CN102333884B - 用于检测脱氧核糖核酸酶活性的方法和制品 - Google Patents
用于检测脱氧核糖核酸酶活性的方法和制品 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供可用于检测DNA酶活性的离散来源的制品和方法。可检测出产DNA酶微生物。所述装置还可包括用于区分微生物群体或种类的选择剂和/或指示剂。使用方法包括检测或计数产DNA酶微生物。
Description
相关专利申请的交叉引用
本申请要求于2009年2月26日提交的美国临时专利申请No.61/155,666的权利,将该临时专利申请以引用方式并入本文。
背景技术
DNA核酸酶(DNA酶)在生物细胞中普遍存在,参与许多细胞功能,包括例如DNA复制和修复。某些微生物(例如粘膜炎布兰汉球菌(Branhamella catarrhalis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、化脓链球菌(Streptococcuspyogenes)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、茄病镰刀菌(Fusarium solani)能产生分泌出细胞的DNA酶。
DNA核酸酶(DNA酶)被用于许多研究和诊断应用中。已开发出DNA酶活性测定法来监测该酶。在研究应用中,DNA酶测定法常常采用放射性标记的DNA底物,并需要将反应的产物与未反应的底物分离开来,然后才对酶活性进行定量。Tolun和Myers开发了基于DNA染料配体的差异荧光输出的连续DNA酶测定法(Nuc.Acid Res.31:e111,2003)。他们的测定法需要分光荧光计来检测DNA酶活性。
DNA核酸酶已被用于检测会将该酶分泌到细胞或细胞集落周围环境中的微生物,如金黄色葡萄球菌。包含营养物、琼脂和如下指示剂系统的培养基已被用于检测金黄色葡萄球菌,所述指示剂系统包含DNA(通常为高分子量的DNA或大的寡核苷酸)以及100μg/mL甲苯胺蓝O或50μg/mL甲基绿。培养方法通常需要费力的程序来制备琼脂,而琼脂一旦制备必须在相对较短时间内使用。
因此对于用来检测DNA酶活性和检测能产生DNA酶的微生物的稳定制品及简单低廉的方法存在着需求。
发明内容
鉴于当前用来检测DNA酶活性的一般方法需要复杂的技术和/或昂贵的设备,本发明包括可用低成本的成像系统来执行的简单方法。在一些实施例中,本发明方法提供DNA酶活性的定量或半定量测定。在一些实施例中,本发明方法提供微生物的定量或半定量测定。
另外,本发明包括用来检测产DNA酶微生物的简单廉价的制品和方法。本发明人已观察到,在本领域通常使用的甲基绿浓度下,一些产DNA酶微生物的生长会被显著抑制。本发明人已发现了使用出乎意料地低的浓度的甲基绿来检测产DNA酶微生物的方法。较低浓度的染料使得产DNA酶微生物可更好地生长,和/或使得产DNA酶微生物可从环境胁迫或代谢胁迫中更好地恢复过来,从而使得可更快地检测产DNA酶微生物。另外,通过使用成像系统和通过对用来采集、分析和/或显示图像的光的波长进行偏置,本发明方法提供更简单、更早期和更一致的DNA酶活性检测。
因此,在一个方面,本发明提供检测微生物的方法。该方法可包括提供干组合物和怀疑含有微生物的样品。该干组合物可包含冷水可溶性胶凝剂及包括甲基绿和DNA的DNA酶指示剂系统。该方法可进一步包括使预定体积的包含样品的水性液体与该干组合物接触以形成水凝胶,将该再水化的水凝胶温育一段时间,然后检测微生物。
在一些实施例中,该干组合物可进一步包含营养物、选择剂或指示剂。在一些实施例中,该方法可进一步包括提供营养物、选择剂、指示剂或者前述两者或更多者的任意组合的步骤;其中该包含该样品的水性液体进一步包含该营养物、该选择剂、该指示剂或者前述两者或更多者的任意组合。在一些实施例中,选择剂可包含抗生素。在一些实施例中,抗生素选自头孢噻吩、头孢唑啉、头孢拉定、头孢氨苄、头孢羟氨苄、头孢孟多、头孢西丁、头孢克洛、头孢呋辛、头孢呋辛乙酰氧乙酯、氯碳头孢、头孢尼西、头孢替坦、头孢雷特、头孢噻肟、头孢泊肟普塞酯、头孢唑肟、头孢克肟、头孢曲松、头孢哌酮、头孢他啶、拉氧头孢(moxlactam)、头孢吡肟(cefipime)、头孢匹罗和苯唑西林。
在一些实施例中,该方法可进一步包括提供成像系统和用该成像系统获取该水凝胶的图像。在这些实施例中,检测微生物可包括显示(例如在计算机显示器上)、打印或分析该水凝胶的图像。
在一些实施例中,该方法可进一步包括对一种或多种类型的微生物进行计数。
在另一个方面,本发明提供检测脱氧核糖核酸酶活性的方法。该方法可包括提供包含DNA酶指示剂系统(其包括甲基绿和DNA)的水凝胶以及怀疑含有脱氧核糖核酸酶活性的离散来源(discrete source)的样品。甲基绿在该水凝胶中可占至少约5μg/mL至不超过49μg/mL。该方法还可包括使该样品与该水凝胶接触预定的时间段,然后检测脱氧核糖核酸酶活性。
在另一个方面,本发明提供检测脱氧核糖核酸酶活性的方法。该方法可包括提供包含DNA酶指示剂系统(其包括甲基绿和DNA)的水凝胶、怀疑含有脱氧核糖核酸酶活性的离散来源的样品以及成像系统。该方法还可包括使该样品与该水凝胶接触预定的时间段。该方法还可包括用该成像系统获取该水凝胶的图像和检测脱氧核糖核酸酶活性的离散来源,其中检测脱氧核糖核酸酶活性包括显示、打印或分析该水凝胶的图像。
在任何上述实施例中,该水凝胶可进一步包括营养物、选择剂、抗生素和/或指示剂。在任何上述实施例中,该方法可进一步包括提供营养物、选择剂、指示剂或者前述两者或更多者的任意组合的步骤;其中接触预定的时间段包括使该样品和该水凝胶与该营养物、该选择剂、该指示剂或者前述两者或更多者的任意组合接触。在任何上述实施例中,选择剂可包含抗生素。在任何上述实施例中,抗生素选自头孢噻吩、头孢唑啉、头孢拉定、头孢氨苄、头孢羟氨苄、头孢孟多、头孢西丁、头孢克洛、头孢呋辛、头孢呋辛乙酰氧乙酯、氯碳头孢、头孢尼西、头孢替坦、头孢雷特、头孢噻肟、头孢泊肟普塞酯、头孢唑肟、头孢克肟、头孢曲松、头孢哌酮、头孢他啶、拉氧头孢、头孢吡肟、头孢匹罗和苯唑西林。
在任何上述的包括成像系统的实施例中,该成像系统可包括照明源,该获取该水凝胶的图像的步骤可包括照明该水凝胶。在任何上述的包括成像系统的实施例中,照明该水凝胶可包括用有限波段的可见光波长照明该水凝胶。在任何上述的包括成像系统的实施例中,该水凝胶可用选自约625nm至约740nm范围内的波长的可见光波长进行照明。在任何上述的包括成像系统的实施例中,获取该制品的图像可包括使用偏置滤波器来照明该水凝胶或者来采集该图像。在任何上述的包括成像系统的实施例中,分析该图像可包括分析选定波长的该图像。
在另一个方面,本发明提供检测制品。该检测制品可包括主体构件,该主体构件包括具有上表面和下表面的自支撑防水基材。包含冷水可溶性胶凝剂和DNA酶指示剂系统的干涂层可均匀地粘附至该主体构件的至少一个表面的一部分上。该DNA酶指示剂系统可包含DNA和甲基绿。在一些实施例中,在与预定体积的液体接触后,该胶凝剂可形成水凝胶,在该水凝胶中甲基绿的浓度为至少约5μg/mL至约100μg/mL。
在一些实施例中,该涂层还可包含营养培养基、指示剂、选择剂或前述两者或更多者的任意组合。在一些实施例中,该选择剂可对金黄色葡萄球菌的生长具有选择作用。在一些实施例中,该选择剂可包含抗生素。在一些实施例中,抗生素选自头孢噻吩、头孢唑啉、头孢拉定、头孢氨苄、头孢羟氨苄、头孢孟多、头孢西丁、头孢克洛、头孢呋辛、头孢呋辛乙酰氧乙酯、氯碳头孢、头孢尼西、头孢替坦、头孢雷特、头孢噻肟、头孢泊肟普塞酯、头孢唑肟、头孢克肟、头孢曲松、头孢哌酮、头孢他啶、拉氧头孢、头孢吡肟、头孢匹罗和苯唑西林。
在另一个方面,本发明提供试剂盒。该试剂盒可包括检测制品,该检测制品包含干涂层,该干涂层包含冷水可溶性胶凝剂、DNA和甲基绿。在一些实施例中,该检测制品可进一步包含营养物、选择剂、指示剂或前述两者或更多者的任意组合。在一些实施例中,该试剂盒可进一步包含抗生素。
词语“优选的”和“优选地”指在某些情况下,可提供某些有益效果的本发明实施例。然而,在相同的情况或其它情况下,其它实施例也可能是优选的。此外,对一个或多个优选实施例的表述并不暗示其它实施例是不可用的,且并非意图将其它实施例排除在本发明范围之外。
本文所用的“一种(个)”、“所述(该)”、“至少一种(个)”以及“一种(个)或多种(个)”可互换使用。因此,例如,怀疑含有“一种”微生物的样品可被解释为意指该液体可包含“一种或多种”微生物。
术语“和/或”意指所列要素的一个或全部,或所列要素的任何两个或更多个的组合。
本文通过端点表述的数值范围包括该范围内的所有数值(比如,1-5包含1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。
