ES2336124T3 - Procedimiento para evaluar la frescura de un producto de pescado. - Google Patents

Procedimiento para evaluar la frescura de un producto de pescado. Download PDF

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Abstract

Procedimiento para evaluar la frescura de un producto de pescado, que comprende: cortar una cantidad pequeña de muestra del producto de pescado; añadir sobre la muestra una cantidad efectiva de un reactivo de tinción que comprende por lo menos un colorante que permea la célula y un colorante fluorescente que no permea la célula; en el que el colorante que permea la célula se convierte en un compuesto que emite una primera fluorescencia en presencia de actividad de esterasa intracelular; en el que el colorante fluorescente que no permea la célula puede penetrar en membranas comprometidas de células y emitir una segunda fluorescencia; y en el que la primera fluorescencia y la segunda fluorescencia pueden distinguirse entre sí cuando el reactivo indicador comprende tanto el colorante que permea la célula como el colorante que no permea la célula; incubar la muestra a la que se ha añadido el reactivo de tinción durante un periodo predeterminado; y determinar la frescura del producto de pescado basándose en por lo menos un parámetro seleccionado de entre el grupo constituido por: intensidad de la primera fluorescencia emitida a partir de la muestra incubada, la intensidad de una segunda fluorescencia emitida a partir de la muestra incubada, una primera distancia a partir de la parte superior de la muestra hasta el punto más distante en la muestra en el que se detecta la primera fluorescencia; una segunda distancia a partir de la parte superior de la muestra al punto más distante de la muestra en el que se detecta la segunda fluorescencia.

Description

Procedimiento para evaluar la frescura de un producto de pescado.
Solicitudes relacionadas
La presente solicitud de patente reivindica la prioridad de la solicitud provisional nº 60/552.778, presentada el 12 de marzo de 2004, y de la solicitud provisional nº 60/553.059, presentada el 15 de marzo de 2004.
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Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención
La presente invención se refiere a la detección y evaluación de la frescura o del grado de degradación o de deterioro de un producto basado en proteínas, a modo de indicación del grado de calidad del producto basado en proteínas.
2. Descripción de la técnica relacionada
Los documentos de la técnica anterior dan a conocer procedimientos de análisis de la viabilidad de muestras celulares o de muestras de tejido, que comprenden calceína-AM, homodímero de EtD-1 y/o azul tripán. Estos procedimientos ni enseñan ni sugieren la utilización de colorantes en la industria alimentaria. En particular, dichos procedimientos no se utilizan para evaluar la frescura de un producto de pescado. Los procedimientos de este tipo se dan a conocer en los documentos de la técnica anterior siguientes: patente US nº 5.534.416, nº 5.314.805; P.L. Moore et al., Journal of Cell Biology 5(2):58A, 1990, y J.R. Tennant, Transplantation United States 2:685-694, 1964.
Entre los procedimientos tradicionales para evaluar la frescura o grado de deterioro del pescado se incluyen la evaluación sensorial (apariencia, tacto y olor). Este procedimiento es subjetivo y debatible. La publicación de G. Olafsdttir et al., Trends in Food Science & Technology 8:258-265, 1997, da a conocer no sólo un procedimiento de este tipo, sino también procedimientos para evaluar la frescura del pescado que comprenden procedimientos microbiológicos, evaluaciones de compuestos volátiles, cambios en las proteínas musculares, etc. Sin embargo, dicho documento no contiene enseñanza de procedimientos que evalúen la frescura del pescado mediante la tinción de muestras de pescado utilizando colorantes.
La patente US nº 5.744.321 da a conocer un procedimiento colorimétrico para evaluar rápidamente el grado de degradación bacteriana de pescado, tal como bacalao, rape y lenguado de invierno, mediante la mezcla de músculo de pescado con un caldo nutritivo bacteriano, y haciendo reaccionar el extracto con un cromógeno soluble en agua, tal como una sal de colorante tetrazolio ionizado que experimenta una reacción de reducción con las bacterias del pescado, produciendo un colorante formazán insoluble en agua o producto de reacción coloreado. A continuación, se añade un agente activo en superficie para ayudar a solubilizar el colorante formazán formado, y para producir la lisis y detener la reacción, y se añade un solvente alcohol alifático para disolver el colorante formazán añadido o producto de reacción coloreado, y para impedir la degradación posterior y el oscurecimiento con el tiempo. El producto de reacción disuelto presenta un color que se intensifica dependiendo de la población bacteriana de la muestra de pescado y que puede evaluarse colorimétricamente mediante comparación visual con un gráfico de colores estándares indicativos de poblaciones bacterianas reducidas, intermedias o abundantes. Este procedimiento resulta complicado debido a que comprende bastantes etapas y reactivos.
