CN1109758C - 检测细菌的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种缩短第一细菌分析反应时间的方法，其特征在于：a)将所述第一细菌暴露于所述第一细菌允许的噬菌体颗粒的感染；b)处理该感染的第一细菌以灭活外源噬菌体颗粒；c)在一种第二细菌存在下培养该处理的细菌，第二细菌对所述噬菌体或其复制体是允许的，并且它的倍增速率大于第一细菌的有效倍增速率；以及d)评价噬菌斑形成的程度和/或在培养的第二细菌细胞中的第二细菌生长的程度。本发明的方法可用于评价一个样品中第一细菌的存在，特别是当第一细菌是一种缓慢生长细菌，尤其是结核分支杆菌时，本发明的方法可使操作者在几天内，而不是常规细菌培养技术所需的几周内，检测样品中低数量细菌的存在。本发明也可用于评价药物或其它处理对细菌或病毒的作用。本发明也提供一个用于本发明方法的诊断试剂盒。

Description

检测细菌的方法
本发明涉及一种方法，特别是在一个样品中诊断细菌存在的一种方法。
发明背景
通常方法是在合适的培养基上繁殖来自诸如痰的体液样品的细菌，以便能或者用肉眼或者用检测试剂或化验来检测培养基上的细菌菌落。这种方法可适用于范围广泛的细菌，并作为一种标准细菌检测和诊断方法而被广泛接受。然而，当细菌为缓慢生长类型时产生问题，在细菌已经生长至足以能检测到时之前，可能需要几天或甚至几周。这种情况特别是在某些分支杆菌种或军团杆菌种中，可能需要四周或更长时间繁殖成可检测的细菌菌落。在证实病人的细菌感染中这迫使不可接受的延误，希望提供一种更快评价细菌的存在和鉴定的方法。
在PCT申请WO92/02633中已经提出了制备一种能生存的细菌样品，用对该细菌为特异性的一个病毒株感染该细菌，这种感染细菌的病毒被表示为噬菌体(bacteriophage)或更常用的噬菌体(phage)。某些噬菌体颗粒感染细菌并在细菌细胞中复制。那些不被细菌吸收的噬菌体颗粒与细菌栽体的母液或基质(一般是培养基)一起保留。那么如果例如用热和/或用酸处理感染的样品以杀死暴露的外源噬菌体颗粒，或用表面活性剂洗涤以将其除去，外源噬菌体颗粒则失活或被除去。感染性内源噬菌体颗粒未被失活，因为它们在细菌细胞中被保护。然后在更多的未感染细菌存在下培养处理的受感染细菌，未感染细菌对噬菌体颗粒是许可的，也就是能被噬菌体颗粒感染。噬菌体颗粒在感染细菌中复制，导致细胞壁破裂或裂解，并释放其所载的复制的噬菌体颗粒。第一代的子代噬菌体颗粒感染其它细菌细胞，导致感染复制和裂解的连续循环。这使得在培养基中噬菌体颗粒的数目呈指数地增加。甚至在受感染细菌细胞的最初数目小时，也可以检测或观察到或者细菌细胞的减速生长或者大量复制的噬菌体颗粒，因此提高检测被评价样品中存在的原始细菌细胞的敏感性。
这种修改增强细菌细胞的检测敏感性，已成功地用于检测快速生长的细菌如沙门氏菌种。然而，对于缓慢生长的细菌如分支杆菌种，我们已发现采用这种方法获得可检测的噬菌体颗粒群体的时间与其它技术所用的时间保持基本相同，在这类细菌中该方法不能解决时间问题。仍需要实现快速并准确检测缓慢生长细菌的方法。
我们已设计了一种能快速检测缓慢生长细菌的方法，因此克服了在这类检测中不得不等待数天或甚至数周的困难。该方法也可用于测定特定细菌对抗菌素和其它药物的敏感性，以及测定抗特定细菌的一种特定抗菌素或药物是否有活性，或抗特定病毒的一种特定杀病毒成分是否有效。因为该方法可以用简单的设备并且由非技术人员实施，该方法容易提供给可能没有熟练的微生物学家和复杂的设备的第三世界国家使用。
发明概述
因此，一方面本发明提供一种在一个样品中检测第一细菌存在的方法，该方法包含下列步骤：
a.用一种噬菌体感染第一细菌的活样品，该噬菌体对那种细菌是特定的，因此至少某些细菌细胞每个吸收一个或多个噬菌体颗粒；
b.灭活或去除没有被细菌细胞吸收的噬菌体颗粒；
c.在至少含一种其它第二细菌的培养基中培养感染的第一细菌细胞，该第二细菌的繁殖速率大于所述第一细菌的繁殖速率，因此至少某些所述第二细菌细胞被因所述感染的第一细菌细胞的裂解而释放的噬菌体颗粒感染，每个所述的感染的细菌细胞作为感染循环后代的进一步感染的感染源；以及
d.监测复制的噬菌体颗粒群体和/或在步骤 c中所述的第二细菌的减速生长，以确定在该测试样品中所述第一细菌的存在。
最好是，将培养和第二细菌的感染进行到或接近于稳定状态，在此状态下，进一步的细菌细胞生长及裂解基本停止。在此状态下，由于噬菌体颗粒活性而导致的基本稳定的死细菌细胞群体存在于培养基中。通过透明斑点，可用肉眼检测到已发生噬菌体复制的培养基的区域，其周围的培养基更加混浊。由于存活细菌的生长而致的不透明或其它可见的区别。由于噬菌体活性而致的细菌生长减速的这类区域通常称为噬菌斑。因为第二细菌的速率繁殖大于第一细菌的繁殖速率，所以最初感染的第一细菌细胞产生可检测的噬菌斑所需要的时间大大缩短。当同一细菌用于最初的噬菌体感染及用于随后的培养步骤时，不会发生噬菌斑形成的加速。