本发明的上述发明内容并非意图描述本发明的每个公开的实施例或每种实施方式。以下具体实施方式更具体地举例说明了示例性实施例。在本专利申请全文的几处,通过例子列表提供指导,可以不同组合使用这些例子。在每一种情况下,所引用的列表均仅用作一个代表性的组,不应被理解为是排他性列表。
附图说明
本发明将结合下面所列的附图进行进一步的阐述,其中在几个视图中相同的结构由相同的数字指代。
图1是包括隔离物的薄膜培养装置的一个实施例的顶部透视图(局部剖视)。
图2是包括网格图案的自支撑基材的一个实施例的顶视图。
图3是薄膜培养装置的一个实施例的顶部透视图(局部剖视)。
图4是包括隔离物的薄膜培养装置的一个实施例的顶部透视图(局部剖视)。
图5是根据本发明的具有隔离物的检测制品的一个实施例的顶部透视图(局部分解图)。
图6是根据本发明的检测系统的一个实施例的框图。
图7a是用绿色发光二极管照明的PETRIFILM板的黑白图像的示图,其中所关注的选定区域由线条A表示。
图7b是位于图7a的线条A上的像素的像素强度数据的曲线图。
图8a是用红色发光二极管照明的PETRIFILM平板的黑白图像的示图,其中所关注的选定区域由线条A表示。
图8b是位于图8a的线条A上的像素的像素强度数据的曲线图。
具体实施方式
在详细说明本发明的任何实施例之前,应当理解,本发明并不将其应用局限于以下描述所提及的或附图所示出的具体构造和组件布置方式。本发明能有其他的实施例,并且能够以多种方式进行实践或实施。另外应该理解的是,本文中所用的用语和术语的目的是为了进行说明,不应被认为是限制性的。本文的“包括”、“包含”、“含有”或“具有”及其变型的使用旨在涵盖随后所列的项及其等同物以及附加项。除非指明或另外限定,否则术语“支承”和“连结”及其变型按广义使用,均涵盖直接和间接的支承和连结。应理解,其他的实施例也可采用,且可在不偏离本发明范围的情况下作出结构变化或逻辑变化。另外,诸如“前部”、“后部”、“顶部”和“底部”等之类的术语仅用于描述相对于彼此的元件,而绝非旨在细述设备的特定取向、指示或暗示必需或必要的设备的取向或者指定在使用中将要如何使用、安装、显示或布置本文描述的本发明。
本发明整体涉及用于检测和区分样品中的微生物的方法和制品。具体而言,本发明涉及产DNA酶微生物的检测和区分。在一些实施例中,本发明公开的方法和制品可用于检测能产生被称为耐热核酸酶(TNA酶)的热稳定性DNA酶的微生物。在一些实施例中,产DNA酶微生物的检测包括对样品中的产DNA酶微生物进行计数。合适的样品可获自或源自多种来源。
术语“来源”通常用来指需要测试微生物的食物或非食物。来源可以是固体、液体、半固体、凝胶状材料及其组合。在一些实施例中,来源可由捕集元件提供,该捕集元件用于例如从所关注的表面或者从空气采集该来源。在一些实施例中,液体组合物可包括捕集元件,该捕集元件可进一步被破碎分开(例如在搅动或溶解过程中)以增强该来源和任何所关注的微生物的回收。所关注的表面可包括多个表面的至少一部分,所述表面包括但不限于墙壁(包括门在内)、地板、天花板、排水沟、冷却系统、导管(例如空气导管)、通风孔、盥洗室座位、把手、门把手、栏杆、床栏杆(例如在医院中)、工作台面、桌面、用餐表面(例如盘子、碟子等)、工作表面、设备表面、服装等,以及它们的组合。该来源的全部或一部分可用于该方法中。当使用该来源的一部分时,这有时可以称作该来源的“样品”。但是,术语“样品”在本文中一般用来指从该来源获取并被引入到培养板装置中以进行微生物检测的那部分材料体积或质量。
术语“食物”通常用于指固体、液体(例如,包括但不限于溶液、分散体、乳状液、悬浮液等以及它们的组合)和/或半固体可食用组合物。食物的例子可包括(但不限于)肉类、家禽、蛋、鱼、海鲜、蔬菜、水果、预加工食品(如汤、调味汁、糊)、谷物产品(如面粉、谷类食物、面包)、罐装食物、奶、其他乳制品(如奶酪、酸奶、酸奶油)、脂肪、油类、甜点、调味品、香料、面食、饮料、水、动物饲料、其他合适的可食用材料以及它们的组合。
术语“非食物”通常用于表示不在“食物”定义之内且通常认为不可食用的所关注的源。非食物来源的例子可包括但不限于临床样品、细胞裂解物、全血或其部分(例如血清)、其他体液或分泌物(例如唾液、汗液、皮脂、尿液)、粪便、细胞、组织、器官、活组织切片、植物材料、非饮用水、木材、土壤、沉淀物、药品、化妆品、膳食补充剂(例如人参胶囊)、医药品、传染体、其他合适的非可吃材料以及它们的组合。
“样品获取装置”在本文中以最广义的含义使用,指用来收集液体、半固体或固体样品材料的器具。样品获取装置的非限制性例子包括拭子、擦拭物、海绵、勺子、刮刀、压舌板、过滤器、移液管、移液管头和虹吸管。
术语“传染体”通常用于指能够携带和/或传播传染性有机体的无生命物体或基质。传染体可包括(但不限于):布、拖把头、毛巾、海绵、抹布、餐具、硬币、纸币、手机、衣物(包括鞋子)、门把手、女性用品、尿布等以及它们的部分或它们的组合。
术语“微生物”通常用来指任何能够在培养基中生长和繁殖的用显微镜可见的原核或真核生物体,包括但不限于细菌(例如运动型细菌、细菌营养体、革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌)、细菌孢子或内生孢子、真菌(例如酵母、丝状真菌、真菌孢子)中的一者或多者。在一些情况下,特别要关注的微生物是病原性的那些,术语“病原体”用于指任何病原微生物。病原体的例子可包括但不限于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的成员,或者微球菌科(Micrococcaceae)的成员,或者以下各属:葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)、链球菌属(Streptococcusspp.)、假单胞杆菌属(Pseudomonas spp.)、肠球菌属(Enterococcus spp.)、沙门氏菌属(Salmonella spp.)、军团菌属(Legionella spp.)、志贺氏菌属(Shigella spp.)、耶尔森氏菌属(Yersinia spp.)、肠杆菌属(Enterobacterspp.)、埃希氏菌属(Escherichia spp.)、芽孢杆菌属(Bacillus spp.)、李斯特菌属(Listeria spp.)、弯曲杆菌属(Campylobacter spp.)、不动杆菌属(Acinetobacter spp.)、弧菌属(Vibrio spp.)、梭菌属(Clostridium spp.)和棒杆菌属(Corynebacteria spp.)。病原体的具体例子可包括(但不限于)大肠杆菌,其包括肠出血性大肠杆菌例如血清型O157:H7、铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)、粘膜炎布兰汉球菌(Branhamellacatarrhalis)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、艰难梭菌(Clostridiumdifficile、耐万古霉素肠球菌(Enterococcus)、化脓性链球菌、粘质沙雷氏菌和阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)。可能影响微生物生长的环境因素可包括营养物质存在与否、pH值、含水量、氧化-还原电位、抗微生物化合物、温度、大气气体组成和生物结构或屏障。
DNA酶指示剂系统
本发明的制品和方法包括DNA酶指示剂系统。该DNA酶指示剂系统包含DNA和甲基绿。任选地,该指示剂系统可进一步包含粘合剂如λ-角叉菜胶和/或缓冲剂。在使用时,将该DNA酶指示剂系统与胶凝剂如琼脂或冷水可溶性胶凝剂(例如瓜耳胶、黄原胶、刺槐豆胶以及它们的组合)进行混合。在一些实施例中,将与胶凝剂混合的该DNA酶指示剂系统如本文所述涂覆在基材上。
甲基绿与DNA分子形成稳定的复合物。当甲基绿复合的DNA解聚(例如通过酶促水解)时,甲基绿变成无色的。Smith等人(1969.Appl.Microbiol.,18:991)证明产DNA酶细菌可在含有DNA和甲基绿的微生物培养基中检测到。
该指示剂系统中的DNA通常容易商购获得(例如,鲑精DNA可获自Sigma-Aldrich,St.Louis,MO),且可以是任何具有足够分子量的DNA,使得它能够与甲基绿形成绿色的复合物。甲基绿的盐形式(例如甲基绿氯化锌盐)可用于该指示剂系统,且可获自例如Sigma-Aldrich(St.Louis)。
培养装置:
