JP4842473B2 - 微生物を検出し、定量し、特徴付けする装置および方法 - Google Patents

Description

【０００１】
[発明の背景]
本願は、１９９７年１２月１２日に出願されたJeffreyらの米国特許出願第０８／９８９，５６０号、および１９９９年３月１２日に出願されたMatsumuraらの米国特許出願第０９／２６７，８６３号に関連する。それぞれの内容は、ここで引用することによって本願の一部をなすものとする。
【０００２】
臨床試料内の微生物の汚染の存在は、従来は、試料を栄養分があるところで培養し、ある期間後の試料内の変化または試料上の雰囲気の変化を通して微生物の活性を検出することによって決定される。例えば、Ahnellらの米国特許第４，１８２，６５６号では、サンプルは発酵性の基質を標識した炭素１３を含む培地を有するコンテナの中に置かれる。このコンテナをシールし、生物の活性を助長する状態に試料をさらした後、試料上のガス雰囲気の炭素１２に対する炭素１３の比率を測定し、初期の比率と比較する。米国特許第４，１５２，２１３号では、試料内の酸素を消費するバクテリア（細菌）の存在が、コンテナ内のガス圧をモニタして試料上のガス雰囲気の酸素の量の減少を検出することによって、シールされたコンテナの中で測定される方法がクレームされている。米国特許第４，０７３，６９１号は、ある期間後の試料上のガス体中の特性の変化を測定することによって、培地を含むシールされたコンテナの中で、バクテリアを含む生物活性原因物質の存在を測定する方法を提供している。
【０００３】
非侵襲性の検出方法は、Calandraらによる米国特許第５，０９４，９５５号によって教示されている。この方法では、透明なシールドされたコンテナの中で殺菌した液体の増殖培養液を用いて試料を培養することによって、血液または他の体液などの臨床試料内および非臨床試料内の微生物の存在を検出する装置が開示されている。微生物の存在は、コンテナの内面またはコンテナをシールするために使用するシーリング手段に貼り付けられたセンサを用いて、試料のｐＨまたは試料内の二酸化炭素の生成物の変化を検出または測定することによって決定される。Calandraらの特許では、非放射手段および非侵襲手段によって、赤血球の大きな濃縮物のような干渉材料が存在する中で、微生物を検出することができる。
【０００４】
Calandraらの検出システムの１つの欠点は、微生物の存在を検出するために必要な時間が、サンプル内の微生物の数に関係していることである。また、微生物用の増殖培地が液体のため、通常コンテナを培養の間は撹拌する必要があることである。このことは、機械的な故障の可能性が増加するだけでなく、培養装置の製造に含まれる費用が追加されることになる。また、そのようなシステムにより、微生物の存在を決定することは可能になるが、計数することはできない。さらに、微生物を検出した後、微生物を同定することおよび／または種々の抗生物質に対する感受性を決定することが望ましい場合が多い。Calandraのタイプのシステムでは、感受性試験または同定試験を行う前に、液体の培地から微生物を取り出すことが必要であり、別の時間がかかる。この時間は、患者が重体の場合は常に使えるとは限らない。また、Calandraのタイプのシステムは、抗生物質の感受性および／または微生物の同定に対する読取り用プレート／画像化用プレートの別の機能を行うことができない。
【０００５】
患者のサンプル内の微生物の検出に続いて、どの抗生物質にこの微生物が敏感であるかを決定することが望ましい場合が多い。現在では、１つ以上のクラスの抗菌薬剤に大きな耐性を示す多数の細菌種があり、感受性試験を行うことが極めて重要である。患者の分離菌における抗菌剤耐性を正確に予測するための特定の感受性試験に失敗すると、微生物に効き目がない抗生物質を使用してしまう場合、患者の治療に大きく影響を与える可能性がある。
【０００６】
異なるタイプの感受性試験を使用して、微生物を試験することができる。次の短い説明によって、いくつかの周知の感受性試験の詳細および本発明に関連するいくつかの詳細を述べる。
【０００７】
感受性試験の１つのタイプは、カービー−バウエル試験とよく呼ばれるディスク拡散試験（disk diffusion test）である。これは標準化された試験であり、ゲルのプレート（例えば、150 mmのMueller-Hintonの寒天のプレート）に接種すること（0.5マックファーランド（McFarland）の微生物分離菌の標準懸濁液を用いて）および固定濃度の抗生物質を注入した１つ以上のディスクをその上に置くことを含んでいる。培養（例えば、３５℃で１８〜２４時間）の後、ディスクの周りの抑制領域の直径が（もしあれば）、各ディスク内に注入された特定の抗菌薬剤に対する接種された微生物の感受性を決定する。カービー−バウエル法の標定によれば、この方法の結果は、「Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Testing」の中のＮＣＣＬＳ（National Committee on Clinical Laboratory Standards）が出版した情報に基づいて、抑制領域の直径を比較することによって分析される。この情報の内容は、引用することによって本願の一部をなすものとする。この試験の結果は、３つのカテゴリーの感受性、すなわち耐性、中間的および敏感があり、半定量的である。図１４において分かるように、接種材料を含む寒天のプレート１１０は上に置かれた複数のディスク１１２を有しており、これらのディスクには（様々なタイプおよび／または濃度の）抗生物質が含浸されている。培養の後で、微生物増殖抑制領域１１４が形成される。これらの領域１１４は、ＮＣＣＬＳ基準に基づいて、耐性、中間的および敏感の微生物を示すと解釈される。
【０００８】
抗菌物質感受性試験の別の方法は、抗菌物質勾配法である。この試験は、ゲル培地内の抗菌物質の勾配を利用する。ペーパまたはプラスチックのストリップが、抗菌物質の濃度勾配で含浸される。複数のストリップが、ホイールのスポークのようにMueller-Hintonの寒天のプレート上に置かれる。プレートは試験される微生物で接種されている。（微生物が特定のストリップ上の抗菌物質に敏感である場合、）培養の後で、抗菌物質の勾配が、ゲル内のそれぞれの試験ストリップの周りに楕円形に形成される。目視できる微生物の増殖を防ぐ抗菌薬剤の最小の濃度が、この試験の終了点（最小抑制濃度（minimum inhibitory concentration）、すなわちＭＩＣ）である。言い換えると、ディスク拡散試験では、ＭＩＣは抑制領域のエッジの濃度（増殖／非増殖境界）である。この場合、ＭＩＣは、楕円形の増殖抑制領域が試験ストリップを横切るポイントである。図１５から分かるように、寒天のプレート１０１は、抗菌物質の勾配で含浸された複数の試験ストリップ１０３を有している。微生物の増殖が試験ストリップの中または上で抗菌薬剤によって抑制される、楕円形の領域１０５が形成される。楕円形の領域が試験ストリップと交差するポイント１０７が、ＭＩＣポイントである。
【０００９】
感受性試験の第３のタイプは、ブロス希釈試験(broth dilution test)である。このタイプの試験では、抗菌物質の希釈（例えば、連続した２倍希釈）が調合される。少なくとも薬物の１０個の濃度が、チューブまたはマイクロウェル内に調合されることが多い。種々の濃度の抗生物質を有するそれぞれのチューブまたはウェルに、特定の微生物が接種される（試験用バクテリアの標準懸濁液が各希釈液に加えられ、5 x 10⁵ CFU/mlの最終濃度を得る）。増殖コントロールウェルおよび接種されないコントロールウェルが、各プレートに含まれる。培養（例えば、３５℃で１６〜２４時間）の後で、ウェルまたはチューブが、濁度、くもりおよび／または沈殿についてマニュアルでまたは機械によって検査される。微生物の増殖を容易に目視化できるように、インジケータをウェルの中に配置することができる。他の試験と同様に、目に見える微生物の増殖を防止する抗菌薬剤の最小の濃度が、ＭＩＣである。
【００１０】
商業上の微量希釈試験は、一般に、標準的な９６個のウェル用プレート上で行われる。それぞれのウェルには、市販の抗生物質試験パネルを含む約100〜200マイクロリットルが入っている。各抗生物質に対して９６個のウェルおよび２〜１０種の異なる希釈液を用いて、多数の抗生物質を単一のプレート上で試験することができる。そのような市販の微量希釈システムについての重大な問題は、標準的な抗生物質試験パネルに柔軟性がないことである。市販のパネルは、ウェル内の様々な量の冷凍、乾燥または凍結乾燥された抗菌薬剤から製造される。これにより、プレートを用意する仕事に費やす時間が節約される。しかしながら、多くの抗生物質を利用することができる（米国では５０以上）ため、研究室がその研究室の要求に理想的な標準の市販の試験パネルを見つけだすことが疑わしいことが多い。図１６は、そのような微量希釈システムで使用される９６ウェル式プレートの説明図である。
【００１１】
ブロス微量希釈法の変形例は、米国特許第５，５０１，９５９号の中に記載されている。このシステムは、それぞれがウェルの底に付けられたペーパーのディスクを含む、１６８個のウェルが付いたマイクロタイタ（microtiter)のプレートを使用する。このディスクには、種々の抗菌薬剤の連続した２倍希釈の濃度液およびレドックスのインジケータが含まれる。最大２０の異なる抗菌薬剤を、プレート上で試験することができる。このペーパディスクの使用により、カスタムパネルの製造が単純化される。しかしながら、感受性試験を顧客に対して特別注文で作る場合は、より高いコストが必要になる。
【００１２】
感受性試験に最高の自動化を提供する現在の機器は、一般に、前述したマニュアルのブロス微量希釈法の中で実行されるタスクの自動化に基づいている。１つのそのような例は、米国特許第４，４４８，５３４号の中で説明される機器である。この機器は、抗菌薬剤の連続した２倍希釈濃度液で予め負荷（プレロード）された複式ウェルのプレートを使用する。プレートはマニュアルで接種され、培養される機器の中に置かれる。適当な時間に、プレート上のウェルが光度計／蛍光光度計で読み取られて、試験の結果を測定する。別の自動化システムが、米国特許第３，９５７，５８３号の中で説明されている。この機器は、抗菌薬剤の連続した２倍希釈濃度液で予め負荷（プレロード）された小さな複式チャンバのカードを使用する。カードは自動的に接種され、培養され、そして機器内でモニタされる。この機器は、光度計を用いて定期的にカード内のチャンバを読み取る。これらの反応速度測定によって、機器が試験の結果を測定することができる増殖曲線が作られる。前述した機器は４時間から８時間で試験を実行するが、それらの装置は微生物の誘発された耐性を検出することはできないため、結果として不正確な感受性の報告書を作成する可能性がある。残念なことに、ブロスの微量希釈に基づいた機器によって提供される自動化の程度は、ディスク拡散のような方法には利用することができない。
【００１３】
微生物の同定については、種々の選択培地および鑑別培地に基づいて、どのタイプの微生物が検出されたかが決定されてきた。選択培地は、微生物の特定の属又は種に対する試験が、ターゲットの微生物を除く全て（または、ほぼ全て）の微生物を抑制することによって行われる場合に適当である。鑑別培地は、特別な特性（例えば、クエン酸塩を単独の炭素源／エネルギー源として代謝する能力）に基づいて、バクテリアのいくつかの種の間を区別するために使用される。病院または環境設定の中では、直面する可能性がある異なった種は極めて多いので、選択培地を使用することは非常に高価なものになる。これらの設定における微生物の同定は、この場合、代謝特性に基づく。従来の技術では、適当な培地を準備するための多くの時間のコミットメントおよび従来の装置を使用するための大きな研究室の空間が必要である。
【００１４】
