RU2374643C2 - Способ оценки свежести рыбного продукта - Google Patents
Способ оценки свежести рыбного продукта Download PDFInfo
- Publication number
- RU2374643C2 RU2374643C2 RU2006132248/13A RU2006132248A RU2374643C2 RU 2374643 C2 RU2374643 C2 RU 2374643C2 RU 2006132248/13 A RU2006132248/13 A RU 2006132248/13A RU 2006132248 A RU2006132248 A RU 2006132248A RU 2374643 C2 RU2374643 C2 RU 2374643C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- fluorescence
- sample
- freshness
- dye
- cell
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 41
- 235000013332 fish product Nutrition 0.000 title claims abstract description 23
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 title description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 36
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 13
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 238000004040 coloring Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 7
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims description 43
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 claims description 28
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 claims description 14
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 claims description 14
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 claims description 13
- BQRGNLJZBFXNCZ-UHFFFAOYSA-N calcein am Chemical group O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(C)=O)=C(OC(C)=O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(=O)C)C(OC(C)=O)=C1 BQRGNLJZBFXNCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 239000012128 staining reagent Substances 0.000 claims description 12
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 claims description 11
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 11
- 230000035515 penetration Effects 0.000 claims description 8
- 241000269908 Platichthys flesus Species 0.000 claims description 6
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 5
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 3
- GRRMZXFOOGQMFA-UHFFFAOYSA-J YoYo-1 Chemical compound [I-].[I-].[I-].[I-].C12=CC=CC=C2C(C=C2N(C3=CC=CC=C3O2)C)=CC=[N+]1CCC[N+](C)(C)CCC[N+](C)(C)CCC[N+](C1=CC=CC=C11)=CC=C1C=C1N(C)C2=CC=CC=C2O1 GRRMZXFOOGQMFA-UHFFFAOYSA-J 0.000 claims description 2
- 239000003086 colorant Substances 0.000 claims description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 2
- 241001327682 Oncorhynchus mykiss irideus Species 0.000 claims 1
- 241000269980 Pleuronectidae Species 0.000 claims 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 abstract description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract 4
- 238000013329 compounding Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 57
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 11
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 description 10
- 241000277275 Oncorhynchus mykiss Species 0.000 description 9
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 8
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 6
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 6
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 241000028631 Microstomus pacificus Species 0.000 description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 3
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 3
- XIAYFENBYCWHGY-UHFFFAOYSA-N 2-[2,7-bis[[bis(carboxymethyl)amino]methyl]-3-hydroxy-6-oxoxanthen-9-yl]benzoic acid Chemical compound C=12C=C(CN(CC(O)=O)CC(O)=O)C(=O)C=C2OC=2C=C(O)C(CN(CC(O)=O)CC(=O)O)=CC=2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O XIAYFENBYCWHGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 2
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- 231100000747 viability assay Toxicity 0.000 description 2
- 238000003026 viability measurement method Methods 0.000 description 2
- DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N (R)-(-)-Propylene glycol Chemical compound C[C@@H](O)CO DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 208000034309 Bacterial disease carrier Diseases 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000276438 Gadus morhua Species 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920004142 LEXAN™ Polymers 0.000 description 1
- 239000004418 Lexan Substances 0.000 description 1
- 241000387436 Mystus vittatus Species 0.000 description 1
- 241000269913 Pseudopleuronectes americanus Species 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N acrylic acid group Chemical group C(C=C)(=O)O NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008953 bacterial degradation Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005553 drilling Methods 0.000 description 1
- GTSMOYLSFUBTMV-UHFFFAOYSA-N ethidium homodimer Chemical compound [H+].[H+].[Cl-].[Cl-].[Cl-].[Cl-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2C(C)=[N+]1CCCNCCNCCC[N+](C1=CC(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C=C11)=C1C1=CC=CC=C1 GTSMOYLSFUBTMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002795 fluorescence method Methods 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000005558 fluorometry Methods 0.000 description 1
- 239000001046 green dye Substances 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000008935 nutritious Nutrition 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003973 paint Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 239000004431 polycarbonate resin Substances 0.000 description 1
- 229920005668 polycarbonate resin Polymers 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 125000003831 tetrazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229960001814 trypan blue Drugs 0.000 description 1
- 231100000164 trypan blue assay Toxicity 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/02—Food
- G01N33/12—Meat; Fish
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/22—Testing for sterility conditions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2334/00—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Meat, Egg Or Seafood Products (AREA)
- General Preparation And Processing Of Foods (AREA)
Abstract
Изобретение относится к пищевой промышленности и может быть использовано для определения качества рыбопродуктов. Способ включает вырезание небольшого количества образца из рыбного продукта. Затем к образцу прибавляют окрашивающий реагент, включающий проникающий в клетку краситель и не проникающий в клетку флуоресцентный краситель. Проникающий в клетку краситель превращается в соединение, эмитирующее первую флуоресценцию в присутствии внутриклеточной эстеразной активности. Не проникающий флуоресцентный краситель может проникать в клетку через нарушенные клеточные мембраны и эмитировать вторую флуоресценцию. Первая и вторая флуоресценция отличаются друг от друга. Определяют свежесть рыбного продукта на основании, по меньшей мере, одного параметра, выбранного из группы, состоящей из интенсивности первой флуоресценции, эмитируемой инкубируемым образцом, интенсивности второй флуоресценции, эмитируемой инкубируемым образцом, первого расстояния от верхнего конца образца до самой дальней точки образца, в которой детектируется первая флуоресценция; второго расстояния от верхнего конца образца до самой дальней точки образца, в которой детектируется вторая флуоресценция. Изобретение позволяет точно и объективно оценить свежесть рыбных продуктов. 3 н. и 26 з.п. ф-лы, 2 табл., 12 ил.
