp. 속, 아시네토박터(Acinetobacter) spp. 속, 비브리오 spp. 속, 클로스트리듐(Clostridium) spp. 속, 및 코리네박테리아(Corynebacteria) spp. 속의 구성원이 포함될 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 병원체의 특정 예에는 장출혈성 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 예를 들어, 혈청형 O157:H7을 포함하는 이. 콜라이, 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 브라나멜라 카타랄리스(Branhamella catarrhalis), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 타이피뮤륨(Salmonella typhimurium), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리듐 페르프린겐스(Clostridium perfringens), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 메티실린-내성 스타필로코커스 아우레우스, 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus), 클로스트리듐 디피실레(Clostridium difficile), 반코마이신-내성 엔테로코커스, 스트렙토코커스 파이오게네스(Streptococcus pyogenes), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens) 및 엔테로박터 사카자키이(Enterobacter sakazakii)가 포함될 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 미생물의 성장에 영향을 줄 수 있는 환경 인자는 영양소, pH, 수분 함량, 산화-환원 전위, 항미생물 화합물, 온도, 대기중 가스 조성 및 생물학적 구조 또는 장벽의 존재 또는 부재를 포함할 수 있다.

DNase 지시 시스템

본 발명의 용품 및 방법은 DNase 지시 시스템을 포함한다. DNase 지시 시스템은 DNA 및 메틸 그린을 포함한다. 선택적으로, 지시 시스템은 λ-카라기난과 같은 바인더 및/또는 완충제를 추가로 포함할 수 있다. 사용에 있어서, DNase 지시 시스템은 겔화제, 예를 들어 한천 또는 냉수-용해성 겔화제(예를 들어, 구아 검, 잔탄 검, 로커스트 빈 검(locust bean gum) 및 그의 조합)와 혼합된다. 일부 실시 형태에서, 겔화제와 혼합된 DNase 지시 시스템은 기재 상에 코팅되며, 이는 본 명세서에 기재된 바와 같다.

메틸 그린은 DNA 분자와 안정한 복합체를 형성한다. 메틸 그린과 복합체를 형성하는 DNA가 (예를 들어, 효소적 가수분해에 의해) 탈중합될 때, 메틸 그린은 무색으로 된다. 문헌[Smith et al., 1969. Appl. Microbiol. 18:991]에는 DNase-생성 박테리아가 DNA 및 메틸 그린을 함유하는 미생물 배지에서 검출될 수 있음이 입증되어 있다.

전형적으로 지시 시스템 중 DNA는 쉽게 구매가능하며 (예를 들어, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)로부터 입수가능한 연어 정자 DNA), 메틸 그린과 녹색 복합체를 형성할 수 있기에 충분한 분자량의 임의의 DNA일 수 있다. 메틸 그린의 염 형태(예를 들어, 메틸 그린 염화아연염)가 지시 시스템에서 사용될 수 있으며, 예를 들어 시그마-알드리치(미국 미주리주 세인트 루이스 소재)로부터 획득될 수 있다.

배양 기구:

본 발명은 DNase 활성 검출을 위한 용품을 포함한다. 본 검출용품은 미생물의 성장 및 검출을 위한 배양 기구를 포함한다. 본 발명의 배양 기구는 예를 들어 박막 배양 플레이트 기구를 포함한다. 박막 배양 플레이트 기구는 전형적으로 전통적인 한천 페트리 디쉬(petri dish)보다 더 콤팩트하며, 전형적으로 건조, 재수화성 배양 배지를 포함하여 소정의 미생물의 성장을 지지한다. 박막 배양 플레이트 기구의 비제한적 예에는 각각이 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제4,565,783호; 미국 특허 제5,089,413호 및 미국 특허 제5,681,712호에 개시된 코팅-기재 기구가 포함된다.

도 1에는 본 발명에 따른 박막 배양 기구의 일 실시 형태가 도시되어 있다. 배양 기구(110)는 상부 표면 및 하부 표면(112a, 112b)을 갖는 자기 지지형 방수 기재(112)를 포함하는 몸체 부재를 포함한다. 기재(112)는 상대적으로 강성인 필름(예를 들어, 폴리에스테르, 폴리프로필렌 또는 폴리스티렌)일 수 있으며, 상기 필름은 물을 흡수하지 않거나 달리 물에 의해 영향을 받지 않을 것이다. 기재(112)는 박테리아 콜로니를 기재를 통하여 관찰하기를 원하는지에 따라 투명하거나 불투명할 수 있다. 도 2에 도시된 바와 같이 박테리아 콜로니의 카운팅을 용이하게 하기 위하여 기재(212) 위에 격자 패턴(예를 들어, 정사각형)이 인쇄될 수 있다.

도 1을 참조하면, 기재(112)는 그의 상부 표면(112a)이 접착제(114) 층으로 코팅될 수 있으며, 상기 접착제층은 용이한 수화를 위하여 건조 겔화제, DNase 지시 시스템 및/또는 영양소를 균일한 단층으로 유지하는 역할을 한다. 접착제(114)는 바람직하게는 분말형 겔화제 및/또는 영양소의 입자의 직경보다 작은 두께로 기재(112) 상에 코팅되어야 한다. 그 목적은 상기 입자를 기재에 부착시키기에 충분하지만 입자를 접착제 중에 완전히 매립되게 할만큼 많은 것은 아닌 접착제를 도포하는 것이다. 냉수-용해성 분말(116)의 균일한 단층이 수화를 위해 노출되는 충분한 표면 영역에서 요망된다. 커버 시트(122) 상의 선택적 접착제(114') 및 냉수-용해성 분말(116') 층이 도 1에 또한 도시되어 있다. 수성 용액(예를 들어, 샘플 및/또는 수성 현탁 매질, 예컨대 물 또는 완충제)으로 수화될 때, 겔화제는 하이드로겔을 형성한다.

일부 실시 형태에서, 접착제(114)는 수성 접착제 조성물을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 수성 접착제(114)의 층은 수성 시험 샘플로 습윤될 때 미생물의 콜로니를 관찰을 가능하게 하기에 충분히 투명하다. 수성 접착제 조성물은 하나 이상의 친수성 제제(hydrophilic agent)를 포함할 수 있으며, 이는 영양소, 선발제, 지시제(예를 들어, DNase 지시 시스템, 효소 기질, 염료), 또는 그 조합을 포함한다. 수성 접착제 조성물에서 사용되는 특정 영양소 및/또는 선발제는 성장시키고/시키거나 선택적으로 검출(예를 들어 염색)하거나 또는 억제할 특정 유기체에 따라 본 발명의 명세서를 고려하면 당업자에게 명백할 것이다.

선발제의 예시적인 유용한 부류는 성장 중인 미생물에 의해 대사되거나 또는 달리 상기 미생물과 반응하고 그렇게 함에 있어서 기술자에 의한 또는 자동 판독기에 의한 정량화 및/또는 검출의 용이함을 위하여 미생물 콜로니가 착색되게 하거나 또는 형광 발광 되게 하는 염료를 포함한다. 그러한 염료의 비제한적 예에는 트라이페닐테트라졸륨 클로라이드, p-톨릴테트라졸륨 레드, 테트라졸륨 바이올렛, 베라트릴 테트라졸륨 블루, 뉴트랄 레드(neutral red), 페놀 레드, 클로로페놀 레드, 및 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트 다이소듐 염이 포함된다. 그러나, 다른 적합한 염료가 동정할 특정 유기체(들)에 따라 사용될 수 있음이 인식될 것이다. 당업자라면, 본 발명에 따라 사용되는 임의의 지시제, 염료, 선발제, 효소 기질 또는 영양소는 DNase 활성을 사실상 억제하지 않아야 하고 본 명세서에 기재된 DNase 지시 시스템의 관찰 및 이미징을 사실상 방해하지 않아야 함을 인식할 것이다.

완충 시약, 예를 들어 탄산나트륨을 이용하여 중성 pH를 나타내는 매질을 제공할 수 있으며, "캅-오-실(Cab-O-Sil) M-5"를 프로세싱 조제(processing aid)로서 이용할 수 있고, 이는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 제4,565,783호에 기재된 바와 같다. 물론, 분말(116)에 사용되는 특정 코팅 혼합물(예를 들어, 영양소, 지시제 및/또는 겔화제)은 성장시킬 미생물의 유형에 따라 조정될 수 있다.

본 발명의 용품은 감별 지시제를 포함할 수 있음이 고려된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "감별 지시제"는 소정 미생물의 존재는 지시하지만 다른 미생물의 존재는 지시하지 않는, 당해 매질에 첨가되는 시약을 말한다. 감별 지시제의 비제한적인 예에는 소정 미생물에 의해 대사될 때 탐지가능한 반응(예를 들어, 콜로니와 관련된 pH 변화)을 생성하는 염료(예를 들어, 착색제, pH 지시제, 산화환원 지시제), 효소 기질(예를 들어, 포스파타아제, 글리코시다아제, 펩티다아제, 뉴클레아제, 리파아제 등의 발색 또는 형광발생 기질), 및 특정 영양소(예를 들어, 발효가능한 탄수화물, 아미노산)가 포함된다.

일부 실시 형태에서, 하나 이상의 감별 지시제는 기재 상에 코팅되는 수-기반의 조성물 형태로 박막 배양 기구에 첨가될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 감별 지시제는 배양 기구에 첨가되는 액체 샘플에 첨가될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 감별 지시제는 배양 기구의 수화 후에 배양 기구에 첨가될 수 있다. 수화 후 배양 기구에 첨가되는 감별 지시제의 사용을 포함하는 방법의 일례로는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 제6,022,682호에 기재된 바와 같이 서모뉴클레아제의 탐지를 위한 용품을 인큐베이션 후에 배양 기구에 첨가하는 방법이 있다.

분말(116)이 미생물 동정을 위한 소정의 생화학적 시험의 수행에 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있음이 본 발명의 범주 내에서 또한 고려된다. 특정 유형의 미생물의 존재 하에서 변색을 겪는 그러한 시약(예를 들어, 효소 기질)이 분말(116) 또는 접착제(114)에 포함될 수 있다.

본 발명의 다른 실시 형태에서, 분말(116)은 용액 중에 용해 또는 현탁되고, 기재(112) 상에 코팅되어 건조된 지시제, 선발제 및/또는 영양소 및 겔화제의 혼합물을 포함하는 코팅을 포함할 수 있다. 이 실시 형태에서, 코팅에는 사실상 수분이 없다(즉, 코팅은 일단 이것이 주위 환경과 평형을 이루는 것이 가능케 되었으면 탈수된 코팅의 대략적인 수분 함량 이하인 수분 함량을 갖는다).

도 1에 도시된 바와 같이, 몸체 부재는 기재(112)의 상부 표면에 적용되는 스페이서(118)를 포함할 수 있으며, 상기 스페이서(118)는 기재(112) 상에 분말(116)을 노출시키도록 중심부를 관통하여 절단되는 원형 개구(120)를 포함한다. 개구(120)의 벽은 소정의 크기 및 형상의 웰(well)을 제공하여 수화 후 매질을 국한시킨다. 스페이서(118)는 원하는 부피, 예를 들어 1, 2 또는 3 밀리리터의 웰을 형성하기에 충분한 두께를 가져야 한다. 폐쇄 셀 폴리에틸렌 폼이 스페이서(118)에 바람직한 재료이지만, 소수성(비-습윤성)이며 미생물에 대하여 불활성이고 살균을 견딜 수 있는 임의의 재료가 사용될 수 있다. 몇몇 실시 형태(도시되어 있지 않음)에서, 스페이서(118)는 복수의 개구(20)(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 또는 20개의 개구)를 포함할 수 있으며, 이들 각각에는 별개의 액체 샘플이 접종될 수 있다.