また、微生物を同定するために各種の自動化機器が存在する。１つのそのような機器では、小さい複式チャンバ型カードが各種の基体を含んでいる。チャンバは、光度計で測定される。代謝された基体（substrate)のパターンに基づいて、同定が決定される。別のシステムは、９６ウェル式プレートを使用する。それぞれのウェルには、個別の炭素のソースおよびレドックスのインジケータが含まれる。同定は、基体利用のパターンに基づいて決定される。さらに別のシステムは、蛍光染料および蛍光化合物でラベルした基体を使用する。酵素の活動により、蛍光化合物がこれらの基体から放出されるか、または蛍光の輝度の変化の中でｐＨの結果が変化する。
【００１５】
[発明の要約]
本発明は、機器上の微生物の検出および／またはスクリーニング、また同時にまたは連続して同じ機器上で、様々な抗生物質に対する微生物の感受性の決定、および／または微生物の同定に関する。本発明はまた、同じ機器内で尿のスクリーニングを随意的に実行することに関する。この機器は、画像収集技術、いくつかの画像処理アルゴリズム、およびこれらの機能を実行するための各種の専門のディスポーザブルな（処理可能な）プレートを使用する。
【００１６】
特に、この機器は微生物を培養するためのディスポーザブルなプレート、および機器による検出および／または測定を容易にするためのコンピュータのハードウェアおよびソフトウェアを使用する。このシステムは種々の機能を行うので、機器内で使用するいくつかのタイプの専門のプレートがある。それぞれのタイプのプレートは、その特定の機能に対して最適に形成されているため、プレートは培養および検出特性、および物理的な寸法に関して著しく異なっている。しかしながら、タイプに係わらず全てのプレートは、機器の中で処理することができる。機器は各プレート上で時間をかけて複数の測定を行うことができ、またこの反応速度の情報を利用して、各機能をより正確に実行することができる。
【００１７】
[好ましい実施の形態の詳細な説明]
図１で理解できるように、ユーザインターフェース用サブシステム２０２、プレート搬送用サブシステム２０４、培養用サブシステム２０６、および画像化用サブシステム２０８と通信するプロセッシング用サブシステム２００が設けられている。プロセッシング用サブシステムの役割は機器の動作をコントロールすることであり、埋め込まれたマイクロプロセッサ（例えば、ペンティアム（登録商標））またはＰＣのようなマイクロコントローラボードまたはシステムに基づいている。種々の並列または直列のインターフェースを用いて、このプロセッシング用サブシステムは、他のサブシステムと通信すると共にそれらをコントロールする。このプロセッシング用サブシステムは、取得したデータの分析を行うこともできる。ユーザインターフェース用サブシステムは、ユーザが機器をコントロールする能力、およびコントロール用パラメータおよび／または機器からのデータを見る能力を提供する。このユーザインターフェース用サブシステムは、ＣＲＴ、ＬＣＤ、ＣＣＤおよび／またはＣＭＯＳディスプレイから構成し、別個のボタン、バーコードリーダ、キーパッド、キーボード、および／またはタッチスクリーンに接続されている。オーディオ入力（音声認識付き）および出力の能力も設けられている。培養用サブシステムは、機器の培養チャンバ内の温度および／または湿度を調節する能力を提供し、プレート搬送用サブシステムは、機器内の装置の動きをコントロールする能力を提供する。画像化用サブシステムは、プレートの画像を撮る能力を提供すると共に、様々な画像収集および照射装置を備えている。
【００１８】
一般に、この機器の役割は（付加的な機能が想定されるが）３つの主要な機能を実行することである。すなわち、プレートの培養、画像の収集および画像の処理である。この機器はコントロールされた環境を提供して、最適な増殖条件で種々のプレートを培養する。プレート（検出／計数センサ用プレート、抗生物質感受性用プレート、同定用プレート、尿スクリーン用プレートなど）は接種されて、インキュベータの中に配置される。このインキュベータで、プレートは続いて培養期間の間に画像収集装置によって定期的な間隔でスキャンされる。この機器は、１つ以上のカラーおよび／またはグレースケールの撮像装置（画像化装置）および照射装置を用いて、画像収集を行う。時間が経過した画像が、プレートの１つ以上の側（視野および角度）から得られる。培養期間の間に収集された画像は、いくつかの画像処理技術およびアルゴリズムを用いて分析され、結果を確定する。機器の設計をモジュール方式にして、広範囲のプレート培養能力を提供するように構成することができる。
【００１９】
どのように種々のプレートを１つ以上の画像化プレートに対して移動させることができるかについての１つの実施例が、図２に示されている。この図から分かるように、撮像装置２１１および２１２が、各プレートのそれぞれ上部および底部の画像を取り込むように設けられている。上部および底部の画像化搬送システム２１５および２１６が、プレートが上部または底部の画像化ステーションに置かれたときに、複数のプレートを通過してそれぞれの撮像装置を移動させるために設けられている。各画像化ステーションにおける各プレート２１７は、撮像装置によって取り込まれた画像を有している。図２に示すように、プレートを画像化ステーションから上方および下方の両方に移動させるプレート搬送システム２１８によって、プレートは画像化ステーションに移動される。１つの可能な構成では、プレートを保持するプレート棚は、機器の前側では下方に、後側では上方に搬送される。撮像装置は、回転トラックの上部および底部位置で直線のトラック上に取り付けられる。プレート棚は、機器の内部で「階段状」に回転される。回転トラックの上部および底部位置のプレート棚は、「画像化ステーション」に入る。撮像装置は棚の長さ方向に沿って追跡して、画像データを取り入れる。プレート棚は、次に、別の「ステップ」に回転し、他の棚が画像を取り入れるために画像化位置に移動される。異なるタイプのプレートが同じ寸法で図示されているが、プレートホルダは異なる寸法のプレートを保持するように構成することもできるか、または異なるプレートホルダが特定の寸法のプレートをそれぞれ保持することもできる。この場合、プレート寸法はプレートホルダ間で異なっている。
【００２０】
本発明の別の実施形態では、図３および図４から分かるように、複数のプレート２２０がプレート棚２２１上に保持されている。これらのプレート棚は、機器の前面側上でのみ「積重ね」られている。棚はスライドベアリング上に取り付けられていて、これらのスライドベアリングにより棚は画像化するために機器の中にスライドして戻ることができる。画像化／ライティング装置２２３は、棚の後のＸ−Ｙトラッキング機構のような画像化／ライティング搬送機構２２５上に装着される。プレートは以下に述べる方法で画像化される。
【００２１】
（ａ）撮像装置が、棚の後ろの（棚の高さに整列した）位置に移動される。
（ｂ）棚が、撮像装置の間の、直線状のベアリングに沿って機器の中に引き戻される。
（ｃ）撮像装置が、棚の長さ方向に沿って追跡されて、画像データを取り入れる。
（ｄ）棚が、前に押し出されて、次の棚を画像化するために撮像装置が移動される。
【００２２】
本発明のさらに別の実施形態では、図５および図６から分かるように、プレート２３０がプレート棚２３２上に保持される（これらのプレート棚は、図３および図４と同様な方法で構成することができる）。撮像装置２３４は、棚の長さ方向に沿って配列された長いスキャナアレイとして設けられている。プレートは次のような方法で画像化される。
【００２３】
（ａ）スキャナアレイが、棚の後の（棚の高さに整列した）スキャナ搬送機構２３６によって、位置に移動される。
（ｂ）棚がスキャナアレイの間の、直線状のベアリングに沿って機器の中に引き戻される。
（ｃ）棚が押し戻されると、この棚上の全てのプレートが、スキャナのアレイによって同時に画像化される。
（ｄ）棚が前に押し出されて、次の棚を画像化するためにスキャナアレイが移動される。
【００２４】
本発明のさらに別の実施形態では、図７および図８に示すように、中にプレート２４０を有するプレート棚２４３が、（図２のような）回転トラック上の機器内に移動される。図５のように、撮像装置２４５は棚の長さ方向に沿って配列されたスキャナアレイである。しかしながら、これらのアレイは機器の上部に固定されている。プレート２４０は、次の方法で画像化される。
【００２５】
（ａ）プレート棚が、機器の中で「ステップ状」に回転される。
（ｂ）棚が機器の後部から前部に向かって移動するとき、棚が（機器の上部に搭載された）スキャナアレイの間を追加し、そこで全てのプレートが同時に画像化される。
（ｃ）プレート棚は他の「ステップ」に回転され、別の棚が画像を取り入れるためにスキャナアレイを通って移動される。
【００２６】
無論、他のプレートおよび／または撮像装置用搬送システムも、利用することができる。カートリッジ式システムも使用することができ、このシステムでは一度に１つのプレートが画像化するためにトラックから移動される（そして、スタックまたは撮像装置のいずれかが、撮像装置および選択されたプレートが互いに接近する位置に移動される）。回転可能なシステムまたは他の回転システムを使用して、各プレートを撮像装置の近傍に位置決めすることができる。またはコンベヤーベルトまたはホイールのシステムを使用することができる。このシステムでは、（固体の培地付きの）プレートを列をなしてベルトまたはホイールに固定して、ベルトまたはホイールのどちら側にプレートを付けるかによるが、プレートを逆さまに回転する。
【００２７】
１つ以上のカラーおよび／またはグレースケールの撮像装置を使用して、機器は画像収集を提供する。撮像装置には、単独でまたはさらに処理した後で使用することができる、十分に鮮明なプレートの画像を提供するＣＣＤリニアアレイ型スキャナ、ＣＣＤラインスキャン型カメラ、ＣＣＤ二次元アレイ型カメラ（静止又動画のビデオ）、レーザスキャニング型カメラまたは他の装置がある。「画像（イメージ）」という用語は、１×１ピクセル以上のプレートからの光学情報のような任意の情報を意味する。画像収集は、定期的な前もってプログラムされた間隔で実行され、取り込まれた画像はプレートの１つ以上の観察および角度から得られる。
【００２８】
培養期間の間に得られた画像は、１つ以上の画像処理技術を用いて分析される。図２の実施例では、画像は定期的な間隔で、プレートの上部および底部の両方から得られる（プレートの一方の側だけの画像化も得られる）。一般に、間隔は５分から４時間であるが、好ましくは、この間隔は３０分と２時間との間であり、最も好ましくは１時間ごとである。定期的な間隔でスキャニングすることにより動的な増殖データが得られ、このデータを使用して微生物を特徴付けることができる。各プレートの結果を決定するために実行される画像処理アルゴリズムは、１つ以上の以下のステップから成る。
【００２９】
（ａ）関心のあるカラー帯域（センサに依存する）を選択するカラー分離および（必要な場合は）選択のステップ
（ｂ）不要な（extraneous)画像データから関心領域を分離する画像マスキングのステップ、
（ｃ）続いて起こる時間間隔で得られた２つの画像間の変化の領域を分離する画像減算のステップ
（ｄ）減算された画像内に起こる変化の大きさを増幅する画像等化のステップ、
（ｅ）等化された画像内の単一ピクセルノイズの影響を減少させる画像ぼやし化（ブラーリング）（例えば、ローパスフィルタ）のステップ、
（ｆ）フィルタ処理された画像内の局所的な差をさらに増幅する画像コントラストおよび輝度強調（enhancement）のステップ
（ｇ）コロニー検出／計数アルゴリズムのために画像を用意する画像しきい値化（必要な場合、いくつかのしきい値を使用）のステップ
（ｈ）分析したプレートに基づいて、次の（または他の）機能（１）〜（３）の１つを用いる処理された画像分析のステップ。
（１）プレート上の微生物の存在を決定する、プレート上のコロニーの数を計数する、および／またはプレート上のコロニーを分類するカラー分析を行うコロニー検出、計数および／または分類、