本发明包括用于DNA酶活性的检测的制品。该检测制品包括用于生长和检测微生物的培养装置。本发明的培养装置包括例如薄膜培养板装置。薄膜培养板装置通常比传统的琼脂平皿更加紧凑,且通常含有干燥的可再水化的培养基以支持某些微生物的生长。薄膜培养板装置的非限制性例子包括美国专利No.4,565,783、No.5,089,413和No.5,681,712中公开的带涂层基材装置;将所述专利中每一个都以引用方式全文并入本文。
图1示出根据本发明的薄膜培养装置的一个实施例。培养装置110包括主体构件,该主体构件包括具有上下表面(分别为112a和112b)的自支撑防水基材112。基材112可为相对坚硬的膜(例如聚酯、聚丙烯或聚苯乙烯),该膜不会吸水或者以别的方式被水影响。基材112可为透明的或不透明的,这取决于是否想要透过该基材观察细菌菌落。为有利于细菌菌落的计数,基材212可在其上印刷有网格图案(例如方格),如图2中所示。
参见图1,基材112可在其上表面112a上涂覆有一层粘合剂114,该粘合剂的作用是将干胶凝剂、DNA酶指示剂系统和/或营养物以均匀单层的形式保持以便容易水化。粘合剂114应以优选小于粉末化胶凝剂和/或营养物的粒子直径的厚度涂覆到基材112上。目的是施加足够的粘合剂以将粒子粘附到基材,但又不太多而造成粒子完全嵌在粘合剂中。冷水可溶性粉末的均匀单层116是所期望的,其表面积充分暴露以便水化。图1中还示出了可任选的在覆盖片122上的粘合剂层114′和冷水可溶性粉末层116′。当用水溶液(例如该样品和/或含水助悬介质,如水或缓冲液)进行水化时,胶凝剂形成水凝胶。
在一些实施例中,粘合剂114可包含水基粘合剂组合物。优选地,水基粘合剂层114当被含水测试样品湿润时充分透明,以使得能够观察微生物菌落。该水基粘合剂组合物可掺入一种或多种亲水剂,包括营养物、选择剂、指示剂(例如DNA酶指示剂系统、酶底物、染料)或者它们的组合。本领域技术人员参考本说明书,根据所要培养和/或选择性检测(例如染色)或抑制的具体微生物,将显而易见地知道水基粘合剂组合物中使用的具体营养物和/或选择剂。
示例性的一类有用的选择剂包括这样的染料,其可被生长中的微生物代谢或者以其他方式与生长中的微生物反应,由此造成微生物菌落被着色或者发荧光,以易于由技术人员或由自动读数器检测和/或定量。这种染料的非限制性例子包括氯化三苯基四唑、对甲苯基四唑红、四唑紫、藜芦基四唑蓝、中性红、酚红、氯酚红和5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸二钠盐。但是应认识到,取决于所要鉴定的具体生物体,也可使用其他合适的染料。本领域普通技术人员会认识到,任何根据本发明使用的指示剂、染料、选择剂、酶底物或营养物不应实质上抑制DNA酶活性,也不应实质上干扰本文所述的DNA酶指示剂系统的观察和成像。
可采用缓冲试剂如碳酸钠来提供显示中性pH的培养基,并可采用“Cab-O-Sil M-5”作为加工助剂,如美国专利No.4,565,783中所描述,将该专利以引用方式全文并入本文。当然,可根据所要培养的微生物的类型,对用于粉末116的具体涂层混合物(例如营养物、指示剂和/或胶凝剂)加以调整。
设想到,本发明的制品可包括区分性指示剂。本文所用的“区分性指示剂”指添加到培养基中的会指示某些微生物的存在而不会指示其他微生物的存在的试剂。区分性指示剂的非限制性例子包括染料(例如着色剂、pH指示剂、氧化还原指示剂)、酶底物(例如磷酸酶、糖苷酶、肽酶、核酸酶、脂肪酶等的发色底物或荧光底物)以及当被某些微生物代谢时会产生可检测的反应(例如与菌落相关的pH变化)的特定营养物(例如发酵性碳水化合物、氨基酸)。
在一些实施例中,可将一种或多种区分性指示剂在涂覆到基材上的水基组合物中添加至薄膜培养装置。在一些实施例中,可将一种或多种区分性指示剂添加至液体样品,然后液体样品加到培养装置。在一些实施例中,可在培养装置进行水化后,将一种或多种区分性指示剂加至培养装置。涉及到使用加至水化后的培养装置的区分性指示剂的方法的一个例子是其中将用于检测耐热核酸酶的制品加到温育后的培养装置的方法,如美国专利No.6,022,682中所述,将该专利以引用方式全文并入本文。
在本发明范围内还设想到,粉末116可任选包括为执行某些用于微生物鉴定的生化测试所必需的试剂。这种在特定类型的微生物存在下发生颜色变化的试剂(例如酶底物)可包括在粉末116或粘合剂114中。
在本发明的另一个实施例中,粉末116可包含这样的涂层,其包括胶凝剂和营养物的混合物、选择剂和/或指示剂,其已被溶解或悬浮于溶液中,涂覆并干燥到基材112上。在这个实施例中,涂层实质上是无水的(即涂层一旦被允许与周围环境平衡,其水分含量不超过大约脱水涂层的水分含量)。
如图1所示,主体构件可包括施加到基材112的上表面的隔离物118,该隔离物118包括在中部切穿以暴露基材112上的粉末116的圆形孔120。孔120的壁提供预定大小和形状的槽以限定水化后的培养基。隔离物118应足够厚以形成所需体积的槽,例如1、2或3毫升。聚乙烯闭孔泡沫塑料是隔离物118的优选材料,但也可使用任何疏水性(非湿润性)、对微生物惰性且能够承受灭菌的材料。在一些实施例中(未显示),隔离物118可包括多个孔20(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15或20个孔),每个孔可接种上不同的液体样品。
隔离物118可包括相对较厚的设计,如美国专利No.5,681,712中所述的那些设计,将该专利以引用方式全文并入本文。较厚的带孔隔离物118的一个目的是对布置在隔离物118的孔120中的膜(例如微孔过滤膜)(未显示)进行定位和保护。较厚的隔离物118的另一个目的是为了减少或防止覆盖片122与生长中的微生物集落的接触(即提供生长表面和覆盖片122之间的“顶部空间”,这还可使得对生长中的微生物菌落的通气增加)。
隔离物118的厚度应足以围住在对培养装置接种时加到该装置的液体体积。取决于膜(当使用时)的厚度,隔离物可为至少约0.5mm厚、约1mm厚、约1.5mm厚和约2mm厚。
图3示出了薄膜培养装置310的另一个实施例。该实施例包括基材312、粘合剂314、冷水可溶性粉末316和覆盖片322,如图1中所述。DNA酶指示剂系统可被包括在冷水可溶性粉末316中。与图1的培养装置110相反,图3的装置310不包括用于在接种过程中限定该样品的隔离物。可将模板例如加重环(未显示)暂时施加到覆盖片322的外面,该模板在闭合后用以在冷水可溶性粉末316形成凝胶的时候将样品限定到特定区域。在一些实施例中,装置310可接种上多份(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15或20份)不同的液体样品,使用适当的隔离物和模板来将各样品限定到培养装置310的粉末316的不同部分。当用水溶液(例如该样品和/或含水助悬介质,如水或缓冲液)进行水化时,包含胶凝剂的冷水可溶性粉末形成水凝胶。
图4示出了根据本发明的薄膜培养装置的另一个实施例410。培养装置410包括主体构件411,该主体构件包括具有上下表面412a和412b的自支撑基材412。基材412在其上表面412a上涂覆有一层粘合剂414。包含一种或多种胶凝剂的冷水可溶性粉末416以薄的相对均匀的层粘附到粘合剂414。一旦接种上含水测试样品(未显示),该层冷水可溶性粉末416(其可包括DNA酶指示剂系统)快速水化形成复水的培养基(未显示),而该培养基继而能够长出在液体接种物中或在膜(如测试样品微生物过滤器(未显示))的表面上存在的微生物。隔离物418部分地覆盖基材412和覆盖粉末416的表面,具有孔420。另外,薄膜培养装置410任选包括覆盖片422,以覆盖在加入含水测试样品后形成的复水培养基。图4还示出了膜426和生长在其上的微生物菌落428。在图示的实施例中,膜426是微孔膜,液体样品已被滤过该膜以使样品中的任何细菌(如果存在的话)截留在膜上。合适的微孔膜不会实质上干扰DNA酶活性或者干扰DNA酶活性与DNA酶指示剂系统之间的相互作用。另外,合适的微孔膜当与水凝胶接触时是实质上透明的。
如美国专利No.5,232,838中所述,有可能在本发明的装置中使用透气膜层,前提条件是该透气膜不会实质上干扰DNA酶活性或者对DNA酶活性的观察和成像。透气层可“夹”在基材和冷水可溶性粉末之间,在透气膜层的两面上均有粘合剂涂层(未显示)。
在一个实施例中,可根据例如美国专利No.4,565,783中所述的方法,如下制备薄膜培养板装置:产生液体涂覆混合物,将该液体涂覆混合物涂覆到基材上,干燥该经涂覆的基材并任选地附接覆盖片。这个实施例的示例性装置在图4中示出。
图4示出了适合与本发明的培养基一起使用的薄膜培养装置410的一个实施例。制备该装置的方法在美国专利No.4,565,783中描述,将该专利以引用方式全文并入本文。