Description
Родственные заявки
Данная патентная заявка претендует на приоритет временной заявки №60/552778, поданной 12 марта 2004 г. и временной заявки №60/553059, поданной 15 марта 2004 г., которые целиком включены сюда в качестве ссылок.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Область техники
Настоящее изобретение относится к обнаружению и оценке свежести, или степени деградации, или порчи продукта на белковой основе, как показателя уровня качества продукта на белковой основе.
Описание известного уровня техники
Традиционные способы оценки свежести или степени порчи рыбы включают сенсорную оценку (внешний вид, проба на ощупь и запах). Этот способ является субъективным и спорным.
Патент США №5744321 раскрывает колориметрический способ быстрой оценки степени бактериальной деградации рыбы, такой как треска, полосатая зубатка и зимняя камбала, путем смешивания рыбного мяса с питательным бактериальным бульоном и проведения реакции экстракта с водорастворимым хромогеном, таким как ионизированная соль тетразолиевого красителя, который вступает в восстановительную реакцию с бактериями рыбы с образованием водонерастворимого формазанового красителя или окрашенного продукта реакции. Затем прибавляют поверхностно-активный агент для облегчения солюбилизации образовавшегося формазанового красителя, проводят лизис, и останавливают реакции, и прибавляют растворитель типа алифатического спирта для растворения образовавшегося формазанового красителя или окрашенного продукта реакции и предотвращения дальнейшего разрушения и потемнения со временем. Растворенный продукт реакции имеет окраску, интенсивность которой зависит от бактериальной популяции образца рыбы, и которая может быть оценена колориметрически путем визуального сравнения со стандартной цветовой шкалой, указывающей низкую, среднюю и высокую бактериальную обсемененность. Этот способ является усложненным, потому что включает использование ряда стадий и реагентов.
Таким образом, существует потребность в создании точного, удобного и объективного способа оценки свежести рыбных продуктов для поставщиков рыбы, ресторанов, компаний, оказывающих представительские услуги, и продовольственных предприятий и т.д.
Суть изобретения
Настоящее изобретение предусматривает способ оценки свежести рыбного продукта, включающий:
вырезание небольшого количества образца из рыбного продукта;
прибавление к образцу эффективного количества окрашивающего реагента, включающего, по меньшей мере, один из проникающего в клетку красителя и не проникающего в клетку флуоресцентного красителя;
инкубирование образца с добавленным окрашивающим реагентом в течение предварительно определенного периода времени;
определение свежести рыбного продукта на основании, по меньшей мере, одного из следующих параметров: интенсивность первой флуоресценции, эмитируемой инкубируемым образцом, интенсивность второй флуоресценции, эмитируемой инкубируемым образцом, первое расстояние от верхнего конца образца до самой дальней точки образца, в которой детектируется первая флуоресценция, и второе расстояние от верхнего конца образца до самой дальней точки образца, в которой детектируется вторая флуоресценция.
В присутствии внутриклеточной эстеразной активности проникающий в клетку краситель превращается в соединение, эмитирующее первую флуоресценцию. Не проникающий в клетку флуоресцентный краситель не проникает через интактные мембраны живых клеток, но может проникать в нарушенные мембраны клеток и эмитировать вторую флуоресценцию. Если окрашивающий реагент включает как проникающий в клетку краситель, так и не проникающий в клетку краситель, то первая флуоресценция должна отличаться от второй флуоресценции, т.е. они должны эмитировать разные цвета флуоресценции. Примеры проникающих в клетку красителей включают кальцеин AM и С12-резазурин. Примеры не проникающих в клетку красителей включают гомодимер EthD-1, краситель Sytox® Green и краситель YoYo-1.
Кроме того, проникающий в клетку краситель, такой как кальцеин AM и С12-резазурин, может быть использован в комбинации с красителем трипановым синим. Окрашивание красителем трипановым синим зависит от потери целостности мембранами мертвых клеток. Краситель трипановый синий нормально не проходит через интактные клеточные мембраны. В общем, мертвые клетки становятся проницаемыми для красителя трипанового синего. Таким образом, краситель трипановый синий может гасить флуоресценцию мертвых клеток в сочетании с проникающим в клетку красителем. Снижение флуоресценции после прибавления трипанового синего может быть мерой числа мертвых клеток.
В соответствии с одним вариантом исполнения настоящего изобретения стадия определения может быть проведена путем сравнения, по меньшей мере, одного параметра с предварительно установленной корреляционной зависимостью между свежестью и, по меньшей мере, одним параметром.
Интенсивности первой флуоресценции и второй флуоресценции могут быть количественно определены с помощью цифрового устройства, и предварительно установленная корреляция может быть определена на основании количественно определенной интенсивности первой флуоресценции и второй флуоресценции.
В соответствии с другим вариантом исполнения настоящего изобретения первая флуоресценция и вторая флуоресценция могут быть зарегистрированы в виде изображения с помощью оптического устройства, и предварительно установленная корреляция между свежестью и интенсивностью, по меньшей мере, одной из первой флуоресценции и второй флуоресценции может быть представлена в виде стандартной цветовой шкалы.
Предпочтительно, окрашивающий реагент включает эффективное количество кальцеина AM и эффективное количество гомодимера EthD-1. Свежесть первого продукта может быть затем определена на основании красной (гомодимер EthD-1) флуоресценции и зеленой (кальцеин) флуоресценции, эмитируемой образецом.
В соответствии с еще одним вариантом исполнения настоящего изобретения не проникающий в клетку флуоресцентный краситель, входящий в состав окрашивающего реагента, является красителем трипановым синим. Свежесть первого продукта может быть затем определена на основании синей окраски, появляющейся в образце. Предпочтительно, свежесть определяют по величине расстояния, на которое краситель трипановый синий проникает в образец, причем более свежая рыба соответствует меньшей глубине проникания.
