JP2979383B2 - 菌類の即時判別方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】 本発明は細菌類や黴菌類の付
着或いは混入する検体から、即時にその付着混入する菌
類を初め付着量並びに生菌、死菌の判別が可能で、特に
食品類の生産者や流通業者には極めて好適な菌類の即時
判別方法に関する。

【０００２】

【従来技術】食品類とりわけ水分率の高い生鮮食品や加
工食品等は細菌類や黴菌類の繁殖しやすい条件を具有す
ることから、これら食品等の生産原初から混在し若しく
は流通及び消費に至る段階で該菌類等が付着し或いは落
下混入し、且これが短時間に繁殖し極めて不衛生となる
ばかりか度々食中毒が招来されたり、或いは商品の変質
や不腐が招来される結果となっている。

【０００３】これがため生鮮食品では合成樹脂素材製の
容器や紙器で包装し更には保冷等を施し流通や消費に供
しているが、これら容器や紙器には特段抗菌処理がなさ
れてないため、原初から混在する菌類は時間経過ととも
に繁殖するばかりか該容器や紙器の外面には、流通や消
費に亘る間に付着し或いは落下した菌類が繁殖し極めて
不衛生な状態におかれている。他方加工食品についても
従来許容される合成保存料を添加し菌類の繁殖防止を図
っていたが、近年の健康指向の高まりとともに合成保存
料が危険視されるに至り、加えて消費者保護の見地より
製造物責任所謂ＰＬ法の施行とも相俟って、食品生産者
はもとより流通業者においても衛生管理が強く求められ
る実情にある。

【０００４】かかる実情に際しては関係業者が総力を挙
げて菌類の判別方法についての研究に取組んでいるもの
の、現状においては発色酵素を適宜の培地に混合させた
発色培地に採取した菌類を植菌し、而してこれを所要温
度に保持されたインキュベーター等の培養器で略２４時
間乃至４８時間培養することによりコロニーを形成さ
せ、且大腸菌等が保持するβ−ガラクトシターゼ酵素で
発色酵素を分解し発色させて判別するものであって、流
通に供される食品類の菌類の判別手段としては判別のた
めの培養に長時間を要するため全く実用性に劣り、而も
判別しえる菌類も大腸菌や一般生菌の一部に限定される
ばかりか、生菌死菌の判別もできない等の問題を抱えて
いる。

【０００５】更に蛍光染料を生理的食塩水に適宜濃度に
混合させた染色溶液に採取した菌類を混入したるうえ、
これを２４時間乃至４８時間培養しコロニーの形成を図
ったうえ光学顕微鏡で判別する方法も提案されている
が、依然培養のために長時間を要し而も蛍光染料は菌類
の細胞内に入りにくく且一旦細胞内に浸透した染料も容
易に流失するため細胞が十分に染色されず、従って発光
エネルギーも微弱であるから精密高倍率のレンズを使用
せねばならぬ等判別装置も大型で且高価となる等、流通
に供される食品類の菌類判別のためには問題が多い。

【０００６】発明者はかかる問題に鑑み鋭意研究を重ね
たる結果、フルオレセイン若しくはその誘導体からなる
蛍光染料は生菌並びに死菌の細胞内に浸透し易いこと、
及びプロピデュームイオダイドからなる蛍光染料は死菌
の細胞内のみに浸透しえること、更には生菌細胞内に浸
透したフルオレセイン或いはその誘導体からなる蛍光染
料が特定波長たる４８８ｎｍの励起光の吸収によりスト
ークス則に従って該吸収光より長波長の５２０ｎｍの強
い蛍光発光を呈すること、及び死菌細胞内に浸透したプ
ロピデュームイオダイドからなる蛍光染料も４８８ｎｍ
励起光の吸収に伴いストークス則に従い該吸収光より長
波長の６２５ｎｍの強い蛍光発光がなされる反面、フル
オレセイン若しくはその誘導体からなる蛍光染料は死菌
細胞に取込まれて蛍光発光が阻害されることを究明し
た。