薄膜培养装置410包括具有自支撑防水基材412的主体构件。基材412优选为由不会吸水的防水材料(如聚酯、聚丙烯或聚苯乙烯)制成的相对刚性的材料。其他合适的防水材料包括含有防水聚乙烯涂层的基材如纸张。基材412的上表面用液体组合物涂覆,然后进行干燥以在基材412上提供干涂层417。干涂层417包含本文所述的冷水可溶性胶凝剂,且还可包括营养物、选择剂、指示剂或前述两者或更多者的任意组合。用于产生干涂层417的液体组合物可容易地如下进行干燥:将液体组合物在约220℉的烘箱中加热,直到组合物中基本上所有水分都被蒸发掉。然而,如果在水分已蒸发后加热组合物,则组合物的某些组分(例如营养物、指示剂)可能开始降解。
在基材412上可涂覆一层粘合剂(未显示)。该粘合剂可起到将干涂层417保持到基材412的作用。粘合剂当水化时应充分透明,以使得可查看在经涂覆的基材412的表面上生长的细菌菌落。该粘合剂还应以这样的厚度涂覆在基材412上,该厚度让该基材均匀地涂覆有干涂层417,而又不完全使涂层嵌在粘合剂中。
在泡沫中具有圆形开口的泡沫隔离物418被粘附到基材412的涂覆有培养基的表面。覆盖基材412的周边的该泡沫隔离物限定出样品要接种的区域,并起到防止样品从基材泄漏的作用。在一个替代实施例中,装置可不包括容纳样品的泡沫层。在这个装置中,样品的量只通过培养基的各组分被容纳在基材上。
覆盖片422附接到泡沫隔离物418的上表面的边缘。覆盖片422优选由透明的薄膜或片材制成,以便于计数基材上存在的细菌菌落。另外,覆盖片422优选对细菌和水蒸汽具有不透性,以避免各组分受污染和变质的风险。用作覆盖片422的优选材料是双轴向拉伸聚丙烯。任选地,覆盖片422可涂覆有一层粘合剂,该粘合剂可涂覆上包含胶凝剂、营养物、选择剂和指示剂(例如DNA酶指示剂系统)或前述两者或更多者的任意组合的干燥组合物(例如粉末)(未显示)。
在使用时,将预定量的接种物(通常为约1毫升的液体接种物)加到图4所示的装置,加入方式是将覆盖片向后拉,然后将含水测试样品或水分配到干涂层417上。接种物可任选包含营养物、选择剂、指示剂或前述两者或更多者的任意组合。然后再将覆盖片422放回涂层417上,接种物均匀地散布在泡沫隔离物418的圆形开口内。用于此操作的简便工具是加重的圆形模板。随着接种物接触涂层417并分散在该涂层上,涂层发生水化而形成凝胶。凝胶中存在的营养物可支持微生物的生长。接着将接种了的装置温育预定的时间,然后可透过透明的覆盖片422计数生长在基材上的细菌菌落的数目。
用于形成装置410的干涂层417的涂层混合物可包含DNA酶指示剂系统,且任选包含培养基、指示试剂、选择剂或者前述两者或更多者的任意组合。优选的涂层混合物,当进行涂覆、干燥和用适当体积的样品再水化时,包含营养培养基和DNA酶指示剂系统,如表1所示。
表1.示例性的营养培养基的组成
成分 | 量(毫克/mL) |
胰蛋白胨 | 6.6 |
酵母提取物 | 4.6 |
右旋糖 | 0.9 |
丙酮酸钠 | 13.2 |
K2HPO4 | 3.0 |
KH2PO4 | 0.6 |
甲基绿 | 0.02 |
λ-角叉菜胶 | 0.1 |
DNA | 2.0 |
瓜尔胶 | 10 |
本发明的培养基可包含在培养基接种上怀疑含有微生物的样品时通常适合促进目标微生物(即产DNA酶微生物)的生长的营养物、盐和离子。含有添加剂如(例如)营养物、盐、离子、选择剂、指示剂等的培养基可用已知的产DNA酶生物体进行测试,以确定该添加剂能促进目标微生物的生长,抑制非目标微生物的生长和/或不干扰DNA酶指示剂系统。培养基还可包括一种或多种胶凝剂。合适的营养物、盐、离子和胶凝剂在美国专利No.5,443,963中有所描述。本发明的培养基可包括至少一种对某些DNA酶微生物(例如葡萄球菌、芽孢杆菌、链球菌、弧菌、布兰汉球菌和/或沙雷氏菌)的生长具有选择作用的选择剂。
目标微生物的选择可包括抑制非非目标微生物(non-non targetmicroorganisms)的生长,促进非目标微生物的生长或者这两者兼备。促进目标微生物的生长,这可由该至少一种第一选择剂直接地提供(例如可被目标微生物利用而不被其他微生物利用的营养物)、间接地提供(例如通过减少抑制性的非目标微生物对营养物的竞争)或者同时直接和间接地提供。
任何对目标微生物的生长具有选择作用的元素、基团、离子或化合物都可适合用作选择剂。例如,适用于葡萄球菌目标微生物的选择剂包括但不限于氯化锂、氨曲南、亚碲酸钾、氯化钠、萘啶酸、黏菌素、甲磺酸盐、盐酸甘氨酸、硫氰酸钾、叠氮化钠、多粘菌素B、磺胺二甲嘧啶、抗生素以及前述两者或更多者的任意组合。
某些选择剂可不仅对葡萄球菌的生长具有选择作用,而且还可在某些条件下对金黄色葡萄球菌与其他葡萄球菌的生长具有差异选择作用。例如,包含亚碲酸钾、氯化锂和蛋黄的培养基能够选择性地区分金黄色葡萄球菌与所有其他细菌种类。蛋黄可作为乳状液或者以脱水形式商购获得。
根据本发明的干培养基可按以下方式施加到薄膜培养装置的一个或多个表面。可将培养基的各组分溶于溶剂中。接着可将所得的溶液涂覆到该装置的一个或多个表面上。然后让涂层干燥,从而在该已用培养基溶液涂覆的装置的表面上留下干燥的培养基。涂层可以任何合适的方式进行干燥,包括但不限于空气干燥和加热。
干培养基的每种组分的量至少部分地由至少以下两个因素决定:(1)该组分在培养基溶液中的浓度,和(2)涂覆到培养装置的给定表面积上的溶液的量(涂层重量)。合适的涂覆重量可在约0.45mg/cm2至约2.5mg/cm2的范围内。在一些实施例中,培养基营养物可与指示剂分开涂覆。在这种实施例中,培养基营养物的涂覆重量可在约1.6mg/cm2至约2.5mg/cm2的范围内。在一个实施例中,营养物涂层的涂覆重量为约2.1mg/cm2。指示剂涂层的涂覆重量可在约0.45mg/cm2至约0.84mg/cm2的范围内。在一个实施例中,指示剂涂层的涂覆重量为约0.62mg/cm2。
培养基中包含的选择剂的量可部分地取决于为在具体培养基中使用而选择的具体选择剂或选择剂组合。例如,在一个实施例中,培养基包含氯化锂、氨曲南和亚碲酸钾作为选择剂。在以上对营养物涂层所述的涂覆重量的情形中,涂覆溶液中包含的氯化锂的量可在约1g/L至约15g/L的范围内。在一个实施例中,涂覆溶液在涂覆到培养装置上之前包含10g/L的氯化锂。类似地,包含的氨曲南的量可在约0.001g/L至约0.015g/L的范围内。在一个实施例中,涂覆溶液包含0.01g/L的氨曲南。包含的亚碲酸钾的量可在约0.05g/L至约0.19g/L的范围内。在一个实施例中,培养基包含0.16g/L的亚碲酸钾。
在上述实施例的任一者中,胶凝剂被水化(例如通过包含样品的水溶液)而形成水凝胶。水凝胶可以是任何能限制DNA酶在含水溶液中的扩散但实质上不抑制DNA酶活性的合适水凝胶。合适的水凝胶的非限制性例子包括琼脂、琼脂糖、明胶、天然树胶(瓜尔胶、刺槐豆胶、黄原胶等)以及它们的衍生物和组合。
虽然图1-4所示的实施例具有连接到装置的覆盖片,但在本发明范围内还设想到,含粉末的实施例可在保藏和温育过程中不进行覆盖,而是仅仅放在无菌环境中。
检测制品:
本发明包括用于DNA酶活性的检测的制品。检测制品包括主体构件,该主体构件包括具有上主表面和下主表面的自支撑基材。制品进一步包括包含冷水可溶性胶凝剂和DNA酶指示剂系统的涂层,该DNA酶指示剂系统包含DNA和甲基绿。可使用与美国专利No.6,022,682(将其以引用方式全文并入本文)中所述的方法类似的方法,制备涂层并将其均匀地粘附到基材的至少一个表面的一部分上。
图5以局部分解的透视图示出了根据本发明的检测制品550的一个实施例。图5中所示的制品具有大致盘状的外形,但该制品可具有具体的应用所需的任何外形。制品550包括固体载体555、涂覆到固体载体555的上主表面上的检测层560以及在分解图中示出为栅格的任选的保护材料565。保护材料565如果存在的话,可将其除去以露出检测层560的表面,以供抵靠包含样品的表面放置。
一般而言,制品550的制备涉及制备含有适当量的被选择包含在该制品中的各成分(包括DNA、甲基绿和冷水可溶性胶凝剂)的溶液,冷却该溶液,接着将该溶液涂覆到固体载体555上。然后将经涂覆的载体进行干燥以固化涂覆溶液。为说明一个优选的但非限制性的实施例,将含有2g/L鲑鱼精DNA、0.02g/L甲基绿和1%(重量/体积)瓜尔胶的溶液涂覆到0.18mm聚酯膜固体载体上,然后在200℉下干燥2-10分钟。所得的干燥涂层可为任何需要的厚度,但优选厚度为约0.12-0.25mm。可选定各成分及其量,使得取决于具体的应用所需,该制品为相对刚性或柔性的。
固体载体555可为聚合物膜,如聚酯膜。固体载体555可源自用于在干燥后提供模制制品的模具,或者该固体载体可源自片状材料,以便在涂覆和干燥后切出或冲压出所需大小或形状的制品。可对用于固体载体555的材料加以选择,以给制品550赋予任何程度的刚性或柔性。另外,取决于具体的应用所需,制品550可制备成任何形状或厚度。
固体载体优选为透明的或至少半透明的,以便在使用时查看在制品中发生的颜色变化。固体载体还给检测层提供稳定性并保护它不受损害。