스페이서(118)는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 제5,681,712호에 기재된 것과 같은 상대적으로 두꺼운 디자인을 포함할 수 있다. 상기 더 두꺼운, 개구가 있는 스페이서(118)의 한 가지 목적은 스페이서(118)의 개구(120)에 배치되는 막(예를 들어 미공성 여과막)(도시되어 있지 않음)을 위치시키고 보호하는 것이다. 상기 더 두꺼운 스페이서(118)의 다른 목적은 커버 시트(122)가 성장 중인 미생물 콜로니와 접촉하는 것을 감소 또는 방지하는 것이다(즉, 성장 표면과 커버 시트(122) 사이에 "상부 공간" - 이는 성장 중인 미생물 콜로니에게 증가된 통기를 또한 제공할 수 있음 - 을 제공하는 것이다).

스페이서(118)의 두께는 배양 기구에 접종할 때 배양 기구에 첨가되는 액체의 부피를 봉입하기에 충분하여야 한다. 사용될 때 당해 막의 두께에 따라 스페이서는 적어도 두께가 약 0.5 ㎜, 두께가 약 1 ㎜, 두께가 약 1.5 ㎜, 그리고 두께가 약 2 ㎜일 수 있다.

도 3에는 박막 배양 기구(310)의 다른 실시 형태가 도시되어 있다. 이 실시 형태는 기재(312), 접착제(314), 냉수-용해성 분말(316), 및 커버 시트(322)를 포함하며, 이는 도 1에 개시된 바와 같다. DNase 지시 시스템이 냉수-용해성 분말(316)에 포함될 수 있다. 도 1의 배양 기구(110)와는 대조적으로, 도 3의 기구(310)는 접종 동안 샘플을 국한시키기 위한 스페이서를 포함하지 않는다. 템플릿(template), 예를 들어 (도시되지 않은) 무게가 있는 링(weighted ring)이 커버 시트(322)의 외부에 일시적으로 적용되어, 폐쇄 후 샘플을 특정 영역에 국한시키는 한편 냉수-용해성 분말(316)이 겔을 형성하도록 할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 기구(310)에는 배양 기구(310)의 분말(316)의 독특한 부분들에 별도의 샘플을 국한하기 위하여 적절한 스페이싱 및 템플릿을 사용하여 복수의 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15 또는 20가지의) 독특한 액체 샘플을 접종할 수 있다.

도 4에는 본 발명에 따른 박막 배양 기구(410)의 다른 실시 형태가 도시되어 있다. 배양 기구(410)는 상부 표면 및 하부 표면(412a, 412b)을 갖는 자기 지지형 기재(412)를 포함하는 몸체 부재(411)를 포함한다. 기재(412)는 그의 상부 표면(412a)이 접착제(414)의 층으로 코팅된다. 하나 이상의 겔화제를 포함하는 냉수-용해성 분말(416)은 얇은, 상대적으로 균일한 층으로 접착제(414)에 부착된다. 일단 수성 시험 샘플(도시되어 있지 않음)을 접종하면, DNase 지시 시스템을 포함할 수 있는 냉수-용해성 분말(416)의 층은 빠르게 수화되어 재구성 매질(도시되어 있지 않음)을 형성하고, 이는 다시 액체 접종물 중에 또는 시험 샘플 미생물 필터(도시되어 있지 않음)와 같은 막의 표면 상에 존재하는 미생물을 성장시킬 수 있다. 스페이서(418)는 기재(412) 및 분말(416)의 표면을 부분적으로 덮으며 개구(420)를 포함한다. 게다가, 박막 배양 기구(410)는 수성 시험 샘플의 첨가 후 형성되는 재구성 매질을 덮기 위하여 커버 시트(422)를 선택적으로 포함한다. 또한 도 4에는 막(426) 및 그 위에서 성장하는 미생물 콜로니(428)가 도시되어 있다. 도시된 실시 형태에서, 막(426)은 미공성 막이며, 이것을 통하여 샘플에 존재할 경우 그 위의 임의의 박테리아를 포획하기 위하여 액체 샘플을 여과시켰다. 적합한 미공성 막은 DNase 효소 활성 또는 DNase 효소 활성과 DNase 지시 시스템 사이의 상호작용을 사실상 방해하지 않는다. 부가적으로, 적합한 미공성 막은 하이드로겔과 접촉할 때 사실상 투명하다.

공기-투과성 막이 DNase 활성 또는 DNase 활성의 관찰 및 이미징을 사실상 방해하지 않는다면, 미국 특허 제5,232,838호에 기재된 바와 같이 본 발명의 기구에서 공기 투과성 막 층을 사용하는 것이 가능하다. 공기 투과성 층은 기재와 냉수-용해성 분말 사이에 "샌드위치될" 수 있으며, 이때 공기 투과성 막 층의 양면에는 접착제 코팅이 있다(도시되어 있지 않음).

일 실시 형태에서, 박막 배양 플레이트 기구는 예를 들어 미국 특허 제4,565,783호에 기재된 방법에 따라 액체 코팅 혼합물을 생성하고, 액체 코팅 혼합물을 기재 상에 코팅하고, 코팅된 기재를 건조시키고, 선택적으로, 커버 시트를 부착시킴으로써 제조될 수 있다. 이 실시 형태의 예시적인 기구가 도 4에 도시되어 있다.

도 4에는 본 발명의 매질과 함께 사용하기에 적합한 박막 배양 기구(410)의 일 실시 형태가 도시되어 있다. 본 기구의 제조 방법은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제4,565,783호에 기재되어 있다.

박막 배양 기구(410)는 자기 지지형 방수 기재(412)를 갖는 몸체 부재를 포함한다. 기재(412)는 바람직하게는 폴리에스테르, 폴리프로필렌 또는 폴리스티렌과 같이 물을 흡수하지 않는 방수 재료로 만들어진, 상대적으로 강성인 물질이다. 기타 적합한 방수 재료는 방수 폴리에틸렌 코팅을 함유하는 종이와 같은 기재를 포함한다. 기재(412)의 상부 표면은 액체 조성물로 코팅되며, 이어서 이것은 건조되어 기재(412) 상에 건조 코팅(417)을 제공한다. 건조 코팅(417)은 본 명세서에 기재된 바와 같이 냉수-용해성 겔화제를 포함하며, 영양소, 선발제, 지시제 또는 전술한 것 중 임의의 2가지 이상의 조합을 또한 포함할 수 있다. 건조 코팅(417)의 제조에 사용되는 액체 조성물은 조성물 중 물의 본질적으로 전부가 증발될 때까지 액체 조성물을 오븐에서 약 104℃(약 220℉)에서 가열함으로써 쉽게 건조시킬 수 있다. 그러나, 물의 증발 후 조성물이 가열될 경우, 조성물의 소정 성분(예를 들어, 영양소, 지시제)이 열화되기 시작할 수 있다.

접착제 층(도시되어 있지 않음)이 기재(412) 상에 코팅될 수 있다. 접착제는 건조 코팅(417)을 기재(412)에 유지하는 역할을 할 수 있다. 접착제는 수화될 때 충분히 투명하여서 코팅된 기재(412)의 표면 상에서 성장하는 박테리아 콜로니의 관찰을 허용하여야 한다. 또한 접착제는 접착제 중에 코팅을 완전히 매립하지 않고서 기재가 건조 코팅(417)으로 균일하게 코팅되게 하는 두께로 기재(412) 상에 코팅되어야 한다.

폼 내의, 원형 개구를 갖는 폼 스페이서(418)는 기재(412)의 매질 코팅된 표면에 부착된다. 기재(412)의 주변부를 커버하는 폼 스페이서는 샘플이 접종되는 영역을 규정하며 샘플이 기재로부터 누출되는 것을 방지하는 역할을 한다. 다른 실시 형태에서, 기구는 샘플-함유 폼 층을 포함하지 않을 수도 있다. 이러한 기구에서, 당해 양의 샘플은 매질 단독의 성분들에 의해 기재 상에 함유된다.

커버 시트(422)는 폼 스페이서(418)의 상부 표면의 에지에 부착된다. 바람직하게는 커버 시트(422)는 기재 상에 존재하는 박테리아 콜로니의 계수를 용이하게 하기 위하여 투명 필름 또는 시트 재료로 만들어진다. 게다가, 바람직하게는 커버 시트(422)는 오염 위험성 및 성분들의 열화를 피하기 위하여 박테리아 및 수증기에 대하여 불투과성이다. 커버 시트(422)로서 사용하기에 바람직한 재료는 이축-배향 폴리프로필렌이다. 선택적으로, 커버 시트(422)는 접착제 층으로 코팅될 수 있으며, 이는 겔화제, 영양소, 선발제, 지시제(예를 들어, DNase 지시 시스템) 또는 전술한 것 중 임의의 2가지 이상의 조합을 함유하는 건조 조성물(예를 들어, 분말)로 코팅될 수 있다(도시되어 있지 않음).

사용에 있어서, 소정의 양의 접종물, 전형적으로 약 1 ㎖의 액체 접종물은 커버 시트를 잡아당기고 수성 시험 샘플 또는 물을 건조 코팅(417) 상에 분배함으로써 도 4에 도시된 기구에 첨가된다. 접종물은 영양소, 선발제, 지시제 또는 전술한 것 중 임의의 2가지 이상의 조합을 선택적으로 포함할 수 있다. 이어서 커버 시트(422)는 코팅(417) 위에 도로 놓여지고, 접종물은 폼 스페이서(418)의 원형 개구 내부에 고르게 산재된다. 이를 행하는 편리한 도구는 무게가 있는 원형 템플릿이다. 접종물이 접촉하여 코팅(417) 상에 산재됨에 따라, 코팅은 수화되어 겔을 형성한다. 겔에 존재하는 영양소는 미생물의 성장을 지지할 수 있다. 이어서 접종된 기구는 소정 시간 동안 인큐베이션되며, 그 후 기재 상에서 성장하는 박테리아 콜로니의 수가 투명 커버 시트(422)를 통하여 계수될 수 있다.

기구(410)의 건조 코팅(417)의 형성에 사용되는 코팅 혼합물은 DNase 지시 시스템과, 선택적으로, 배양 배지, 지시 시약, 선발제 또는 전술한 것 중 2가지 이상의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 바람직한 코팅 혼합물은, 코팅되고 건조되고 적절한 부피의 샘플로 재수화될 때, 표 1에 예시된 DNase 지시 시스템 및 영양 배지를 포함한다.

[표 1]

본 발명의 배양 배지는 미생물을 함유할 것으로 의심되는 샘플을 배양 배지에 접종할 때 표적(즉, DNase-생성) 미생물의 성장을 촉진하기에 일반적으로 적합한 이온, 염 및 영양소를 포함할 수 있다. 예를 들어 영양소, 염, 이온, 선발제, 지시제 등과 같은 첨가제를 함유하는 배양 배지는 첨가제가 표적 미생물의 성장을 촉진하고/하거나, 비-표적 미생물의 성장을 억제하고/하거나 DNase 지시 시스템을 방해하지 않음을 결정하기 위하여 공지된 DNase-생성 유기체를 이용하여 시험될 수 있다. 또한 배양 배지는 하나 이상의 겔화제를 포함할 수 있다. 적합한 영양소, 염, 이온 및 겔화제는 미국 특허 제5,443,963호에 개시되어 있다. 본 발명의 배양 배지는 소정의 DNase-생성 미생물(예를 들어, 스타필로코커스, 바실러스, 스트렙토코커스, 비브리오, 브라나멜라 및/또는 세라티아 종)의 성장에 대하여 선발하는 적어도 하나의 선발제를 포함할 수 있다.

표적 미생물의 선발은 비-표적 미생물 이외의 것의 성장의 억제, 비-표적 미생물의 성장의 촉진, 또는 이들 둘 모두를 포함할 수 있다. 표적 미생물의 성장의 촉진은 적어도 하나의 제1 선발제에 의해 직접적으로 (예를 들어, 표적 미생물에 의해서는 사용될 수 있지만 다른 미생물에 의해서는 사용될 수 없는 영양소), 간접적으로 (예를 들어, 비-표적 미생물의 억제에 의해 영양소에 대한 경쟁을 감소시킴으로써), 또는 직간접적으로 제공될 수 있다.