（２）特定の抗生物質に対する微生物の感受性を決定する抑制領域検出および測定、
（３）カラー分析によって基体反応の程度を決定する基体反応領域検査。
【００３０】
別個のライティング機構によって、プレートを照射することができる、または撮像装置の一体化部分として、光源を設けることができる。光源は、広帯域および／または狭帯域の可視、紫外および／または赤外の照射とすることができる。
【００３１】
以下に説明するように、各種のプレートを、全て同じ機器の中で取扱いおよび分析することができる。
【００３２】
[プレートの検出／計数]
図９は、少なくとも一方の側（例えば、底側）が透明または半透明な、平らで浅いコンテナの形状とすることができるセンサプレート１の説明図である。このコンテナは開放状態（または単に基体）とすることができるが、シールされたコンテナまたはシール可能なコンテナであることが好ましく、またセンサプレート層の上にある量のヘッドスペースがあることが好ましい。このコンテナは、ストッパ３、スクリューキャップ、隔壁またはその任意の組合わせ（または他の任意のシーリング装置）を用いてシールすることができるポート２を含むことができる。いったんサンプルがコンテナの中に集められると、微生物の増殖についての要求事項により、センサプレートはガス透過性またはガス不透過性のどちらかのコンテナとして構成することができる。この構成は、種々のプレート組成材料、ラミネート（ガス不透過性および／または疎水性のガス透過性の薄膜）、および／または構成可能な通気孔（ベント）（例えば、コンテナの壁の開口部内のガス透過性の薄膜）を用いて実現される。
【００３３】
センサプレート用装置のコンテナの中に、サンプルを固定／吸収するために有用な１つ以上の層があるため、微生物のコロニーが局所的に増殖することができ、これにより、微生物のコロニーを検出する能力が増加する。１つの実施形態では、装置内の少なくとも１つの層が、微生物の目視化に悪影響を与えるマトリックスを有している。図１０から分かるように、固定層（マトリックス層）１０およびセンサ層１２が設けられている。これらの２つの層は、より詳細に後で説明するが、単一の層の中に結合することもできるが、これらの２つの層を別個に設けることが好ましい。また図１０に示すように、プレート底部１４があり、これは微生物の増殖によるセンサ層内の変化を目視／画像化するために、透明であることが好ましい。
【００３４】
紫外、可視および／または赤外のスペクトル内のはっきりと局在した大きな変化をもたらすことによって、微生物の増殖の位置を示す目的のために、センサ層１２を設ける。この局在化された変化は、微生物の増殖の近くのセンサ面と反対側の、プレートの底面上で検出可能である。センサ層は、好ましくは不透明のマトリックス（支持材料）上および／またはマトリックス内に埋め込まれた、検出可能な特性（例えば、インジケータ）における変化を受ける材料を含んでいる。「不透明」にすることにより、固定層内に固定された試験サンプルおよび／または実際の微生物のコロニーがセンサ層の反対側（例えば、半透明、かなり不透明、または十分に不透明）から（任意の関連する電磁気領域で）観察または検出されることを、センサ層が十分に阻止することを意味する。試験サンプルもかなり透明である場合は（この場合は、センサ層は微生物のコロニーが存在すると、透明から不透明に局所的な変化を受ける）、センサ層を透明または比較的透明にすることが可能であるが、センサ層は透明でないことが好ましい。センサ層が不透明な場合は、検出および計数に干渉する可能性がある試験サンプル内の微生物の検出に、改良された結果が得られる。試験サンプル自体が、固定層内の微生物の存在または増殖を目視／検出すること（例えば、目でまたは機器を用いて）に直接干渉する場合、少なくとも１つの固定層またはセンサ層（センサ層が好ましい）が、実際の試験サンプルおよび／または実際の微生物を検出／目視することを阻止できて、その代わり固定層内の微生物の存在／増殖に対応するセンサ層内の変化を検出することが好ましい。固定層も不透明にすることができ、また本発明を実行する１つの実施形態では、センサ層、固定層およびサンプルの全てが不透明である。
【００３５】
センサには、その上またはその中に固定されたインジケータの培地を有する固体の組成または薄膜が含まれる。センサ層は、外部から見えるように、コンテナの内面と同じ高さに、またはコンテナをシールするために使用されるシーリング手段の中に配置するが、またはシーリング手段に取り付けることが好ましい。セル、蛋白質、他の固形のまたは他の不透明なまたは着色された成分が、センサ層とコンテナ面との間に出ないように、センサ層をコンテナに付けることが好ましい。いくつかの実施形態では、センサ層は薄膜または他の固体の層によって、試料およびその増殖培地から分離される。
【００３６】
本発明の１つの実施形態には、透明であるかまたは透明な部分を有する蓋またはキャップのようなシーリング手段が含まれる。センサは透明な蓋または蓋の部分の近くに配置したり、蓋の一部によって作ることができる。蓋がコンテナをシールするように使用される場合、インジケータ内の変化は透明なシーリング手段を通して読み取られる。シーリング手段は、カプセル化されたインジケータのミセルを含む、ポリマーのような材料からも作られる。材料が微生物の代謝が原因の変化に対して透明である限り、またインジケータ内の変化がシーリング手段の表面で目視できる限り、コンテナまたはシーリング手段内の透明な部分は必要とされない。
【００３７】
全サンプルの体積に対してわずか１つの微生物しか含まない、血液のような体液の試料内の微生物を、本発明を使用して検出することができる。そのような試料は、微生物の個体数がクリティカルレベルに達して、微生物の代謝に伴って生ずるパラメータ内の変化を測定できるまでに、多数の日数の培養を必要とする。
【００３８】
このセンサは以下に述べるように有用である。すなわち、（１）微生物の代謝によるセンサ層内の変化（例えば、代謝によるガス成分の増加または減少）は、試料上のガス雰囲気の中からではなく、固体または半固体の固定層から検出される。（２）センサはプレートまたはクロージャまたはシーリング手段の内面に付けられる、またはクロージャまたはシーリング手段の外側を通して取り付けられるので、プレートの完全性を損なう必要なしに、プレートまたはシーリング手段の透明な壁の外側から測定を行うことができる。（３）目視によりまたは反射率、蛍光発光などによって測定する機器を用いて、または画像収集によって、外部の測定を行うことができる。（４）試料内の不透明な／着色された成分または蛍光成分は、変化を検出する能力またはこれらの変化の測定を妨害しない。（５）インジケータ分子の高い濃度は、変化を容易に観察または検出することができるように、センサ内の小さな体積の中で（例えば、ポリマーのエマルジョンの中でまたは薄膜の上で）維持することができる。
【００３９】
複雑な微生物の培地を構成する栄養成分は、微生物が使用する代謝経路に影響する。有機酸、塩基および種々のガスが、利用できる養分により比例的に生成される。これらの生成物はまた、微生物の種によって変化する。固定層内にこれらの生成物が存在すると、そのｐＨが変化することがある。本発明の中で使用されるセンサ層は、ｐＨの変化に応答して測定可能な変化を発生するｐＨ感知インジケータを含んでいる。または、インジケータのｐＨに影響する、ＣＯ₂のようなガスの存在を測定することができる。微生物の増殖は、Ｏ₂および／または蛍光発光を測定することによっても検出することができる。センサ層は、微生物の代謝によるＯ₂濃度の減少に応答するように設計することができる。そして、カラーまたは他のパラメータ内の変化ではなく、蛍光発光の変化を受けるインジケータを選択することができる。二酸化炭素は大抵の微生物が発生する一般的な代謝産物であり、このため、微生物の増殖の検出に好ましい代謝産物である。どのような機構が使用されても、好ましい実施形態では、センサ層は大抵の微生物の存在／増殖に応答する検出可能な変化を受ける。
【００４０】
インジケータは、支持培地に共有結合または非共有結合で取り付けることができる。あるいはまた、インジケータは、硬化の前にポリマーマトリックスの中に乳化されるように、カプセル化することができる。
【００４１】
センサ層は、必要な場合、適当な接着剤を用いて、適当な透明な容器または透明なシーリング手段の中に付加することが好ましい。それらはシーリング手段の一体化された部分を含むことができるか、またはそのまま硬化されたポリマーマトリックス内に乳化されたインジケータとして、シーリング手段または容器の中に付加することができる。微生物の代謝による変化がセンサに影響を与えることができる方法が提供される限り、それらをコンテナの外部に配置することもできる。
【００４２】
種々の異なった蛍光発光および可視のｐＨインジケータを、ｐＨ、Ｈ₂、Ｈ₂Ｓ、ＮＨ₃、Ｏ₂またはＣＯ₂センサの活性分子種として使用することができる。一般に、インジケータを選択する上の唯一の制約は、インジケータが、赤外線、蛍光発光、反射率および／または画像化技術によって検出可能な許容できるダイナミックレンジおよび波長の変化を有するという要求事項である。
【００４３】
本発明による培地内のｐＨの変化を検出するセンサは、約5.0から約8.0にわたるｐＨ範囲の蛍光発光の輝度または可視のカラーにおける変化を示すことが好ましい。
【００４４】
ＣＯ₂センサ用のインジケータは、ＣＯ₂濃度の変化を検出するために、好ましくはｐＨが約13と約5との間、また最も好ましくはｐＨが約13と約9との間で、赤外線の輝度、蛍光発光の輝度または可視のカラー内の変化を示す必要がある。
いくつかのｐＨインジケータ分子のみが、支持媒体に共有結合または非共有結合で結合し、それらのｐＨ表示特性を保持することができる。キサンテン、フェノールフタレイン、フェノールスルホンフタレインのグループに属するインジケータは有用である。これらの例には、フルオレセイン、クマリン、フェノールフタレイン、チモールフタレイン、ブロムチモールブルー、チモールブルー、キシレノールブルー、オルソクレゾールフタレインおよびα−ナフトールベンゼンが含まれる。
【００４５】
支持媒体は、ｐＨインジケータを有機反応を用いて共有結合的に付けることができるセルロースまたはある種のシリコーンのような物質とすることができる。ｐＨインジケータを非共有結合的に付けることは、正または負のゼータ電位を有するナイロンの薄膜のようなイオン支持材料を用いて実現することができる。使用可能な他のイオン支持材料は、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）樹脂またはＤＥＡＥセルロースなどの、正または負に帯電したイオン樹脂である。蛋白質による支持材料の前処理は、インジケータの薄膜が微生物増殖用培地と直接接触する場合は必要である。
【００４６】
ｐＨインジケータ用センサは、微生物増殖培地のｐＨ環境により、直接ｐＨの変化を検出する。しかしながら、これらのセンサは、微生物の代謝に基づいて、ガス（例えば、二酸化炭素、アンモニア、水素、硫化水素、または酸素）に選択的に反応するように作ることができる。イオンを通過させずにガスの拡散を選択的に可能にする能力によって特徴付けられた、シリコーン、ラテックス、テフロン、または種々のプラスチックなどの、選択的に半透性の組成物または薄膜を、センサ層上に設けることができる。ポリマーマトリックス内にカプセル化されたインジケータを含むセンサについては、マトリックスを形成するポリマーが、ガスの通過は可能にするがイオンは通過させない半透性のバリアとして機能することができる。
【００４７】