可选择固体载体使得其可从检测层剥离,从而留下供用于在没有该固体载体情况下进行测试的检测层。例如,在聚酯膜用作固体载体的情况中,当在使用过程中检测层变为水化时,固体载体可以是可从检测层剥离的。
保护材料565可邻近检测层的暴露表面放置。例如,在固体载体邻近检测层的一个表面的情况中,保护材料可邻近相对的表面。保护材料可以是在制品储藏和运输中保护制品的聚合物膜或格栅(例如稀松布),且可优选充当检测层之间的隔离物,以使在干燥后具有吸湿性的制品互相隔开,从而可以稳定储藏且货架期更长。
选定保护材料使得其在制品使用前可从制品的表面剥离或除去。适合用作保护材料的材料是本领域已知的。如上所述,本发明的制品可为任何所需的厚度、形状或刚度,且如果存在的话,固体载体可为任何所需的厚度,并可加以选择以赋予任何所需程度的刚性或柔性。
该制品优选还可包括其他组分,如氯化钙(例如用以检测耐热核酸酶活性)、氯化钠(以提供适当的离子强度)或缓冲体系(以控制DNA酶反应发生的pH),如Tris盐酸盐/Tris碱。
本发明的制品可从不同pH的溶液制备。由此,该制品可含有使得DNA酶活性会在选定的pH下出现的试剂。例如,根据本发明的一个优选实施例的制品可从pH 7.3的溶液制备。或者根据本发明的制品可从pH 9.0的溶液制备。
样品
合适的样品可源自任何来源,如生理流体,例如血液、唾液、眼晶状体液、滑液、脑脊髓液、脓液、汗液、渗出液、尿液、粘液、粪便、乳汁等。此外,测试样品可源自身体部位,例如伤口、皮肤、鼻孔、头皮、指甲等。
特别值得关注的样品包括含粘液的样品,如鼻样品(来自例如前鼻孔、鼻咽腔、鼻腔、鼻前庭等)以及来自外耳、中耳、口、直肠、阴道或其他类似组织的样品。具体的粘膜组织的例子包括口腔、齿龈、鼻、眼、气管、支气管、胃肠、直肠、尿道、输尿管、阴道、子宫颈和子宫的粘膜。
除了生理流体外,其他测试样品可包括其他液体以及溶于液体介质的固体。所关注的样品可包括工艺液流、水、土壤、植物或其他植被、空气、表面(例如受污染的表面、地面、墙壁、仪器、被褥)等。样品还可包括经培养的细胞。
多种用于检测表面上的微生物如金黄色葡萄球菌的患者采样技术是已知的。这些取样技术也适用于本发明方法。例如,常常擦拭患者的鼻孔以获取样品。特别优选的采样技术包括用无菌拭子或采样装置拭抹受试者(例如患者)的前鼻孔。例如,一个拭子用于对一名受试者取样,即一个拭子用于两个鼻孔。例如可这样进行采样:将干燥的或用适当的溶液预湿润的拭子插入到受试者鼻孔的前末端,并将拭子沿着鼻孔的粘膜表面完整地旋转一圈或多圈。
有多种拭子或其他样品收集装置可商购获得,例如以商品名PURE-WRAPS获自Puritan Medical Products Co.LLC(Guilford,ME),或者以商品名ESWAB获自Copan Diagnostics,Inc.(Corona,CA),或者以商品名FLOCKEDSWAB获自microRheologics,S.r.l.(Brescia,IT)。如果需要也可使用例如美国专利No.5,879,635(Nason)中公开的样品采集装置。拭子可为包括棉花、人造丝、藻酸钙、涤纶、聚酯、尼龙、聚氨酯等在内的多种材料。
然后可将样品采集装置(例如拭子)直接培养、直接分析或用适当的溶液提取(例如,通过洗涤,经涡旋洗脱)。这些提取(即洗脱)溶液通常包括水并可任选包括缓冲液和至少一种表面活性剂。洗脱缓冲液的例子包括例如磷酸缓冲盐水(PBS),其可例如与TWEEN 20或PLURONIC L64组合使用。测试样品(例如液体)可先进行处理再作进一步的分析。这可包括浓缩、沉淀、过滤、离心、透析、稀释、天然组分的灭活、试剂的加入、化学处理等。
捕集粒子
本发明的培养装置可与捕集粒子一起使用以检测样品(例如液体悬浮液)中的微生物。优选地,捕集粒子的尺寸被设计为使得它们能放入本发明的培养装置中,并在温育期间保持在培养装置中达足以使目标微生物进行至少一次细胞分裂的一段时间。将捕集粒子布置在培养装置中可使捕集粒子与培养装置中的胶凝剂和/或营养培养基(如果存在的话)接触,从而让微生物生长和/或增殖。在一些实施例中,在将捕集粒子置于培养装置中之前,先将培养装置水化(例如用无菌液体或未知液体样品接种)。在一些实施例中,培养装置是在捕集粒子布置在培养装置中之后进行水化。
合适的捕集粒子包括一个粒子或多个粒子。粒子可包括用于将粒子偶联至微生物的手段。粒子的非限制性例子包括微球体、微珠粒、纳米珠粒等。这种粒子可为树脂粒子,例如琼脂糖、乳胶、聚苯乙烯、尼龙、聚丙烯酰胺、纤维素、多糖或它们的组合,或者为无机粒子,例如二氧化硅、氧化铝或它们的组合。这种粒子可以是磁性的、顺磁性的、超顺磁性或非磁性的。这种粒子可为胶体大小,例如约100nm至约10微米(μm)。这种粒子的非限制性例子包括以商品名DYNABEADS(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA)和BIO-ADEMBEADS(Ademtech,Pessac,法国)出售的超顺磁性聚合物粒子。
有多种手段将捕集粒子偶联至微生物。在一些实施例中,将捕集粒子偶联到微生物的手段可包括能促进非特异性吸附的表面分子或性质。例如,捕集粒子的至少一部分可在其表面上具有这样的分子,所述分子在适当条件下(例如高pH或低pH)会带正电荷或负电荷,从而非特异性地吸附到与微生物表面结合的带互补电荷的分子。
除此之外,或者作为另外一种选择,捕集粒子(例如聚苯乙烯粒子)的至少一部分可具有疏水表面,该疏水表面可非特异性地吸附至与微生物表面结合的疏水分子。在一些实施例中,用于将捕集粒子偶联到微生物的手段可包括通过受体-配体相互作用特异性结合微生物的分子。这种特异性的受体-配体相互作用是本领域公知的,包括例如抗体或抗体片段与其相应的抗原之间的相互作用、凝集素与其相应的碳水化合物结合伴侣之间的相互作用、噬菌体蛋白或片段与其相应的噬菌体受体之间的相互作用等等。
检测样品中的DNA酶活性的方法
本发明提供检测样品中的DNA酶活性的离散来源的方法。本文所用的“DNA酶活性的离散来源”是指这样的DNA酶活性来源,在其中该样品的一部分所具有的DNA酶活性的浓度显著地不同于该样品的至少一个其他部分。在一些实施例中,该DNA酶活性的离散来源可为一群细胞(例如生物组织的一部分、微生物的集落)的细胞(例如植物细胞、动物细胞或微生物)。
DNA酶活性是使用包含DNA和甲基绿的指示剂系统来检测,DNA和甲基绿两者的量均足以检测到由于DNA和甲基绿之间形成复合物而产生的绿颜色。在DNA酶活性来源的存在下,DNA分子被消化,于是DNA-甲基绿复合物分解而变成无色。
用于检测DNA酶活性的离散来源的方法包括提供包含DNA酶指示剂系统的水凝胶和怀疑含有DNA酶活性的离散来源的样品。
DNA酶指示剂系统包含DNA和甲基绿。DNA和甲基绿两者的量均足以显示出由于DNA和甲基绿之间形成复合物而产生的绿颜色。本领域所用的甲基绿浓度可提供足够的色对比度以目视检测产DNA酶细菌菌落周围的脱色区域。但是,本发明证实甲基绿的浓度会抑制至少一些微生物的生长。
DNA酶指示剂系统中的DNA可为鲑鱼睾丸DNA的钠盐(可获自Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)或者heimfish精子DNA的钠盐(可获自Acros Organics,Geel,比利时),其在水凝胶中的浓度例如为约2.0g/L。
在一些实施例中,DNA酶指示剂系统可手工检测。对于手工检测,由技术人员目视观察含有DNA酶指示剂系统的制品或装置,确定制品或装置中是否存在DNA酶活性来源(例如微生物的集落)。在本发明的一些实施例中,本发明方法包括在包含DNA酶指示剂系统的水化制品或装置中使用相对低浓度的甲基绿。在这些实施例中,对微生物生长的抑制显著较小,同时出乎意料的是仍有足够的色对比度以目视检测产DNA酶微生物。在某些手工检测实施例中,水化制品或装置中的甲基绿可例如为甲基绿的氯化锌盐,浓度为至少约5μg/mL至不超过49μg/mL。在某些手工检测实施例中,包含样品的水化制品或装置中的甲基绿可为甲基绿的氯化锌盐,浓度为至少约5μg/mL至约40μg/mL。在某些手工检测实施例中,包含样品的水化制品或装置中的甲基绿可为甲基绿的氯化锌盐,浓度为至少约5μg/mL至约30μg/mL。在某些手工检测实施例中,包含样品的水化制品或装置中的甲基绿可为甲基绿的氯化锌盐,浓度为至少约5μg/mL至约20μg/mL。在某些手工检测实施例中,包含样品的水化制品或装置中的甲基绿可为甲基绿的氯化锌盐,浓度为至少约5μg/mL至约10μg/mL。在某些手工检测实施例中,包含样品的水化制品或装置中的甲基绿可为甲基绿的氯化锌盐,浓度为约5μg/mL、约10μg/mL、约20μg/mL、约30μg/mL、约40μg/mL或约45μg/mL。