【０００７】更に発明者は、特定波長たる４８８ｎｍの
励起光を吸収し蛍光発光する発光エネルギーは極めて強
いために、前記蛍光染料で染色した染色菌液を培養する
ことなく且光散乱させることによって低い倍率を以って
蛍光波長毎の発光数（生菌及び死菌）、発光の形状（菌
の種類）、発光数（菌数）を即時に判別しえることを解
明し本発明に至ったものである。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】 即ち本発明は細菌
類や黴菌類等菌類が混在付着する検体から適宜手段で被
着採取した菌類を、極めて簡便な方法と安価な装置をも
って即時に生菌や死菌、菌の種類或いは菌数を判別する
ことの可能な、菌類の即時判別方法を提供することにあ
る。

【０００９】

【課題を解決するための手段】上述の課題を解決するた
めに本発明が採用した技術的手段は、菌類の生菌並びに
死菌細胞内に浸透しえ且生菌細胞内では染料が分散され
て励起光の吸収に伴い蛍光発光し、而も死菌細胞内にお
いては細胞組織に取込まれて励起光の吸収に際しても蛍
光発光しえないフルオレセイン若しくはその誘導体から
なる蛍光染料と、生菌細胞内には浸透できず死菌細胞内
のみに浸透し且励起光の吸収により蛍光発光しえるプロ
ピデュームイオダイドからなる蛍光染料とを、生理的食
塩水に対し３乃至１５μｍｏｌ／ｍｌ混合し、且細胞内
への浸透性を高めて細胞が蛍光染料で効果的に染色され
るよう塩類、キチナス或いはセルラーゼからなる染色促
進剤を１乃至１０μｍｏｌ／ｍｌ配合してなる染色溶液
中に検体から採取した菌類を混入し而も所要温度に加温
させながら染色する。

【００１０】更に細胞内に浸透された蛍光染料が再び細
胞外に流失せぬよう、該蛍光染料の染色に引続いてジエ
チルスチルベストロール或いはＮ，Ｎ’−ジシクロヘキ
シルカーボジイミドからなる流失防止剤を、該染色溶液
に５乃至２０μｍｏｌ／ｍｌ混合して蛍光染料の流失防
止を図る。

【００１１】かくして蛍光染料で染色し且流失防止がな
された染色菌液を、その菌類の細胞内に浸透染色された
蛍光染料の蛍光発光を光散乱させて発光拡大化しえる光
散乱加工が施された透光板上に滴下させ、その下側より
中心波長が４８８ｎｍの励起光を照射して菌類細胞内に
浸透染色されたフルオレセイン若しくはその誘導体から
なる蛍光染料からはその中心波長５２０ｎｍの緑色にや
や黄味色の強い蛍光発光をなさしめ、且プロピデューム
イオダイドからなる蛍光染料からはその中心波長が６２
５ｎｍの赤味を帯びた橙色の強い蛍光発光をなさしめ
る。

【００１２】而して発光拡大化されたこれら蛍光発光を
その上側より更に拡大レンズを以て視認することによ
り、検体から採取した菌類について蛍光発光の色光の相
違により生菌及び死菌を、蛍光発光の形状及び大小によ
り菌類の種類を、更に蛍光発光数により菌数を即時に判
別する、菌類の即時判別方法の構成に存する。

【００１３】

【作 用】上述の如き構成からなる本発明は以下のよう
な作用を有する。即ち菌類の細胞を染色する蛍光染料と
してフルオレセイン若しくはその誘導体からなる蛍光染
料と、プロピデュームイオダイドからなる蛍光染料を用
いてなるため、フルオレセイン若しくはその誘導体から
なる蛍光染料は生菌細胞内及び死菌細胞内に浸透するも
のの、生菌細胞内では該蛍光染料が分散されるが死菌細
胞内では細胞に取込まれ、更にプロピデュームイオダイ
ドからなる蛍光染料は生菌のエステラーゼにより細胞内
に浸透できず、死菌細胞内に浸透され且分散される。