１つの実施形態では、ＣＯ₂センサは複数の成分から構成する。第１のセンサは、ｐＨの範囲が6および10の間で反応する、可視または蛍光発光のｐＨインジケータである。これらの基準を満たすインジケータの例は、ブロムチモールブルー、チモールブルー、キシレノールブルー、フェノールフタレイン、オルソクレゾールフタレイン、クマリン、およびフルオレセインである。第２の成分は、必要な場合、酸、塩基またはバッファ（緩衝液）であり、これは選択されたｐＨインジケータによるＣＯ₂の検出に対して最適なｐＨ環境を維持する。第３の成分は、グリセロールまたは等価の乳化剤とすることができ、これは未硬化のポリマー内で乳化されたインジケータ溶液の小滴を生成することができる。第４の成分は、酸化チタン、酸化亜鉛、酸化マグネシウム、酸化第１鉄などの色素とすることができる。第５の成分はシリコーンのような未硬化のポリマーとすることができ、これはインジケータに対して適当な環境を維持する。ガスに対して透過性であるがイオンは透過させず、また殺菌されるときこれらの特性が変化されることがない限り、それ自体の化学的特性または物理的特性、または硬化に対するその要求事項のいずれかから、インジケータの化学的活性に非常に多くの影響を与えることがない、任意のポリマーを使用することができる。満足がいく他のシリコーンポリマーは、高温、触媒作用、または紫外の加硫によって硬化されるポリマーである。乳剤が種々の成分から調製され、またポリマーが硬化されて、ｐＨインジケータの小滴の周りに半透性のマトリックスを形成する。このマトリックスが、固定層からのＣＯ₂および他のガスの選択的な拡散を可能にして、センサ層内に結果として局所的で測定可能な変化が発生する。センサ層は、モールド（型板）内などで別個に調製され、硬化され、次にシリコーン接着剤のような適当な接着剤を用いてプレートに付けることができる。あるいはまた、センサはコンテナの底部に形成されて、その場所で硬化されることが好ましい。硬化の後で、加圧滅菌（オートクレービング）またはガンマ線照射によって、センサを有するコンテナを殺菌することができる。都合がいいことに、固定層および付加的な任意の層を殺菌前にセンサプレート用装置内に導入し、これにより、そのプロセスによって殺菌することができる。
【００４８】
さらに別の実施例では、センサ層は、着色されたシリコーンマトリックス内に乳化されたインジケータ溶液を含んでいる。このインジケータ溶液は、0.8 Mの水酸化カリウム（10.0 ml）およびイソプロピルアルコール（10.0 ml）の溶液内に溶解されたチモールブルーのインジケータ（0.65 g）から構成する。インジケータ溶液（5.0 g）は、次ぎに、着色されたシリコーン成分と混合される。着色されたシリコーンマトリックスは、Sylgard 184シリコーン（成分Ａ（50.0 g）およびＢ（5.0 g））および白色顔料（部品番号 61-18000, Feiro Corp., ニュージャージー州）（1.0 g）から構成する。センサ材料は、次に、プレート上の薄い層の中に注がれ引き伸ばされる（約0.2から0.5 mm）。
【００４９】
別の実施形態では、センサ層は、着色されたシリコーンマトリックスと混合されたインジケータ溶液を含んでいる。このインジケータ溶液は、イソプロピルアルコール(5.0 ml)および0.9 Mの水酸化カリウム(5.0 ml)の溶液中に溶解されたオルソクレゾールフタレインのインジケータ(2.0 g)から構成する。インジケータ溶液(2.5 g)は、次に、着色されたシリコーン成分と混合される。着色されたシリコーンマトリックスは、Sylgard 184シリコーン（成分Ａ（25.0 g）およびＢ（2.5 g））および白色顔料（部品番号 61-18000, Feiro Corp., ニュージャージー州）（0.5 g）から構成する。センサ材料は、次に、プレート上の薄い層の中に注がれ引き伸ばされる（約0.2から0.5 mm）。この実施例の変形例では、上述したオルソクレゾールフタレインのセンサ層は、着色されたシリコーンマトリックスから成るオーバコート層でカバーされる。
【００５０】
さらに別の実施例では、センサ層は、着色された溶液と混合されたインジケータ溶液およびシリコーンマトリックスから構成している。このインジケータ溶液は、イソプロピルアルコール(10.0 ml)および0.8 Mの水酸化カリウム(10.0 ml)の溶液中に溶解されたオルソクレゾールフタレインのインジケータ(2.0 g)から構成する。着色された溶液は、シリコーンオイル(40.0 g)および白色顔料（部品番号 61-18000, Feiro Corp., ニュージャージー州）（4.0 g）から構成する。シリコーンマトリックスは、Wacker Elastosil RT 601シリコーン（成分Ａ（200.0 g）およびＢ（20.0 g））およびトルエン(40.0 g)から構成する。インジケータ溶液(20.0 g)は、次に、着色溶液(40.0 g)およびシリコーン成分と混合される。センサ材料は、次に、プレート上の薄い層（厚さが約0.1から0.3 mm）にスプレーされる。
前述したように、酸素、二酸化炭素およびｐＨの変化に反応するインジケータに加えて、アンモニア、酸化還元の電位、水素、硫化水素、または微生物の存在または増殖による変化を受ける何らかの他の物質の変化を検出するインジケータも利用することができる。また、複数の異なるインジケータを、１つのセンサ層（または、複数のセンサ層）の中に使用することができる。
【００５１】
センサ層は、サンプルの特性（例えば、固有の蛍光発光、不透明度など）がセンサの反応に影響するまたはマスキングすることを防止するために、不透明であることが好ましい。センサ層は、微生物の存在の下で、ある不透明な状態から別の不透明な状態に変化し、この変化が画像の収集および処理によって検出可能な変化であることが好ましい。１つの実施例のように、センサ層は、白に着色されたシリコーンで上重ね（オーバーレイ）された白に着色されたシリコーンマトリックス内のオルソクレゾールフタレインのインジケータの乳化された混合体とすることができる。または、センサ層は、チモールブルーのインジケータ、キシレノールブルーのインジケータ、または「一般的な」インジケータなどの１つ以上のインジケータで乳化された、着色されたシリコーンマトリックスとすることができる。センサ層内のマトリックスは、適当なラテックス、ポリウレタン、ナイロンの薄膜（例えば、帯電したナイロンの薄膜）、またはセルロースの粉末とすることができる。センサ層のマトリックスは、Sylgard 184、Wacker 601、またはWacker 934などのシリコーンマトリックスとすることもできる。または、センサ層は、インジケータ層および不透明な層のように、２つの層から構成することができる。
【００５２】
センサプレート用装置の中の他の主要な層は、固定層１０である。固定層の目的は、サンプル内の微生物をマトリックスの中またはマトリックスの表面上のいずれかに固定することである。サンプル自体は、液体、半固体、または半流動体（例えば、ペーストまたはゲル）のサンプルとすることができる。液体のサンプルは乾燥し粉末化したゲル剤と混合して、微生物を混ぜたとき微生物固定用のゲルのマトリックスを形成することができる。センサプレート用装置内の層としてすでに設けてある乾燥し粉末化したゲル剤に、液体のサンプルを加えることが好ましい。しかしながら、液体のサンプルを乾燥し粉末化したゲル剤と混合し、次に、ゲルになる前に、センサプレート用装置に両方を直接加えることもできる。また、微生物をゲルの表面上に固定するために、液体のサンプルをすでにゲル化したマトリックス、または脱水した若しくは部分的に脱水したゲルのマトリックスに加えることができる。ゲル剤を、物理的な支持加えるために、支持マトリックス内に埋め込むこともできる。実施例には、全体的に混合されたまたは編み合わせた若しくは編み合わせないファブリックの形状のガラスまたはセルロースの合成ポリマーのファイバが含まれる。また、サンプルを固定するために、固定層はゲル剤とする必要はなく、むしろスポンジ材料、セルロース、ガラスファイバ、フィルタペーパなどの非ゲル状の吸収材料を含むことができる。
【００５３】
混合した層または別個の層として、２つ以上のゲル剤をセンサプレート用装置の中で使用することができる。例えば、２：１の適当な重量比で混合されたグアールガムおよびキサンタンガムの混合体を使用することができる。自然のヒドロゲルおよび合成のヒドロゲルの粉末を含む他のゲル剤を、単独でまたは組み合わせて使用することができる。ガム、寒天、アガロース、カラゲナン、ベントナイト、アルギナート、コラーゲン、ゼラチン、溶融ケイ酸塩、水溶性スターチ、ポリアクリレート、セルロース、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリビニールアルコール、デキストラン、ポリアクリルアミド、多糖類または任意の他のゲル状若しくは粘性のある促進剤から選択された１つ以上のゲル剤を組み合わせることができる。
【００５４】
１つ以上の合成または自然の親水性ポリマーを含む、表面コロニー分離／固定用の脱水したおよび／または部分的に脱水したゲル材料を使用することができる。２つ以上のゲル剤を使用する場合、それらを混合したりまたは複数の層の中に入れることができる。１つの実施形態では、上部の層を設けて表面に微生物をトラップし、また下部の層を吸い上げ剤として設けて、上部の層を通して液体のサンプルを引き寄せることができる（例えば、変形したセルロース吸収剤上の薄い寒天の層、または吸収剤のパッド、ポリマーまたはヒドロゲル上の多孔質で親水性の薄膜）。
【００５５】
固定層は、センサ層に悪影響を与えてはならない。センサ層がｐＨの変化により検出可能な変化を受ける場合、酸性の強いゲル層がセンサ層に悪影響を与えることがある（また、製造プロセスによっては酸性のものがあり、センサ層に悪影響を与える可能性のある残留物を残すことがある）。さらに、固定層が粉末化されたゲル層である場合、この層がサンプルと混合された場合に、微生物が存在しない場合でもセンサ層を変化させることがあるので、確実に酸性に変わらないようにする必要がある。
【００５６】
図１０からさらに分かるように、任意のコンディショニング層１６を固定層の上（または中、または下）に設けることができる。図１０では固定層から離して図示しているが、コンディショニング層からのコンディショニング材料は、固定層自体の中に組み入れることが好ましい。コンディショニング成分は、固定層の中または分離した層の中に設けられていようとも、微生物の増殖、溶解剤、溶解性酵素、抗生物質中和剤、界面活性剤または微生物の検出および／または計数能力を向上させるために有用な他の材料用の１つ以上の培地を含むことができる。コンディショニング成分は、固定層の中または同じセンサプレート用装置内の別個の層の中の両方に設けることもできる。
【００５７】
コンディショニング用の溶解剤は、ゲルをより滑らかにできるようにおよび／またはゲルの再水和性をより良くするために、試験サンプル内の血液細胞を溶解するために加えることができる。可能な溶解剤の例には、サポニン、ジギトニン、Tweens（登録商標）、モノラウリン酸ポリソルビタン、および他の界面活性剤が含まれる。溶解性酵素は、一般に必ずしもタンパク質加水分解酵素である必要はないが、ゲルをより滑らかにするようにおよび／またはゲルの再水和性をより良くするために、血液サンプル内の細胞材料を消化するために加えることができる。コンディショニング用の溶解性酵素は、例えば、こうじ菌などから導かれた酵素の混合体のような１つ以上のプロテアーゼを含むことができる。
【００５８】
抗生物質中和剤は、特に、試験サンプル内の微生物のより早いおよび／またはより良い回収のために、コンディショニング用に加えることができる。１つ以上のそのような中和剤は、様々な抗生物質（例えば、ラクタマーゼ）を具体的に和らげるために、樹脂、ガム、および炭素ベースの材料（例えば、活性チャコールまたはEcosorb（登録商標））、または種々の酵素の１つから選択することができる。
【００５９】