除此之外,或者作为另外一种选择,可使用本文所述的成像系统以电子方式分析DNA酶指示剂系统。DNA-甲基绿复合物与水解的DNA-甲基绿复合物之间的色对比度,可通过使用成像过程来极大地增强,所述成像过程例如这样的过程:用选定波长的光(即红色波长)对指示剂细胞进行照明,对包含指示剂系统的水凝胶进行成像,分析包含指示剂系统的水凝胶的图像;或者通过前述过程中的两种或多种的组合来极大地增强。在某些电子检测实施例中,包含样品的水化制品或装置中的甲基绿可例如为甲基绿的氯化锌盐,浓度为至少约5μg/mL至约100μg/mL。在某些电子检测实施例中,包含样品的水化制品或装置中的甲基绿可为甲基绿的氯化锌盐,浓度为至少约5μg/mL至约60μg/mL。在某些电子检测实施例中,包含样品的水化制品或装置中的甲基绿可为甲基绿的氯化锌盐,浓度为至少约5μg/mL至约40μg/mL。在某些电子检测实施例中,包含样品的水化制品或装置中的甲基绿可为甲基绿的氯化锌盐,浓度为至少约5μg/mL至约20μg/mL。在某些电子检测实施例中,包含样品的水化制品或装置中的甲基绿可为甲基绿的氯化锌盐,浓度为至少约5μg/mL至约10μg/mL。在某些电子检测实施例中,包含样品的水化制品或装置中的甲基绿可为甲基绿的氯化锌盐,浓度为约5μg/mL、约10μg/mL、约20μg/mL、约30μg/mL、约40μg/mL或约45μg/mL。
在包括手工分析或电子分析的方法中,所述方法还包括使DNA酶活性来源与包含DNA酶检测系统的水凝胶在适合容许DNA酶活性的条件下接触预定的时间段。DNA酶是本领域知道的,适合容许DNA酶活性的条件也是本领域知道的。二价阳离子(例如钙和镁)有助于某些DNA酶(例如DNA酶I)活性。二价阳离子可添加至水凝胶,和/或可包含在水凝胶或样品中的营养培养基(如果存在的话)中。一般而言,DNA酶在大约中性pH下具有最适活性。在某些实施例中,pH为约6.5至约8.0。一般而言,在较高的温度下,酶反应(例如DNA酶活性反应)的速率提高,因此,可使DNA酶活性与水凝胶在相对较低温度(例如环境温度)下或者在高温(例如30-45℃)下接触。通常,当反应在高温下温育时,检测DNA酶活性所需的时间将较短。在接触期间,将水凝胶保持在容器中,以限制水分从水凝胶损失。合适的容器包括例如平皿、薄膜培养板装置或增湿的烧杯。
在一些实施例中,该方法还包括用成像系统获取水凝胶的图像。成像系统包括处理器和成像装置。在一些实施例中,成像装置包括线扫描机或面扫描机(例如相机)。成像装置可包括单色(例如黑白)或多色(例如彩色)扫描机。有利地,单色成像系统可提供较高分辨率的图像,这可提高结果的准确度和/或减少测定样品中的DNA酶的存在所需的时间。
在一些实施例中,成像系统包括照明系统。照明系统可包括至少一个广谱可见光(例如“白”光)来源。在一些实施例中,照明系统可包括至少一个窄谱可见光来源(例如发射相对较窄带宽的可见光如红光、绿光或蓝光的发光二极管)。在某些实施例中,照明系统可包括光发射峰在约633nm处的窄谱可见光来源(例如发光二极管)。
图像可获自被水凝胶反射的光,或者图像可获自透过水凝胶的光。合适的成像系统和相应的照明系统在例如国际专利公布WO2005/024047和美国专利申请公布No.US 2004/0101954和US2004/0102903中有描述,将这每个专利都以引用方式全文并入本文。合适的成像系统的非限制性例子包括可获自3M Company(St.Paul,MN)的PETRIFILM读板机(PPR),可获自Spiral Biotech(Norwood,MA)的PETRISCAN菌落计数器和可获自Synbiosis(英国剑桥)的PROTOCOL和ACOLYTE板扫描机。
在一些实施例中,获取图像包括获取波长偏置(wavelength-biased)图像。例如,成像系统可包括将成像装置采集的光线偏置的偏置滤波器。滤波器元件是本领域知道的,包括“截止”滤波器(即允许某个指定波长以上或以下的光波长通过的滤波器)和“带通”滤波器(即允许某个指定上限和下限之间的光波长通过的滤波器)。偏置滤波器可布置在照明源和水凝胶之间。作为另外一种选择或者除此之外,偏置滤波器可布置在水凝胶和成像装置之间。
在某些优选的实施例中,获取图像包括用能选择性地允许红光波长通过的偏置滤波器获取图像。在一些实施例中,获取图像包括使用能选择性地允许约620nm至约740nm的波长通过的偏置滤波器。
图6是显示成像系统670的内部操作的框图。如图6所示,水凝胶682布置在成像系统内的焦平面中(例如在平台上,未显示)。根据本发明,成像装置692可包括用于水凝胶682的前和/或后照明的多颜色照明系统(未显示),以及捕集水凝胶682的图像的单色线或面扫描机。在一些实施例中,例如,成像装置692可采取二维单色相机的形式。
一般而言,在用一个或多个不同的照明颜色照明水凝胶682的过程中,成像装置692捕集该水凝胶的图像或其至少一部分。在一些实施例中,可用不同的照明时间或强度产生同一水凝胶682的多幅图像,并可选择该多幅图像中的一幅或多幅进行分析。在一些实施例中,可采取对水凝胶682的第一侧面和第二侧面进行选择性照明以产生该水凝胶的多幅图像,并选择其中一幅或多幅图像进行分析。选择图像进行分析可基于例如各个图像的色对比度和/或目标分辨率性质。用于确定图像的色对比度和目标分辨率性质的方法是本领域知道的,在例如美国专利No.6,243,286中有公开,将该专利以引用方式全文并入本文。
处理器694控制成像装置692的操作。图6中还显示了任选的显示器676,其可从处理器694接受图像以供操作员目视观察。在操作时,处理器694控制成像装置692以照明水凝胶682并获取图像。处理器694接受代表来自成像装置692的扫描图像的图像数据。在一些实施例中,处理器694可从多个图像中选择一个图像供分析和/或显示。处理器694分析水凝胶682的至少一个图像,且可产生分析结果,如DNA酶活性的离散来源的计数或者存在与否的结果。分析结果(例如定性或定量结果)可显示在显示器676上,存储在任选的数据存储器698中,或者由主计算机(未显示)通过任选的通信端口695收取。
该方法进一步包括检测水凝胶中的脱氧核糖核酸酶活性。检测水凝胶中的脱氧核糖核酸酶活性包括分析水凝胶的图像。在DNA酶活性的离散来源的存在下,DNA分子被消化,于是DNA-甲基绿复合物分解,从而脱色。由于DNA酶活性从的离散来源的扩散离开为水凝胶所限制,与的离散来源(例如细胞或细胞集落)相关的DNA酶活性导致在邻近DNA酶活性的离散来源处形成着色相对较浅的区域(即在邻近DNA酶活性来源处的绿颜色比水凝胶的不接触DNA酶活性的其他区域少)。通常,在水凝胶中DNA酶活性的离散来源的周围会出现相对无色的区域。因此,分析水凝胶的图像可包括分析该图像以找出水凝胶中的具有比该水凝胶至少一个其他部分相对较少的绿颜色的区域。在一些实施例中,分析水凝胶的图像可包括将水凝胶的一个或多个区域(或全部区域)中的绿颜色的量与相应的无DNA酶活性的水凝胶(即阴性对照)的另一个图像进行比较。
分析水凝胶的图像可包括使用某种系统来检测图像中的颜色和/或颜色(例如红色、绿色、蓝色、灰色)的不同色度。合适的图像分析系统包括例如在美国专利No.5,448,652、No.6,243,486和No.6,153,400中描述的图像分析系统;将这每个专利都以引用方式全文并入本文。
在某些实施例中,分析水凝胶的图像包括分析选定波长的图像。在一些实施例中,图像可以是通过用广谱可见光(例如“白”光)的来源对水凝胶进行照明所采集的彩色图像。在一些实施例中,图像可以是用相对窄谱可见光的多个来源(例如各自发射相对窄带宽的可见光(如红光、绿光或蓝光)的发光二极管的组合)对水凝胶进行照明所采集的彩色图像。在一些实施例中,图像可以是通过将在用相对窄谱可见光(如红光、绿光或蓝光)的两个或多个不同来源对水凝胶进行照明时采集的两个或多个图像进行组合所制成的合成图像。在一些实施例中,图像可以是在用相对窄谱可见光(例如红光)的某个来源对水凝胶进行照明时采集的图像。在这些实施例中,可选择某些波长的图像供显示或打印图像和/或进行图像分析。在一些实施例中,选择用来分析图像的波长可以是红色波长(例如约625nm至约740nm的波长)。在一些实施例中,选择用来分析的波长是约630nm至约670nm的波长。在一些实施例中,选择用来分析的波长是约630nm至约650nm的波长。
波长可例如通过使用计算机程序来选择,该计算机程序以电子方式选择图像中的预定范围的波长供显示、打印和/或分析。任何合适的计算机程序都可用于选择图像中的预定范围的波长。合适的计算机程序的非限制性例子包括可获自Adobe Systems,Inc.(San Jose,CA)的PHOTOSHOP CS4软件和可获自Media Cybernetics(Silver Springs,MD)的IMAGE-PRO Plus软件。