Por lo tanto, todavía existe una necesidad de proporcionar un procedimiento exacto, conveniente y objetivo para evaluar la frescura de un producto de pescado para proveedores de pescado, restaurantes, compañías de restauración y de catering, etc.
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Sumario de la invención
La presente invención proporciona un procedimiento para evaluar la frescura de un producto de pescado, que comprende:
cortar una cantidad pequeña de muestra del producto de pescado,
añadir sobre la muestra una cantidad efectiva de un reactivo de tinción que comprende por lo menos un colorante que permea la célula y un colorante fluorescente que no permea la célula,
incubar la muestra a la que se ha añadido el reactivo de tinción durante un periodo predeterminado, y
determinar la frescura del producto de pescado basándose en por lo menos uno de los parámetros siguientes: intensidad de una primera fluorescencia emitida por la muestra incubada, la intensidad de una segunda fluorescencia emitida por la muestra incubada y una primera distancia entre la parte superior de la muestra y el punto más distante de la muestra en que se detecta la segunda fluorescencia.
En presencia de actividad esterasa intracelular, el colorante que permea la célula se convierte en un compuesto que emite la primera fluorescencia. El colorante fluorescente que no permea la célula no cruza membranas intactas de células vivas, aunque puede penetrar en membranas celulares comprometidas y emitir la segunda fluorescencia. En el caso de que el reactivo de tinción comprenda tanto colorante que permea la célula como colorante que no permea la célula, la primera fluorescencia debería poder distinguirse de la segunda fluorescencia, es decir, emiten diferentes colores fluorescentes. Entre los ejemplos del colorante que permea la célula se incluyen la calceína-AM y la resazurina-C12. Entre los ejemplos del colorante que no permea la célula se incluyen homodímero de EtD-1, colorante verde Sytox® y colorante YoYo-1.
Además, el colorante que permea la célula, tal como calceína-AM y resazurina-C12, puede utilizarse en combinación con colorante azul tripán. La tinción con colorante azul tripán depende de la pérdida de la integridad de la membrana en las células muertas. El colorante azul tripán normalmente resulta excluido por las membranas celulares intactas. En general, en el caso de que las células se encuentren muertas, son permeables al colorante azul tripán. De esta manera, el colorante azul tripán puede desactivar la fluorescencia de las células muertas conjuntamente con el colorante que permea las células. La reducción de fluorescencia tras la adición de azul tripán puede ser una medida de la proporción de células muertas.
Según una forma de realización de la presente invención, la etapa de determinación puede llevarse a cabo mediante la comparación de por lo menos un parámetro con una correlación preestablecida entre la frescura y por lo menos un parámetro.
Las intensidades de las primera y segunda fluorescencias pueden cuantificarse con un dispositivo digital, y la correlación preestablecida puede establecerse basándose en las intensidades cuantificadas de la primera fluorescencia y la segunda fluorescencia.
Según otra forma de realización de la presente invención, las primera y segunda fluorescencias pueden registrarse en una imagen con un dispositivo óptico, y la correlación preestablecida entre la frescura y la intensidad de por lo menos uno de entre la primera y la segunda fluorescencias puede ilustrarse en un gráfico de color estándar.
Preferentemente, el reactivo de tinción comprende una cantidad efectiva de calceína-AM y una cantidad efectiva de homodímero de EtD-1. La frescura del primer producto en este caso puede determinarse basándose en la fluorescencia roja (homodímero de EtD-1) y en la fluorescencia verde (calceína) emitida por la muestra.
Según todavía otra forma de realización de la presente invención, el colorante fluorescente que no permea las células, contenido en el reactivo de tinción es el colorante azul tripán. La frescura del primer producto en este caso puede determinarse basándose en el color azul que aparece en la muestra. Preferentemente, la frescura se determina basándose en la distancia a la que penetra el colorante azul tripán dentro de la muestra, en la que un pescado más fresco corresponde a una distancia de penetración más corta.
Otros objetivos y características se pondrán de manifiesto a partir de la descripción detallada siguiente, considerada haciendo referencia a los dibujos adjuntos. Sin embargo, debe entenderse que los dibujos se han proporcionado únicamente a título ilustrativo y no limitativo de la invención, para los cuales debe hacerse referencia a las reivindicaciones adjuntas. Debe entenderse también que los dibujos no se han dibujado necesariamente a escala y que, a menos que se indique lo contrario, pretenden únicamente ilustrar conceptualmente las estructuras y los procedimientos descritos en la presente memoria.
Breve descripción de los dibujos
En los dibujos:
la figura 1 representa el tubo de muestreo utilizado en el ejemplo.
La figura 2 representa las imágenes fluorescentes de muestras de salmón almacenadas a 1ºC y recogidas en diferentes días del almacenamiento, obtenidas mediante la utilización del ensayo fluorescente live/dead.