另一方面，用常规噬菌体检测技术可评价步骤 c的末期在培养基中复制的噬菌体颗粒的存在。除了用上述方法确定噬菌斑的存在外，或作为其替代方法，可以进行该方法。
因此本发明的方法可应用于样品中缓慢生长细菌的检测，该样品例如来自被怀疑为结核病分支杆菌感染的病人或军团杆菌病的病人，常规的评价方法可能需要几天或几周，来获得在该原始样品中存在这种细菌的任何可观察到的指标。在这种情况下，用对预期细菌特异性的噬菌体感染一定比例的原始样品，噬菌体颗粒被携带通过灭活步骤b，因为它们已感染的细菌细胞保护它们。在被感染细胞的培养中，这些被保护的噬菌体颗粒导致在每个被感染的第一细菌细胞的附近形成噬菌体或噬菌斑-步骤 c。如果在该样品中没有被怀疑的细菌存在，在步骤 c中将基本没有噬菌体或噬菌斑形成，该培养基将呈现基本均一的外观。
也可用一种已知的细菌实施本发明，该已知细菌已用一种抗菌素或测试中的其它药物处理，以确定该抗菌素或药物是否有任何杀菌效果。在这种情况下，在步骤 c末期的噬菌体群体或噬菌斑显示出抗菌素或药物杀死最初细菌有效与否。在常规测试方法中，将抗菌素或药物用于细菌，死细胞的数目是抗菌素或药物效力的直接指标。然而，除非在显微镜下，否则观察死细胞个体可能是困难的。在本发明的这种应用中，用可能杀死第一细菌的抗菌素或药物对第一细菌的处理同用噬菌体颗粒对仍活的第一细菌的感染结合进行，以证明有多少第一细菌逃脱了被该抗菌素或药物杀死。
在本发明的另一应用中，用具有杀病毒或病毒生长调节剂作用的组合物处理一个病毒或噬菌体样品。然后处理的噬菌体用于感染对该特异性噬菌体许可的(也就是说这种细菌能被该噬菌体感染)活的第一细菌。然后处理被感染的细菌以灭活外源性的噬菌体颗粒，也就是那些没有感染细菌细胞并且保持暴露在细胞外面，或对细胞是外源性的噬菌体颗粒。然后在一种更快繁殖的第二细菌存在下培养灭活的被感染的第一细菌细胞材料，以产生噬菌斑，其中被感染的第一细菌内的噬菌体颗粒已经复制并裂解。如果噬菌体颗粒最初的处理完全有效，那么当第一细菌材料被感染时将没有存活的噬菌体颗粒存在，因此将没有活噬菌体颗粒被携带到第二细菌存在的培养中。因此，第二细菌将繁殖产生一种基本均一的颜色或使培养基不透明。然而，如果噬菌体颗粒最初的处理不是完全有效，那么噬菌体颗粒将被携带到第二细菌存在的培养中并将导致能被肉眼检测的噬菌斑。
为方便起见，在下文将根据一种缓慢生长的分支杆菌种存在的评价来描述本发明。本发明可应用于来自种类繁多的动物或植物宿主的细菌，但特别应用于检测来自哺乳动物宿主的细菌，并且为方便起见，特别参考在为怀疑被该细菌感染的人的身体材料的原始样品中评价这样一种缓慢生长细菌来描述本发明。
用于此处的术语缓慢生长细菌指那些细菌，在37℃的正常繁殖条件下，在含90％v/v已知为7H9的培养基和10％v/v已知为OADC的营养物中，它们以细菌细胞群体倍增评价的有效繁殖周期(有效倍增速率)超过10小时。这类细菌用常规培养技术产生可检测的噬菌体群体或噬菌斑将一般需要超过72小时或很难培养。用本发明的方法，对这类细菌通常在16小时内可检测到噬菌体或噬菌斑。
典型的缓慢生长细菌包括分支杆菌种，特别是结核分支杆菌、类结核分支杆菌和鸟型结核分支杆菌；军团杆菌种，特别是嗜肺性军团杆菌；螺杆菌种，特别是幽门螺杆菌；链球菌种，特别是毗邻链球菌(Streptococcus adjacens)以及立克次体种，特别是普氏立克次体。本发明也可用于这类细菌，当瞬时倍增速率不到10小时时，由于它们最初繁殖的困难而使平均有效倍增速率大于10小时，例如缺损链球菌(Streptococcus defectens)和嗜极端微生物属(Extremophiles)种。因此本文和权利要求书中用的术语缓慢生长细菌是指先天为缓慢繁殖体的细菌和由于它们繁殖周期间歇的故障或中断而具有超过10小时的慢平均繁殖速率的细菌。
尽管本发明在检测这类缓慢生长细菌方面特别有利，但本发明可用于在人类样品、食品或在为检测厨房中细菌侵扰所取的样品等中，任何希望提高可检测的噬菌体群体或噬菌斑形成速度的细菌，如有效倍增速率小于10小时(如在2-10小时，优选4-10小时范围内)的细菌的检测，以便提供比用常规细菌培养技术得到结果更快的细菌检测方法。为方便起见，在下文将通过用结核分支杆菌作为第一细菌来描述本发明。
该第一细菌可能存在于来自病人的任何合适形式的样品中，如痰和其它粘性(mucal)分泌物。然而，本发明可应用于其它身体材料的样本，如来自人类其它哺乳类(如马、牛、羊和猪)的血液、尿液或粪便以及来自植物材料的样本，如叶或根作物或水果。为方便起见，在下文通过检测来自人类病人的痰样品来描述本发明。