【００１４】そして該蛍光染料に加えて塩類、キチネス
或いはセルラーゼからなる染色促進剤が混合されるた
め、菌類の細胞膜が柔軟化されるとともに蛍光染料はそ
れぞれ生理的食塩水に対し３乃至１５μｍｏｌ／ｍｌ及
び該染色促進剤も１乃至１０μｍｏｌ／ｍｌと極めて微
量に混合され、且この混合された生理的食塩水が略２５
乃至３５℃に加温された状態で採取した菌類が混入され
て染色されるため、極めて僅かな時間内に蛍光染料が菌
類細胞内に浸透して染色され而も生菌に対しても何等の
支障も与えることがない。

【００１５】更にかかる菌類細胞内への蛍光染料の浸透
染色に引続いて、ジエチルスチルベストロール若しくは
Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカーボジイミトが１乃至１
０ｍｏｌ／ｍｌ混合されるため、細胞膜が再び強靭化さ
れ細胞内に浸透した蛍光染料の流失が防止される。

【００１６】かくして生理的食塩水に蛍光染料や染色促
進剤並びに流失防止剤更には染色された菌類の混合され
てなる染色菌液を、光散乱加工されてねる透光板上に滴
下しその下側より４８８ｎｍの中心波長を有する励起光
を照射することにより、菌類細胞内に浸透染色されてな
るフルオレセイン若しくはその誘導体からなる蛍光染料
が分散された生菌からは、ストークス則に従い中心波長
が５２０ｎｍの強い蛍光発光が生れ、且プロピデューム
イオダイドからなる蛍光染料が分散された死菌からは、
その中心波長が６２５ｎｍの強い蛍光発光が生じる。

【００１７】而して、菌類細胞からの蛍光発光は微小な
ものの光散乱加工された透光板により該蛍光発光が数倍
乃至数十倍に拡大散乱されるため、この拡大散乱された
蛍光発光は上側より低倍率の拡大レンズでも容易に視認
できる。

【００１８】

【実施例】以下に本発明実施例を図に基づき詳細に説明
すれば、図１は本発明菌類の即時判別方法の説明図であ
って、菌類１は検体より適宜手段で採取される細菌類や
黴菌類からなるもので、検体からの菌類１を採取する具
体的手段としては滅菌綿棒に生理的食塩水２を含ませて
検体面から被着させること、或いは水溶性培地を検体面
と接触させて被着させることが挙げられる。

【００１９】かくして採取された菌類１は、生理的食塩
水２に生菌及び死菌の細胞内に浸透し且生菌細胞内にお
いては分散され、死菌細胞内においてはその細胞内に取
込まれ而も中心波長が４８８ｎｍの励起光の吸収により
その中心波長が５２０ｎｍの強い蛍光発光のなしうるフ
ルオレセイン若しくはその誘導体からなる蛍光染料３、
及び生菌細胞内には浸透できず且死菌細胞内には浸透し
分散しえ、而もその中心波長が４８８ｎｍの励起光の吸
収により中心波長が６２５ｎｍの強い蛍光発光をなしう
るプロピデュームイオダイドからなる蛍光染料４が混合
され、更にはこれら蛍光染料３及び４の細胞内への浸透
を高めて細胞全体を有効に染色せしめ、以って菌類細胞
からの蛍光発光を忠実ならしめるため塩類、キチネス或
いはセルラーゼからなる染色促進剤５が混合されてなる
染色溶液２０内に混入される。