La figura 3 representa las imágenes fluorescentes de las muestras de salmón almacenadas a 1ºC y recogidas los días 1 y 8 de almacenamiento, obtenidas mediante la utilización del ensayo fluorescente live/dead.
La figura 4 ilustra la correlación entre la frescura de las muestras de salmón y la proporción entre la distancia desde la parte superior de la muestra hasta el punto más distante de la muestra en que se detecta fluorescencia verde y la distancia entre la parte superior de la muestra y el punto más distante de la muestra en que se detecta fluorescencia roja.
La figura 5 representa las imágenes fluorescentes de la muestra recogida de una trucha arcoiris viva.
La figura 6 representa las imágenes fluorescentes de una muestra recogida de un producto de pescado de trucha arco iris almacenado a 4ºC durante siete días.
La figura 7 ilustra la correlación entre la frescura de una muestra de trucha arco iris y la proporción entre la distancia entre la parte superior de la muestra y el punto más distante de la muestra en que se detecta fluorescencia verde y la distancia entre la parte superior de la muestra y el punto más distante de la muestra en que se detecta fluorescencia roja.
La figura 8 representa la correlación entre la frescura de una muestra de lenguado y la proporción entre la distancia entre la parte superior de la muestra y el punto más distante de la muestra en que se detecta fluorescencia verde y la distancia entre la parte superior de la muestra y el punto más distante de la muestra en que se detecta fluorescencia roja.
La figura 9 representa imágenes de lapsos temporales entre la adición del colorante y 16 minutos después, de una muestra de lenguado almacenada a 1ºC durante cinco días, obtenidas mediante la utilización del ensayo fluorescente vivo/muerto.
La figura 10 representa imágenes fluorescentes de muestras de salmón almacenadas a 1ºC y recogidas los días 1 y 5 de almacenamiento.
La figura 11 ilustra las profundidades de penetración del colorante de tinción azul tripán en muestras de salmón almacenadas a 1ºC y recogidas los días 1, 4 y 7 de almacenamiento, obtenidas mediante la utilización del ensayo de azul tripán.
La figura 12 ilustra la distancia a la que penetra el colorante azul tripán en muestras de salmón a 1ºC recogidas entre los días 1 y 8 de almacenamiento.
Descripción detallada Material y procedimiento experimentales Filete de salmón
Se cortaron en 8 porciones dos paquetes de filetes de salmón congelado en buenas condiciones. Cada porción era de aproximadamente 60 gramos en estado congelado. Se introdujeron cuatro porciones en una cámara frigorífica a una temperatura continua de 1ºC (\pm0,5ºC), y se introdujeron las otras cuatro porciones en un frigorífico de laboratorio estándar mantenido a 4ºC. La totalidad de dichas porciones se almacenaron en una bolsa resellable para evitar la oxidación y la deshidratación en los periodos entre muestreos.
Procedimientos de muestreo
Se recogieron diariamente muestras del filete de salmón y se observaron los cambios. Para realizar mediciones exactas, es importante que el tamaño de la muestra sea consistente. Se fabricó una herramienta para el muestreo que obtenía las muestras de pescado mediante perforación. La herramienta utilizada en los experimentos era un tubo transparente Lean® (resina de policarbonato) que presentaba 4,8 mm de diámetro exterior, 2,1 mm de diámetro interior y 90 mm de longitud. Un extremo del tubo se biseló para formar una superficie cortante (ver la fig. 1). Durante la inserción en el músculo de un producto de pescado, se empuja una parte del músculo hacia el interior de la abertura inferior del tubo. A continuación, mediante torsión y elevación suaves, se extrae una muestra, permaneciendo dentro del tubo. Puede utilizarse un aplicador de 2 mm de diámetro exterior para golpear suavemente la muestra y eliminar cualquier espacio de aire. El tubo preferentemente se diseña con cualidades alimentarias seguras y es ópticamente transparente. También pueden resultar adecuados otros materiales acrílicos o de policarbonato. De esta manera, la muestra obtenida con dicha herramienta presenta un tamaño de aproximadamente 2,1 mm x \sim5 a 25 mm.
Dicho muestreo proporciona varias ventajas, entre ellas:
\bullet
Tamaño de muestra pequeño y reproducible
\bullet
Tamaño de muestra estándar
\bullet
Recipiente de etiquetado pulcro
\bullet
Herramienta económica, desechable y no tóxica
\bullet
Irrompible
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Muestra visible a través del tubo
Tinción, incubación
Puede añadirse un volumen reducido de solución de tinción por la abertura superior del tubo e incubarse durante un periodo de tiempo apropiado, por ejemplo aproximadamente 10 minutos. Típicamente el volumen de la solución de tinción puede encontrarse comprendido entre 1 \mul y 1 ml. El tiempo de incubación puede encontrarse comprendido entre 1 minuto y 1 hora.