通常，样品将作为新鲜获得的流体存在，在该样品中细菌仍为活的。然而，在检测前为了储存和/或转移已将样品冰冻或干躁时，通常希望将该样品放在大约20至55℃(最好是37℃)的合适培养基中，以保证细菌是活的并在本发明方法的步骤 b中能用噬菌体颗粒感染。如果希望的话，可以处理原始样品，例如N-乙酰半胱氨酸稀释和/或用碱、表面活性剂或酸处理，以减少可能干扰待评价细菌检测的其它细菌群体。通常用于在制备评价用的细菌样品的条件和技术可用于实施该预处理。然而，与常规的评价缓慢生长细菌的方法相比，减少了对在原始样品中消除其它细菌污染的需要，因为本发明的方法比常规检测方法更快，其它细菌的作用可忽略不计。
原始样品含有存活状态的待评价细菌。这通常将在流体或凝胶中，如在琼脂、培养基中。然而，该载体介质可以是一种固体微粒或一种有孔材料的微孔，如陶瓷烧结料或泡沫塑料或滤纸或网状材料的网孔，用合适的营养成分浸透。为方便起见，在下文通过将一种流体载体介质用于原始细菌样品来描述本发明，该原始细菌样品接着用于凝胶载体介质。
用一种合适的噬菌体感染该原始样品，该噬菌体对被评价的第一细菌类型和第二细菌是特异性的，在第二细菌中被感染的第一细菌将在本发明方法的步骤 c中培养。该噬菌体从种属上说对细菌类型可能是特异性的，使得该噬菌体将感染一个属的一类细菌。然而，最好用对待评价的特定细菌特异性窄的噬菌体。如果需要，可修饰噬菌体以增加该噬菌体的特异性，以便减少感染该评价样品中的其它细菌。考虑待感染的特定细菌，例如在PCT申请WO92/02633号中描述的，可以用已知的技术(例如通过遗传修饰)达到合适的噬菌体修饰。目前用的典型噬菌体包括AG1、B1、BG1、BK1、C3、D29、D34、D56A、GS4E、HP1、L1、I3和TM4。目前用的最佳噬菌体将取决于所用的第一和第二细菌，因为该噬菌体或裂解时从细菌细胞产生的其复制体(replicand)需要是所用细菌允许的。因此用包皮垢分支杆菌作为第二细菌评价结核分支杆菌存在时，噬菌体D29是合适的；而当用鸟型结核分支杆菌时，噬菌体TM4是合适的。
可以以如在流体介质中的培养物(cultivatar)形式提供噬菌体，或以冰冻或喷雾干躁的颗粒形式提供噬菌体。用任何适当的技术和在任何合适的条件下将该噬菌体与该活细菌样品混和。该细菌样品一般将为流体形式，而该噬菌体感染是在流体载体中用于该细菌样品。
最好是使该噬菌体感染在55℃以下的温度(特别是在大约37℃)进行10分钟至4小时，以使多数细菌细胞每个感染至少一个噬菌体颗粒。然而，过度的感染可能削弱细菌，以致于在用下述酸处理的没有非吸收的噬菌体颗粒的灭活中不能存活下来。考虑在本发明方法后续阶段中将经受的条件，可通过简单实验和误差试验或通过被感染细菌的显微镜检查，确定对一种特定细菌的最适感染时间。
然后处理该被感染的细菌样品，以除去或灭活任何没有尚未吸收入细菌细胞并保持在细菌细胞外的外源噬菌体颗粒，并暴露于在灭活阶段-步骤 b的条件下。为方便起见，将在这里用的术语灭活总体上表示使未吸收的噬菌体颗粒在本发明方法下面的步骤中实际上不能复制的任何方法。该术语因此包括物理分离或从样品中除去噬菌体颗粒或颗粒的去活化。可以用如那些在PCT申请WO92/0233号中描述技术的任何合适的技术，实施这种灭活。推荐技术包括该被感染样品的洗涤和过滤，以从该被感染细菌细胞中物理地分离外源噬菌颗粒；通过用酸、表面活性剂或化学药品处理被该感染的样品，以杀死外源噬菌体颗粒或使外源噬菌体颗粒失活；或通过在一种合适的基质上优先吸收来自该被感染样品的外源噬菌体颗粒，该基质然后可与细菌细胞分离。
为方便起见，下文中将通过将被感染细菌细胞和外源噬菌体颗粒混合物的化学或酸处理来描述本发明。这种处理最好用以下物质来实现：无机酸或其铁盐，例如硫酸亚铁胺、或磷酸或硫酸；C1-4脂族羧酸，特别是乙酸，它可以是稀释的冰醋酸或醋；或酸性缓冲介质。该处理达到细菌载体介质中pH值，该介质灭活所用的噬菌体，但不会杀死被感染的细菌。最适的洗涤条件和pH条件将取决于在评价中的细菌并可由简单实验和误差试验决定。一般酸化该被感染的细菌材料并将其在较高温度(一般约为37℃)下培养足够的时间，一般约为15分钟，然后通过加入强碱或碱将pH调至大约中性。
在另一个可选择的技术中，通过向被感染的细菌材料加入杀病毒剂而杀死外源噬菌体。最佳的杀病毒剂将取决于待杀死的噬菌体和第一细菌的性质，并可容易地由简单实验和误差试验决定。因此，第一细菌为结核分支杆菌时，目前用的合适的杀病毒剂包括无机酸的铁盐、和不饱和脂肪酸和含12-24个碳原子的醇、可选地用光化学辐射或其它辐射，特别是大约400-600nm波长的紫外辐射。
灭活后，该细菌材料含有活的第一细菌细胞，至少某些里面有存活的噬菌体颗粒。该混合物与含第二细菌或细菌混合物的培养混合物混合。这些第二细菌的特征在于，它们可被第一细菌细胞内的噬菌体颗粒感染，也就是说它们对噬菌体是允许的；并且它们的速率繁殖大于待评价的第一细菌的繁殖速率。最好是第二细菌的倍增速率至少为第一细菌倍增速率两倍。繁殖的最佳相关速率将取决于第一细菌繁殖的实际速率，因为如果产生可检测的噬菌体群体和/或减少第二细菌的生长区域或噬菌斑所需要的时间不是过分的，那么一种生长非常缓慢的第一细菌将需要高的相对繁殖速率。一般第二细菌的倍增速率将为第一细菌倍增速率的4-20倍。因此为在该原始样品中评价结核分支杆菌，我们已发现用包皮垢分支杆菌作为第二细菌产生特别快的结果。目前用的其它合适的第二细菌包括其它分支杆菌，例如金分支杆菌(Mycobacterium aurum)。