Другие цели и признаки настоящего изобретения будут понятны из приведенного далее детального описания, рассматриваемого в сочетании с прилагаемыми чертежами.
Следует понимать однако, что чертежи предназначены только для иллюстрации, а не для установления объема изобретения, который определяется прилагаемой формулой изобретения. Следует также понимать, что чертежи не обязательно выполнены в масштабе и что, если не указано иное, они предназначены только для концептуальной иллюстрации описанных тут конструкций и процедур.
Краткое описание чертежей
На чертежах:
Фиг.1 отображает трубку, используемую в примере.
Фиг.2 показывает флуоресцентные изображения образцов лосося, хранящихся при 1°С и отобранных в разные дни хранения, полученные с помощью флуоресцентного анализа Live/Dead (живые/мертвые).
Фиг.3 показывает флуоресцентные изображения образцов лосося, хранящихся при 1°С и отобранных в дни хранения 1 и 8 с помощью флуоресцентного анализа Live/Dead.
Фиг.4 показывает корреляцию свежести образцов лосося и соотношения расстояния от верхнего конца образца до самой дальней точки образца, в которой наблюдается зеленая флуоресценция, и расстояния от верхнего конца образца до самой дальней точки образца, в которой наблюдается красная флуоресценция.
Фиг.5 показывает флуоресцентные изображения образца, взятого у живой радужной форели.
Фиг.6 показывает флуоресцентные изображения образца, взятого у рыбного продукта на основе радужной форели, хранящегося при 4°С в течение семи дней.
Фиг.7 иллюстрирует корреляцию между свежестью образца радужной форели и соотношением расстояния от верхнего конца образца до самой дальней точки образца, в которой наблюдается зеленая флуоресценция, и расстояния от верхнего конца образца до самой дальней точки образца, в которой наблюдается красная флуоресценция.
Фиг.8 отображает корреляцию между свежестью образца дуврской камбалы и соотношением расстояния от верхнего конца образца до самой дальней точки образца, в которой наблюдается зеленая флуоресценция, и расстояния от верхнего конца образца до самой дальней точки образца, в которой наблюдается красная флуоресценция.
Фиг.9 показывает изображения, полученные через определенные промежутки времени на протяжении 16 минут после прибавления красителей, для образца дуврской камбалы, хранящегося при 1°С в течение пяти дней, с помощью флуоресцентного анализа Live/Dead.
Фиг.10 показывает флуоресцентные изображения образцов лосося, хранящихся при 1°С и отобранных в дни хранения 1 и 5.
Фиг.11 иллюстрирует глубину проникновения окрашивающего красителя трипанового синего в образцы лосося, хранящиеся при 1°С и отбираемые в дни хранения 1, 4 и 7, с помощью анализа с трипановым синим.
Фиг.12 иллюстрирует расстояние, на которое краситель трипановый синий проникает в образцы лосося, хранящиеся при температуре 1°С, взятые в дни хранения с 1 по 8.
Детальное описание предпочтительных в настоящее время вариантов исполнения
Экспериментальные материалы и процедуры
Филе лосося
Две упаковки замороженного филе лосося в хорошем состоянии разделяли на 8 порций. Каждая порция составляет примерно 60 грамм в замороженном состоянии. Четыре порции помещают в холодильную камеру с постоянной температурой 1°С (±0,5°С), а другие четыре порции помещают в стандартный лабораторный холодильник, поддерживающий температуру 4°С. Все эти порции хранят в повторно запечатываемом пакете для предотвращения окисления и обезвоживания в периоды между отбором проб.
Способы отбора проб
Образцы филе лосося отбирают ежедневно и наблюдают изменения. Для точных измерений важно обеспечить постоянство размеров образцов. Был изготовлен инструмент для отбора проб, предназначенный для высверливания образца из рыбы. Инструмент, используемый в экспериментах, представлял собой прозрачную трубку из материала Lexan® (поликарбонатная смола), имеющую наружный диаметр 4,8 мм, внутренний диаметр 2,1 мм и длину 90 мм. Один конец трубки был срезан на конус для образования режущей поверхности (см. Фиг.1). При введении в мякоть рыбного продукта часть мяса вдавливается в донное отверстие трубки. Затем путем осторожного поворачивания и вытягивания вынимается образец, который остается в трубке. Аппликатор с наружным диаметром 2 мм может быть использован для осторожного уплотнения образца и удаления воздушных зазоров. Трубка предпочтительно выполнена безвредной для пищевых продуктов и является оптически прозрачной. Могут быть пригодными также другие акриловые или поликарбонатные материалы. Полученный таким способом с помощью такого инструмента образец имеет размер примерно 2,1 мм ×~5-25 мм.
Такой способ отбора проб имеет несколько преимуществ, включая:
- малый, воспроизводимый размер образца;
- стандартный размер образца;
- четкая маркировка контейнера;
- недорогой, одноразовый, нетоксичный инструмент;
- небьющийся;
- образец виден через трубку.
Окрашивание, инкубирование
Небольшой объем окрашивающего раствора может быть введен в верхнее отверстие трубки для инкубирования в течение требуемого периода времени, например примерно 10 минут. Типично, объем окрашивающего раствора может изменяться от 1 мкл до 1 мл. Время инкубирования может меняться от 1 минуты до 1 часа.