培地もコンディショニング用に（固定層に直接または別々に）加えることができる。培地は、微生物の増殖用の栄養分を与えるために加えられる。様々なタイプの微生物用に多くのタイプの培地を使用することができるが、微生物が好気性の生物である場合、培地は１つの実施例として（それぞれの典型的な量はカッコの中にg/lで列挙されている）、トリプトン(17)、ソイトン(3)、プロテオースペプトン(5)、麦芽エキス(2.5)、デキストロース(2.5)およびＭＯＰＳ(23)を含むことができる。微生物が嫌気性の生物である場合、培地はヘミン(.005)、Ｌ−シスチン(.2)、Ｎａ−ｍ−二硫化物(.2)およびメナジオン(.0005)だけでなく、好気性の生物について前に列挙した培地をさらに含むことができる。
大腸菌については、培地は、実施例として、ラクトース(5)、胆汁酸塩＃３(.8)、Ｋ₂ＨＰＯ₄(7)、ＫＨ₂ＨＰＯ₄(7)、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄(.5)、ＭｇＳＯ₄(.1)、Ｎａ−ｍ−二硫化物(.4)、およびＳＤＳ(.1)を含むことができる。イースト菌、糸状菌及び他の耐酸性の微生物については、培地は、１つの実施例として、ブドウ糖(10)、酵母エキス(10)、クエン酸アンモニウム(2)およびｐＨが5.5の酒石酸を含むことができる。
【００６０】
図１０からさらに分かるように、アパーチャ（開孔）２０を有するコンテナの壁を設けることができる。その壁の下側は疎水性のガス透過性フィルム２２であり、上側はガス不透過性の（取り外し可能な）フィルム２４である。または、コンテナはその壁の中に、開口部をカバーする共に接着したガス不透過性のフィルムおよび疎水性のガス透過性のフィルムを有する開口部を設けることができる。微生物が嫌気性である場合、ガス不透過性のフィルムはそのまま残しておく。しかしながら、微生物が好気性である場合は、試験サンプルをセンサプレート用装置に加えるときに、ガス不透過性のフィルムを取り除く。無論、疎水性のガス透過性フィルムは、汚染物がコンテナに入らないようにするため、また感染の可能性がある試験材料が装置から漏れ出ないようにするために有用であるが、それは設ける必要が全くない。
【００６１】
図１０の領域Ａは、図１１および図１２にさらに詳細に示されている。図１１から分かるように、センサプレート用装置のさらなる実施形態では、単一の固定層に代えて、増殖後の表面捕捉および回収を可能にするための半剛体面用の分離ゲル層３０、接着層１、吸収性ゲル層３２および別の接着層３３の少なくとも１つを設けることができる。吸収性ゲル層３２は、１つ以上のコンディショニング成分（ゲル内に）、微生物増殖用の培地、溶解性酵素、および抗生物質中和剤を含むことができる。図１１からさらに分かるように、単一のセンサ層に代えて、１つ以上のオーバコート層３４、接着層３５、インジケータ層３６、およびプレート底部３８に接触する別の接着層３７を含むことができる。
【００６２】
図１２に示したような本発明の別の実施形態では、ゲル粉末、および培地、溶解性酵素および抗生物質中和剤などの乾燥したコンディショニング成分を含むマトリックス層４０を設ける。図１１のように、単一のセンサ層に代えて、１つ以上の接着層４１、オーバコート層４２、接着層４３、インジケータ層４４、およびプレート底部４６に接触する接着層４５を含むことができる。
【００６３】
センサプレート用装置の寸法は、所望のサンプルの寸法により変化することができる。１つの実施形態では、センサプレート用装置は、74 mm x 117 mmの寸法の固定層を有している。固定層が湿式タイプのゲルを含む場合、サンプルの寸法を極めて小さくすることができ（例えば、1 ml以下）、血液のサンプルを有する場合は、サンプルの寸法は最大15 mlになる。他方、固定層が乾燥し粉末化したゲルを含む場合は、粉末化したゲルの量により、サンプルの寸法はより大きくなる（例えば、サンプルは30 ml以上になる）。
【００６４】
使用にあっては、液体のサンプルがセンサプレート用装置の中に取り入れられる。サンプルは、センサプレートの底面に広がるときに、（所望の場合）「コンディショニング」される。サンプルは固定層に吸収されるか、または固定層とゲルを形成する。センサプレートは、次に、培養されて、微生物のコロニーの増殖が促進される。センサプレート用装置の底面に向かって配置されたセンサ層は、微生物のコロニーの存在を示すように検出可能な変化を受ける。最終的に、センサプレート用装置はマニュアルでまたは自動的に検査されて、微生物のコロニーの存在および位置を決定する。
【００６５】
この機器は、センサプレート上で３つの主要な機能、すなわち、プレートの培養、画像収集／取込み、および画像処理を実行する。機器は、プレートを培養するコントロールされた環境を提供する。培養が周囲温度から高められた温度で行われる場合は、この機器はヒータを含むことができる（高められた温度は、全ての状況で必要とされるものではない）。液体のサンプルがセンサプレート用装置に加えられ、この後センサプレートは機器の中に入れられる。ここでセンサプレートは続いて、培養期間の間に画像収集／取込み装置（例えば、カメラまたはスキャナ）によって感知／観察される。
【００６６】
センサプレート用装置の底部の画像は、１つ以上の画像処理技術およびアルゴリズムを用いて、所定の定期的な間隔で取り込まれ続いて分析されて、微生物のコロニーがセンサプレート上に存在するかどうかを決定することができる。微生物を検出および計数するために実行される画像処理アルゴリズムは、１つ以上の以下のステップから構成する。
【００６７】
（ａ）不要な画像データから関心領域を分離する画像マスキングステップ、
（ｂ）異なる時間間隔で取り込んだ２つの画像間の変化の領域を分離する画像減算ステップ
（ｃ）減算（サブトラクション）された画像に現れる変化の大きさを増幅する画像等化のステップ
（ｄ）等化された画像（ローパスフィルタ）内の単一ピクセルノイズの影響を減少させる画像ぼかし化（ブラーリング）のステップ
（ｅ）フィルタ処理された画像内の局所的な差をさらに増幅する画像コントラストおよび輝度強調のステップ
（ｆ）画像をコロニー検出／計数アルゴリズムに対して準備する画像しきい値化のステップ（必要な場合、いくつかのしきい値を使用）
（ｇ）プレート上に微生物の存在を測定し、プレート上のコロニーの数を計数し、および／またはプレート上のコロニーを分類するカラー分析を実行するコロニーを検出し、計数しおよび分類するステップ
【００６８】
多数の異なるタイプのセンサプレート用装置の実行可能性検討試験は、良好な検出結果を示している、すなわち、大腸菌は約６時間で検出され、Ｅファカエリス（E. facaelis）は約１０時間で検出され、また黄色ブドウ球菌は約１１時間で検出された。図１３は、４つのセンサプレートの下側を示しており、ここでセンサ層は、固定のマトリックス層に隣接した微生物のコロニーに最も近いセンサ層のこれらの領域の中で検出可能な変化を受けている。試験の中で検出されたコロニーは、次の試験で直ちに使用できる微生物の希釈をその後に生じた。
【００６９】
[感受性用プレート]
患者のサンプル内の微生物の検出および／または計数に続いて、どの抗生物質に微生物が敏感であるかを決定することが望ましい場合が多い。現在では１つ以上のクラスの抗菌薬剤にますます耐性を示す多数のバクテリア種があるため、感受性試験を実行することが極めて重要になっている。患者の分離菌の抗菌耐性を正確に予測する特定の感受性試験が失敗すると、微生物に効かない抗生物質が使用される場合、患者の治療が重大な影響を受けることがある。
【００７０】
本発明の一環として、微生物の抗菌感受性試験を行う感受性用プレートが提供される。プレートはディスポーザブルで複式チャンバ型であり、微生物（バクテリア、糸状菌、原生動物、藻類またはビールスなどの任意の適当な生物体）で接種され、微生物が種々の濃度またはそれぞれの抗菌薬剤の勾配にさらされるように、抗菌薬剤が加えられる。プレートは、次に、微生物の増殖（または微生物が存在しないこと）をモニタおよび測定する機器の中に入れられる。このデータを使用して、抗生物質に対する微生物の感受性が決定される。そのようなシステムは、固体の培地およびカービー−バウエルの標準結果レポートを用いて、抗菌性の感受性試験を自動化する。このため、本発明は、前述したブロスの微量希釈試験にのみ関連した感受性試験用の自動化のレベルを提供する一方で、マニュアルによるディスク拡散試験の利点も持ち続けている。
【００７１】
本発明の感受性用プレートの１つの実施形態が、図１７に示されている。そのようなプレートは、ディスポーザブルで安価に製造できるように提供され、またプラスチックで作られることが好ましい。底部１４２に嵌め合う頂部１４０が提供される。この頂部１４０は、透明であるかまたはそうでない場合は底部１４２のチャネル内の微生物の増殖を（マニュアルでまたは機械を用いて）目視することができる特性を有することが好ましい。底部１４２は、複数のチャネル１４４または互いに分離されたチャンバを備えている。そのようなチャネルは、底部１４２に嵌合する挿入物１４６の中に形成するか、または底部１４２および挿入物１４６を単体として一体的に形成することができる（また、底部および挿入物のいずれかまたは両方を不透明とすることができる）。図１８および図１９の各チャネルに沿って示したようなマーク（または番号などの他のマーキング）を、チャネル内の抑制部の長さのマニュアルによる測定を支援するために、所望する場合、設けることが好ましい。このことは、標準的なマニュアルによるディスク拡散システムと比較する場合、確かな利点である。ディスク拡散システムでは、キャリパを使用して抑制領域の直径を測定しており、より労働集約的であり精度が落ちる。各チャネル１４４は、固体（または半固体）の増殖培地を備えている。そのような増殖培地は、種々のチャネル内の増殖パターンの判読率を向上させるインジケータ用添加剤を随意的に含むことができる。また、インジケータを個々の層（「センサ層」）内に設けることができ、コンディショニング層を設けることができ、またセンサプレートに関連して前述したような様々な成分をゲル層の中に設けることができる。
【００７２】
物理的に、感受性用プレートの外部形状は、標準のマイクロウェル用プレートの形状（128 mm x 86 mm）と同様に作ることができる。しかしながら、他の形状および寸法を想定することもできる。プレートは、正方形または標準的な寒天プレートのような円形さえも含む、ほとんどどのような幾何学的な形状に作ることができる。どのような外部形状であっても、プレートは、固体（または半固体）の培地を中に保持する個々のチャンバまたはチャネルに、内部的に仕切られている。プレート内のウェルまたはチャンバは、三角形、パイ形、円形または正方形のウェル、または他の幾何学的な形状のウェルも想定されるが、細長いチャネルであることが好ましい。実施例として、図１８ａは１つの実施形態を示している。この実施形態では、互いに分離されたチャネル（溝）１５０がプレートの幅をほぼ完全に横切って伸びている。抗生物質用ディスク１５２は、各チャネル内のチャネルの端部または中央部に配置される。図１８ｂに示したように、短いチャネル１５４もプレート内に形成することができる。図１９ａはさらに別の実施例を示しており、ここでは抗生物質勾配ストリップ１６１が細長いチャネル１６３の中に配置されている。この実施形態では、ＭＩＣ（最小抑制濃度）を決定することができる（ＭＩＣは抑制領域の端部の濃度であり、増殖と非増殖との境界である）。個々のチャネルは、図１９ｂに示すように、さらに細く作ることもできる。しかしながら、標準的なカービー−バウエルの抗生物質試験用に商業的に提供されるような、標準的な抗生物質用ディスク（このディスクの直径は約6 mm）を使用することを望む場合、各狭いチャネルの端部にあるような、より大きな抗生物質用ディスク受入れ領域を設ける必要がある。一般に、チャネル長は8 mm以上（好ましくは、長さは20 mmから45 mmまで）であり、チャネル幅は6 mm以上（好ましくは、幅は8 mmから16 mmまで）である。標準の抗生物質用ディスク（直径が約6 mm）を使用する場合は、約8 mmのチャネル幅が最も好ましい。無論、別の寸法の抗生物質用ディスクを使用する場合は、チャネルの寸法をより大きくまたはより小さくすることができる。約30から35 mmまでの長さは、感受性試験で使用されるほぼ全ての抗生物質／微生物の組合わせから生ずる抑制領域を検出および測定する十分な長さを可能にするので最も好ましい。チャネル内の固体または半固体の増殖培地の深さは、1 mm以上にする必要があり、好ましくは約2 mmから約20 mmまで、最も好ましくは約5 mmから約15 mmまでである。