【００２０】かかる場合において、フルオレセイン若し
くはその誘導体からなる蛍光染料３並びにプポロピデュ
ームイオダイドからなる蛍光染料４は、励起光の吸収に
伴い視認しえる蛍光発光をなさしめるうえから少なくと
も生理的食塩水２に対し３μｍｏｌ／ｍｌ以上の濃度が
要請されるが、過剰な濃度は生菌に対し悪影響を与える
危険があることから、最大でも１５μｍｏｌ／ｍｌに制
限することが望まれる。更に染色促進剤５は、蛍光染料
の菌類細胞内への浸透と高めるもので該蛍光染料の細胞
内への浸透阻害は細胞膜に起因するものである。そこで
細胞膜の柔軟化を図り細胞内への浸透を促進するもの
で、細胞膜の柔軟化には少なくともその濃度が生理的食
塩水２に対し１μｍｏｌ／ｍｌ以上が必要となるが、反
面１０μｍｏｌ／ｍｌ以上の濃度となると細胞膜が過剰
に柔軟化し浸透した蛍光染料が再び細胞外に流失する結
果となることに留意すべきである。そして該染色促進剤
５に用いられる塩類の具体的なものとしては、塩化ナト
リウムや塩化マグネシウム等が挙げられる。

【００２１】而して該染色溶液２０を所要温度に加温６
すること、好ましくは２５乃至３５℃程度に加温６する
ことにより、染色促進剤５の作用とも相俟って蛍光染料
が菌類の細胞内に浸透されて有効な染色がなされるもの
であって、かかる場合の染色に要する時間は加温条件に
よっても多少異るが、概ね５乃至１５分程度である。

【００２２】そして更に重要なことは、染色促進剤５に
より菌類の細胞膜が柔軟化されてなるから、かかる状態
のままでは細胞内に浸透し染色された蛍光染料が再び細
胞膜より流失し、鮮明な蛍光発光を現出させられぬ結果
となる。そこで蛍光染料の浸透染色に引続いて、染色さ
れた細胞の細胞膜を強靭化し蛍光染料の流失を防止する
ことが肝要となる。これがため細胞膜の強靭化作用を有
するジエチルスチルベストロール若しくはＮ，Ｎ’−ジ
シクロヘキシルカーボジイミドからなる流失防止剤７が
混合されるもので、該流失防止剤７は生理的食塩水２に
対して少なくとも５μｍｏｌ／ｍｌ以上の濃度が流失防
止効果のうえで望まれるが、２０μｍｏｌ／ｍｌを超え
る濃度では流失防止効果に特段の有利性は無く且却って
生菌の活動を阻害する危険もあることから、かかる濃度
以下に制限されるべきである。

【００２３】かくして染色溶液２０において菌類の細胞
内に十分浸透染色され且流失防止剤７の混合により染色
の安定化が図られた菌類の混在する染色菌液２１が得ら
れるもので、該染色菌液２１に励起光を照射して視認判
別８する方法を図２に示す菌類の即時判別装置に基づき
説明すれば、蛍光染料で染色された菌類の細胞は微細な
ものであるから該細胞内の蛍光染料に励起光を照射し、
且この励起光の吸収に伴うストークス則に従った鮮明で
視認性の高い中心波長が５２０ｎｍの蛍光発光と、その
中心波長が６２５ｎｍの蛍光発光を創出せしめる必要が
ある。

【００２４】そこで菌類の即時判別装置を見ると、その
内部が暗室状態に保持しえるケーシング３０の下部に中
心波長が４８８ｎｍの励起光を照射しえる励起光源３１
が設けられてなるとともに、該励起光の照射光軸線上の
上部には所要の倍率好ましくは１００乃至５００倍程度
の拡大レンズ３２が設けられてなり、而も該照射光軸線
の中間位置には光散乱加工が施され且透光性を有する透
光板３３が設けてなるもので、該光散乱は望ましくは５
乃至５０倍程度の光散乱率を持つものが用いられてなる
構成からなるもので具体的には摺りガラスが挙げられ
る。