如果需要，在与第二细菌混合前，可以让该被感染的第一细菌在灭活步骤 b后维持原状，以获得至少复制一代并从该被感染细胞释放噬菌体颗粒。这种维持原状允许复制的噬菌体颗粒从被感染的细菌细胞释放，以便在第二细菌内提供更多可能的感染位点，这以有助于在原始样品中低数目活第一细菌的检测。
在本发明方法的步骤 c中，在较快繁殖的第二细菌存在下培养该被感染的第一细菌。当噬菌体颗粒在该被感染的第一细菌细胞内复制时，它们形成大量的随细胞节烈而从该被感染细胞释放的噬菌体颗粒。每个释放的噬菌体颗粒能感染一个邻近的细菌细胞，该细菌细胞可以是第一细菌细胞或第二细菌细胞。在那些新近感染的细菌细胞中的每个噬菌体颗粒能复制并被释放去感染更多的细菌细胞；如此等等。
可以用任何适当的技术和条件进行第一和第二细菌混合物的培养。一般第二细菌采用与感染的第一细菌混合的流体或凝胶介质培养物的形式。然而，第二细菌可以采用冰冻或喷雾干燥粉末或固体颗粒的形式，这些固体颗粒其上浸渍或涂上细菌。为方便起见，在下文将通过一种琼脂凝胶载体中的第二细菌应用于该感染的第一细菌来描述本发明。加入到处理的第一细菌样品中的第二细菌的量能在宽范围变化，这取决于该样品中的第一细菌细胞预期的量和从本发明方法得到需要结果的想要的时间。一般来说，最好是提供大量的第二细菌细胞，一般比第一细菌的数量大2-50倍，以增加从该感染的第一细菌细胞裂解的噬菌体颗粒感染第二细菌细胞而不是第一细菌细胞的可能性。通过简单实验和误差试验可容易地确定第一细菌细胞与第二细菌细胞的最佳比例。
在该培养过程中，最好是培养基以某种可检测的方式变化，以反映复制的噬菌体颗粒、存活的第二细菌或由于噬菌体颗粒的作用而致死的细菌细胞的噬菌斑的存在。通常，第二细菌的生长将导致琼脂培养基混浊或有色，而噬菌体颗粒和相关的死细菌细胞(从这些细胞中已释放了噬菌体颗粒)将导致几乎不混浊或透明的点，即噬菌斑(在有色的或混浊的培养基中)，以便能用肉眼检测和评价这些噬菌斑。或者用常规染色技术通过差示染色可检测差异的生长区域。当培养基含有合适的成分式，在裂解时细菌细胞可释放发光体(lumiphores)并可在紫外射线下检测到，例如PCT申请WO92/02633中描述的。也可通过如ELISA的免疫分析技术或其它酶学技术检测数量增加的复制的噬菌体颗粒。
噬菌体颗粒的数目和/或噬菌斑的数目表示存在的第一细菌细胞的数目，因此表示待评价的原始样品中这类细胞的存在与否。
如上所述，本发明方法提供来自病人的原始样品中一种预期细菌菌株存在的快速测试。通过适当地选择用于感染第一细菌的噬菌体颗粒，该测试可特别用于特定的细菌。另一方面，该测试可提供关于存在于该原始样品中的细菌类型的一个粗略指标。因此本发明方法能适合于需要的结果。因为在大约几小时而不是当迄今需要的几天就可获得结果，它对实施最初普通筛选是可行的，一旦鉴定出该原始样品中存在普通类型的细菌，就接着进行特定的测试。因为本发明的方法可用简单细胞培养技术实施，并且结果可用肉眼评价，所以本发明方法可在可能不具有技术人员和复杂实验室条件的第三世界国家容易地使用。
本发明也提供用于本发明方法的诊断试剂盒，以检测样品中第一细菌的存在或不存在，该试剂盒包含感染第一细菌的一种已知的噬菌体源；一种活的第二细菌源，该第二细菌的倍增速率比第一细菌的倍增速率快并且它对从被所述噬菌体感染的第一细菌释放的噬菌体颗粒是允许的。该试剂最好盒也包含灭活和/或除去来自被所述噬菌体感染源感染的第一细菌的外源噬菌体颗粒的工具。
现在将通过以下实施例说明本发明，其中所有部分以重量给出，除非另外说明。
实施例1
是在一个安全模型系统中测试用本发明的原理，用缓慢生长的疫苗菌株BCG代表标准倍增时间至少为10小时的第一细菌，并用快速生长的包皮垢分支杆菌作为第二细菌，它的标准倍增时间大约为2小时。该实施例兼有液体和固体琼脂步骤室并用酸灭活该外源噬菌体。
步骤1.来自琼脂基培养基的BCG菌落在加10％(v/v)OADC补充物(Difco)的7H9(下文中称为OADC、7H9)液体培养中于37℃生长两周，以产生能用于检测分析的细胞原料。在临床上这些细胞直接来源于临床样品而不需要该预培养步骤。在临床上，缓慢生长细胞将是结核分支杆菌。
步骤2连续地稀释含有BCG细胞的液体培养物，将10μl每个稀释度的液体与10μl含105D29细菌噬菌体(噬菌体)的7H9、OADC混合。也设置含以下成分的对照样品：
a)无BCG，10μl无任何BCG的培养基与噬菌体混合；以及
b)热杀死对照，在与噬菌体混合前于80℃加热30分钟杀死BCG。
步骤3.在37℃培养90分钟后，加入20μl1.2％(v/v)HCL灭活外源噬菌体颗粒。
步骤4.然后加入20μl 22.2mM NaOH中和酸性。