표적 미생물의 성장에 대하여 선발하는 임의의 원소, 라디칼, 이온 또는 화합물이 선발제로 사용하기에 적합할 수 있다. 예를 들어, 포도상구균 표적 미생물에 적합한 선발제는 염화리튬, 아즈트레오남, 포타슘 텔루라이트, 염화나트륨, 날리딕스산, 콜리스틴 메탄설포네이트, 글리신-염산염, 티오시안산칼륨, 소듐 아자이드, 폴리믹신 B, 설파메타진, 항생제, 및 전술한 것 중 2가지 이상의 임의의 조합을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

소정의 선발제는 포도상구균의 성장에 대해 선발할 수 있을 뿐만 아니라 소정의 조건 하에서 다른 포도상구균에 비하여 에스. 아우레우스의 성장에 대하여 차별적으로 선발할 수 있다. 예를 들어, 포타슘 텔루라이트, 염화리튬, 및 난황을 포함하는 배양 배지는 에스. 아우레우스와 모든 다른 박테리아 종을 선별적으로 구별할 수 있다. 난황은 에멀젼으로서 또는 탈수 형태로 구매가능하다.

본 발명에 따른 건조 배양 배지는 하기 방식으로 박막 배양 기구의 하나 이상의 표면에 적용될 수 있다. 배양 배지의 성분은 용매에 용해될 수 있다. 이어서 생성된 용액은 기구의 하나 이상의 표면 상에 코팅될 수 있다. 이어서 코팅을 건조시켜, 배양 배지 용액으로 코팅된 기구의 표면 상에 건조 배양 배지를 남긴다. 코팅은 공기 건조 및 가열을 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 적합한 방식으로 건조될 수 있다.

건조 배양 배지의 각각의 성분의 양은 적어도 부분적으로 하기 적어도 2가지의 요인에 의해 결정된다: (1) 배양 배지 용액 중 그 성분의 농도, 및 (2) 배양 기구의 주어진 표면 영역 상에 코팅되는 용액의 양(코팅 중량). 적합한 코팅 중량은 약 0.45 ㎎/㎠ 내지 약 2.5 ㎎/㎠의 범위일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 배양 배지 영양소는 지시제와는 별도로 코팅될 수 있다. 이러한 실시 형태에서, 배양 배지 영양소에 있어서의 코팅 중량은 약 1.6 ㎎/㎠ 내지 약 2.5 ㎎/㎠의 범위일 수 있다. 일 실시 형태에서, 영양소 코팅의 코팅 중량은 약 2.1 ㎎/㎠이다. 지시제 코팅에 있어서의 코팅 중량은 약 0.45 mg/㎠ 내지 약 0.84 mg/㎠의 범위일 수 있다. 일 실시 형태에서, 지시제 코팅의 코팅 중량은 약 0.62 ㎎/㎠이다.

배양 배지에 포함된 선발제의 양은 부분적으로는 특정 배양 배지에 사용하기 위하여 선택된 특정 선발제 또는 특정 선발제들의 조합에 의존적일 수 있다. 예를 들어, 일 실시 형태에서, 배양 배지는 염화리튬, 아즈트레오남 및 포타슘 텔루라이트를 선발제로 포함한다. 영양소 코팅에 대하여 상기에 기재된 코팅 중량의 맥락에서, 염화리튬은 약 1 g/L 내지 약 15 g/L의 범위의 양으로 코팅 용액에 포함될 수 있다. 일 실시 형태에서, 코팅 용액은 배양 기구 상에 코팅되기 전에 10 g/L의 염화리튬을 포함한다. 이와 유사하게, 아즈트레오남은 약 0.001 g/L 내지 약 0.015 g/L의 범위의 양으로 포함될 수 있다. 일 실시 형태에서, 코팅 용액은 0.01 g/L의 아즈트레오남을 포함한다. 포타슘 텔루라이트는 약 0.05 g/L 내지 약 0.19 g/L의 범위의 양으로 포함될 수 있다. 일 실시 형태에서, 배양 배지는 0.16 g/L의 포타슘 텔루라이트를 포함한다.

상기 실시 형태들 중 임의의 하나의 것에서, 겔화제는 (예를 들어, 샘플을 포함하는 수성 용액에 의해) 수화되어 하이드로겔을 형성한다. 하이드로겔은 수성 용액에서의 DNase 효소의 확산을 제한하지만 DNase 효소 활성의 활성을 사실상 억제하지 않는 임의의 적합한 하이드로겔일 수 있다. 적합한 하이드로겔의 비제한적인 예에는 한천, 아가로스, 젤라틴, 천연 검(구아 검, 로커스트 빈 검, 잔탄 검 등) 및 그의 유도체 및 조합이 포함된다.

도 1 내지 도 4에 도시된 실시 형태가 기구에 부착된 커버 시트를 갖지만, 분말 함유 실시 형태는 덮여져 있지 않고 단순히 보관 및 인큐베이션 동안 살균 환경 내에 배치될 수 있음이 본 발명의 범주 내에서 또한 고려된다.

검출용품:

본 발명은 DNase 활성 검출을 위한 용품을 포함한다. 검출용품은 상부 및 하부 주 표면을 갖는 자기 지지형 기재를 포함하는 몸체 부재를 포함한다. 본 용품은 냉수-용해성 겔화제와, DNA 및 메틸 그린을 포함하는 DNase 지시 시스템을 포함하는 코팅을 추가로 포함한다. 코팅은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제6,022,682호에 기재된 것과 유사한 방법을 이용하여 제조되어 기재의 적어도 일 표면의 일부분 상에 균일하게 부착될 수 있다.

도 5에는 부분적으로 분해된 사시도 형태의, 본 발명에 따른 검출용품(550)의 일 실시 형태가 도시되어 있다. 도 5에 도시된 용품은 일반적으로 디스크-유사 형상을 갖지만, 본 용품은 특정 응용에 요구되는 임의의 형상을 가질 수 있다. 용품(550)은 고형 지지체(555), 고형 지지체(555)의 상부 주 표면 상에 코팅된 검출 층(560), 및 분해도에서 격자로 도시된, 선택적 보호 물질(565)을 포함한다. 보호 물질(565)은, 존재할 경우, 검출 층(560)의 표면이 샘플을 포함하는 표면에 마주하여 배치되도록 나타나게 하기 위하여 제거될 수 있다.

일반적으로, 용품(550)의 제조는 DNA, 메틸 그린 및 냉수-용해성 겔화제를 포함하여 용품 내에 포함되게 선택된 적절한 양의 성분들을 함유하는 용액을 제조하는 단계, 용액을 냉각시키는 단계, 그리고 이어서 용액을 고형 지지체(555) 상에 코팅하는 단계를 포함한다. 이어서 코팅된 지지체는 코팅된 용액이 고형화되도록 건조된다. 한 가지 바람직한 그러나 비제한적인 실시 형태를 예시하기 위하여, 2 g/L의 연어 정자 DNA, 0.02 g/L의 메틸 그린, 및 1%(중량/부피)의 구아 검을 함유하는 용액을 0.18 ㎜ 폴리에스테르 필름 고형 지지체 상에 코팅하고, 이어서 2-10분간 약 93.3℃(200℉)에서 건조시킨다. 생성된 건조 코팅은 임의의 요구되는 두께의 것일 수 있지만, 바람직하게는 두께가 약 0.12-0.25 ㎜이다. 성분들 및 그의 양은 용품이 특정 응용에 요구되는 것에 따라 상대적으로 강성 또는 가요성이 되도록 선택될 수 있다.

고형 지지체(555)는 중합체 필름, 예를 들어 폴리에스테르 필름일 수 있다. 고형 지지체(555)는 건조 후에 성형 용품을 제공하기 위하여 주형으로부터 유래될 수 있거나, 또는 고형 지지체는 코팅 및 건조 이후 요구되는 크기 또는 형상의 용품의 절삭 또는 펀칭을 허용하는 시트 물질로부터 유래될 수 있다. 고형 지지체(555 )에 사용되는 물질은 용품(550)에 임의의 정도의 강성 또는 가요성을 부여하도록 선택될 수 있다. 게다가, 용품(550)은 특정 응용에 요구되는 것에 따라 임의의 형상 또는 두께로 제조될 수 있다.

고형 지지체는 바람직하게는 투명하거나 적어도 반투명하여, 사용에 있어서 용품에서 나타나는 변색의 관찰을 허용한다. 고형 지지체는 또한 검출 층에 안정성을 제공하며 검출 층을 손상으로부터 보호한다.

고형 지지체는 검출 층으로부터 이것이 박리가능해지도록 선택되어서, 고형 지지체 없이 시험에서 검출 층이 자유롭게 사용되게 할 수 있다. 예를 들어, 폴리에스테르 필름이 고형 지지체로 사용되는 경우, 고형 지지체는 검출 층이 사용 중에 수화되게 될 때 검출 층으로부터 박리가능해질 수 있다.

보호 물질(565)은 검출 층의 노출된 표면에 인접하여 배치될 수 있다. 예를 들어, 고형 지지체가 검출 층의 일 표면에 인접할 경우, 보호 물질은 반대쪽 표면에 인접할 수 있다. 보호 물질은 보관 및 수송에 있어서 용품을 보호하는 중합체 필름 또는 격자(예를 들어, 스크림)일 수 있으며, 바람직하게는, 검출 층들 사이의 스페이서로서 작동하여 건조 후 흡습성일 수 있는 용품들을 서로로부터 분리하여 안정한 보관 및 더욱 긴 저장 수명을 가능케 할 수 있다.

보호 물질은 이것이 용품의 표면으로부터 사용 이전에 박리가능하거나 제거가능하도록 선택된다. 보호 물질로서 사용하기에 적합한 물질은 당업계에 공지되어 있다. 상기한 바와 같이, 본 발명의 용품은 임의의 요구되는 두께, 형상, 또는 강성의 것일 수 있으며, 고형 지지체는, 존재할 경우 임의의 요구되는 두께의 것일 수 있고 임의의 요구되는 정도의 강성 또는 가요성을 부여하도록 선택될 수 있다.

본 용품은 바람직하게는 다른 구성성분, 예를 들어 염화칼슘(예를 들어, 서모뉴클레아제 활성을 검출하기 위하여), 염화나트륨(적절한 이온 강도를 제공하기 위하여) 또는 완충 시스템(DNase 반응이 일어나는 pH의 제어를 위하여), 예를 들어 트리스 염산염/트리스 염기를 또한 포함할 수 있다.

본 발명의 용품은 다양한 pH의 용액으로부터 제조될 수 있다. 이와 같이, 본 용품은 DNase 활성이 선택된 pH에서 일어나도록 시약들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 바람직한 실시 형태에 따른 용품은 pH 7.3 용액으로부터 만들어질 수 있다. 대안적으로, 본 발명에 따른 용품은 pH 9.0 용액으로부터 만들어질 수 있다.

샘플

적합한 샘플은 임의의 공급원, 예를 들어 생리학적 유체, 예를 들어 혈액, 타액, 수정체액, 활액, 뇌척수액, 고름, 땀, 삼출물, 소변, 점액, 대변, 포유기 밀크(lactation milk) 등으로부터 유래될 수 있다. 또한, 시험 샘플은 신체 부위, 예를 들어 창상, 피부, 비공, 두피, 손발톱 등으로부터 유래될 수 있다.

특히 관심있는 샘플은 점액 함유 샘플, 예를 들어 코 샘플(예를 들어, 전비공, 비강 인강, 비강, 전비전정(anterior nasal vestibule) 등으로부터 유래)과, 외이, 중이, 구강, 직장, 질 또는 기타 유사 조직으로부터 유래된 샘플을 포함한다. 특정 점막 조직의 예에는 협측(buccal), 잇몸(gingival), 코, 눈, 기관, 기관지, 위장, 직장, 요도, 요관, 질, 자궁 경부, 및 자궁 점막이 포함된다.

생리학적 유체 외에도, 기타 시험 샘플은 액체 매질에 용해되는 고형물(들)뿐만 아니라 다른 액체도 포함할 수 있다. 관심있는 샘플은 공정 스트림, 물, 토양, 식물 또는 기타 초목, 공기, 표면(예를 들어, 오염된 표면, 바닥, 벽, 기기, 침구류) 등을 포함할 수 있다. 샘플은 배양된 세포를 또한 포함할 수 있다.