Окрашивающий раствор может быть раствором, содержащим кальцеин AM и гомодимер этидия, например раствором, приготовленным из набора LIVE/DEAD для определения жизнеспособности/цитотоксичности фирмы Molecular Probes (L3224). Набор L3224 включает две пробы: кальцеин AM и гомодимер этидия-1. Кальцеин AM представляет собой флуорогенный субстрат эстеразы, который гидролизуется до продукта с зеленой флуоресценцией (кальцеин). Таким образом, зеленая флуоресценция является индикатором клеток, обладающих эстеразной активностью, а также имеющих интактную мембрану для удерживания эстеразных продуктов. Зеленая флуоресценция означает, что они являются живыми на основании некоторого уровня эстеразной активности. Гомодимер этидия-1 представляет собой высокоаффинный краситель для нуклеиновых кислот с красной флуоресценцией, который может проходить только через нарушенные мембраны мертвых клеток. Если клетки красные, это означает, что они "мертвые". Концентрация кальцеина AM может составлять от 0,1 до 50 мкМ.
Концентрация гомодимера EthD-1 составляет от 0,1 до 100 мкМ.
Использование набора для анализа на определение жизнеспособности/цитотоксичности LIVE/DEAD обеспечивает несколько преимуществ:
- Простота. Реагенты одновременно прибавляются к образцу, который затем инкубируют в течение 3-10 минут во время оттаивания или сразу же после оттаивания. Стадии промывки перед анализом не требуются.
- Специфичность и надежность. Клетки с зеленой флуоресценцией являются живыми; клетки с красной флуоресценцией являются мертвыми.
- Универсальность. Анализ на определение жизнеспособности/цитотоксичности LIVE/DEAD является применимым для прилипающих клеток, таких как астроциты, неприлипающих клеток и определенных тканей. Результаты могут быть проанализированы методом флуоресцентной микроскопии с использованием стандартных наборов флуоресцеиновых барьерных фильтров (longpass filter), а также методами поточной цитометрии или флуорометрии. Флуоресцентная эмиссия двух зондов легко разделяется и различается. Одно- или многочастотные светодиоды (LED) могут быть использованы для получения света возбуждения в интервале длин волн 360-520 нм. Другие источники освещения включают: флуоресцентные лампы, лампы с газовой смесью, переносные источники УФ-излучения, проекционные лампы и лазеры.
- Простота количественных определений. Измерения индивидуальных клеток дают только две популяции; клетки с двойной окраской встречаются редко. Ткани могут иметь смешанные популяции с "промежуточными" стадиями окрашивания.
Окрашивающий раствор может также быть раствором трипанового синего. Трипановый синий используется как краситель для колориметрического метода определения жизнеспособности клеток. Концентрация раствора трипанового синего может составлять от 0,1 до 10 мМ. В биологических экспериментах с клетками трипановый синий является самым распространенным красителем, используемым для различения жизнеспособных клеток от нежизнеспособных. Только нежизнеспособные клетки поглощают краситель, приобретают синюю окраску и могут также иметь асимметричный вид. Наоборот, живые, здоровые клетки выглядят круглыми и преломляющими, не поглощая окрашенный в синий цвет краситель. Использование этого красителя, однако, требует учета фактора времени. Жизнеспособные клетки со временем поглощают трипановый синий, что может повлиять и на результаты подсчета и определения жизнеспособности. Для предотвращения поглощения красителя жизнеспособными клетками, которые после этого выглядят как нежизнеспособные, образец, окрашенный трипановым синим, может быть разбавлен. Например, окрашенные трипановым синим образцы могут быть зафиксированы погружением в 2% глутаральдегид в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4) и сохранены для дальнейших наблюдений. Для того чтобы уменьшить нежизнеспособную окраску, отбор проб предпочтительно проводят в течение 5-30 минут. Кроме того, трипановый синий имеет большее сродство к белкам сыворотки, чем к клеточным белкам. Для клеток в среде с высоким содержанием сыворотки фон может оказаться слишком темным. В этом случае клетки предпочтительно выделяют из ткани.
Визуализация и запись изображений
Могут быть получены изображения отраженной флуоресценции для документирования каких-либо изменений характера окрашивания в зависимости от времени хранения и температуры.
Для количественных определений и/или автоматизации процесса могут быть использованы формирователи изображения, имеющие функции захвата, хранения и/или анализа изображения, такие как устройства с ПЗС (CCD) или на КМОП-структурах (CMOS).
Такие устройства включают систему UVP BioDoclt с цифровой камерой; цифровую камеру Nikon CoolPix 995 с телеобъективом; фотомикроскоп Nikon Eclipse E800, оснащенный светлым полем, системой DIC (независимые от устройства цвета), фазовой и флуоресцентной оптикой; синие и зеленые излучающие светодиоды (LED) и систему детектирования на ПЗС (CCD).
В данных исследованиях образцы наблюдали с использованием 4× 0,13 объектива Plan Fluor с цифровой апертурой (n.a.). Цифровые изображения получали с помощью цветной ПЗС-камеры CoolCam с жидкостным охлаждением на трех микросхемах (three-chip) (Cool Camera Company, Decatur, GA 30033) и сохраняли на персональном компьютере Pentium IV 3,0 GHz с помощью прикладной программы Image Pro Plus version 4.5 (Media Cybernetics, Silver Springs, MD 20910). Цифровые изображения сохраняли для дальнейшей распечатки и анализа с использованием программ ImageJ или ImagePro Plus. Для воспроизведения использовались прикладные программы Adobe PhotoShop и Microsoft PowerPoint.
Цифровые изображения получали таким образом, чтобы для сравнения цвета окрашенных образцов как функции жизнеспособности или "свежести" клеток могли быть использованы количественные способы. Цвет окрашенных образцов и глубина проникновения краски в образец являются важными критериями оценки свежести образца.