【００７３】
分離されたチャンバの目的の１つは、１つの感受性用プレート上で実行することができる試験の数を最大にすることだけでなく、感受性試験の容易性および再現性を増加することである。標準的なディスク拡散（カービー−バウエル）試験は、150 mmのミュラー−ヒントン（Mueller-Hinton）のプレート（14.73 cm²当たり１試験）に対して物理的に12試験以下の濃度に制限されるが、本発明は128 mm x 85 mmのプレート（少なくとも4.53 cm²当たり１試験）で24試験以上、標準的なディスク拡散用プレートの3倍以上の濃度を容易に可能にする。最初は、本発明のチャネル内の抑制領域の長さは、標準のディスク拡散用プレート上の抑制領域の半径と（同じ微生物および抗生物質を使用する場合）関連がないと考えられていた。その代わりに、抑制領域の測定された長さは、標準的なプレート内で測定された半径と本発明ではほぼ同じであることが分かった。「ほぼ同じである」ことにより、同じ期間後の本発明および標準のカービー−バウエルの試験における測定された長さは、正確に同じであったか、または試験の最終的な結果（National Committee for Clinical Laboratory StandardsすなわちＮＣＣＬＳによって定義された、敏感、中間的または耐性）が80％以上の時間で相関していることに極めて近かったかのいずれかであり、またＮＣＣＬＳにより概説されたコントロール範囲内であったことを意味する。大抵の場合、結果は90％以上の時間で相関した。また、わずかなパーセンテージ（1.1％以下）の場合でのみ、（同じ微生物および抗生物質を使用する）標準のカービー−バウエルの試験が耐性を示したとき、本発明の結果が敏感を示し、その逆の場合（0.9％以下）もあった。
【００７４】
本発明の感受性用プレートは、以下のように使用される。
（１）試験される各抗生物質の単一濃度を含むディスクまたはいくつかの濃度を含むストリップが、感受性用プレートの各チャンバ内の増殖培地の接種された表面上に（マニュアルでまたは自動的に）配置される。いったんディスクまたはストリップがプレート上に置かれると、抗生物質は増殖培地の中に拡散を開始し、増殖培地の中で抗菌物質の勾配を形成する。抗生物質用パネルは可撓性で、ユーザ構成可能形および／または事前構成可能形とすることができる。
（２）感受性用プレートは培養される機器の中に（マニュアルでまたは自動的に）配置され、増殖培地の中に拡散された抗生物質によって増殖抑制された場所を除いて、チャンバ内の微生物の増殖が促進される。
（３）感受性用プレートはマニュアルでまたは自動的に検査されて、チャンバ内の抑制領域の存在および長さが決定される。各チャネルに沿った定規のマーキングまたはナンバリングのために、マニュアルによる領域測定が容易にされる。自動的な領域測定が、画像の取込みおよび画像処理を介して機器によって実行される。
【００７５】
前述したように、感受性用プレートのチャネル内の抑制領域の長さは、マニュアルでまたは自動的に測定することができる。自動的に測定する場合、３つの主要な機能、すなわち、感受性用プレートの培養、画像の収集／取込み、および画像の処理を実行する働きをする機器を設ける。機器は、プレートを培養するコントロールされた環境を提供する。感受性用プレートは接種されて、インキュベータの中に配置される。このインキュベータで、プレートは続いて培養期間の間に画像収集装置によって定期的な間隔でスキャンされる。この機器は、１つ以上のカラーおよび／またはグレースケールの撮像装置を用いて、画像収集を提供する。撮像装置には、単独でまたはさらに処理した後で使用することができる、十分に鮮明な感受性用プレートの画像を提供するＣＣＤリニアアレイ型スキャナ、ＣＣＤラインスキャン型カメラ、ＣＣＤ二次元アレイ型カメラ（静止又動画のビデオ）、レーザスキャニング型カメラまたは他の装置がある。「画像（イメージ）」という用語は、１×１ピクセル以上の感受性用プレートからの光学情報のような任意の情報を意味する。画像収集は、定期的な前もってプログラムされた間隔で実行され、取り込まれた画像は感受性用プレートの１つ以上の観察および角度から得られる。
【００７６】
感受性を決定するために実行される画像処理アルゴリズムは、１つ以上の以下のステップから成る。
（ｈ）不要な画像データから関心領域を分離する画像マスキングステップ、
（ｉ）試験用の抗生物質の同一性および濃度を決定する抗生物質用ディスクまたはストリップ検出のステップ、
（ｊ）異なる時間間隔で取り込んだ２つの画像間の変化の領域を分離する画像減算（サブトラクション）のステップ、
（ｋ）減算（サブトラクション）された画像に現れる変化の大きさを増幅する画像等化のステップ
（ｌ）等化された画像（ローパスフィルタ）内の単一ピクセルノイズの影響を減少させる画像ぼやし化（ブラーリング）のステップ
（ｍ）フィルタ処理された画像内の局所的な差をさらに増幅する画像コントラストおよび輝度強調のステップ
（ｎ）特定の抗生物質に対する微生物の感受性を決定する、抑制領域を検出し、測定し、および検査のステップ。
【００７７】
本発明のシステムを用いる感受性試験の結果は、図２０〜図２２に示されている。図２０ａは、接種および抗生物質用ディスクの配置の１８時間後で取り込んだ（いくつかの異なる抗生物質用ディスクを用いる）感受性用プレート上の大腸菌のグレースケールの画像を示している。図２０ｂは、画像処理した後の同じプレートである。接種時に取り込んだ画像は、接種の１８時間後に取り込んだ画像から減算された。この差の画像は、等化されぼかされたヒストグラムであった。また、領域測定のアルゴリズムが、結果として生じた画像に適用された。抑制領域および対応する直径の寸法が、図２０ｂに示されている。同様に、図２１ａおよび図２１ｂは、図２０と同じタイミングおよび処理技術を用いる、黄色ブドウ球菌のグレースケールの画像および処理した画像を示している。
【００７８】
接種後の１時間から１７時間までの各時間に得られた画像の分析は、微生物と抗生物質との間の反応に関する別の情報が存在することを示している。微生物の増殖率、抗生物質の拡散率、および微生物に対する抗菌薬の効果の指標などの特性が明らかになる。実際には、多数の例では、プレートに接種した後、抑制領域は早ければ４時間から６時間で、画像処理を用いて定義される。実施例として、図２２ａおよび図２２ｂは、それぞれ、接種後わずか４時間の肺炎桿菌のグレースケールの画像および処理した画像を示している（図２２ｃおよび図２２ｄは、それぞれ、１８時間後の同一プレートのグレースケール画像および処理した画像である）。
【００７９】
本発明は、上部プレートおよび底部プレートを備えているとも想定される。ここで底部プレートは微生物用の固体または半固体の養分培地で満たされた単一のチャンバであり、上部プレートは複数のリブまたはデバイダ（分離器）を備えている。上部および底部のプレートが（抗生物質用ディスクが上部プレートの「チャンバ」の中に配置された後で）はめ合わされると、図４で示した本発明の実施形態のように、養分培地は分離されたチャンバの中に切り離される。無論、リブまたはデバイダは上部プレートからの分離素子として設けることができる。
【００８０】
本発明の別の態様は、敏感、中間的または耐性を決定することではなく、ＭＩＣの決定である。本発明では、ディスクからの抗生物質の拡散が予測可能性が高い対数勾配を形成するため、領域測定（チャネルに沿った抑制領域の長さ）の回帰分析を用いて、ＭＩＣを決定することができる。ディスク拡散の長さからＭＩＣを決定することは、Giles Scientific社（ニューヨーク）のBIOMIC（登録商標）システムのような、何らかの周知の方法を用いて実現することができる。
【００８１】
本発明によれば、抗菌薬剤を複数の仕切りの中に異なった濃度で加えることができる。固体または半固体の増殖培地は、抗菌薬剤が増殖培地に加えられたときに時間をかけて拡散して、濃度勾配を形成するように、十分に固体である必要がある（濃度勾配は横方向に形成することができ、１０から１８時間以上にわたって拡散を継続することができる）。感受性用プレートの各チャンバ内の固体または半固体の増殖培地は、試験される微生物のマックファーランド0.5標準懸濁液で接種される（綿棒で塗られる）。微生物がバクテリアの場合、それは好気性のグラム陽性の生物、好気性のグラム陰性の生物、嫌気性のグラム陽性の生物、嫌気性のグラム陰性の生物、またはセル壁欠如生物である可能性がある。
固体または半固体の増殖培地は、１つ以上のルーチン培地、選択培地、鑑別培地、選択−鑑別培地、強化培地、感受性培地、嫌気性培地およびカビ培地を含むことができる。培地がルーチン培地である場合、それは１つ以上のトリプティカーゼ大豆血液寒天培地（trypticase soy blood agar）、トリプティカーゼ大豆寒天培地（trypticase soy agar）、トリプシン大豆（tryptic soy）、ＢＨＩ血液寒天培地、ＢＨＩ寒天培地、カスマン血液（Casman blood）、ＨＢＴ２層培地（HBT bi-layer media）、および標準方法の寒天培地を含むことができる。培地が選択培地である場合、それは１つ以上のコロンビアＣＮＡ血液（Columbia CNA blood）、アジド血液寒天培地（azide blood agar）、チョコレート選択物（chocolate selective）、ブルセラ菌血液（Brucella blood）、血液ＳｘＴ（blood SxT）、ストレップ選択物Ｉ＆ＩＩ（Strep selective I & II）、胆汁エスクリン寒天培地（Bile Esculin agar）、クロストリジウムディフィシレ寒天培地（Clostridium difficile agar）、スキロー（skirrow）、ＣＣＦＡ、ＣＬＥＤ、シュードモナスセパシア寒天培地（Pseudomonas cepada agar）、ＳｘＴ血液寒天培地（SxT blood agar）、ＴＣＢＳ寒天培地、ＣＩＮ、モラクセラカタラーリス培地（Moraxella catarrhalis media）、および木炭選択物（charcoal selective）を含むことができる。培地が鑑別培地である場合、それは１つ以上のブリリアントグリーン、ＣＹＥ−レジオネラ、セントリミド（centrimide）、ＤＮＡ−セ（DNA-se）、ヘクトエン腸溶性寒天培地（hektoen enteric agar）、ジョーダンス酒石酸エステル（Jordans tartrate）、マンニトール塩（mannitol salt）、ＬＩＡ、ＴＳＩ、ＦＬＯ−シュードモナスＦ（FLO - Pseudomonas F）、ＴＥＣＨ−シュードモナスＰ（TECH - Pseudomonas P）、セラーズ（Sellers）、スターチ寒天培地（starch agar）、サーモヌクレアーゼ（thermonuclease）、ティンスダル寒天培地（Tinsdale agar）、マッカーシー（McCarthy）、ＬＳＭ、ソルビトール−マッカーシー（sorbitol-McConkey）、およびＭＵＧ−マッカーシー（MUG-McConkey）を含むことができる。
【００８２】