표면 상의 미생물, 예를 들어 에스. 아우레우스의 검출을 위한 다양한 환자 샘플링 기술이 공지되어 있다. 그러한 샘플링 기술은 본 발명의 방법에 또한 적합하다. 예를 들어, 환자의 비공을 닦음에 의해 샘플을 얻는 것이 일반적이다. 특히 바람직한 샘플링 기술은 살균 면봉(swab) 또는 샘플링 기구를 이용하여 대상의 (예를 들어 환자의) 전비공을 닦아내는 것을 포함한다. 예를 들어, 하나의 면봉을 사용하여 각각의 대상을 샘플링하는데, 즉, 하나의 면봉을 둘 모두의 비공에 대하여 사용한다. 샘플링은 예를 들어 건조하거나 적절한 용액으로 사전에 적신 면봉을 대상의 비공의 앞쪽 단부 내에 삽입하고, 비공의 점막 표면을 따라 1회 이상의 완전한 회전 동안 면봉을 회전시킴으로써 실시될 수 있다.

매우 다양한 면봉 또는 기타 샘플 수집 기구는 예를 들어 미국 메인주 길포드 소재의 퓨리탄 메디칼 프로덕츠 컴퍼니 엘엘씨(Puritan Medical Products Co. LLC)로부터 상표명 퓨어-랩스(PURE-WRAPS)로 또는 미국 캘리포니아주 코로나 소재의 코판 다이아그노스틱스, 인크.(Copan Diagnostics, Inc.)로부터 상표명 에스왑( ESWAB)으로 또는 이탈리아 브레시아 소재의 마이크로레올로직스, 에스.알.엘(microRheologics, S.r.l.)로부터 상표명 플록트스왑(FLOCKEDSWAB)으로 구매가능하다. 원할 경우 예를 들어 미국 특허 제5,879,635호(네이슨(Nason))에 개시된 것과 같은 샘플 수집 수단이 또한 사용될 수 있다. 면봉은 면, 레이온, 알긴산칼슘, 데이크론(Dacron), 폴리에스테르, 나일론, 폴리우레탄 등을 비롯한 다양한 재료의 것일 수 있다.

이어서 샘플 수집 기구(예를 들어, 면봉)는 적절한 용액을 이용하여 (예를 들어 세척에 의해, 와동에 의한 용출에 의해) 직접적으로 배양되거나, 직접적으로 분석되거나 직접적으로 추출될 수 있다. 그러한 추출(즉, 용출) 용액은 전형적으로 물을 포함하며, 완충제 및 적어도 하나의 계면활성제를 선택적으로 포함할 수 있다. 용출 완충제의 예에는 예를 들어 인산염 완충 염수(phosphate buffered saline; PBS)가 포함되며, PBS는 예를 들어 트윈(TWEEN) 20 또는 플루로닉(PLURONIC) L64와 조합되어 사용될 수 있다. 시험 샘플(예를 들어, 액체)을 추가 분석 이전에 처리할 수 있다. 이는 농축, 침전, 여과, 원심분리, 투석, 희석, 천연 성분들의 불활성화, 시약의 첨가, 화학적 처리 등을 포함한다.

포착 입자

본 발명의 배양 기구를 포착 입자와 함께 사용하여 샘플(예를 들어, 액체 현탁물) 중 미생물을 검출할 수 있다. 바람직하게는, 포착 입자는 본 발명의 박막 배양 기구 내에 배치되고 표적 미생물의 적어도 하나의 세포의 분열을 허용하기에 충분한 기간 동안 인큐베이션 기간 중에 배양 기구 내에 남아 있을 수 있도록 크기가 정해진다. 본 배양 기구 내로의 포착 입자의 배치는 포착 입자가 배양 기구 내의 겔화제 및/또는 영양 배지 - 존재할 경우 - 와 접촉되게 하여 미생물이 성장 및/또는 증식할 수 있게 한다. 일부 실시 형태에서, 배양 기구는 포착 입자가 배양 기구 내에 배치되기 전에 수화된다(예를 들어, 살균 액체 또는 미지의 액체 샘플이 접종된다). 일부 실시 형태에서, 배양 기구는 포착 입자가 배양 기구 내에 배치된 후 수화된다.

적합한 포착 입자는 하나의 입자, 또는 복수의 입자를 포함한다. 상기 입자는 입자를 미생물에 커플링시키는 수단을 포함할 수 있다. 입자의 비제한적인 예에는 미소구체, 마이크로비드, 나노비드 등이 포함된다. 그러한 입자는 수지 입자, 예를 들어 아가로스, 라텍스, 폴리스티렌, 나일론, 폴리아크릴아미드, 셀룰로오스, 다당류, 또는 그 조합, 또는 무기 입자, 예를 들어 실리카, 산화알루미늄 또는 그 조합일 수 있다. 그러한 입자는 자성, 상자성, 초상자성, 또는 비자성일 수 있다. 그러한 입자는 크기 면에서 콜로이드성일 수 있으며, 예를 들어 약 100 ㎚ 내지 약 10 마이크로미터(㎛)일 수 있다. 그러한 입자의 비제한적인 예에는 초상자성 중합체 입자가 포함되며, 이는 상표명 다이나비즈(DYNABEADS)(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로젠, 인크.(Invitrogen, Inc.)) 및 바이오-아뎀비즈(BIO-ADEMBEADS)(프랑스 페삭 소재의 아뎀테크(Ademtech))로 판매된다.

포착 입자를 미생물에 커플링시키는 다양한 수단이 있다. 일부 실시 형태에서, 포착 입자를 미생물에 커플링시키는 수단은 비특이적 흡착을 촉진하는 표면 분자 또는 특성을 포함할 수 있다. 예를 들어, 포착 입자의 적어도 일부분은 적당한 조건(예를 들어 높은 pH 또는 낮은 pH) 하에서 양으로 또는 음으로 하전되게 되고 미생물의 표면과 관련된 상보적으로 하전된 분자에 비특이적으로 흡착하는 분자를 그의 표면 상에 가질 수 있다.

부가적으로, 또는 대안적으로, 포착 입자(예를 들어, 폴리스티렌 입자)의 적어도 일부분은 미생물의 표면과 관련된 소수성 분자에 비특이적으로 흡착하는 소수성 표면을 가질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 포착 입자를 미생물에 커플링시키는 수단은 수용체-리간드 상호작용을 통하여 미생물에 특이적으로 결합하는 분자를 포함할 수 있다. 그러한 특이적 수용체-리간드 상호작용은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 항체 또는 항체 단편과 그의 상응하는 항원, 렉틴과 그의 상응하는 탄수화물 결합 파트너, 박테리오파지 단백질 또는 단편과 그의 상응하는 파지 수용체 사이의 상호작용 등을 포함한다.

샘플에서 DNase 활성을 검출하는 방법

본 발명은 샘플에서 DNase 효소 활성의 별개의 공급원을 검출하는 방법을 제공한다. 본 명세서에 사용될 때, "DNase 효소 활성의 별개의 공급원"은 샘플의 일부분이 샘플의 적어도 하나의 다른 부분과 측정가능하게 별개의 것인 DNase 활성의 농도를 갖는 DNase 활성의 공급원을 말한다. 일부 실시 형태에서, DNase 활성의 별개의 공급원은 세포들의 군(예를 들어, 생물 조직의 일부분, 미생물의 콜로니)의 세포(예를 들어, 식물 세포, 동물 세포 또는 미생물)일 수 있다.

DNase 효소 활성은 DNA 및 메틸 그린을 포함하는 지시 시스템의 사용에 의해 검출되며, 이들 둘 모두는 DNA와 메틸 그린 사이의 복합체의 형성으로 인한 녹색을 검출하기에 충분한 양으로 있다. DNase 효소 활성의 공급원의 존재 하에서는 DNA 분자가 절단되며, 따라서 DNA-메틸 그린 복합체가 붕해되어 무색으로 된다.

DNase 활성의 별개의 공급원의 검출 방법은 DNase 지시 시스템을 포함하는 하이드로겔과, DNase 활성의 별개의 공급원을 함유할 것으로 의심되는 샘플을 제공하는 단계를 포함한다.

DNase 지시 시스템은 DNA 및 메틸 그린을 포함한다. DNA 및 메틸 그린 둘 모두는 DNA와 메틸 그린 사이의 복합체의 형성으로 인하여 녹색을 나타내기에 충분한 양으로 존재한다. 당업계에서 사용되는 메틸 그린의 농도는 DNase-생성 미생물 콜로니를 둘러싸고 있는 탈색 구역을 시각적으로 검출하기에 충분한 색대비를 제공한다. 그러나, 본 발명에서 그 농도의 메틸 그린은 적어도 일부의 미생물의 성장을 억제하는 것으로 밝혀졌다.

DNase 지시 시스템 중 DNA는 예를 들어 하이드로겔 중 약 2.0 g/L의 농도의, 연어 고환 유래의 (미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마 케미칼 컴퍼니(Sigma Chemical Co.)로부터 입수가능함) 또는 헤임피시(heimfish) 정자 유래의 (벨기에 길 소재의 아크로스 오가닉스(Acros Organics)로부터 입수가능함) DNA의 나트륨염일 수 있다.

일부 실시 형태에서, DNase 지시 시스템은 수동으로 검출될 수 있다. 수동 검출에 있어서, DNase 지시 시스템을 함유하는 용품 또는 기구는 DNase 활성의 공급원(예를 들어, 미생물의 콜로니)이 그 용품 또는 기구에 존재하는지를 결정하는 기술자에 의해 시각적으로 관찰된다. 본 발명의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 DNase 지시 시스템을 포함하는, 수화된 용품 또는 기구에서의 상대적으로 낮은 농도의 메틸 그린의 사용을 포함한다. 이들 실시 형태에서, 미생물 성장이 유의하게 덜 억제되며, 놀랍게도, DNase-생성 미생물의 시각적 검출에 충분한 색대비가 남아 있다. 소정의 수동 검출 실시 형태에서, 수화된 용품 또는 기구 중 메틸 그린은 예를 들어 약 5 ㎍/㎖ 이상, 49 ㎍/㎖ 이하의 농도의 메틸 그린의 염화아연염일 수 있다. 소정의 수동 검출 실시 형태에서, 샘플을 포함하는 수화된 용품 또는 기구 중 메틸 그린은 적어도 약 5 ㎍/㎖ 내지 약 40 ㎍/㎖의 농도의 메틸 그린의 염화아연염일 수 있다. 소정의 수동 검출 실시 형태에서, 샘플을 포함하는 수화된 용품 또는 기구 중 메틸 그린은 적어도 약 5 ㎍/㎖ 내지 약 30 ㎍/㎖의 농도의 메틸 그린의 염화아연염일 수 있다. 소정의 수동 검출 실시 형태에서, 샘플을 포함하는 수화된 용품 또는 기구 중 메틸 그린은 적어도 약 5 ㎍/㎖ 내지 약 20 ㎍/㎖의 농도의 메틸 그린의 염화아연염일 수 있다. 소정의 수동 검출 실시 형태에서, 샘플을 포함하는 수화된 용품 또는 기구 중 메틸 그린은 적어도 약 5 ㎍/㎖ 내지 약 10 ㎍/㎖의 농도의 메틸 그린의 염화아연염일 수 있다. 소정의 수동 검출 실시 형태에서, 샘플을 포함하는 수화된 용품 또는 기구 중 메틸 그린은 약 5 ㎍/㎖, 약 10 ㎍/㎖, 약 20 ㎍/㎖, 약 30 ㎍/㎖, 약 40 ㎍/㎖, 또는 약 45 ㎍/㎖의 농도의 메틸 그린의 염화아연염일 수 있다.