Результаты
Флуоресцентный анализ Live/Dead
Окрашивающий раствор содержит 5,0 мкМ кальцеина AM и 10,0 мкМ гомодимера EthD-1. Он был приготовлен из реагентов набора для определения жизнеспособности/цитотоксичности LIVE/DEAD фирмы Molecular Probes (L3224). Примерно 10-30 мкл окрашивающего раствора помещали сверху на образцы (2,1 мм ×~2-10 мм). Свежесть образца может быть определена на основании соотношения изменений красной и зеленой флуоресцентной эмиссии после инкубации в течение примерно 5-10 минут. Флуоресцентное изображение получают путем возбуждения образца на длине волны 490±40 нм и регистрации на 525±20 нм.
Фиг.2 и 3 отображают результаты анализа образцов лосося, хранившихся в течение разного числа дней при одинаковой температуре (1°С). Изображение, представленное на Фиг.2, было получено через 5 минут после прибавления красителя. Зеленый цвет указывает на эстеразную активность (свежий образец). Красный цвет указывает на ядра клеток с нарушенными мембранами. Расстояние, которое краситель проходит от верхней части образца вглубь, зависит от числа дней хранения. Изображение, показанное на Фиг.3, было получено через 30 минут после окрашивания образцов.
В таблице ниже приведены сводные данные флуоресцентного метода определения свежести Live/Dead (5,0 мкМ кальцеина AM и 10,0 мкМ гомодимера-1 EthD-1) замороженного образца лосося, хранящегося при 1°С, при отборе проб с 24-часовыми интервалами. Фиг.4 отображает корреляцию между свежестью рыбного продукта и соотношением расстояний, пройденных зеленой и красной флуоресценцией.
| Таблица 1 Сводные данные флуоресцентнго анализа Live/Dead |
||||||||
| Отношение пройденного расстояния к общему расстоянию | День 1 | День 2 | День 3 | День 4 | День 5 | День 6 | День 7 | День 8 |
| Зеленый/Общее расстояние | 0,89 | 0,49 | 0,42 | 0,44 | 0,34 | 0,39 | 0,32 | 0,24 |
| Стандартное отклонение (SD) | 0,237 | |||||||
| между днями для отношения | ||||||||
| Зеленый/Общее расстояние | ||||||||
| Красный/Общее расстояние | 0,47 | 0,58 | 0,83 | 0,81 | 0,83 | 0,92 | 0,83 | 0,84 |
| Стандартное отклонение (SD) | 0,155 | |||||||
| между днями для отношения | ||||||||
| Красный/Общее расстояние | ||||||||
Фиг.5-8 отображают результаты флуоресцентного анализа для других видов рыбы, хранившихся различное число дней при одинаковой температуре. Фиг.5 показывает результаты флуоресценции для свежего образца радужной форели (Oncorhynchus mykiss). Фиг.6 показывает результаты флуоресценции для образца радужной форели, хранящегося при 4°С в течение семи дней. На Фиг.6 верхнее изображение показывает информацию о зеленой и красной окраске образцов; среднее изображение показывает полутоновое изображение информации о зеленой окраске; нижнее изображение представляет собой полутоновое изображение информации о красной окраске. Оба изображения на Фиг.5 и 6 были получены через 30 минут после прибавления красителя к образцу радужной форели. Краситель добавляли в верхнее отверстие трубки (левая сторона изображения).
Представленный на Фиг.7 график построен на основании результатов анализа образцов радужной форели, взятых от 3 рыб (всего 12 образцов), отбираемых ежедневно из рыбы, хранившейся 7 дней при 4°С. Образцы визуализировали через 30 минут после прибавления красителя. Этот график показывает среднее отношение расстояний, пройденных зеленой и красной флуоресценцией, для образцов, взятых в один день.
Фиг.8 отображает корреляцию свежести дуврской камбалы {Microstomus pacificus) и соотношения расстояний, пройденных зеленой и красной флуоресценцией. Процедура, использованная для Фиг.8, была такой же, как и для Фиг.7, за исключением того, что вместо образцов радужной форели в соответствии с Фиг.7 была взята дуврская камбала (Microstomus pacificus).
Изображения, полученные через определенные промежутки времени, как показано на Фиг.9, демонстрируют, что поглощение красителя изменяется со временем. Используемый образец представляет собой образец дуврской камбалы (Microstomus pacificus), хранившийся в течение 5 дней при 1°С.
Фиг.10 показывает флуоресцентные изображения образцов лосося, помещенных на чашки.
Измерения с трипановым синим
Примерно 10-30 мкл окрашивающего реагента трипанового синего (0,5 мас.%/об.) прибавляют сверху на образцы (2,1 мм ×2-10 мм). Измеряют глубину проникновения красителя трипанового синего в образец. Время инкубации составляет 10 минут. Образцы хранятся при 1°С и метятся при комнатной температуре. Для наблюдения образцов используется проходящий/отраженный свет.
Фиг.11 и 12 показывают корреляцию свежести образцов лосося с расстоянием, на которое краситель трипановый синий проникает в образец. Как показано на Фиг.12, соотношение глубины проникновения красителя к общей длине образца для Дня 1 является уникальным, значения для Дня 2, и Дня 3, и с Дня 4 по День 8 являются близкими. День 1 значительно отличается от остальных и День 2, и День 3 значительно отличаются от Дней 4-8.