步骤5然后将10μl该溶液点在含7H9、OADC、5％(v/v)静止期包皮垢分支杆菌培养物和1.5％细菌琼脂(Bacoagar)(Difco)的琼脂平板上。
步骤6.然后在37℃培养平板以允许被保护的内源噬菌体颗粒在BCG细胞内复制。复制的噬菌体颗粒导致BCG细胞裂解并被释放。至少某些释放的噬菌体颗粒感染包皮垢分支杆菌并在这些较快速生长细胞中建立感染循环。
步骤7.16小时后，观察这些平板的混浊生长的未感染的包皮垢分支杆菌指示细胞中的噬菌体裂解区域或噬菌斑。记录结果，表示如下：
   样品     裂解范围
   未稀释的BCG     +
   10-2稀释     10个噬菌斑
   10-4稀释     -
   加热杀死的BCG     -
   无BCG，只有噬菌斑     -
+观察到单个噬菌斑，但太多而不能计数
-无噬菌斑
加热杀死的BCG和只有噬菌体的对照组保持阴性，表明需要活细胞在酸灭活中给噬菌体提供保护。活的BCG能保护在BCG细胞内感染并复制的噬菌体。因BCG细胞的裂解，释放复制的噬菌体并且至少某些噬菌体在快速生长的包皮垢分支杆菌中开始复制循环，它在培养16小时后产生噬菌斑。表现出裂解的BCG的最高稀释度为10-2，当所用的最初BCG培养物才在早对数期时，这代表大约103BCG菌落形成单位。因此，这种分析具有检测给定样品中少至103的活的缓慢生长细菌的潜力。该敏感性高于对显微镜规定的敏感性并与用常规方法检测分支杆菌的培养敏感性大致相同。然而，产生可观测噬菌斑所需要的时间与常规培养技术需要4-6周相比仅为不到24小时。
实施例2
重复实施例1的方法，只是在固体琼脂培养基中进行分析并通过洗涤而不是酸处理灭活除去外源噬菌体。
步骤1.步骤1如实施例1中描述进行。
步骤2.在7H9、OADC中进行BCG培养物的连续10倍稀释。将每个稀释度的液体10μl点在一个琼脂平板上(7H9、OADC、1.5％细菌琼脂)。10μl加热杀死的BCG培养物也点在一个相同的平板上，以提供一个对照测试。将平板置于37℃。
步骤3.用7H9、OADC、3％奶粉、每毫升106D29细菌噬菌体湿润一片滤纸。将滤纸铺在点种的平板面上，37℃培养20分钟以允许感染平板上的细菌细胞。
步骤4.将一叠五片滤纸放在浸湿噬菌体的滤纸上面，通过这叠滤纸的毛细管作用从感染细胞的附近除去外源噬菌体。
步骤5.当这叠滤纸被完全湿润，从琼脂表面除去所有滤纸并丢弃。
步骤6.然后用硝酸纤维滤膜从琼脂的表面剥离感染的细胞。该硝酸纤维滤膜放在琼脂上，使其湿润，然后将其剥去。然后将该滤膜细胞面向下放在含快速生长物包皮垢分支杆菌指示细胞的琼脂平板上(7H9、OADC、5％(v/v)的静止期包皮垢分支杆菌培养物、1.5％细菌琼脂)。
步骤7.来自步骤6的平板在37℃培养直至可用肉眼观察噬菌斑(大约16小时)并记录结果：
    样品     溶解范围
    未稀释的BCG     +++
    10-1稀释     +++
    10-2稀释     ++
    10-3稀释     +
    10-4稀释     -
    加热杀死的BCG     -
+++指示细胞完全溶解(无细胞生长)
++噬菌斑融合，在噬菌斑间有某些生长的指示细胞
+观察到单个噬菌斑，但太多而无法计数
-无噬菌斑
加热杀死的对照又保持阴性表明需要活细胞在通过洗涤除去噬菌体步骤中给噬菌体提供保护。活的BCG能再次保护在BCG细胞内感染和复制的噬菌体。因BCG细胞的裂解而释放复制的噬菌体，并且至少某些噬菌体在快速生长物包皮垢分支杆菌中开始复制循环，培养16小时后产生噬菌斑。表现出溶解的BCG的最高稀释度为10-3，当所用的最初BCG培养物在晚对数生长期时，这代表大约103BCG菌落形成单位。因此，在这种形式下这种分析具有检测给定样品中少至103的活的缓慢生长细菌存在的潜力。
实施例3
本实施例证明进行细菌分析的另一种方法。用于噬菌体感染步骤的痰样品的处理
整个痰样品放在一个无菌的20ml有螺旋帽的玻璃瓶中。
1.向样品中加入等体积的“消毒试剂”以消毒并液化样品。
2.颠倒几次混合稀释的样品，竖立放置混合物10分钟使痰液化。
3.然后将样品在4000×g离心10分钟，以沉淀这些杆菌。
4.将产生的上清液倒入干净的Hycolin杀菌剂并丢弃。
5.将杆菌沉淀重新悬浮在20ml无菌的蒸馏水中。
6.如步骤4离心悬浮的细菌混合物以沉淀杆菌。
7.然后将杆菌沉淀再悬浮在1.0ml“生长培养基”中并使其在35-37℃竖放24小时以提供供测试分析的样品。
8.向一个新的试管中加入1.0ml“生长培养基”制备对照样品以提供灭活的对照样品；将1滴“助手细胞(Helper Cells)”加入新试管中的1.0ml“生长培养基”，以提供对保护的内源噬菌体的阳性对照。噬菌体对杆菌的感染
9.用一个无菌微量进样器(pastette)向每个测试样品(包括灭活的对照样品)加入1滴(50μl)“细菌噬菌体”。摇动混合，在35-37℃静置培养30小时。在该时间内不处理对内源噬菌体保护的阳性对照。