부가적으로, 또는 대안적으로, DNase 지시 시스템은 본 명세서에 기재된 바와 같이 이미징 시스템을 사용하여 전자적으로 분석될 수 있다. DNA-메틸 그린 복합체와 가수분해 DNA-메틸 그린 복합체 사이의 색대비는, 예를 들어 선택된 파장의 광(즉, 적색 파장)으로 지시 시스템을 조사하고, 지시 시스템을 포함하는 하이드로겔을 이미징하고, 지시 시스템을 포함하는 하이드로겔의 이미지를 분석하는 공정을 포함하는 이미징 방법을 사용함으로써, 또는 전술한 공정들 중 2가지 이상의 조합에 의해 사실상 향상될 수 있다. 소정의 전자 검출 실시 형태에서, 샘플을 포함하는 수화된 용품 또는 기구 중 메틸 그린은 예를 들어 적어도 약 5 ㎍/㎖ 내지 약 100 ㎍/㎖의 농도의 메틸 그린의 염화아연염일 수 있다. 소정의 전자 검출 실시 형태에서, 샘플을 포함하는 수화된 용품 또는 기구 중 메틸 그린은 적어도 약 5 ㎍/㎖ 내지 약 60 ㎍/㎖의 농도의 메틸 그린의 염화아연염일 수 있다. 소정의 전자 검출 실시 형태에서, 샘플을 포함하는 수화된 용품 또는 기구 중 메틸 그린은 적어도 약 5 ㎍/㎖ 내지 약 40 ㎍/㎖의 농도의 메틸 그린의 염화아연염일 수 있다. 소정의 전자 검출 실시 형태에서, 샘플을 포함하는 수화된 용품 또는 기구 중 메틸 그린은 적어도 약 5 ㎍/㎖ 내지 약 20 ㎍/㎖의 농도의 메틸 그린의 염화아연염일 수 있다. 소정의 전자 검출 실시 형태에서, 샘플을 포함하는 수화된 용품 또는 기구 중 메틸 그린은 적어도 약 5 ㎍/㎖ 내지 약 10 ㎍/㎖의 농도의 메틸 그린의 염화아연염일 수 있다. 소정의 전자 검출 실시 형태에서, 샘플을 포함하는 수화된 용품 또는 기구 중 메틸 그린은 약 5 ㎍/㎖, 약 10 ㎍/㎖, 약 20 ㎍/㎖, 약 30 ㎍/㎖, 약 40 ㎍/㎖, 또는 약 45 ㎍/㎖의 농도의 메틸 그린의 염화아연염일 수 있다.

수동 또는 전자 분석을 포함하는 방법에서, 본 방법은 소정의 시간 동안 DNase 활성의 공급원과, DNase 검출 시스템을 포함하는 하이드로겔을 DNase 활성을 가능케 하기에 적합한 조건 하에 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. DNase 효소는 DNase 효소 활성을 가능케 하기에 적합한 조건이 그러하듯이 당업계에 공지되어 있다. 소정의 DNase 효소(예를 들어, DNase I)의 활성은 예를 들어 칼슘 및 마그네슘과 같은 2가 양이온에 의해 촉진된다. 2가 양이온은 하이드로겔에 첨가될 수 있고/있거나 영양 배지에, 존재할 경우, 하이드로겔 또는 샘플에 포함될 수 있다. 일반적으로, DNase 효소는 대략 중성 pH에서 최적 활성을 갖는다. 소정의 실시 형태에서, 상기 pH는 약 6.5 내지 약 8.0이다. 일반적으로, 효소 반응(예를 들어, DNase 효소 활성 반응) 속도는 더욱 높은 온도에서 증가한다. 따라서, DNase 활성은 상대적으로 더욱 낮은 온도(예를 들어, 주위 온도) 또는 승온(예를 들어, 30-45℃)에서 하이드로겔과 접촉시킬 수 있다. 전형적으로, DNase 활성 검출에 필요한 시간의 양은 반응물이 승온에서 인큐베이션될 때 더욱 짧아질 것이다. 접촉 기간 중에, 하이드로겔은 하이드로겔로부터의 수분의 손실을 제한하기 위하여 용기 내에 유지될 수 있다. 적합한 용기는 예를 들어 페트리 디쉬, 박막 배양 플레이트 기구 또는 가습 비커를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 본 발명은 이미징 시스템을 이용하여 하이드로겔의 이미지를 획득하는 단계를 추가로 포함한다. 이미징 시스템은 프로세서 및 이미징 기구를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이미징 기구는 라인 스캐너 또는 영역 스캐너(예를 들어, 카메라)를 포함한다. 이미징 기구는 단색(예를 들어, 흑백) 또는 다색(예를 들어, 컬러) 스캐너를 포함할 수 잇다. 유리하게는, 단색 이미징 시스템은 더욱 높은 해상도의 이미지를 제공할 수 있으며, 이 이미지는 결과의 정확도를 향상시키고/시키거나 샘플 중 DNase의 존재를 결정하는 데 필요한 시간을 감소시킬 수 있다.

일부 실시 형태에서, 이미징 시스템은 조사 시스템을 포함한다. 조사 시스템은 넓은 스펙트럼의 가시광(예를 들어, "백색" 광)의 적어도 하나의 공급원을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 조사 시스템은 좁은 스펙트럼의 가시광의 적어도 하나의 공급원(예를 들어, 상대적으로 좁은 대역폭의 가시광, 예컨대 적색광, 녹색광 또는 청색광을 방출하는 발광 다이오드)을 포함할 수 있다. 소정의 실시 형태에서, 조사 시스템은 약 633 ㎚의 발광 피크를 갖는 좁은 스펙트럼의 가시광의 공급원(예를 들어, 발광 다이오드)을 포함할 수 있다.

이미지는 하이드로겔에 의해 반사되는 광으로부터 획득될 수 있거나, 또는 이미지는 하이드로겔을 통과하는 광으로부터 획득될 수 있다. 적합한 이미징 시스템 및 상응하는 조사 시스템은 예를 들어 각각이 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 국제특허 공개 WO 2005/024047호 및 미국 특허 출원 공개 제2004/0101954호 및 미국 특허 출원 공개 제2004/0102903호에 개시되어 있다. 적합한 이미징 시스템의 비제한적 예에는 쓰리엠 컴퍼니(3M Company; 미국 미네소타주 세인트폴 소재)로부터 입수가능한 페트리필름 플레이트 판독기(PETRIFILM Plate Reader; PPR), 스파이럴 바이오테크(Spiral Biotech; 미국 매사추세츠주 노르우드 소재)로부터 입수가능한 페트리스캔 콜로니 계수기(PETRISCAN Colony Counter), 및 신바이오시스(Synbiosis; 영국 캠브리지 소재)로부터 입수가능한 프로토콜(PROTOCOL) 및 아콜라이트(ACOLYTE) 플레이트 스캐너가 포함된다.

일부 실시 형태에서, 이미지 획득은 파장-바이어스된 이미지를 획득하는 것을 포함한다. 예를 들어, 이미징 시스템은 이미징 기구에 의해 수집되는 광을 바이어스시키는 바이어스 필터를 포함할 수 있다. 필터 요소는 당업계에 공지되어 있으며, "컷오프(cut-off)" 필터(즉, 소정의 특정한 파장보다 큰 또는 그보다 작은 광 파장의 통과를 허용하는 필터) 및 "밴드패스(band-pass)" 필터(즉, 소정의 특정한 상한치와 하한치 사이의 광 파장의 통과를 허용하는 필터) 둘 모두를 포함한다. 바이어스 필터는 조사 공급원과 하이드로겔 사이에 위치될 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 바이어스 필터는 하이드로겔과 이미징 기구 사이에 위치될 수 있다.

소정의 바람직한 실시 형태에서, 이미지 획득은 적색 파장의 통과를 선택적으로 허용하는 바이어스 필터를 사용하여 이미지를 획득하는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이미지 획득은 약 620 ㎚ 내지 약 740 ㎚의 파장의 통과를 선택적으로 허용하는 바이어스 필터를 사용하는 것을 포함한다.

도 6은 이미징 시스템(670)의 내부 작동을 예시하는 블록 다이어그램이다. 도 6에 도시된 바와 같이, 하이드로겔(682)은 이미징 시스템 내의 초점면(플랫폼 상에 있음, 도시되어 있지 않음)에 위치된다. 본 발명에 따르면, 이미징 기구(692)는 하이드로겔(682)의 이미지를 포착하는 단색 라인 또는 영역 스캐너뿐만 아니라 하이드로겔(682)의 전면 및/또는 후면 조사를 위한 다색 조사 시스템(도시되어 있지 않음)도 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 예를 들어 이미징 기구(692)는 2차원 단색 카메라 형태를 취할 수 있다.

일반적으로, 이미징 기구(692)는 하이드로겔을 하나 이상의 상이한 조사 색으로 조사하는 중에 하이드로겔(682) 또는 그의 적어도 일부분의 이미지를 포착한다. 일부 실시 형태에서, 상기 하이드로겔(682)의 다수의 이미지가 다양한 조사 지속 기간 또는 강도에 의해 생성될 수 있으며, 다수의 이미지 중 하나 이상이 분석용으로 선택될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 하이드로겔(682)의 제1 면 및 제2 면의 선택적 조사를 이용하여 하이드로겔의 다수의 이미지를 생성할 수 있으며, 이미지들 중 하나 이상이 분석용으로 선택될 수 있다. 분석용 이미지의 선택은 예를 들어 개별 이미지의 사물 해상 특성 및/또는 색대비를 기반으로 할 수 있다. 이미지의 색대비 및 사물 해상 특성의 결정 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제6,243,286호에 개시되어 있다.

프로세서(694)는 이미징 기구(692)의 작동을 제어한다. 조작자에 의한 시각적 개관을 위하여 프로세서(694)로부터 이미지를 받을 수 있는 선택적 디스플레이(676)가 도 6에 또한 도시되어 있다. 작동에 있어서, 프로세서(694)는 이미징 기구(692)가 하이드로겔(682)을 조사하여 이미지를 획득하는 것을 제어한다. 프로세서(694)는 이미징 기구(692)로부터의 스캐닝된 이미지를 나타내는 이미지 데이터를 받는다. 일부 실시 형태에서, 프로세서(694)는 분석 및/또는 디스플레이를 위하여, 다수의 이미지로부터 하나의 이미지를 선택할 수 있다. 프로세서(694)는 하이드로겔(682)의 적어도 하나의 이미지를 분석하며, 분석 결과, 예를 들어 DNase 활성의 별개의 공급원의 계수치 또는 존재/부재 결과를 생성할 수 있다. 분석 결과(예를 들어, 정량적 또는 정성적 결과)는 디스플레이(676) 상에 디스플레이되거나, 선택적 데이터 저장 메모리(698)에 저장되거나, 선택적 통신 포트(695)를 통하여 호스트 컴퓨터(도시되어 있지 않음)에 의해 검색될 수 있다.

본 방법은 하이드로겔에서 데옥시리보뉴클레아제 활성을 검출하는 단계를 추가로 포함한다. 하이드로겔에서 데옥시리보뉴클레아제 활성을 검출하는 것은 하이드로겔의 이미지를 분석하는 것을 포함한다. DNase 효소 활성의 별개의 공급원의 존재 하에서는 DNA 분자는 절단되며, 따라서 DNA-메틸 그린 복합체는 붕해되고 그럼으로써 탈색된다. 상기 별개의 공급원으로부터의 DNase 활성의 확산은 하이드로겔에 의해 제한되기 때문에, 별개의 공급원(예를 들어, 세포 또는 세포 콜로니)과 결부된 DNase 활성에 의해 DNase 활성의 별개의 공급원에 인접한 상대적으로 덜 착색된 구역이 형성된다(즉, DNase 활성과 접촉하지 않은 하이드로겔의 다른 영역보다 DNase 활성의 공급원에 인접한 것이 녹색이 덜함). 전형적으로, 상대적으로 무색인 구역이 DNase 활성의 별개의 공급원 주위의 하이드로겔에서 나타날 것이다. 따라서, 하이드로겔의 이미지의 분석은 하이드로겔의 적어도 하나의 다른 부분보다 상대적으로 녹색이 덜한 하이드로겔의 구역들의 이미지의 분석을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 하이드로겔의 이미지의 분석은 하이드로겔의 하나 이상의 영역(또는 전체 영역)에서의 녹색의 양을 DNase 활성이 없는 상응하는 하이드로겔의 다른 이미지(즉, 음성 대조군)와 비교하는 것을 포함할 수 있다.