В таблице ниже приведены сводные данные результатов анализа с трипановым синим.
| Таблица 2 Сводные данные результатов анализа с трипановым синим |
||||||||
| Окрашивание трипановым синим | День 1 | День 2 | День 3 | День 4 | День 5 | День 6 | День 7 | День 8 |
| Отношение (окрашенный участок/длина образца) | 0,985 | 1,078 | 1,105 | 1,492 | 1,453 | 1,606 | 1,509 | 1,557 |
| Стандартное отклонение для каждого дня | 0,084 | 0,107 | 0,112 | 0,294 | 0,296 | 0,484 | 0,316 | 0,377 |
| Стандартное отклонение для соотношения | 0,0245 | |||||||
| Доверительный интервал (95%) для всех | 0,307 | |||||||
| Доверительный интервал для каждого дня = отношение среднего значения за день ± 1.96·sqrt(0,0245)/sqrt(ni) | ||||||||
| ni | 119 | 106 | 110 | 117 | 143 | 182 | 128 | 170 |
| Доверительный интервал для каждого дня | Нижний | Верхний | ||||||
| День 1 | 0,957 | 1,013 | ||||||
| День 2 | 1,048 | 1,108 | ||||||
| День 3 | 1,076 | 1,134 | ||||||
| День 4 | 1,464 | 1,52 | ||||||
| День 5 | 1,427 | 1,479 | ||||||
| День 6 | 1,583 | 1,629 | ||||||
| День 7 | 1,482 | 1,536 | ||||||
| День 8 | 1,581 | 1,533 | ||||||
Изобретение не ограничено описанными выше вариантами исполнения, представленными только в виде примеров, но может быть модифицировано различными способами в пределах объема защиты, определяемого прилагаемой формулой изобретения.
Claims (29)
1. Способ оценки свежести рыбного продукта, включающий: вырезание небольшого количества образца из рыбного продукта; прибавление к образцу эффективного количества окрашивающего реагента, включающего по меньшей мере один из проникающего в клетку красителя и непроникающего в клетку флуоресцентного красителя, где проникающий в клетку краситель превращается в соединение, эмитирующее первую флуоресценцию в присутствии внутриклеточной эстеразной активности; непроникающий флуоресцентный краситель может проникать в клетку через нарушенные клеточные мембраны и эмитировать вторую флуоресценцию; и первая флуоресценция и вторая флуоресценция отличаются друг от друга, если индикаторный реагент включает как проникающий в клетку краситель, так и непроникающий в клетку краситель; инкубирование образца с добавленным окрашивающим реагентом в течение предварительно определенного периода времени и определение свежести рыбного продукта на основании по меньшей мере одного параметра, выбранного из группы, состоящей из интенсивности первой флуоресценции, эмитируемой инкубируемым образцом, интенсивности второй флуоресценции, эмитируемой инкубируемым образцом, первого расстояния от верхнего конца образца до самой дальней точки образца, в которой детектируется первая флуоресценция; второго расстояния от верхнего конца образца до самой дальней точки образца, в которой детектируется вторая флуоресценция.
2. Способ по п.1, в котором стадию определения проводят путем сравнения по меньшей мере одного параметра с предварительно установленной корреляционной зависимостью между свежестью и по меньшей мере одним параметром.
3. Способ по п.1, в котором интенсивности первой флуоресценции и второй флуоресценции количественно определяют с помощью цифрового устройства, и предварительно установленную корреляционную зависимость устанавливают на основании количественно определенных интенсивностей первой флуоресценции и второй флуоресценции.
4. Способ по п.3, в котором интенсивности первой флуоресценции и второй флуоресценции регистрируют в виде изображения оптическим устройством, и предварительно установленная корреляционная зависимость между свежестью и интенсивностью по меньшей мере одной из первой флуоресценции и второй флуоресценции представлена в виде стандартной цветовой шкалы.
5. Способ по п.1, в котором окрашивающий реагент включает как проникающий в клетку краситель, так и непроникающий в клетку краситель.
6. Способ по п.5, в котором определение свежести рыбного продукта осуществляется на основании соотношения интенсивностей первой флуоресценции и второй флуоресценции.
7. Способ по п.5, в котором определение свежести рыбного продукта осуществляется на основании соотношения первого расстояния и второго расстояния.
8. Способ по п.5, в котором проникающий в клетку краситель является кальцеином AM, а непроникающий в клетку краситель является гомодимером EthD-1, причем первая флуоресценция является зеленой, а вторая флуоресценция является красной.
9. Способ по п.5, в котором проникающий в клетку краситель является С12-резазурином, а непроникающий в клетку краситель является красителем Sytox® Green, причем первая флуоресценция является красной, а вторая флуоресценция является зеленой.
10. Способ по п.1, в котором проникающий в клетку краситель выбирают из группы, состоящей из кальцеина AM и С12-резазурина, а непроникающий в клетку краситель выбирают из группы, состоящей из гомодимера EthD-1, красителей YoYo-1 и Sytox® Green.
11. Способ по п.1, в котором окрашивающий реагент дополнительно включает краситель трипановый синий, если окрашивающий реагент включает проникающий в клетку краситель.
12. Способ оценки свежести рыбного продукта, включающий: вырезание небольшого количества образца из рыбного продукта; прибавление к образцу окрашивающего реагента, включающего эффективное количество кальцеина AM и эффективное количество гомодимера EthD-1; инкубирование образца с добавленным окрашивающим реагентом в течение предварительно определенного периода времени; определение свежести рыбного продукта на основании по меньшей мере одного параметра из интенсивности зеленой флуоресценции и первого расстояния от верхнего края инкубируемого образца до самой дальней точки инкубируемого образца, в которой детектируется зеленая флуоресценция, и по меньшей мере одного параметра из интенсивности красной флуоресценции и второго расстояния от верхнего края инкубируемого образца до самой дальней точки инкубируемого образца, в которой наблюдается красная флуоресценция.
13. Способ по п.12, в котором определение свежести осуществляют на основании соотношения интенсивностей зеленой флуоресценции и красной флуоресценции.
14. Способ по п.12, в котором определение свежести осуществляют на основании соотношения первого расстояния и второго расстояния.
15. Способ по п.12, в котором определение свежести проводят путем сравнения интенсивности зеленой флуоресценции и красной флуоресценции с предварительно установленной корреляционной зависимостью между свежестью и интенсивностью зеленой флуоресценции и красной флуоресценции.