10.向样品加入细菌噬菌体2.5小时后，向阳性对照试管加入包皮垢分支杆菌沉淀。
11.将所有的测试和对照样品培养总计每个3小时。用一个无菌的微量选样器向每个样品(包括对照样品)加入2滴(100μl)“灭活试剂”。样品完全混合，竖立放置5分钟。
12.用一个无菌的塑料微量进样器在每个样品试管中加入“生长培养基”至5ml刻度，混和里面的东西，在35-37℃静置培养4小时。细菌噬菌体噬菌斑的目测
13.用一个无菌的塑料pastette向每个测试和对照样品加入1.0ml“助手细胞”。
14.向每个样品加入5.0ml熔化的基底琼脂，将样品和琼脂慢慢地旋动混合。
15.将每个试管中的东西倒入冷的有相应标记的“指示平板”中。
16.将“指示平板”放在工作台上30分钟让琼脂固化。
17.将“指示平板”放在37℃15小时。
18.对黑色背景肉眼观察平板计数每个“指示平板”上的噬菌斑数目。在平板上所见的“助手细胞”的生长是一个不透明的区域，而所见的在这种混浊里的透明或半透明的区域是由于细菌噬菌体而致的裂解区域(噬菌斑)。检查对照管
在分析测试样品的结果前，检查灭活对照样品中出现的由在灭活处理中残存的噬菌体而导致的裂解。在该平板上应当不到10个噬菌斑。如果多于10个噬菌斑，则外源噬菌体的化学灭活不完全，必须重复试验。检查阳性对照板的噬菌斑。在这个板上应当出现大范围的裂解并且应当有大量的噬菌斑。在某些情况下，由于细胞的完全裂解可能根本没有“助手细胞”生长，结果是平板可能没有细菌菌苔。
检查每个测试样品平板，根据以下标准评价噬菌斑的存在或溶解：
+++完全裂解，无细菌碎片
++完全裂解但有些细菌碎片
+合并成片的噬菌斑但有些单个噬菌斑
 如果噬菌斑的数目能被计数，记录该数值
-没有观察到噬菌斑。
那些显示出溶解的平板表明那些痰样品含有作为分支杆菌噬菌体复制宿主的活分支杆菌。
通过上述噬菌体分析技术检测了来自肺结核病人的八个消毒的痰样品，显示其中五个样品含有存活的结核分支杆菌而另三个样品没有。当将这些结果与那些通过样品常规细菌培养所获得的结果相比较，通过培养方法是阳性的五个样品在噬菌体分析中也是阳性，即支持细菌噬菌体的存活和复制，而通过培养方法是阴性的三个样品在噬菌体分析中也是阴性，即不支持细菌噬菌体的存活和复制。
在以上检测方法中用的试剂如下：
消毒试剂：2gms NaOH、0.5％N-乙酰L-半胱氨酸、加无菌蒸馏水至100ml。
生长培养基：7H9、OADC添加0.1％甘油。
基底琼脂：生长培养基加入1.5％细菌琼脂。
噬菌体：由平板裂解物制备噬菌体D29。用10ml7H9、OADC、0.1％甘油、1mM CaCl2淹没一个显示融合裂解的90mm佩特里细菌培养皿，在冰箱中放置过夜(16小时)。用一个吸管(pastet)从平板收获液体，在4000×g离心15分钟。上清液通过一个0.4μ滤膜过滤除菌并等量分装贮存于4℃。
助手细胞：包皮垢分支杆菌生长至静止期并贮存于4℃。
灭活试剂：100mM硫酸亚铁铵，过滤除菌。
实施例4：
在一个安全模型系统中，通过分支杆菌的药物敏感性试验检测本发明的原理。用BCG作为一种敏感的分支杆菌(对低浓度的异烟肼和利福平敏感)模型，而用对异烟肼有先天抗性的和对利福平有部分抗性的包皮垢分支杆菌作为抗性或半抗性分支杆菌模型。
步骤1.来自琼脂基培养基的BCG菌落在7H9、OADC液体培养基中于37℃生长两周，以产生能用于检测分析的对药物敏感的细胞原液。同样包皮垢分支杆菌的贮菌在7H9、OADC中生长24小时以产生抗药性细胞的原液。在临床上这类细胞将直接从临床样品来源而不需要这个预培养步骤。在临床上药物敏感细胞将是不同的菌株或是结核分支杆菌的分离菌。
步骤2.用不同浓度的异烟肼和利福平在3ml体积的7H9、OADC中与100μl每个培养物培养72小时。这个步骤是使细胞被抗生药物作用所必需的。也设置不含药物的对照。
步骤3.然后每个培养物取出100μl用于检测。
步骤4.加入800μl含5×106D29噬菌体的7H9、OADC，37℃培养BCG培养物4.5小时或培养包皮垢分支杆菌培养物40分钟。加热杀死的BCG和包皮垢分支杆菌及只有噬菌体的样品也包括在实验中作为对照。
步骤5.然后通过添加100μl pH2.2酸缓冲液(由混合32.2ml0.1M柠檬酸二钠和67.8ml 0.1M HCl制备)灭活外源噬菌体。
步骤6.5分钟后，加入84μl 1.0M NaOH中和酸性。
步骤7.加入另外4ml 7H9、OADC并将包皮垢分支杆菌培养物直接倒平板。而将BCG培养物在37℃培养3小时以使内源的、被保护的噬菌体在任何活的或存活的细胞内复制。
步骤8.然后将每个培养物100μl与5ml含5％(v/v)的静止期包皮垢分支杆菌培养物和0.7％细菌琼脂(Difco)的流体7H9、OADC混合并倒入一个50mm佩特里细菌培养皿。
步骤9琼脂凝固后，在37℃培养平皿16小时。在此期间，在活分支杆菌中经受酸处理后存活的任何内源噬菌体复制并裂解最初的靶细胞，并且至少某些这些噬菌体在快速生长菌包皮垢分支杆菌指示细胞内建立新的复制循环。