【００２５】従って染色菌液２１を該透光板３３の上に
滴下し、その下側より中心波長４８８ｎｍの励起光を照
射することにより、該染色菌液２１に混在する菌類細胞
内に浸透染色されてなる蛍光染料は該励起光の吸収に伴
い、生菌からはフルオレセイン若しくはその誘導体から
なる蛍光染料による中心波長５２０ｎｍの蛍光発光色で
且形状及び大小を異にした菌種に係る蛍光発光や菌数に
係る蛍光発光数が、更に死菌からはプポロピデュームイ
オダイドからなる蛍光染料により、その中心波長が６２
５ｎｍの蛍光発光色で且形状及び大小を異にした菌種に
係る蛍光発光や菌数に係る蛍光発光数が、光散乱により
拡大され而も上部の拡大レンズ３２によって明確に視認
されて判別されることとなる。

【００２６】

【発明の効果】 本発明は上述した如く検体から適宜
手段で被着採取した菌類を、生理的食塩水にフルオレセ
イン若しくはその誘導体からなる蛍光染料、及びプロピ
デュームイオダイドからなる蛍光染料並びに塩類、キチ
ネス或いはセルラーゼからなる染色促進剤が混合され且
所用温度に加温された染色菌液中に混入し、菌類の細胞
を直接染色するため極めて短時間内に有効に染色がなさ
れるとともに、引続いてジエチルスチルベストロール若
しくはＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカーボジイミドから
なる流失防止剤が染色溶液中に混合されることにより、
染色された菌類の細胞が安定化される。そして染色され
且安定化された菌類細胞が多数混在する染色菌液を、光
散乱加工の施された透光板上に滴下しその下側より中心
波長が４８８ｎｍの励起光を照射させることで、該励起
光を吸収して生菌からは鮮明で且視認性の高い中心波長
が５２０ｎｍの蛍光発光色で而も形状や大小の異なる発
光及び発光数が、更に死菌からは鮮明で視認性の高い中
心波長が６２５ｎｍの蛍光発光色で、而も形状や大小の
異なる発光及び発光数が現出され、且これが透光板の光
散乱により数倍乃至数十倍に散乱拡大化されるため、上
部からの視認に際しては比較的低倍率の拡大レンズで鮮
明に視認できることとなり、従って判別装置も極めて安
価、軽量に形成できることから、食品類のいかなる流通
段階においても携帯し或いは設置しえ、且即時に菌類の
生菌死菌、菌の種類及び菌数を視認判別できる等極めて
特長の多い、菌類の即時判別方法といえる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明菌類の即時判別方法の説明図である。

【図２】本発明菌類の即時判別装置の説明図である。

【符号の説明】

１ 菌類 ２ 生理的食塩水 ２０ 染色溶液 ２１ 染色菌液 ３ フルオレセイン若しくはその誘導体からなら蛍光
染料 ４ プロピデュームイオダイドからなる蛍光染料 ５ 染色促進剤 ６ 加温 ７ 流失防止剤 ８ 視認判別 ３０ ケーシング ３１ 励起光源 ３２ 拡大レンズ ３３ 透光板

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 菌類を適宜手段で被着採取したうえ、
   フルオレセイン若しくはその誘導体からなる蛍光染料、
   及びプロピデュームイオダイドからなる蛍光染料が生理
   的食塩水にそれぞれ３乃至１５μｍｏｌ／ｍｌの濃度で
   及び塩類、キチネス若しくはセルラーゼからなる染色促
   進剤が１乃至１０ｐｍｏｌ／ｍｌの濃度で混合された染
   色溶液中に混入し、且所用温度に加温させて菌類の細胞
   を染色したうえ、更にジエチルスチルベストロール或い
   はＮ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカーボジイミドからなる
   流失防止剤を５乃至２０μｍｏｌ／ｍｌ混合し染色され
   た菌類の細胞からの染料流失防止を図ったうえ、光散乱
   加工が施された透光板上に該染色菌液を滴下させ且その
   下側より中心波長が４８８ｎｍの励起光を照射し、吸収
   発光する蛍光波長、発光形状及び発光数を上側より拡大
   視認し、以て生菌及び死菌、菌の種類並びに菌数を判別
   する菌類の即時判別方法。