在其中水凝胶的图像已以对图像中透过水凝胶和/或被水凝胶反射的红色波长的采集加以偏置的方式进行获取和/或分析的某些实施例中,绿颜色的DNA-甲基绿复合物与无色的解聚DNA之间的对比度得到显著提高。因此,在这些实施例中,与不对所采集的图像的波长进行偏置的类似方法相比,DNA酶活性可在较早的时间检测。另外,对透射通过水凝胶和/或被水凝胶反射的红色波长的采集加以偏置的方法,与不对所采集的图像的波长进行偏置的类似方法相比,容许检测到更低数量的DNA酶活性。
检测样品中的微生物的方法
本发明提供检测样品中的微生物的方法。在一些实施例中,该方法包括提供干组合物和怀疑含有微生物的样品。干组合物包含冷水可溶性胶凝剂和包括甲基绿和DNA的指示剂系统,如本文所述。任选地,干燥的水凝胶组合物进一步包含营养物、选择剂、抗生素、指示剂或前述两者或更多者的任意组合。该方法进一步包括使预定体积的包含样品的水性液体与干燥的水凝胶接触以形成水化的水凝胶,将水化的水凝胶温育一段时间,然后检测微生物。
将干组合物放在适合于在该组合物处于干燥状态和/或水化状态时保持该干组合物的制品(例如烧杯、烧瓶、试管、平皿)上或者放入该制品中。在一些实施例中,将干组合物涂覆到基材上以形成检测制品。在一些实施例中,干组合物是以粉末形式涂覆到涂覆有粘合剂的基材上,从而干组合物粘附到该粘合剂。在一些实施例中,将该组合物水化,涂覆到基材上,随后将水化的组合物充分干燥以形成干组合物。涂覆上水化的组合物的基材可包含干燥的组合物所粘附到的粘合剂。涂覆基材并任选干燥基材上的涂层以形成检测制品的方法例如在美国专利No.4,565,783、Re.35,286和No.6,022,682中有描述,将这每个专利以引用方式全文并入本文中。
使干组合物与预定体积(例如1mL、3mL、5mL)的包含样品的水性液体进行接触。样品可包括水性液体(例如水或奶的样品)。样品可包括液体或悬浮在水性液体(例如水或含水缓冲液,例如磷酸缓冲盐水或Butterfield缓冲液)中的固体。任选地,在包含样品的水性液体接触干组合物之前和/或之后,可将营养物、选择剂、指示剂或前述两者或更多者的任意组合添加到该水性液体。在一些实施例中,选择剂包含抗生素,例如头孢噻吩、头孢唑啉、头孢拉定、头孢氨苄、头孢羟氨苄、头孢孟多、头孢西丁、头孢克洛、头孢呋辛、头孢呋辛乙酰氧乙酯、氯碳头孢、头孢尼西、头孢替坦、头孢雷特、头孢噻肟、头孢泊肟普塞酯、头孢唑肟、头孢克肟、头孢曲松、头孢哌酮、头孢他啶、拉氧头孢(moxlactam)、头孢吡肟(cefipime)、头孢匹罗和苯唑西林。包含样品的水性液体将干组合物水化以形成水凝胶。
将水凝胶温育一段时间,在此过程中微生物可生长出和/或与微生物(如果存在的话)相关的DNA酶活性可与DNA酶指示剂系统发生相互作用。可根据要检测的微生物选择温育步骤的温度和持续时间。一般而言,细菌培养物在22-45℃下温育16-48小时。在一些实施例中,细菌培养物在30-37℃下温育24-48小时。生长慢的细菌可温育更长时间。一般而言,真菌培养物(例如酵母或丝状真菌)在22-37℃下温育1-5天。要确定在给定的营养培养基中生长的给定微生物的温育条件,这完全在本领域普通技术人员的技能范围内。在一些实施例中,微生物可通过其与本文所述的DNA酶指示剂系统的相互作用而得到检测。在一些实施例中,微生物可通过其与水凝胶中的另外的指示剂(如果存在的话)的相互作用而得到检测。在一些实施例中,微生物可通过其与水凝胶中的DNA酶指示剂系统、选择剂和/或一种或多种另外的指示剂系统的相互作用而被鉴定为某种类型(例如DNA酶阳性的、DNA酶阴性的、大肠菌类的、抗生素抗性的等等)。在一些实施例中,可计数出与一种或多种指示剂系统发生相互作用的微生物的数目,以指示原始样品中存在的微生物的数目。
检测微生物可包括检测菌落。检测用于培养微生物的营养培养基中的菌落的方法是本领域公知的,包括例如以目视方式或以显微镜检测菌落。除此之外,或者作为另外一种选择,检测微生物可包括检测与某种微生物或一群微生物相关的指示剂。适用于检测微生物的指示剂是本领域知道的,包括例如发色或发荧光的氧化还原指示剂(例如三苯基氯化四唑)、发色或发荧光的酶底物(例如5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯、4-伞形酮-β-D-吡喃葡萄糖苷)或pH指示剂(例如氯酚红、溴百里酚蓝)。除此之外,或者作为另外一种选择,检测微生物可包括检测与产DNA酶微生物相关的DNA酶活性。本发明提供用于检测耐抗生素微生物的装置和方法。由于已知金黄色葡萄球菌能产生DNA酶活性,本发明提供用于检测和区分耐抗生素的金黄色葡萄球菌(例如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌或MRSA)的装置和方法。
本发明的方法可提供对产DNA酶微生物的早期检测。例如,某种方法可包括接种包含DNA酶指示剂系统的培养基,该DNA酶指示剂系统包括2mg/mL DNA和20μg/mL甲基绿。在合适的条件(例如37℃)下温育后,可使用例如NIKON E8400数码相机(Nikon,Inc.,Melvelle,NY)获取培养基的图像,并用例如IMAGE-PRO Plus软件(MediaCybernetics,Silver Springs,MD)分析图像。在约12.5小时的温育后,查看全色图像,可检测到产DNA酶微生物的菌落。在约11.5小时的温育后,查看红色通道图像,可检测到产DNA酶微生物的菌落。
在一些实施例中,该方法进一步包括提供成像系统和获取水凝胶的图像,其中检测微生物包括显示、打印或分析水凝胶的图像。合适的成像系统和条件在本文中有描述。在一些实施例中,显示水凝胶的图像,使得操作者能查看图像并检测样品中产DNA酶微生物的存在和/或数目或者样品中产DNA酶微生物的不存在和/或数目。在一些实施例中,图像通过处理器进行分析,该处理器检测样品中产DNA酶微生物的存在和/或数目或者样品中产DNA酶微生物的不存在和/或数目。
本发明的试剂盒
本发明提供的试剂盒包括两个或多个部件。一个部件包括包含冷水可溶性胶凝剂和本文所述的DNA酶指示剂系统的检测制品或培养装置。每个试剂盒的第二个部件可选自如下的辅助制品:膜过滤器、移液管、涂布器、手套、样品获取装置、捕集元件、样品悬浮介质、试剂和前述辅助制品中的两者或更多者的任意组合。
膜过滤器的形状和大小应适合于装配到试剂盒的培养板装置的隔离物的孔中。不同种类的过滤器可与试剂盒一起提供,或者多个试剂盒可包含多种过滤器。过滤器是任选的,且优选在无菌条件中提供,如已通过γ辐射、环氧乙烷或其他灭菌方式灭菌的带聚乙烯涂层的纸包装。或者,过滤器可为将由使用者进行灭菌的非无菌组件。
合适的移液管和涂布器可由例如塑料或玻璃制作。移液管和涂布器可在预灭菌条件中提供,或者可在非无菌条件中提供。移液管和涂布器可在单次使用后丢弃,或者可再灭菌以供多次使用。本文所用的“移液管”包括具有至少一个对应于已知体积的刻度标志和具有移液管头的容量移液管,其可用于容量移液装置。试剂盒可装有一包试剂。试剂优选装在无菌包装中,例如箔包装,如医药行业中常规使用的那些。这种包装的一个例子用于NITRO-BID软膏剂(Marlon Laboratories,Inc.,Kansas City,Mo.)。试剂盒中可用的和必需的试剂的选择可取决于要评估的微生物。
现将参考以下非限制性实例对本发明作进一步说明。所有的份数和百分数均以重量份表示,除非另有指明。除非另有说明,否则所有的试剂均获自Sigma Chemical公司(St.Louis)。
实例
实例1
PETRIFILM好氧菌计数板中的生长和DNA酶活性的检测
磷酸盐缓冲盐水(PBS)是作为10X浓缩液(OmniPur 6505;EMDChemicals;Gibbstown,NJ)获得。DNA(钠盐,来自鲑鱼睾丸)和甲基绿染料(氯化锌盐,Aldrich 198080-10G)获自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。λ-角叉菜胶(viscarin GP 109F型)获自FMC BioPolymer(Philadelphia,PA)。3M PETRIFILM好氧菌计数板和PETRIFILM读板机(PPR)获自3M Company(St.Paul,MN)。金黄色葡萄球菌ATCC 25923(DNA酶阳性,甲氧西林敏感性)获自美国模式培养物保藏所(Manassas,VA)。表皮葡萄球菌菌株472(DNA酶阴性)和金黄色葡萄球菌菌株565(DNA酶阳性,耐甲氧西林)获自临床分离株。