16. Способ по п.15, в котором интенсивности зеленой флуоресценции и красной флуоресценции количественно определяют с помощью цифрового устройства, и предварительно установленную корреляционную зависимость определяют на основании количественно определенной интенсивности зеленой флуоресценции и красной флуоресценции.
17. Способ по п.15, в котором интенсивности зеленой флуоресценции и красной флуоресценции регистрируют в виде изображения с помощью оптического устройства, и предварительно установленная корреляционная зависимость между свежестью и интенсивностью зеленой флуоресценции и красной флуоресценции представлена в виде стандартной цветовой шкалы.
18. Способ по п.12, в котором окрашивающий реагент включает 0,1-50 мкМ кальцеина AM.
19. Способ по п.12, в котором окрашивающий реагент включает 0,1-100 мкМ гомодимера EthD-1.
20. Способ по п.12, в котором количество окрашивающего реагента составляет от примерно 1 мкл до 1 мл.
21. Способ по п.12, в котором предварительно определенная продолжительность стадии инкубирования составляет от примерно 1 до 45 мин.
22. Способ по п.12, в котором предварительно определенная продолжительность стадии инкубирования составляет от примерно 5 до 10 мин, и стадия инкубирования проводится при комнатной температуре.
23. Способ по п.12, в котором рыбный продукт выбирают из группы, состоящей из лосося, радужной форели, дуврской камбалы и палтуса.
24. Способ оценки свежести рыбного продукта, включающий: вырезание небольшого количества образца из рыбного продукта; прибавление к образцу окрашивающего реагента, включающего эффективное количество красителя трипанового синего; инкубирование образца с добавленным окрашивающим реагентом в течение предварительно определенного периода времени; определение свежести рыбного продукта на основании глубины проникания от верхнего края инкубируемого образца до самой дальней точки инкубируемого образца, в которой детектируется синяя флуоресценция.
25. Способ по п.24, в котором определение свежести проводят путем сравнения глубины проникания с предварительно установленной корреляционной зависимостью между свежестью и глубиной проникания.
26. Способ по п.24, в котором окрашивающий реагент включает 0,1-10 мМ красителя трипанового синего.
27. Способ по п.24, в котором количество окрашивающего агента составляет от 1 мкл до 1 мл.
28. Способ по п.24, в котором предварительно определенная продолжительность стадии инкубирования составляет от примерно 2 до 45 мин.
29. Способ по п.24, в котором предварительно определенная продолжительность стадии инкубирования составляет примерно 10-30 мин, и инкубирование проводится при комнатной температуре.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US55277804P | 2004-03-12 | 2004-03-12 | |
| US60/552,778 | 2004-03-12 | ||
| US55305904P | 2004-03-15 | 2004-03-15 | |
| US60/553,059 | 2004-03-15 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2006132248A RU2006132248A (ru) | 2008-04-20 |
| RU2374643C2 true RU2374643C2 (ru) | 2009-11-27 |
Family
ID=34994220
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2006132248/13A RU2374643C2 (ru) | 2004-03-12 | 2005-03-11 | Способ оценки свежести рыбного продукта |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7348180B2 (ru) |
| EP (1) | EP1751541B1 (ru) |
| JP (1) | JP4913722B2 (ru) |
| AT (1) | ATE451615T1 (ru) |
| CA (1) | CA2559181C (ru) |
| DE (1) | DE602005018195D1 (ru) |
| ES (1) | ES2336124T3 (ru) |
| IL (1) | IL177996A (ru) |
| MX (1) | MXPA06010349A (ru) |
| NO (1) | NO20064100L (ru) |
| RU (1) | RU2374643C2 (ru) |
| WO (1) | WO2005089254A2 (ru) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2482415B1 (es) * | 2012-10-04 | 2015-05-11 | Universitat De València | Procedimiento y sistema para determinar la frescura del pescado basado en el procedimiento de imágenes oculares, y programa de ordenador que implementa el procedimiento |
| CN103743662B (zh) * | 2014-01-02 | 2016-03-30 | 浙江海洋学院 | 一种鱼类鲜度测定装置 |
| US9341608B2 (en) * | 2014-04-14 | 2016-05-17 | Frank Fish | Method for determining expected shelf life of seafood |
| WO2017056830A1 (ja) * | 2015-10-02 | 2017-04-06 | シャープ株式会社 | 蛍光検出装置 |
| CN107525780A (zh) * | 2017-07-26 | 2017-12-29 | 成都九维云联科技有限公司 | 基于光谱技术的物品腐败程度检测系统 |
| CN107247026A (zh) * | 2017-07-26 | 2017-10-13 | 成都九维云联科技有限公司 | 一种易腐食品的预判方法 |
| CN109142495B (zh) * | 2018-08-13 | 2023-08-08 | 江南大学 | 一种基于骨架蛋白的降解评价鱼肉新鲜度的方法 |
| RU2714044C1 (ru) * | 2019-02-18 | 2020-02-11 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины ФГБОУ ВО СПбГАВМ | Метод изготовления микропрепаратов |
| CN109959765B (zh) * | 2019-04-01 | 2021-06-01 | 中国农业大学 | 三文鱼新鲜度检测系统及方法 |
| CN110501333A (zh) * | 2019-07-16 | 2019-11-26 | 江苏大学 | 一种冰鲜牛肉储藏天数的预测方法 |
| CN111077125B (zh) * | 2019-12-30 | 2022-06-07 | 渤海大学 | 一种具有双重指示信号判断美国红鱼新鲜度的指示卡 |