培地が選択および鑑別培地である場合、それは１つ以上のマッコンキー、ＥＭＢ、ベアードパーカー（Baird Parker）、抗生物質付きのＢＨＩ血液、ＢｉＧＧＹ−菌類（BiGGY - mycologic）、ＣＩＮ、クロストリジウムディフィシル寒天培地（Clostridium difficile agar）、マックブライド（McBride）、シュードモナス分離寒天培地（Pseudomonas isolation agar）、Ｓ−Ｓ寒天培地（S-S agar）、ターギトル７（tergitol 7）、およびＸＬＤ寒天培地を含むことができる。培地が強化培地である場合、それは１つ以上のチョコレート、ＧＣチョコレート、ＢＨＩチョコレート、ボーゲットジャングー（Borget Gengou）、ハートインフュージョン寒天培地（heart infusion agar）、マッカーシー（McCarthy）、リーガン−ロー（Regan-Lowe）、セイヤー−マーチン（Thayer-Martin）、トランスグロー培地（transgrow medium）、システイン亜テルル酸塩血液（cysteine tellurite blood）、システイン亜テルル酸塩ハート（cysteine tellurite heart）、ＢＨＴ、ハートインフュージョン（heart infusion）、レフラーズ（Loefflers）、及び血清亜テルル酸塩（serum tellurite）を含むことができる。培地が嫌気性培地である場合、それは１つ以上のコロンビアベース（Columbia base）、ＰＥＡ、ＣＡＮ、ＬＫＶ、ＢＢＥ、ブルセラ菌、ＢＨＩ血液ベース（BHI blood base）、ＫＢＥ、マックラング−トアベ（McClung-Toabe）、雄牛の胆汁（oxgall）、シャエドラーズ（Schaedlers）、およびウィルキンス−シャルグレン（Wilkens-Chalgren）を含むことができる。また、培地がカビ培地である場合、それは１つ以上のＢＨＩベース（BHI base）、ビギー（BiGGY）、バードシード（birdseed）、コーンミール（corn meal）、綿実（cotton seed）、ＤＴＭ、サブローデキストロース（sabourauds dextrose）、フジ培地（Fuji medium）、抑制モールド（inhibition mold）、リットマン雄牛の胆汁（Littman oxgall）、菌類（mycologic）、ミコフィル（mycophil）、ニッカーソンズ（Nickersons）、ＳＡＢＨＩ、およびトリコフィチンを含むことができる。
【００８３】
抗菌薬剤は、１つ以上のベータラクタム抗生物質（betalactam antibiotic）、セフィーム抗生物質（cepheme antibiotic）、グリコペプチド抗生物質、アミノグリコシド抗生物質、マクロライド抗生物質、テトラサイクリン抗生物質、およびキナロン抗生物質（quinalone antibiotic）とすることができる。抗菌薬剤がベータラクタム抗生物質である場合、それは１つ以上のペニシリン、ウリードペニシリン（uredopenidllin）、合成薬品（synthetic）、カルバペネム（carbapenem）およびベータラクタム／抑制剤（beta-lactam/inhibitor）を含むことができる。抗菌薬剤がセフィーム抗生物質である場合、それは１つ以上のセファロスポリン世代Ｉ〜ＩＶ（cephalosporins generations I to IV）、およびカルバセフィーム（carbacephem）を含むことができる。また、１つ以上の抗菌薬剤は、１つ以上のサルファ剤および誘導体、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、ニトロフラントイン、ポリミキシンおよび化学薬品を含むことができる。
【００８４】
[同定用プレート]
本発明の一環としての同定用プレートは、サンプル内で検出された微生物を同定するために使用される。同定用プレートは、微生物の標準化された懸濁液で接種される。次に、プレートは機器の中に配置される。微生物は種々の基体または基体／インジケータの組合わせと反応して、基体またはインジケータ内に検出可能な変化を発生させる。機器は基体および／またはインジケータの変化（またはそれが存在しないこと）をモニタおよび測定する。このデータを使用して、微生物を同定する。
【００８５】
物理的に、同定用プレートの全体的な寸法および構成は、従来の９６ウェル式マイクロウェル用プレート、すなわち、少なくとも透明な底部を有する浅いコンテナと同様であると想定される。プレートは平らであるか、または一連の凹部を有している。特定のガムまたはゲル内の特定の基体または基体／インジケータの組合わせは、プレート底部の平坦な面上または一連の凹部の中に配置される。これらのガムは、微生物の懸濁液からの液体を吸収することができる。あるいはまた、基体または基体／インジケータの組合わせは、フィルタペーパのディスクのような吸収性材料の中に植え付けて、プレートのゲルまたはガム内の凹部に取り付けることができる。１つの実施形態では、ペーパのディスクにキサンタンガムが加えられる。固定された基体または基体／インジケータの組合わせは、全体的なプレート面より完全に下に置かれるか、全ての全体的なプレート面と同じ高さにされるか、または全体的なプレート面より高くされる。
【００８６】
同定用プレートは、以下のように使用される。
（１）微生物の標準化された懸濁液が、増殖用プレートから調合される。
（２）この懸濁液が、同定用プレートに加えられる。
（３）懸濁液は、それぞれが特定の基体または基体／インジケータの組合わせを含む複数のサイトの中に配置される。
（４）同定用プレートを培養して、各サイトの中の微生物の代謝活動を促進する。
（５）サイトの中のカラーまたは蛍光発光の変化が、特定の基体上の代謝活動を示す。
（６）同定用プレートをマニュアルでまたは自動的に検査して、代謝された基体のパターンを決定する。
【００８７】
微生物の懸濁液が、同定用プレートの一方の端部に加えられる。プレートの形状は、基体または基体／インジケータの組合わせを含む全ての局所的なサイトが十分な量の懸濁液を吸収するように、懸濁液が流れるまたは送られるようにする。局所的なサイトでは、基体または基体／インジケータの組合わせが微生物の懸濁液を吸収することができる。余分な液体をプレートから捨てることによって、あるいはまた、懸濁液が加えられたプレートの反対側の端部で吸い上げ剤が余分な液体を吸収することによって、余分な液体は除かれる。いずれの場合でも、サンプルの導入は、ワンステップ操作である。蓋を加えて、培養中の蒸発を防止する。
【００８８】
別の実施形態では、３点セットのプレートが使用される。この第２の部分は同定用プレートの上に適合し、チャネルまたは一連のチャネルから構成される。それぞれのチャネルは、懸濁液が基体または基体／インジケータの組合わせを含む局所的なサイトに流れることを可能にする「漏斗（funnel）」を含んでいる。この場合もやはり、余分な液体を捨てる、または懸濁液が加えられたプレートの反対側の端部で吸い上げ剤によって吸収することができる。このチャネル／漏斗の部分は、所定の位置に残しておくかまたは培養の前に捨てることができる。
基体または基体／インジケータの組合わせを分離する目的は、競合する基体による干渉を受けない局所的な反応を提供することである。基体は十分な濃度を有し、また微生物の懸濁液を加える間は局所的なサイトに残る必要がある。基体または基体／インジケータの組合わせのタイプはいくつかある。特定の基体は、ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシドおよび他のニトロフェニル誘導体を含むことができる。あるいはまた、基体は、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル（indoyl）−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−ガル）または他の「Ｘ」誘導体、蛍光性の４−メチルランベリフェリル（methyllumbelliferyl）誘導体または７−アミノ−メチルクマリン誘導体を含むことができる。
【００８９】
基体／インジケータの組合わせは、砂糖（グルコース、ラクトースなど）、アミノ酸（リシン、アルギニンなど）、脂肪酸（オレイン酸、パルミチン酸など）、低分子有機酸（クエン酸、グルクロン酸など）、ポリアルコール（グリセロール、ソルビトールなど）およびその他などの基体を含むことができる。インジケータは、ブロムクレゾールパープル、フェノールフタレインなどのｐＨインジケータ、または酸化／還元（レドックス）インジケータを含むことができるが、これらに限定されることはない。陽性反応は、紫外、可視または赤外のスペクトルのいずれかの変化を発生する。
【００９０】
同定用プレートの分析については、画像は、定期的な間隔（一般に、１時間）でプレートの上側および／または下側から得られる。定期的な間隔でスキャニングすることにより、動的な増殖データが得られ、このデータを使用して微生物を特徴付けることができる。同定を決定するために実行される画像処理アルゴリズムは、１つ以上の以下のステップから成る。そのような処理が必要でない場合は、いくつかのステップを割愛することができる。
【００９１】
・不必要な画像データから関心領域を分離する画像マスキングのステップ（必要な場合）
・試験用の基体の位置を決定する減算領域を認識するステップ（必要な場合）
・異なる時間間隔で得られた２つの画像間の変化の領域を分離する画像減算のステップ（必要な場合）
・減算された画像内に起こる変化の大きさを増幅する画像等化のステップ（必要な場合）
・等化された画像内の単一ピクセルノイズの影響を減少させる（ローパスフィルタ）画像ぼかし化（ブラーリング）のステップ（必要な場合）
・フィルタ処理された画像内の局所的な差をさらに増幅する画像コントラストおよび輝度強調のステップ（必要な場合）
・どの基体が反応したかを決定する−画像パターン認識のステップ
微生物の同定は、次に、試験用微生物の懸濁液の反応を異なる微生物の周知の反応度と比較することによって実現される。
【００９２】
図２３ａは、２４時間のときの複数のウェルを持つ同定用プレートの（可視の）画像であり、一方図２３ｂは、２４時間のときのＵＶの画像である。図２４は、同定用プレート３１０の１つの実施形態の図面であり、ここには、間にチャネル３０５を有する複数のウェル３００が設けられている。透明な面を各ウェルの底部に設け、プレートの底部の残りの部分は不透明にすることができる。嫌気性反応用の選択されたウェルをシールする方法を可能にするプレート用の上部を設けることができる。コンテナは水蒸気の損失を防止する不透過性の頂部を含むことができ、また割れないようにまた微生物に対して無害になるように設計することができる。バーコードを同定用プレート（および他のタイプのプレート）上に設けて、プレートのタイプや患者などの情報を示すこともできる。
【００９３】
サンプルをプレート３１０に加えると、液体はチャネル３０５を介して各ウェル３００上を流れる。余分な液体をウェル３０７の中に集めることができ、ウェル３０７の中には、スポンジまたは他の液体吸収材料を置くことができる。各基体／インジケータのマトリックス層は、0.05から0.1 mlの液体サンプルを吸収することができ、また接種の間の基体の相互汚染を防止する。この基体／インジケータは微生物に対して無害であり、少なくとも１年の棚（shelf）の寿命があることが好ましい。
【００９４】
[尿スクリーニング用プレート]
発生率では呼吸感染に次いでいるが、尿路感染は臨床微生物学検査室では最も頻繁に要求される試験であると見なされている。臨床的な尿スクリーニングは、一般に、確立された量の尿、一般に1から10マイクロリットルを非選択培地、一般に血液寒天培地、およびマッコンキー寒天培地、エオシンメチレンブルー（ＥＭＢ）寒天培地などの選択および／または鑑別培地の両方のプレート上に線条接種するステップを含む。培養の後、サンプルの尿内の微生物の存在および患者が感染している可能性を示す何らかの微生物の増殖について、プレートが試験される。試料中に存在する微生物の数およびタイプの両方が臨床的に関連しているので、訓練を受けた技術者が読取りを行う必要があるため、このことは時間を要しまた費用がかかる。必要な場合、より詳細な同定および抗生物質の感受性プロフィールについてのるフォローアップ試験が行われる。