步骤10.然后观察平皿在未感染的指示细胞的混浊生长中的噬菌体裂解的透明区或噬菌斑。记录结果并显示如下：
        异烟肼浓度(μg/ml)        利福平浓度(μg/ml) 无药物   无药物 加热杀死
  0.1   1.0   10   10   50   100
结核分支杆菌   122   40   2   4   4   10     71     109   1
包皮垢分支杆菌   ++   ++   +   ++   50   8     ++     ++   1
该表表明用在不同抗菌素存在下生长的不同分支杆菌观察到的噬菌斑的数目。
++噬菌斑融合，在噬菌斑间的某些指示细胞生长
+观察到单个噬菌斑但太多而无法计数
缓慢生长的结核分支杆菌对异烟肼和利福平敏感。当在利福平存在下生长时，细胞被杀死，因而没有存活细胞保护噬菌体不被灭活并支持它们的生长。在存在的所有利福平浓度下观察的噬菌体数目不是显著地在背景水平以上；背景为在加热杀死的样品中观察到的噬菌斑数目。然而，快速生长菌包皮垢分支杆菌对低浓度的利福平是抗性体，这可从在最低利福平浓度下大量的噬菌斑观察到。当增加利福平浓度，细胞受影响并在噬菌斑数目上逐渐减少。
已知在分支杆菌中利福平的作用是快速的，而异烟肼发挥其作用需要一些时间。因此，在异烟肼的最低浓度下，BCG不受影响并且这反映在观察到的噬菌斑的数目上，这个数目在无药物对照组中观察到的噬菌斑数目差不多。然而在高浓度的异烟肼下，在反映这些细胞死亡的噬菌斑数目上有明显的减少。相反，包皮垢分支杆菌几乎不受异烟肼的影响，在最高浓度下噬菌斑数目只有轻微减少。
这个实验表明本发明可用于评价一种缓慢生长细胞如结核分支杆菌的药物敏感性。这个分析实施简单，可在小数目的细胞上实施且在4天内得到结果，这包括使药物在细胞上发挥其作用所需要的时间。使用培养技术的常规药物敏感性分析需要更大量的细胞并且获得结果需要4周。Bactec系统比常规培养技术更快，需要大件昂贵的设备，而本发明的方法需要的设备最少，并且不昂贵且更适于结核病更常见的第三世界环境。
因此，本发明还提供一种评价对细菌处理的效果的方法，该方法包含：
I.将细菌暴露于该处理中；然后
ii通过以下步骤评价维持在样品中的细菌存活细菌细胞的数
目：
    a.用一种该细菌允许感染的噬菌体感染该被处理细菌样
      品；
    b.灭活该被感染的样品中的外源噬菌体颗粒；
    c.在第二细菌存在下培养该灭活的样品，该第二细菌的倍增
    速率大于第一细菌的倍增速率，以及
    d.评价噬菌斑形成的范围和/或第二细菌生长的范围。
本发明的方法也可用于评价一种组合物对噬菌体的影响，通过：
a.用该组合物处理噬菌体颗粒；
b用处理过的噬菌体颗粒感染对活的噬菌体允许的第一细菌；
c.灭活对被感染的第一细胞为外源的噬菌体颗粒；
d.在第二细菌存在下培养灭活的细胞，该第二细菌的倍增速率大于第一细菌的倍增速率，最好是大至少2倍，一般大4-10倍；以及
e.评价噬菌斑形成的范围和/或在培养的第二细菌细胞中生长的第二细菌的范围。
在本发明方法的这种应用中，细菌生长的范围表示噬菌体颗粒的最初处理有效与否。如果没有噬菌斑形成，则最初处理已杀死或灭活了噬菌体颗粒并因此阻止了它们感染第一细菌细胞。这些细胞在第二细菌的培养阶段的复制不释放已杀死或阻止第二细菌细胞复制的噬菌体颗粒，因此培养的第二细胞将表现出基本均一的颜色或不透明，这表示细菌细胞的均匀生长。当该组合物在杀死或灭活噬菌体颗粒方面没有作用时，这些噬菌体颗粒将感染第一细菌细胞并在对感染的第一细胞的灭活处理中被保护。当在第二细菌存在下培养被感染的细胞时，噬菌体颗粒将复制并从被感染的第一细胞中裂解出来，去感染第二细菌细胞以产生噬菌斑或使第二细菌明显不均匀生长。噬菌斑或不均匀生长的范围指示噬菌体存在的数目，并因此指示在噬菌体颗粒上最初处理的效力范围。尽管本发明方法的这种应用可能不能产生定量的结果，但它提供一个快速的最初筛选技术，该技术可用于区别有潜力的候选组合物，然后该组合物可以经过其它测试，以确定该组合物的定量作用。
因此，在其最广泛的方面，本发明提供一种缩短第一细菌分析的反应时间的方法，特征在于：
a.所述第一细菌受到所述第一细菌允许的噬菌体颗粒的感染；
b.处理感染的第一细菌以灭活外源噬菌体颗粒；
c.在一种第二细菌存在下培养处理的细菌，该第二细菌也是对所述噬菌体或它的复制体允许的，并且它具有比第一细菌的有效倍增速率大的倍增速率，最好是至少大两倍，一般大4-10倍；以及
d.评价噬菌斑形成的范围和/或在培养的第二细菌细胞中的第二细菌生长的范围。

Claims (19)

1.一种缩短第一细菌分析的反应时间的方法，其特征在于：
a.用第一细菌允许的噬菌体颗粒感染所述第一细菌；
b.处理该感染的第一细菌以灭活外源噬菌体颗粒；