| JP2021139894A (ja) | 2020-03-05 | 2021-09-16 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | 食用動物の鮮度・熟成度評価装置、及び、鮮度・熟成度評価方法 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4309185A (en) * | 1979-02-12 | 1982-01-05 | Ralston Purina Company | Chemical analysis for quality determination of tuna |
| US5314805A (en) * | 1991-10-28 | 1994-05-24 | Molecular Probes, Inc. | Dual-fluorescence cell viability assay using ethidium homodimer and calcein AM |
| US5534416A (en) * | 1993-04-13 | 1996-07-09 | Molecular Probes, Inc. | Fluorescent viability assay using cyclic-substituted unsymmetrical cyanine dyes |
| US5744321A (en) * | 1997-02-21 | 1998-04-28 | Gem Biomedical, Inc. | Detection of fish spoilage by colorimetry |
| US6428980B1 (en) * | 1999-11-16 | 2002-08-06 | Rigel Pharmaceuticals, Inc. | Nucleic acids encoding RIP3 associated cell cycle proteins |
| US20040132166A1 (en) * | 2001-04-10 | 2004-07-08 | Bioprocessors Corp. | Determination and/or control of reactor environmental conditions |
| FR2833352B1 (fr) * | 2001-12-07 | 2004-06-18 | Adiv Ass | Procede et dispositif de mesure de la tendrete de la viande animale ou de la fraicheur du poisson |
| US6955872B2 (en) * | 2003-03-20 | 2005-10-18 | Coulter International Corp. | Dye compositions which provide enhanced differential fluorescence and light scatter characteristics |
-
2005
- 2005-03-11 CA CA2559181A patent/CA2559181C/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-03-11 US US11/078,040 patent/US7348180B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-03-11 MX MXPA06010349A patent/MXPA06010349A/es active IP Right Grant
- 2005-03-11 EP EP05725500A patent/EP1751541B1/en not_active Not-in-force
- 2005-03-11 AT AT05725500T patent/ATE451615T1/de not_active IP Right Cessation
- 2005-03-11 ES ES05725500T patent/ES2336124T3/es active Active
- 2005-03-11 RU RU2006132248/13A patent/RU2374643C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2005-03-11 WO PCT/US2005/008371 patent/WO2005089254A2/en active Application Filing
- 2005-03-11 DE DE602005018195T patent/DE602005018195D1/de active Active
- 2005-03-11 JP JP2007503094A patent/JP4913722B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2006
- 2006-09-11 IL IL177996A patent/IL177996A/en active IP Right Grant
- 2006-09-12 NO NO20064100A patent/NO20064100L/no not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IL177996A0 (en) | 2008-03-20 |
| ATE451615T1 (de) | 2009-12-15 |
| WO2005089254A3 (en) | 2007-05-10 |
| RU2006132248A (ru) | 2008-04-20 |
| CA2559181C (en) | 2010-01-26 |
| EP1751541A2 (en) | 2007-02-14 |
| JP4913722B2 (ja) | 2012-04-11 |
| ES2336124T3 (es) | 2010-04-08 |
| CA2559181A1 (en) | 2005-09-29 |
| US7348180B2 (en) | 2008-03-25 |
| DE602005018195D1 (de) | 2010-01-21 |
| EP1751541B1 (en) | 2009-12-09 |
| MXPA06010349A (es) | 2007-06-12 |
| WO2005089254A2 (en) | 2005-09-29 |
| JP2008500810A (ja) | 2008-01-17 |
| EP1751541A4 (en) | 2008-03-26 |
| IL177996A (en) | 2011-06-30 |
| US20050272157A1 (en) | 2005-12-08 |
| NO20064100L (no) | 2006-12-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2374643C2 (ru) | Способ оценки свежести рыбного продукта | |
| Dorsey et al. | Rapid analytical technique for the assessment of cell metabolic activity in marine microalgae | |
| US7947224B2 (en) | Device for calibrating a microorganism quantifying apparatus | |
| US20080220439A1 (en) | Microorganism detecting kit, microorganism counting apparatus, and microorganism counting process | |
| JP4118927B2 (ja) | 微生物計量装置の正常状態確認検査用検体 | |
| US20090325220A1 (en) | Methods and apparatus for sterility testing | |
| JP2006284604A5 (ru) | ||
| Marza et al. | Histochemistry of the ovary of Fundulus heteroclitus with special reference to the differentiating oocytes | |
| US5939282A (en) | Methods of assessing viability of microbial cultures | |
| CN104498583A (zh) | 对家养哺乳动物精子活力评价的荧光染色法 | |
| US20140349382A1 (en) | Assay of functional cell viability | |
| JP2979383B2 (ja) | 菌類の即時判別方法 | |
| Iturriaga et al. | Detection of respiratory enzyme activity in Giardia cysts and Cryptosporidium oocysts using redox dyes and immunofluoresce techniques | |
| US20040023319A1 (en) | Rapid enumeration of viable spores by flow cytometry | |
| Bayyari et al. | Research note: The evaluation of chicken spermatozoa using fluorescent staining in a 96-well format | |
| CN101084434A (zh) | 评价鱼产品的鲜度的方法 | |
| JP4118930B2 (ja) | 微生物計量方法 | |
| Navaluna et al. | The effect of chemical fixation on some optical properties of phytoplankton | |
| SU1329780A1 (ru) | Способ определени качества спермиев | |
| JP2000116396A (ja) | 微生物の染色方法と染色用組成物および染色用組成物の保存方法 | |
| Froundjian et al. | BIOLUMINESCENT ASSAY OF TOTAL BACTERIAL CONTAMINATION (TBC) IN FOOD SAMPLES AND DRINKING WATER USING FILTRAVETTE™ | |
| Burtscher et al. | Zooxanthellae Viability Assay | |
| Serrano Jr et al. | Rapid detection of Vibrio harveyi from water samples by dipslide | |
| JPH10136996A (ja) | 微生物の染色組成物、微生物の染色方法ならびに微生物の染色組成物の保存方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20110312 |