하이드로겔의 이미지의 분석은 이미지에서 색 및/또는 다양한 색조의 색(예를 들어, 적색, 녹색, 청색, 회색)을 검출하는 시스템을 사용하는 것을 포함할 수 있다. 적합한 이미지 분석 시스템은 예를 들어 각각이 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제5,448,652호; 미국 특허 제6,243,486호; 및 미국 특허 제6,153,400호에 개시된 이미지 분석 시스템을 포함한다.

소정의 실시 형태에서, 하이드로겔의 이미지 분석은 선택된 파장의 이미지의 분석을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이미지는 광범위한 스펙트럼의 가시광(예를 들어, "백색" 광)의 공급원을 이용하여 하이드로겔을 조사함으로써 수집된 컬러 이미지일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 이미지는 상대적으로 좁은 스펙트럼의 가시광의 복수의 공급원(예를 들어, 각각이 상대적으로 좁은 대역폭의 가시광, 예컨대 적색광, 녹색광 또는 청색광을 방출하는 발광 다이오드들의 조합)을 이용하여 하이드로겔을 조사함으로써 수집된 컬러 이미지일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 이미지는 상대적으로 좁은 스펙트럼의 가시광(예를 들어, 적색광, 녹색광 또는 청색광)의 2가지 이상의 상이한 공급원을 이용하여 하이드로겔을 조사하면서 수집한 2가지 이상의 이미지를 조합함으로써 만들어진 복합 이미지일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 이미지는 상대적으로 좁은 스펙트럼의 가시광(예를 들어, 적색광)의 공급원을 이용하여 하이드로겔을 조사하면서 수집한 이미지일 수 있다. 이들 실시 형태에서, 소정의 파장의 이미지가 이미지의 디스플레이 또는 인쇄 및/또는 이미지 분석용으로 선택될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 이미지 분석용으로 선택된 파장은 적색 내의 파장(예를 들어, 약 625 ㎚ 내지 약 740 ㎚의 파장)일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 분석용으로 선택된 파장은 약 630 ㎚ 내지 약 670 ㎚의 파장이다. 일부 실시 형태에서, 분석용으로 선택된 파장은 약 630 ㎚ 내지 약 650 ㎚의 파장이다.

상기 파장은 예를 들어 디스플레이, 인쇄 및/또는 분석용 이미지에서 소정의 범위의 파장을 전자적으로 선택하는 컴퓨터 프로그램을 사용함으로써 선택될 수 있다. 이미지에서 소정의 범위의 파장을 선택하기 위하여 임의의 적합한 컴퓨터 프로그램을 사용할 수 있다. 적합한 컴퓨터 프로그램의 비제한적인 예에는 어도비 시스템즈, 인크.(Adobe Systems, Inc.; 미국 캘리포니아주 산호세 소재)로부터 입수가능한 포토샵(PHOTOSHOP) CS4 소프트웨어 및 메디아 사이버네틱스(Media Cybernetics; 미국 매릴랜드주 실버 스프링즈 소재)로부터 입수가능한 이미지-프로 플러스(IMAGE-PRO Plus) 소프트웨어가 포함된다.

하이드로겔을 통과하고/하거나 하이드로겔에 의해 반사되는 적색 파장의 이미지의 수집을 바이어스시키는 방식으로 하이드로겔의 이미지를 획득 및/또는 분석한 소정의 실시 형태에서, 녹색 DNA-메틸 그린 복합체와 무색 탈중합 DNA 사이의 대비는 유의하게 향상된다. 따라서, 이들 실시 형태에서, DNase 활성은 수집되는 이미지의 파장을 바이어스시키지 않는 비견되는 방법에서보다 더 이른 시간에 검출가능해진다. 부가적으로, 하이드로겔을 통과하고/하거나 하이드로겔에 의해 반사되는 적색 파장들의 수집을 바이어스시키는 방법은 수집되는 이미지의 파장들을 바이어스시키지 않는 비견되는 방법에서보다 더 낮은 양의 DNase 활성의 검출을 가능케 한다.

샘플 내의 미생물의 검출 방법

본 발명은 샘플 내의 미생물을 검출하는 방법을 제공한다. 일부 실시 형태에서, 본 방법은 건조 조성물과, 미생물을 함유할 것으로 의심되는 샘플을 제공하는 단계를 포함한다. 건조 조성물은 냉수-용해성 겔화제와, 메틸 그린 및 DNA를 포함하는 지시 시스템을 함유하며, 이는 본 명세서에 기재된 바와 같다. 선택적으로, 건조 하이드로겔 조성물은 영양소, 선발제, 항생제, 지시제 또는 전술한 것 중 임의의 2가지 이상의 조합을 추가로 함유한다. 본 방법은 샘플을 포함하는 소정 부피의 수성 액체를 건조 조성물과 접촉시켜 재수화 하이드로겔을 형성하는 단계, 재수화 하이드로겔을 소정 기간 동안 인큐베이션하는 단계 및 미생물을 검출하는 단계를 추가로 포함한다.

건조 조성물은 조성물이 건조 및/또는 재수화 상태로 존재할 때 건조 조성물을 유지하기에 적합한 용품(예를 들어, 비커, 플라스크, 튜브, 페트리 디쉬) 상에 또는 그 내에 배치된다. 일부 실시 형태에서, 건조 조성물을 기재 상에 코팅하여 검출용품을 형성한다. 일부 실시 형태에서, 건조 조성물은 접착제 코팅된 기재 상에 분말 코팅되며, 건조 조성물은 접착제에 부착된다. 일부 실시 형태에서, 본 조성물은 수화되며, 기재 상에 코팅되며, 수화 조성물은 후속적으로 사실상 건조되어 건조 조성물을 형성한다. 수화 조성물이 코팅된 기재는 건조 조성물이 부착된 접착제를 포함할 수 있다. 기재의 코팅 방법 및, 선택적으로 기재 상의 코팅을 건조시켜 검출용품을 형성하는 방법이 예를 들어 각각이 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제4,565,783호; 재발행 미국 특허 제35,286호; 및 미국 특허 제6,022,682호에 개시되어 있다.

건조 조성물은 샘플을 포함하는 소정 부피(예를 들어, 1 ㎖, 3 ㎖, 5 ㎖)의 수성 액체와 접촉시킨다. 샘플은 수성 액체(물 또는 밀크의 샘플)를 포함할 수 있다. 샘플은 수성 액체(예를 들어, 물 또는 수성 완충제, 예컨대 인산염 완충 염수 또는 버터필드 완충제(Butterfield's buffer))에 현탁된 액체 또는 고형물을 포함할 수 있다. 선택적으로, 수성 액체를 건조 조성물과 접촉시키기 전 및/또는 후에 샘플을 포함하는 수성 액체에 영양소, 선발제, 지시제 또는 전술한 것 중 2가지 이상의 임의의 조합이 첨가될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 선발제는 예를 들어 세팔로틴, 세파졸린, 세프라딘, 세팔렉신, 세파드록실, 세파만돌, 세폭시틴, 세파클로르, 세푸록심, 세푸록심 악세틸, 로라카르베프, 세포니시드 세포테탄, 세포라니드, 세포탁심, 세프포독심 프록세틸, 세프티족심, 세픽스메세프트리악손, 세포페라존, 세프타지딤, 목슬락탐, 세피핌, 세프피롬 및 옥사실린과 같은 항생제를 포함한다. 샘플을 포함하는 수성 액체는 건조 조성물을 수화시켜 하이드로겔을 형성한다.

하이드로겔은 소정의 기간 동안 인큐베이션되며, 그 동안 미생물은 성장할 수 있고/있거나, 존재할 경우, 미생물과 관련된 DNase 활성은 DNase 지시 시스템과 상호작용할 수 있다. 인큐베이션 단계의 온도 및 지속 기간은 검출될 미생물에 따라 선택될 수 있다. 일반적으로, 박테리아 배양물은 22 - 45℃에서 16 - 48시간 동안 인큐베이션된다. 일부 실시 형태에서, 상기 배양물은 30 - 37℃에서 24 - 48시간 동안 인큐베이션된다. 느리게 성장하는 박테리아는 더욱 긴 기간 동안 인큐베이션될 수 있다. 일반적으로, 진균류 배양물(예를 들어, 효모 또는 사상 진균류)은 22 - 37℃에서 1 - 5일 동안 인큐베이션된다. 주어진 영양 배지에서 성장시킨 주어진 미생물을 위한 인큐베이션 조건의 결정은 충분히 당업자의 기술 이내이다. 일부 실시 형태에서, 미생물은 본 명세서에 기재된 바와 같이 DNase 지시 시스템과의 그의 상호작용에 의해 검출될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 미생물은 존재할 경우 하이드로겔 중의 추가의 지시제와의 그의 상호작용에 의해 검출될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 미생물은 하이드로겔 중의 DNase 지시 시스템, 선발제 및/또는 하나 이상의 추가의 지시 시스템과의 그의 상호작용에 의해 특정 유형(예를 들어, DNase-양성, DNase-음성, 대장균, 항생제-내성 등)으로 식별될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 지시 시스템과 상호작용하는 미생물의 수를 계수하여 원래 샘플에 존재하는 미생물의 수를 나타낼 수 있다.

미생물의 검출은 콜로니의 검출을 포함할 수 있다. 미생물 배양용 영양 배지에서 콜로니를 검출하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 콜로니를 시각적으로 또는 현미경에 의해 검출하는 것을 포함한다. 부가적으로, 또는 대안적으로, 미생물의 검출은 미생물 또는 미생물 군과 결부된 지시제를 검출하는 것을 포함할 수 있다. 미생물 검출에 적합한 지시제는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 발색 또는 형광 산화-환원 지시제(예를 들어, 트라이페닐 테트라졸륨 클로라이드), 발색 또는 형광 효소 기질(예를 들어, 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트, 4-움벨리페릴-베타-D-글루코피라노사이드), 또는 pH 지시제(예를 들어, 클로로페놀 레드, 브롬티몰 블루)를 포함한다. 부가적으로, 또는 대안적으로, 미생물의 검출은 DNase-생성 미생물과 결부된 DNase 활성의 검출을 포함할 수 있다. 본 발명은 항생제 내성 미생물의 검출을 위한 기구 및 방법을 제공한다. 스타필로코커스 아우레우스는 DNase 활성을 생성하는 것으로 공지되어 있기 때문에, 본 발명은 항생제-내성 에스. 아우레우스(예를 들어, 메티실린-내성 에스. 아우레우스, 또는 MRSA)를 검출 및 구별하기 위한 기구 및 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 DNase-생성 미생물의 조기 검출을 제공할 수 있다. 예를 들어, 방법은 2 ㎎/㎖의 DNA 및 20 ㎍/㎖의 메틸 그린을 포함하는 DNase 지시제를 포함하는 배양 배지를 접종하는 단계를 포함할 수 있다. 적합한 조건(예를 들어, 37℃) 하에서의 인큐베이션 후, 배양 배지의 이미지는 예를 들어 니콘(NIKON) E8400 디지털 카메라(미국 뉴욕주 멜벨 소재의 니콘, 인크.(Nikon, Inc.))를 이용하여 획득될 수 있으며, 이미지는 예를 들어 이미지-프로 플러스 소프트웨어(미국 매릴랜드주 실버 스프링스 소재의 메디아 사이버네틱스)를 이용하여 분석될 수 있다. 풀컬러(full-color) 이미지를 관찰하면, DNase-생성 미생물의 콜로니는 인큐베이션한지 약 12.5시간 후에 검출될 수 있다. 적색 채널 이미지를 관찰하면, DNase-생성 미생물의 콜로니는 인큐베이션한지 약 11.5시간 후에 검출될 수 있다.