通过将2.0mg/mL DNA和0.1mg/mLλ角叉菜胶加至1X(10mM)PBS,制备DNA-PBS溶液的溶液。将混合物在盖住的容器中煮沸,直到DNA溶解。通过将分别100μg/mL和50μg/mL的甲基绿(MG)染料加到DNA-PBS溶液的等分试样,制备DNA-PBS-MG的母液。将各份DNA-PBS-MG母液用多种量的DNA-PBS缓冲液稀释,以制备含有预定浓度的PBS和DNA(2mg/mL)、具有多种浓度(0-60μg/mL)的甲基绿染料的溶液。所有的溶液都在250℃下高压灭菌15分钟。
通过接种各个含有1mL胰酶大豆肉汤培养基的试管并将试管在37℃下温育过夜,制备细菌的肉汤培养物。将细菌离心沉淀,洗涤并重悬于无菌PBS中。将重悬的细胞在无菌PBS中稀释(1∶10系列稀释)。将两个最高的稀释度(分别为10-4和10-5)1∶100稀释成适当的PBS-DNA-MG溶液,将1mL的每种稀释混合物用于接种PETRIFILM好氧菌计数板(根据厂商说明书)。对照板(无细菌)同样地进行接种。将各板在35℃下温育大约20小时。选择所含菌落数目在可计数范围内(即25-250个菌落之间)的板进行评估。生长的结果在表2中示出。使用Petrifilm读板机对选定的板进行成像,该读板机设定有标准的PETRIFILM好氧菌计数板设置。
将Petrifilm读板机产生的位图图像输入到Adobe PhotoShop软件(Adobe Systems,San Jose,CA)。该软件用来查看图像的红色通道,以显现由与菌落相关的DNA酶活性所致的在菌落周围的透明区域。细菌菌落通过两者不同的手段检测:i)菌落将板中的无色四唑盐指示剂还原成眼睛可看见并在板的图像中可观察到的红色甲臜染料,和ii)产DNA酶菌落与DNA酶指示剂系统发生相互作用以在菌落周围产生无色区域。在所有使用的甲基绿浓度下,区域都是眼睛可看见的。在由Petrifilm读板机产生的红色图像中,在所有试验的甲基绿浓度下,区域都容易看见。数据表明,较高浓度的甲基绿抑制了一些微生物的生长。表2中汇总了结果。
实例2
Petrifilm板图像的分析
如实例1中所述制备PETRIFILM好氧菌计数板。将各板接种上金黄色葡萄球菌葡萄球菌ATCC 25923(一种产DNA酶微生物)。接种后,板中的水凝胶含有20μg/mL甲基绿。如实例1中所述使用PETRIFILM读板机对板进行成像。
将红色、绿色和蓝色图像输出到IMAGE-PRO Plus版本6.3.0.512软件中。当用绿色或红色LED照明时的板的灰阶图像的示图分别在图7a和8a中显示。图中已略去板的格线(其在绿色照明图像中很清楚看见,但在红色照明图像中不可见)。
图7a显示板的接种部分中的水凝胶782。还示出了几个细菌菌落784。使用Image Pro Plus软件的line profile工具,选择了从像素x,y坐标(813,292)到(904,380)的所关注区域,并在图中表示为线条A。使用图像分析软件提取了像素强度数据,并在图7b中作为沿线条A的距离的函数绘出。强度值与水凝胶及其中的物体所反射的光的量成比例。
图7b中的数据显示,除了被细菌菌落占据的区域(即从约50的像素距离到约65的像素距离)外,在所关注的区域中水凝胶对绿光的吸收极少。
图8a显示板的接种部分中的水凝胶882。还示出了几个细菌菌落884。对这个图像选择了同样的所关注区域(同图7a)并表示为线条A。使用图像分析软件提取了像素强度数据,并在图8b中作为沿线条A的距离的函数绘出。
图8b中的数据显示,与绿色图像的数据形成对比的是,被细菌菌落占据的区域(即从约50的像素距离到约65的像素距离)显示极少的红光吸收。同样与绿色图像的数据形成对比的是,图8b显示随着移动离开菌落,水凝胶对红光的吸收越多,且紧邻菌落处的红光吸收量相对于水凝胶的其他地方而言下降,这表明菌落周围的DNA水解区域通过水凝胶中菌落周围的较高的像素强度得到检测。
表2.菌落的目视检测观察各板,并将通过眼睛观察到的或者通过 查看PETRIFILM读板机(PPP)所产生的全色图像观察到的结果报告如 下。
实例3
产DNA酶微生物的早期检测
如实例1中所述制备含有(50μg/mL)甲基绿和不含甲基绿的PBS-DNA溶液。在本实验中在所有含有甲基绿的板中使用20μg/mL的甲基绿终浓度。
如实例1中所述制备经洗涤的细菌细胞(金黄色葡萄球菌ATCC菌株25923)的悬浮液。如实例1中所述将悬浮液稀释并接种到Petrifilm好氧菌计数板中。
将经接种的板放在设定在37℃的金属热块的顶部。将NIKONE8400数码相机(Nikon,Inc.,Melvelle,NY)布置在板上方。该相机通过IMAGE-PRO Plus版本6.3.0.512软件连接到计算机,该软件被编程为连续24小时每隔30分钟获取各板的数码相片。将隔热的盖子放在相机和热块装置的上方,以保持板的温度在37℃。数码相机的预编程设置在表3中显示。
表3.实例3中获取的照片的数码相机设置。
相机: | E8400V1.1 |
测光法: | MATRIX |
模式: | P |
快门: | 1/96秒 |
光圈: | F5.0 |
EXP +/-: | 0.0 |
焦距: | f1 5.2mm(X1.0) |
图像调整: | 自动 |
灵敏度: | 自动 |
白平衡调整: | 白炽光 |
锐度: | 自动 |
画质: | 3264×2448EXTRA |
饱和度: | 0 |
对焦区域: | 中央 |
将数码照片输入到Adobe Photoshop版本5.5中,并查看每个图像的红色通道。当查看时,将所有的图像放大(150-200×)。一般而言,在各板的红色通道图像上菌落呈现为灰色斑点,而在各板的全色图像上菌落呈现为红色斑点。在接种后9.5小时内,在红色通道图像中可看见金黄色葡萄球菌菌落。在接种后11.5小时内,在红色通道图像中可看见薄的白色的DNA酶活性区域。相比之下,在接种10小时之后才在同样的板的彩色图像上可看见菌落,且在接种12小时之后才在同样的板的彩色图像上可看见透明区域。表4显示了接种9-15小时期间每个板观察到的结果的总结。
表4.接种后9-15小时期间获取的两个板的图像的目视判读。各 板分别含有0μg/mL和20μg/mL甲基绿。
现已结合发明人所预见的、有操作性描述(enabling description)的若干具体实施例描述了本发明。本发明的非实质修改形式,包括非当前所预见的修改形式,仍可构成其等同物。因此,本发明的范围不应受本文所述的细节和结构的局限,而是仅受以下权利要求书及其等同物的限定。
Claims (11)
1.一种检测产DNA酶微生物的非诊断性方法,包括:
提供干组合物和怀疑含有产DNA酶微生物的样品;
其中所述干组合物包含冷水可溶性胶凝剂和DNA酶指示剂系统,该DNA酶指示剂系统包括甲基绿和DNA;
使预定体积的包含所述样品的水性液体与所述干组合物接触以形成水凝胶;
将所述水凝胶温育一段时间;以及
检测产DNA酶微生物;
其中在与所述预定体积的水性液体接触后,在所述水凝胶中甲基绿的浓度为5μg/mL至20μg/mL。
2.根据权利要求1所述的方法,其还包括提供营养物、选择剂、指示剂或者前述两者或更多者的任意组合的步骤;其中所述包含所述样品的水性液体还包含所述营养物、所述选择剂、所述指示剂或者前述两者或更多者的任意组合。
3.根据权利要求1所述的方法,还包括:
提供成像系统;以及
用所述成像系统获取所述水凝胶的图像;
其中检测产DNA酶微生物包括显示、打印或分析所述水凝胶的图像。
4.根据权利要求1–3中任一项所述的方法,还包括对一种或多种类型的微生物进行计数。
5.根据权利要求3所述的方法,其中所述成像系统包括照明源,且其中获取所述水凝胶的图像包括对所述水凝胶进行照明。
6.根据权利要求5所述的方法,其中对所述水凝胶进行照明包括用有限波段的可见光波长对所述水凝胶进行照明。
7.根据权利要求5所述的方法,其中对所述水凝胶进行照明包括使用偏置滤波器来照明所述水凝胶或者来采集所述水凝胶的图像。
8.根据权利要求5所述的方法,还包括提供图像分析系统的步骤;其中分析所述图像包括用所述图像分析系统分析所述图像。
9.一种检测制品,包括:
一种主体构件,包括具有上表面和下表面的自支撑防水基材;
其中包含冷水可溶性胶凝剂和指示剂系统的干涂层均匀地粘附至所述主体构件的至少一个表面的一部分上,
其中所述指示剂系统包含DNA和甲基绿,
其中在与预定体积的液体接触后,所述胶凝剂形成水凝胶,且在所述水凝胶中甲基绿的浓度为5μg/mL至20μg/mL。
10.根据权利要求9所述的制品,其中所述涂层还包含营养培养基、指示剂、选择剂或者前述两者或更多者的任意组合。
11.干组合物在制备产DNA酶微生物检测试剂盒中的应用,其中所述干组合物包含冷水可溶性胶凝剂和DNA酶指示剂系统,该DNA酶指示剂系统包括甲基绿和DNA,以及所述干组合物与预定体积的水性液体接触后,形成水凝胶,在所述水凝胶中甲基绿的浓度为5μg/mL至20μg/mL。
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