c.在一种第二细菌存在下培养该处理的细菌，第二细菌对所述噬菌体或其复制体是允许的，并且它的倍增速率大于第一细菌的有效倍增速率；以及
d.评价噬菌斑形成的程度和/或在培养的第二细菌细胞中的第二细菌生长的程度。
2.权利要求1中要求保护的方法，其特征在于，它提供一种在一个样品中检测第一细菌存在的方法，该方法包括下列步骤：
a.用一种对第一细菌特异性的噬菌体感染第一细菌细胞的活样品，从而至少某些细菌细胞每个吸收一个或多个噬菌体颗粒；
b.灭活或除去尚未被细菌细胞吸收的噬菌体颗粒；
c.在含至少一种其它第二细菌的培养基中培养被感染的第一细菌细胞，第二细菌的倍增速率大于所述第一细菌的有效倍增速率，从而至少某些所述第二细菌细胞被由所述感染的第一细菌细胞的裂解而释放的噬菌体颗粒感染，每个所述被感染的细菌细胞作为感染循环后代的进一步的感染源；以及
d.或者监测噬菌体颗粒的群体和/或者监测在步骤 c中所述第二细菌减缓的生长，以确定在该测试样品中所述第一细菌细胞的存在。
3.权利要求1中要求保护的方法，其特征在于，它提供一种方法，该方法通过评价噬菌体在细菌细胞中的复制能力等，评估病毒调节剂组合物或杀病毒组合物对噬菌体颗粒的效力，该方法包含用该组合物处理噬菌体颗粒的步骤和以下步骤：
a.用这些处理的噬菌体颗粒感染允许该活噬菌体的第一细菌；
b.灭活对被感染的第一细菌细胞为外源的噬菌体颗粒；
c.在一种第二细菌存在下培养该灭活的细胞，第二细菌的倍增速率大于第一细菌的有效倍增速率；以及
d.评价噬菌斑形成的程度和/或在培养的第二细菌细胞中的第二细菌生长的程度。
4.权利要求1中要求保护的方法，其特征在于它提供评价处理细菌的效果的方法，该方法包含：
i.将细菌暴露于该处理；然后
ii通过以下步骤评价保留在该细菌样品中的活细菌细胞数：
    a.用该细菌允许的噬菌体感染该处理的细菌样品；
    b.灭活该感染的样品中的外源噬菌体颗粒；
    c.在一种第二细菌存在下培养该灭活的样品，其中第二细菌
      的倍增速率大于第一细菌的有效倍增速率；以及
    d.评价噬菌斑形成的程度和/或第二细菌生长的程度。
5.权利要求1-4的任何一项中要求保护的方法，其特征在于第一细菌在37℃含90％v/v称为7H9的培养基和10％v/v称为OADC的营养物的培养基中的有效倍增速率大于10小时。
6.权利要求1-4的任何一项中要求保护的方法，其特征在于第二细菌的倍增速率至少为第一细菌的有效倍增速率两倍。
7.权利要求1-4的任何一项中要求保护的方法，其特征在于第二细菌的倍增速率比第一细菌的有效倍增速率大4-10倍。
8.权利要求7中要求保护的方法，其特征在于第一细菌是分支杆菌或军团杆菌。
9.权利要求8中要求保护的方法，其特征在于第一细菌是结核分支杆菌或鸟型结核分支杆菌。
10.权利要求8中要求保护的方法，其特征在于第二细菌是包皮垢分支杆菌或金分支杆菌。
11.权利要求1-4的任何一项中要求保护的方法，其特征在于第一细菌的有效倍增速率为2-10小时。
12.权利要求1-4的任何一项中要求保护的方法，其特征在于用这些噬菌体颗粒感染第一细菌是在至多55℃的温度进行10分钟至4小时。
13.权利要求1-4的任何一项中要求保护的方法，其特征在于噬菌体是AG1、B1、BG1、BK1、C3、D29、D34、D56A、GS4E、HP1、L1、I3或TM4。
14.权利要求1-4的任何一项中要求保护的方法，其特征在于第一细菌是结核分支杆菌或鸟型结核分支杆菌，第二细菌是包皮垢分支杆菌，噬菌体是D29或TM4。
15.权利要求1-4的任何一项中要求保护的方法，其特征在于步骤b中通过以下方法灭活外源噬菌体颗粒：
i.洗涤和过滤感染的细菌材料，以从该感染的第一细菌细胞中分离外源噬菌体颗粒；或
ii用杀病毒剂、酸或表面活性剂处理该感染的第一细菌材料，以杀死外源噬菌体颗粒或使外源噬菌体颗粒灭活；和/或
iii.将外源噬菌体颗粒从第一细菌材料优先吸收到一个从细菌细胞分离的基质上。
16.权利要求1-4的任何一项中要求保护的方法，其特征在于在步骤 c中提供最初量的第二细菌，以便在待培养的感染的第一细菌和第二细菌的混合物中提供的第二细菌为第一细菌细胞数目的2-50倍。
17.权利要求1-4的任何一项中要求保护的方法，其特征在于将该方法的培养步骤c大致进行至稳定状态，该状态下进一步的细菌细胞生长和裂解基本停止。
18.用于权利要求1-5的方法中的诊断试剂盒，其用于检测样品中第一细菌的存在或不存在，其特征在于该试剂盒包含：
i.用于第一细菌的已知噬菌体感染源；
ii一种活的第二细菌源，第二细菌的倍增速率大于第一细菌的倍增速率，并且它对将从被所述噬菌体感染的第一细菌中释放的噬菌体颗粒是允许的。
19.权利要求18中要求保护的诊断试剂盒，其特征在于它也包含用于灭活和/或除去被所述噬菌体感染源感染的第一细菌中的外源噬菌体颗粒的工具。
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