일부 실시 형태에서, 본 방법은 이미징 시스템을 제공하는 단계, 및 하이드로겔의 이미지를 획득하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서, 미생물의 검출은 하이드로겔의 이미지의 디스플레이, 인쇄 또는 분석을 포함한다. 적합한 이미징 시스템 및 조건이 본 명세서에 기재되어 있다. 일부 실시 형태에서, 하이드로겔의 이미지는 조작자가 이미지를 관찰하여 샘플 중 DNase-생성 미생물의 존재 및/또는 수 또는 샘플 중 DNase-생성 미생물의 부재 및/또는 수를 탐지할 수 있도록 디스플레이된다. 일부 실시 형태에서, 이미지는 프로세서에 의해 분석되며, 상기 프로세서는 샘플 중 DNase-생성 미생물의 존재 및/또는 수 또는 샘플 중 DNase-생성 미생물의 부재 및/또는 수를 탐지한다.

본 발명의 키트

본 발명에 의해 제공되는 키트는 2개 이상의 부분을 포함한다. 하나의 부분은 냉수-용해성 겔화제 및 DNase 지시 시스템을 포함하는 검출용품 또는 배양 기구를 포함하며, 이는 본 명세서에 기재된 바와 같다. 각 키트의 제2 부분은 여과막, 피펫, 스프레더, 글러브, 샘플 획득 기구, 포착 요소, 샘플 현탁 매질, 시약으로 이루어진 부속 용품들, 및 전술한 부속 물품들 중 2가지 이상의 임의의 조합의 군으로부터 선택될 수 있다.

여과막은 키트의 배양 플레이트 기구의 스페이서의 개구 내에 맞추어지기에 적합한 형상 및 크기의 것이어야 한다. 상이한 종류의 필터가 키트에 구비될 수 있거나, 또는 다수의 키트가 다양한 필터를 포함할 수 있다. 감마 조사, 에틸렌 옥사이드 살균 또는 기타 살균에 의해 살균된 폴리에틸렌 코팅지 패키지와 같이 필터는 선택적으로 그리고 바람직하게는 무균 상태로 제공된다. 대안적으로, 필터는 사용자에 의해 살균되어야 할 비살균 유닛일 수 있다.

적합한 피펫 및 스프레더가 예를 들어 플라스틱 또는 유리로 만들어질 수 있다. 피펫 및 스프레더는 사전 살균 상태로 제공될 수 있거나 비살균 상태로 제공될 수 있다. 피펫 및 스프레더는 일회 사용 후 버릴 수 있거나 다회 사용을 위하여 재살균할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "피펫"은 공지된 부피에 상응하는 적어도 하나의 단계 표시(gradation mark) 및 피펫 팁을 갖는 부피 피펫(volumetric pipette)을 포함하며, 상기 피펫은 부피 피펫팅(volumetric pipetting) 기구에서 사용될 수 있다. 키트는 시약들의 패키지를 포함할 수 있다. 시약은 바람직하게는 살균 패키지, 예를 들어 포일 패키지, 예컨대 제약 산업에서 통상적으로 사용되는 것이다. 그러한 패키지의 일례가 니트로-비드(NITRO-BID) 연고(미국 미주리주 캔자스 시티 소재의 말론 래버러토리즈, 인크.(Marlon Laboratories, Inc.))에 사용된다. 키트에서 유용하고 필요한 시약의 선택은 평가될 미생물에 의존할 수 있다.

본 발명을 하기 비제한적인 실시예를 참고로 하여 추가로 예시할 것이다. 모든 부 및 백분율은 달리 표시되지 않으면 중량부로 표현된다. 달리 명시하지 않으면, 모든 시약은 시그마 케미칼 컴퍼니(미국 미주리주 세인트 루이스 소재)로부터 획득하였다.

실시예

실시예 1.

페트리필름 호기성 계수 플레이트에서의 성장 및 DNase 활성의 검출

인산염-완충 염수(PBS)를 10X 농축물(옴니푸르(OmniPur) 6505; 미국 뉴저지주 깁스타운 소재의 이엠디 케미칼스(EMD Chemicals))로 획득하였다. DNA(나트륨염, 연어 고환에서 유래) 및 메틸 그린 염료(염화아연염, 알드리치 198080-10G)를 시그마-알드리치(미국 미주리주 세인트 루이스 소재)로부터 획득하였다. λ-카라기난(비스카린 GP 109F계)을 에프엠씨 바이오폴리머(FMC BioPolymer; 미국 펜실베이니아주 필라델피아 소재)로부터 획득하였다. 쓰리엠 페트리필름 호기성 계수 플레이트 및 페트리필름 플레이트 판독기(PPR)를 쓰리엠 컴퍼니(미국 미네소타주 세인트 폴 소재)로부터 획득하였다. 에스. 아우레우스 ATCC 25923(DNase 양성, 메티실린-민감성)을 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection; 미국 버지니아주 머내서스 소재)으로부터 획득하였다. 에스. 에피더미디스 주 472(DNase-음성) 및 에스. 아우레우스 주 565(DNase 양성, 메티실린-내성)를 임상 단리체로부터 획득하였다.

DNA-PBS 용액의 용액은 2.0 ㎎/㎖의 DNA 및 0.1 ㎎/㎖의 λ 카라기난을 1X(10 mM) PBS에 첨가함으로써 제조하였다. 상기 혼합물을 DNA가 용해될 때까지 뚜껑을 덮은 용기에서 비등시켰다. DNA-PBS-MG의 원액은 각각 100 ㎍/㎖ 및 50 ㎍/㎖의 메틸 그린 염료를 DNA-PBS 용액의 분취물에 첨가함으로써 제조하였다. DNA-PBS-MG 원액의 부분들은 다양한 양의 DNA-PBS 완충제로 희석시켜 소정의 농도의 PBS와, 다양한 농도(0-60 ㎍/㎖)의 메틸 그린 염료를 포함하는 DNA(2 ㎎/㎖)를 함유하는 용액을 제조하였다. 모든 용액들을 250℃에서 15분 동안 오토클레이브하였다.

박테리아의 브로쓰 배양물은 트립신 처리 대두 브로쓰 배지 1 ㎖를 포함하는 개별 튜브에 접종하고 상기 튜브를 37℃에서 하룻밤 인큐베이션함으로써 제조하였다. 박테리아를 원심분리에 의해 펠렛화하고, 세척하고, 살균 PBS에 재현탁시켰다. 재현탁한 세포를 살균 PBS에 희석시켰다(1:10의 연속 희석). 2가지의 최고 희석물(각각 10^-4 및 10^-5)을 PBS-DNA-MG의 적절한 용액 내로 1:100으로 희석시키고, 각각의 희석된 혼합물 1 ㎖을 이용하여 제조업자의 지시에 따라 페트리필름 호기성 계수 플레이트에 접종하였다. 대조 플레이트 (박테리아가 없음)를 마찬가지로 접종하였다. 플레이트를 35℃에서 대략 20시간 동안 인큐베이션하였다. 계수가능한 범위(즉, 25-250개의 콜로니)로 넘버링된 콜로니를 포함하는 플레이트를 평가용으로 선택하였다. 성장 결과가 표 2에 예시되어 있다. 선택된 플레이트를 표준 페트리필름 호기성 계수 플레이트 세팅을 갖춘 페트리필름 플레이트 판독기를 사용하여 이미징하였다.

PPR에 의해 생성된 비트맵 이미지를 어도비 포토샵(등록상표) 소프트웨어(미국 캘리포니아주 산호세 소재의 어도비 시스템즈)로 불러오기(import)를 하였다. 상기 소프트웨어를 이용하여 이미지의 적색 채널을 관찰하여 콜로니와 결부된 DNase 활성으로 인한 콜로니 주위의 청징 구역을 가시화하였다. 박테리아 콜로니는 하기 2가지 상이한 수단에 의해 검출하였다: i) 콜로니는 플레이트 중의 무색 테트라졸륨 지시제를 적색 포르마잔 염료 - 이는 육안으로 보임 - 로 환원시켰으며, 플레이트의 이미지에서 관찰가능함, 및 ii) DNase-생성 콜로니는 DNase 지시 시스템과 상호작용하여 콜로니 주변에 무색 구역을 생성함. 상기 구역들은 시험한 모든 메틸 그린 농도에서 육안으로 보였다. 상기 구역들은 시험한 모든 메틸 그린 농도에서 페트리필름 플레이트 판독기에 의해 생성된 적색 이미지에서 용이하게 보였다. 데이터에 의하면, 더욱 높은 농도의 메틸 그린이 몇몇 미생물의 성장을 억제함이 나타났다. 그 결과는 표 2에 요약되어 있다.

실시예 2.

페트리필름 플레이트 이미지의 분석

페트리필름 호기성 계수 플레이트를 실시예 1에 설명한 바와 같이 준비하였다. 플레이트에 DNase-생성 미생물인 에스. 아우레우스 ATCC 25923을 접종하였다. 접종 후, 플레이트 내의 하이드로겔은 20 ㎍/㎖의 메틸 그린을 포함하였다. 실시예 1에 설명한 바와 같이 페트리필름 플레이트 판독기를 사용하여 플레이트를 이미징하였다.

적색, 녹색 및 청색 이미지를 이미지-프로 플러스 버전 6.3.0.512 소프트웨어로 내보내기(export)를 하였다. 녹색 또는 적색 LED로 조사될 때 플레이트의 회색톤(grayscale) 이미지를 대표하는 것들이 각각 도 7a 및 도 8a에 예시되어 있다. 녹색-조사 이미지에서는 꽤 보이지만 적색-조사 이미지에서는 보이지 않는 플레이트 격자 라인은 도면에서 누락시켰다.

도 7a에는 플레이트의 접종된 부분에서의 하이드로겔(782)이 예시되어 있다. 몇몇 박테리아 콜로니(784)가 또한 예시되어 있다. 픽셀 x,y 좌표(813, 292)로부터 픽셀 x,y 좌표(904, 380)까지 진행하는 관심있는 영역을 이미지 프로 플러스 소프트웨어의 라인 프로파일 도구를 이용하여 선택하였으며, 이를 상기 도면에서 라인 A로 나타낸다. 픽셀 강도 데이터를 이미지 분석 소프트웨어를 이용하여 추출하고, 라인 A를 따른 거리의 함수로서 도 7b에 도시한다. 강도 값은 하이드로겔 및 그 안의 사물에 의해 반사되는 광의 양에 비례한다.

도 7b의 데이터는, 박테리아 콜로니에 의해 점유된 영역(즉, 약 50의 픽셀 거리로부터 약 65의 픽셀 거리까지)을 제외하고는 관심있는 영역에서의 하이드로겔에 의한 녹색광의 흡수는 매우 적음을 보여준다.

도 8a에는 플레이트의 접종된 부분에서의 하이드로겔(882)이 예시되어 있다. 몇몇 박테리아 콜로니(884)가 또한 예시되어 있다. (도 7a와) 동일한 관심있는 영역을 이 이미지용으로 선택하였으며, 이는 라인 A로 나타내어져 있다. 픽셀 강도 데이터를 이미지 분석 소프트웨어를 이용하여 추출하고, 라인 A를 따른 거리의 함수로서 도 8b에 도시한다.

도 8b의 데이터는, 녹색 이미지로부터의 데이터와는 대조적으로, 박테리아 콜로니에 의해 점유된 영역(즉, 약 50의 픽셀 거리로부터 약 65의 픽셀 거리까지)이 매우 적은 적색광 흡수를 나타냄을 보여준다. 또한, 녹색 이미지로부터의 데이터와는 대조적으로, 도 8b는 콜로니로부터 떠날 때 하이드로겔에 의해 더 많은 적색광 흡수가 있으며 적색광 흡수의 양은 콜로니에 근접한 적색광 흡수의 양이 나머지 하이드로겔에 비하여 감소함을 보여주며, 이는 콜로니 주위의 DNA 가수분해 구역이 콜로니 주위의 하이드로겔에서의 더욱 높은 픽셀 강도에 의해 검출됨을 나타낸다.

[표 2]

실시예 3.

DNase -생성 미생물의 조기 검출

실시예 1에 설명한 바와 같이 메틸 그린을 포함하는 (50 ㎍/㎖) 그리고 메틸 그린을 포함하지 않는 PBS-DNA 용액을 제조하였다. 이 실험에서 메틸 그린을 함유하는 플레이트 전부에서 20 ㎍/㎖의 최종 농도를 메틸 그린에 대하여 사용하였다.