【００９５】
本発明の機器は、細菌尿用の微生物学的試験の負荷を著しく軽くする。この機器は、ほとんど全ての固体または半固体の培地上の微生物のコロニーを検出および計数することができる。ここでは培地は不透明、透明または半透明である。培地の選択には、血液寒天培地およびトリプシン大豆寒天培地などの非選択培地が含まれるか、またはこの培地は、マッコンキー寒天培地、ＥＭＢ寒天培地、シスチン−ラクトース−電解質欠如（ＣＬＥＤ）寒天培地（cystine-lactose-electrolyte deficient (CLED) agar）などの選択および／または鑑別培地、並びにＣＨＲＯ寒天培地オリエンテーション（CHROMagar Orientation）のような強化された鑑別に加えられた生化学的基体を有する培地を含むことができる。微生物のコロニーの検出および／または計数は、微生物の増殖の直接的な画像化、または微生物が培地、インジケータ、またはセンサ層の中で作る直接的または間接的な変化の画像化のいずれかによって行うことができる。培養および検出用の培地のタイプのどのような組合わせも、本発明で使用する別個の仕切りまたはプレートの中に配置することができる。非選択培地の１つの領域および選択および／または鑑別培地の１つの領域を含む２式チャンバ型プレートを使用することが好ましい。非選択培地および鑑別培地の組合わせによって、選択された特定の培地次第で、存在する微生物の全数およびある程度の同定の両方の測定を行うことができる。
【００９６】
尿スクリーニング用プレートが、図２５ａおよび図２５ｂに示されている。このタイプのプレートの分析については、画像は定期的な間隔（例えば、１時間ごと）で、プレートの上部および／または底部の両方から得られる。または、１つの画像を所定の時間（例えば、２４時間後）に得ることができる。尿スクリーニング用プレート上のコロニーを検出および計数するためには、１つの画像しか必要としないが、定期的な間隔でスキャニングすることにより動的な増殖データが得られ、このデータを使用して微生物を特徴付けることができる。例えば、図２５ａおよび図２５ｂでは、肺炎桿菌およびＥフェカリス（E. fecalis）は同じカラーを生ずるが、肺炎桿菌のコロニーがはるかに早い速度で成長するという事実によって容易に同定することができる。
【００９７】
尿スクリーニング用プレート上の微生物の増殖を検出および計数するために実行される画像処理アルゴリズムは、以下のステップから構成する。
（ａ）不必要な画像データから関心領域を分離する画像マスキングのステップ
（ｂ）引き続いた時間間隔で得られた２つの画像間の変化の領域を分離する画像減算のステップ（必要な場合）
（ｃ）減算された画像内に起こる変化の大きさを増幅する画像等化のステップ（必要な場合）
（ｄ）等化された画像内の単一ピクセルノイズの影響を減少させる（例えば、ローパスフィルタ）画像ブラーリングのステップ（必要な場合）
（ｅ）フィルタ処理された画像内の局所的な差をさらに増幅する画像コントラストおよび輝度強調のステップ（必要な場合）
（ｆ）微生物のコロニーの種類を区別する（インジケータに依存する）−カラー分離および分析するステップ（事前検出または後検出処理）
（ｇ）画像をコロニー検出／計数アルゴリズムに対して準備する画像しきい値化のステップ（必要な場合）
（ｈ）プレート上の微生物の存在を決定し、プレート上のコロニーを計数するコロニーを検出および計数するステップ
【００９８】
尿スクリーニング用プレートの研究により、コロニーは接種の後約１２から２０時間で検出および計数できることが示されている。図２５ａおよび図２５ｂは、１８時間で得られた未加工のスキャンされた画像である。プレートされた微生物はＥフェカリス（E. faecalis）（小さい、薄緑−カラーを観察する場合）、大腸菌（赤）、黄色ブドウ球菌（小さい、黄色）、Ｐイルギノサ（中間、黄色）、エンテロバクタークロアカ（大きい、濃い緑）、および肺炎桿菌（中間、中間の緑）であった。
【００９９】
本発明の前述した説明から分かるように、完全に一体化された微生物のシステム、本質的に臨床微生物学研究室が必要とするほぼ全ての機能（微生物の検出／スクリーニングおよび／または計数、微生物の同定、抗生物質の感受性試験、および尿のスクリーニング）を実行する１つのシステムが提供される。他の完全に一体化されたシステムが存在することは知られていない。それどころか、本発明のシステムは、実際は、本発明の複数の機能を実行するために複数の機器を購入する必要がある（また、それぞれについて研究室の空間を見つける必要がある）一体化されない機器／製品の「ファミリー」の一部である。本発明はいくつかの別個の機器よりも使用および保守することが容易であり、１台の機器を所有および操作することは高価になるものではなく、本発明が必要とする研究室の空間は、いくつかの別個の機器が必要とするよりも狭く、また、本発明は広い範囲の能力を受け入れるようにモジュール構造で柔軟性がある。本発明は複数の機能を同じ機器内で実行することができるだけでなく、これらの複数の機能を同時に実行することができる（異なる種類のプレートを互いに隣接して配置することができる）。これにより、研究室のユーザは高い自由度で必要な試験のスケジューリング行うことができる。
【０１００】
前述した説明により、当業者は本発明を十分に実行することができる。本願の実施例は、特許請求の範囲を多少なりとも限定すると解釈してはならない。実際、本願で示し説明した例に加えて本発明の種々の変形例は、当業者には前述した説明から明らかになり、また添付した特許請求の範囲の中に入るであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】 多機能機器の主要コンポーネントのブロック図である。
【図２】 異なるタイプのプレート、撮像装置および搬送システムを示す、本発明の１つの実施形態を説明する図である
【図３】 プレート、プレート棚、画像化／ライティング装置および搬送機構を示す、本発明の別の実施形態を説明する図である。
【図４】 図３に示した実施形態の断面を示す図である。
【図５】 本発明の機器の別の実施形態を説明する図である。
【図６】 図５に示した実施形態の断面を示す図である。
【図７】 本発明の機器のさらに別の実施形態を説明する図である。
【図８】 図７に示した実施形態の断面を示す図である。
【図９】 微生物の検出（センサ）用プレートを説明する図である。
【図１０】 センサプレートの断面図である。
【図１１】 センサプレートの別の実施形態の断面図である。
【図１２】 センサプレートのさらに別の実施形態の断面図である。
【図１３】 大腸菌に陽性の３つのセンサプレートの底部を示す図である。
【図１４】 ディスク拡散抗生物質の感受性試験を行うための寒天プレートを説明する図である。
【図１５】 特定の抗菌薬剤に対する微生物の感受性を決定する抗生物質勾配法を説明する図である。
【図１６】 ブロス微量希釈抗生物質の感受性試験用の装置を説明する図である。
【図１７】 内部仕切りおよび上部カバーを有する底部ゲルプレートを備えた底部を有する、本発明の１つの実施形態を説明する図である。
【図１８ａおよび図１８ｂ】 図１８ａは抗生物質用ディスクを有する細長いチャネルを示し、図１８ｂはいくつかのチャネルが中に抗生物質用ディスクを有するより短いチャネルを示す、本発明の２つの実施形態の平面図である。
【図１９ａ】 それぞれが中に抗生物質のストリップを有する細長いチャネルを備えた実施形態を示す図である。
【図１９ｂ】 一方の端部に抗生物質用ディスクを備えた、細くより短いチャネルを有する実施形態を示す図である。
【図２０ａおよび図２０ｂ】 大腸菌を有する感受性プレートの図面であり、図２０ａは未加工の画像を示し、図２０ｂは処理した画像を示している。
【図２１ａおよび図２１ｂ】 黄色ブドウ球菌を有する感受性プレートの図面であり、図２１ａは未加工の画像を示し、図２１ｂは処理した画像を示している。
【図２２ａ〜図２２ｄ】 肺炎かん菌用の感受性プレートの付加的な図面であり、図２２ａは４時間後の未処理の画像であり、図２２ｂは４時間後の処理した画像であり、図２２ｃは１８時間後の未処理の画像であり、また図２２ｄは１８時間後の処理した画像である。
【図２３ａおよび図２３ｂ】 同定用プレートの図であり、図２３ａは２４時間後の可視光の波長で観察したプレートであり、図２３ｂは紫外線の範囲で観察したプレートである。
【図２４】 本発明の同定用プレートの別の図である。
【図２５ａおよび図２５ｂ】 １８時間後の尿スクリーニング用プレートの図（未処理の画像）である。

Claims (2)

1. （ａ）微生物の検出および／または計数の試験を実行するステップと、ここで、１つ以上の試験サンプルがそれぞれの検出用プレートに加えられ、それぞれの該プレートは前記機器のホルダ上または該ホルダ中に配置されて該機器内で培養され、培養の間および／または培養の後で、それぞれの前記プレートは前記機器内の撮像装置によって定期的な間隔で画像化されて、微生物のコロニーが存在するかどうかおよび／または何個の微生物のコロニーが存在するかが決定され、
   （ｂ）微生物の感受性及び／又は同定の試験を実行するステップと、ここで、感受性試験が実行される場合、微生物を含む１つ以上のサンプルがそれぞれの感受性用プレートに、１つ以上の抗生物質が前記プレートに加えられる前に加えられ、それぞれの前記プレートは前記機器のホルダ上又は該ホルダ中に配置されて前記機器内で培養され、それぞれの前記プレートはステップ（ａ）の前記撮像装置と同様の撮像装置又は異なる撮像装置によって画像化されて、微生物増殖抑制の有無及び／又は微生物増殖抑制の程度を決定し、同定試験が実行される場合は、微生物を含む１つ以上のサンプルが、微生物用の基体を含んだそれぞれの同定用プレートに加えられ、それぞれの前記プレートは前記機器のホルダ上または該ホルダ中に配置されて前記機器内で培養され、それぞれの前記プレートはステップ（ａ）および／またはステップ（ｂ）の前記撮像装置と同様のまたは異なる撮像装置によって定期的な間隔で画像化されて、それぞれの前記プレート上の微生物を分類および／または同定し、
   を含む、任意の順序でまたは同時に、また同じ機器内で複数の微生物学的試験を実行する方法。
2. （ａ）検出用プレートを保持し、感受性プレートおよび／または同定用プレートを相互交換可能に保持する１つ以上のプレートホルダと、
   （ｂ）前記１つ以上のプレートホルダに保持された、微生物の検出および／または計数の試験を実行する前記複数の検出用プレートであって、前記固定層内の微生物の存在による検出可能な変化を受けることができる不透明なセンサ層をさらに含む、検出用プレートと、
   （ｃ）前記１つ以上のプレートホルダ上に保持された、微生物の感受性試験および／または同定試験を実行するための複数のプレートであって、抗生物質の感受性については、プレートの少なくとも一部が固体または半固体の養分培地を中に有する複数のチャネルまたはウェルを含む、複数のプレートと、
   （ｄ）定期的な間隔で前記プレートを画像化するために設けられた１つ以上の撮像装置であって、前記１つ以上の撮像装置が、1 x 1ピクセル以上の情報を前記各プレートから収集する、1つ以上の撮像装置と、
   （ｅ）前記１つ以上のプレートホルダおよび／または前記１つ以上の撮像装置を互いに対して移動させる１つ以上の搬送機構と、
   （ｆ）前記検出用プレート上の微生物の存在を検出するように、かつ前記抗生物質の感受性および／または微生物の同定用のプレート上の抗生物質の感受性および／または微生物の同定を決定するように、機器の機能をコントロールし、前記撮像装置によって得られた画像を処理するコンピュータプロセッサと
   を含むことを特徴とする任意の順序でまたは同時に複数の微生物試験を実行する機器。

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