세척한 박테리아 세포(스타필로코커스 아우레우스 ATCC 주 25923)의 현탁물을 실시예 1에 설명한 바와 같이 제조하였다. 상기 현탁물을 희석시키고, 페트리필름 호기성 계수 플레이트 내에 접종하였으며, 이는 실시예 1에 설명한 바와 같다.

접종된 플레이트를 37℃로 설정한 금속 히트블록(heat block)의 상부 상에 배치하였다. 니콘 E8400 디지털 카메라(미국 뉴욕주 멜벨 소재의 니콘, 인크.)를 상기 플레이트 위에 위치시켰다. 카메라를 이미지-프로 플러스 버전 6.3.0.512 소프트웨어를 통하여 컴퓨터에 연결시켰는데, 이 소프트웨어는 24시간 동안 매 30분마다 플레이트의 디지털 사진을 촬영하도록 프로그래밍되어 있다. 절연 커버를 카메라 및 히트 블록 장치 위에 배치하여 플레이트의 온도를 37℃에서 유지하였다. 디지털 카메라의 사전 프로그래밍된 설정치가 표 3에 예시되어 있다.

[표 3]

디지털 사진을 어도비 포토샵 버전 5.5로 불러오기를 하고, 각각의 이미지의 적색 채널을 관찰하였다. 관찰할 때 모든 이미지를 확대하였다(150-200×). 일반적으로, 콜로니는 플레이트의 적색 채널 이미지에서 회색 스폿으로 보였으며, 콜로니는 플레이트의 풀컬러 이미지에서 적색 스폿으로 보였다. 에스. 아우레우스 콜로니는 접종한 후 9.5시간 내에 적색 채널 이미지에서 보였다. DNase 활성의 얇은 백색 구역이 접종 후 11.5시간 내에 적색 채널 이미지에서 보였다. 이와는 대조적으로, 인큐베이션한지 10시간 후까지는 동일 플레이트의 컬러 이미지에서 콜로니가 보이지 않았으며, 인큐베이션한지 12시간 후까지는 동일 플레이트의 컬러 이미지에서 청징 구역이 보이지 않았다. 표 4에는 인큐베이션한지 9-15시간인 것으로부터의 각각의 플레이트에 대하여 관찰한 결과의 요약이 예시되어 있다.

[표 4]

권한이 부여된 설명을 할 수 있는 발명자가 예견한 몇몇 특정 실시 형태들을 참고로 하여 본 발명이 이제까지 설명되었다. 그럼에도 불구하고, 현재 예견되지 않은 변경을 비롯한 본 발명의 가상의 변경이 본 발명에 대한 등가물을 구성할 수 있다. 따라서, 본 발명의 범주는 본 명세서에 기재된 상세 내용 및 구조에 의해 한정되어서는 안 되며, 오히려 하기 특허청구범위 및 그 등가물에 의해서만 한정되어야 한다.

Claims (37)

1. 냉수-용해성 겔화제와 메틸 그린 및 DNA를 포함하는 DNase 지시 시스템을 포함하는 건조 조성물, 및 미생물을 함유할 것으로 의심되는 샘플을 제공하는 단계;
   샘플을 포함하는 소정 부피의 수성 액체를 건조 조성물과 접촉시켜 하이드로겔을 형성하는 단계;
   소정 시간 동안 하이드로겔을 인큐베이션하는 단계; 및
   미생물을 검출하는 단계를 포함하는, 미생물을 검출하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 소정 부피의 수성 액체와의 접촉 후, 하이드로겔 중 메틸 그린의 농도는 약 5 ㎍/㎖ 내지 약 100 ㎍/㎖인 방법.
3. 제1항에 있어서, 소정 부피의 수성 액체와의 접촉 후, 하이드로겔 중 메틸 그린의 농도는 약 5 ㎍/㎖ 내지 약 60 ㎍/㎖인 방법.
4. 제1항에 있어서, 소정 부피의 수성 액체와의 접촉 후, 하이드로겔 중 메틸 그린의 농도는 약 5 ㎍/㎖ 내지 약 20 ㎍/㎖인 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 건조 조성물은 영양소, 선발제 또는 지시제를 추가로 함유하는 방법.
6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 영양소, 선발제, 지시제 또는 전술한 것 중 2가지 이상의 임의의 조합을 제공하는 단계를 추가로 포함하며, 샘플을 포함하는 수성 액체는 영양소, 선발제, 지시제 또는 전술한 것 중 2가지 이상의 임의의 조합을 추가로 포함하는 방법.
7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 선발제는 항생제를 포함하는 방법.
8. 제7항에 있어서, 항생제는 세팔로틴, 세파졸린, 세프라딘, 세팔렉신, 세파드록실, 세파만돌, 세폭시틴, 세파클로르, 세푸록심, 세푸록심 악세틸, 로라카르베프, 세포니시드 세포테탄, 세포라니드, 세포탁심, 세프포독심 프록세틸, 세프티족심, 세픽스메세프트리악손, 세포페라존, 세프타지딤, 목슬락탐, 세피핌, 세프피롬 및 옥사실린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
   이미징 시스템을 제공하는 단계; 및
   이미징 시스템을 이용하여 하이드로겔의 이미지를 획득하는 단계를 추가로 포함하며,
   미생물을 검출하는 단계는 하이드로겔의 이미지를 디스플레이하는 단계, 인쇄하는 단계 또는 분석하는 단계를 포함하는 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 유형의 미생물을 계수하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
11. 메틸 그린 및 DNA를 포함하는 DNase 지시 시스템을 포함하는 하이드로겔 - 여기서, 하이드로겔 중 메틸 그린의 농도는 약 5 ㎍/㎖ 이상 그리고 49 ㎍/㎖ 미만임 - 과, 데옥시리보뉴클레아제 활성의 별개의 공급원을 함유할 것으로 의심되는 샘플을 제공하는 단계;
    소정의 시간 동안 샘플과 하이드로겔을 접촉시키는 단계; 및
    데옥시리보뉴클레아제 활성의 별개의 공급원을 검출하는 단계를 포함하는, 데옥시리보뉴클레아제 활성을 검출하는 방법.
12. 메틸 그린 및 DNA를 포함하는 DNase 지시 시스템을 포함하는 하이드로겔과, 데옥시리보뉴클레아제 활성의 별개의 공급원을 함유할 것으로 의심되는 샘플과, 이미징 시스템을 제공하는 단계;
    소정의 시간 동안 샘플과 하이드로겔을 접촉시키는 단계;
    이미징 시스템을 이용하여 하이드로겔의 이미지를 획득하는 단계; 및
    데옥시리보뉴클레아제 활성의 별개의 공급원을 검출하는 단계를 포함하며, 데옥시리보뉴클레아제 활성을 검출하는 단계는 하이드로겔의 이미지를 디스플레이하는 단계, 인쇄하는 단계 또는 분석하는 단계를 포함하는, 데옥시리보뉴클레아제 활성을 검출하는 방법.
13. 제12항에 있어서, 하이드로겔 중 메틸 그린의 농도는 적어도 약 5 ㎍/㎖ 내지 약 100 ㎍/㎖인 방법.
14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 데옥시리보뉴클레아제 활성의 별개의 공급원은 미생물인 방법.
15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 하이드로겔은 영양소, 선발제, 항생제 또는 지시제를 추가로 포함하는 방법.
16. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 영양소, 선발제, 지시제 또는 전술한 것 중 2가지 이상의 임의의 조합을 제공하는 단계를 추가로 포함하며, 소정의 시간 동안 접촉시키는 단계는 샘플 및 하이드로겔을 영양소, 선발제, 지시제 또는 전술한 것 중 2가지 이상의 임의의 조합과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 선발제는 항생제를 포함하는 방법.
18. 제17항에 있어서, 항생제는 세팔로틴, 세파졸린, 세프라딘, 세팔렉신, 세파드록실, 세파만돌, 세폭시틴, 세파클로르, 세푸록심, 세푸록심 악세틸, 로라카르베프, 세포니시드 세포테탄, 세포라니드, 세포탁심, 세프포독심 프록세틸, 세프티족심, 세픽스메세프트리악손, 세포페라존, 세프타지딤, 목슬락탐, 세피핌, 세프피롬 및 옥사실린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
19. 제9항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 이미징 시스템은 조명원을 포함하며, 하이드로겔의 이미지를 획득하는 단계는 하이드로겔을 조사하는 단계를 포함하는 방법.
20. 제19항에 있어서, 하이드로겔을 조사하는 단계는 제한된 밴드의 가시 파장으로 하이드로겔을 조사하는 단계를 포함하는 방법.
21. 제20항에 있어서, 제한된 밴드의 가시 파장은 약 625 ㎚ 내지 약 740 ㎚의 범위의 파장으로부터 선택되는 방법.
22. 제20항에 있어서, 제한된 밴드의 가시 파장은 약 630 ㎚ 내지 약 650 ㎚의 범위의 파장으로부터 선택되는 방법.
23. 제19항에 있어서, 하이드로겔을 조사하는 단계는 하이드로겔을 조사하기 위하여 또는 하이드로겔의 이미지를 수집하기 위하여 바이어스 필터를 사용하는 단계를 포함하는 방법.
24. 제9항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 이미지 분석 시스템을 제공하는 단계를 추가로 포함하며, 이미지를 분석하는 단계는 이미지 분석 시스템을 이용하여 이미지를 분석하는 단계를 포함하는 방법.
25. 제24항에 있어서, 이미지를 분석하는 단계는 선택된 파장의 이미지를 분석하는 단계를 포함하는 방법.
26. 제25항에 있어서, 선택 파장은 약 625 ㎚ 내지 약 740 ㎚의 범위에서 선택되는 방법.
27. 제25항에 있어서, 선택 파장은 약 630 ㎚ 내지 약 650 ㎚의 범위에서 선택되는 방법.
28. 상부 및 하부 표면을 갖는 자기 지지형 방수 기재를 포함하는 몸체 부재를 포함하며,
    냉수-용해성 겔화제 및 지시 시스템을 포함하는 건조 코팅은 몸체 부재의 적어도 하나의 표면의 일부분 상에 균일하게 부착되고,
    지시 시스템은 DNA 및 메틸 그린을 포함하는 검출용품.
29. 제28항에 있어서, 소정 부피의 액체와의 접촉 후, 겔화제는 하이드로겔을 형성하며, 하이드로겔 중 메틸 그린의 농도는 약 5 ㎍/㎖ 내지 약 100 ㎍/㎖인 용품.
30. 제29항에 있어서, 소정 부피의 액체와의 접촉 후, 겔화제는 하이드로겔을 형성하며, 하이드로겔 중 메틸 그린의 농도는 약 5 ㎍/㎖ 내지 약 60 ㎍/㎖인 용품.
31. 제29항에 있어서, 소정 부피의 액체와의 접촉 후, 겔화제는 하이드로겔을 형성하며, 하이드로겔 중 메틸 그린의 농도는 약 5 ㎍/㎖ 내지 약 20 ㎍/㎖인 용품.
32. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 코팅은 영양 배지, 지시제, 선발제 또는 전술한 것 중 2가지 이상의 임의의 조합을 추가로 포함하는 용품.
33. 제32항에 있어서, 선발제는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 성장에 대하여 선발하는 용품.
34. 제33항에 있어서, 선발제는 세팔로틴, 세파졸린, 세프라딘, 세팔렉신, 세파드록실, 세파만돌, 세폭시틴, 세파클로르, 세푸록심, 세푸록심 악세틸, 로라카르베프, 세포니시드 세포테탄, 세포라니드, 세포탁심, 세프포독심 프록세틸, 세프티족심, 세픽스메세프트리악손, 세포페라존, 세프타지딤, 목슬락탐, 세피핌, 세프피롬 및 옥사실린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 용품.
35. 냉수-용해성 겔화제, DNA 및 메틸 그린을 포함하는 건조 코팅을 포함하는 검출용품을 포함하는 키트.
36. 제35항에 있어서, 검출용품은 영양소, 선발제, 지시제 또는 전술한 것 중 임의의 2가지 이상의 조합을 추가로 포함하는 키트.
37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 항생제를 추가로 포함하는 키트.

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