La solución de tinción puede ser una solución que contenga calceína-AM y homodímero de etidio, por ejemplo la solución preparada a partir del kit de viabilidad/citotoxicidad LIVE/DEAD de Molecular Probes (L3224). El kit L3224 comprende dos sondas: calceína-AM y homodímero de EtD-1. La calceína-AM es un sustrato de esterasa fluorogénica que se hidroliza formando un producto fluorescente verde (calceína). De esta manera, la fluorescencia verde es indicativa de que las células presentan actividad de esterasa, así como una membrana intacta para conservar los productos de la esterasa. La fluorescencia verde significa que se encuentran vivas, basándose en cierto nivel de actividad de esterasa. El homodímero de EtD-1 es una tinción de ácidos nucleicos fluorescente roja de alta afinidad que únicamente puede pasar a través de las membranas comprometidas de las células muertas. En el caso de que sean rojas, se encuentran "muertas". La concentración de calceína-AM puede encontrarse comprendida entre 0,1 y 50 \muM. La concentración de homodímero de EtD-1 se encuentra comprendida entre 0,1 y 100 \muM.
El ensayo de viabilidad/citotoxicidad LIVE/DEAD ofrece varias ventajas:
\bullet
Simplicidad. Los reactivos se añaden simultáneamente a la muestra, que se incuba a continuación durante 3 a 10 minutos durante o inmediatamente después de la descongelación. No resultan necesarias etapas de lavado antes del análisis.
\bullet
Especificidad y fiabilidad. Las células fluorescentes verdes se encuentran vivas; las células fluorescentes rojas se encuentran muertas.
\bullet
Versatilidad. El ensayo de viabilidad/citotoxicidad LIVE/DEAD es compatible con células adherentes, tales como astrocitos, con células no adherentes y con determinados tejidos.
\bullet
Los resultados pueden analizarse mediante microscopía de fluorescencia utilizando conjuntos de filtros de paso largo estándares, así como mediante citometría de flujo o fluorimetría. Las emisiones de fluorescencia de las dos sondas se resuelven fácilmente y son distinguibles. Pueden utilizarse LED de una o de múltiples longitudes de onda para proporcionar un intervalo de luz de excitación de 360 a 520 nm. Entre otras fuentes de iluminación se incluyen: bombillas fluorescentes, bombillas de gas mixtas, fuentes de UV manuales, lámparas de proyección y láseres.
\bullet
Cuantificación simple. Las mediciones de células individuales proporcionan únicamente dos poblaciones; raramente se observan células doblemente teñidas. Los tejidos pueden presentar poblaciones mixtas de tinción en las etapas "intermedias".
La solución de tinción también puede ser una solución de azul tripán. Se utiliza azul tripán como tinción colorimétrica para determinar la viabilidad celular. La concentración de la solución de azul tripán puede encontrarse comprendida entre 0,1 y 10 mM. En los experimentos de biología celular, el azul tripán es la tinción más común utilizada para distinguir las células viables de las no viables. Únicamente las células no viables absorben el colorante, presentan una apariencia azul y también pueden presentar una apariencia asimétrica. A la inversa, las células vivas sanas presentan una apariencia redonda y refractiva, no absorbiendo el colorante de color azul. Sin embargo, la utilización de este colorante es sensible al tiempo. Las células viables absorben azul tripán a lo largo del tiempo y puede afectar a los resultados de recuento y de viabilidad. Para impedir que las células viables absorban la tinción, y de esta manera presenten la apariencia de no viables, la muestra teñida con azul tripán puede diluirse. Por ejemplo, las muestras teñidas con azul tripán pueden fijarse mediante inmersión en glutaraldehído al 2% en tampón fosfato 0,1 M (pH 7,4) y almacenarse para su examen posterior. Para minimizar la absorción no viable, el muestreo preferentemente finaliza en 5 a 30 minutos. Además, el azul tripán presenta una afinidad mayor para las proteínas séricas que para las proteínas celulares. Para las células bajo condiciones de alto nivel en suero, el fondo puede resultar excesivamente oscuro. En este caso, las células preferentemente se aíslan del tejido.
Visionado y registro de imágenes
Pueden obtenerse imágenes de fluorescencia de reflexión para documentar cualquier cambio que se produzca en el patrón de tinción como resultado del tiempo de almacenamiento y la temperatura.
Para cuantificar y/o automatizar el procedimiento, pueden utilizarse dispositivos de obtención de imágenes que presenten funciones de captura, almacenamiento y/o análisis de imágenes, tales como los dispositivos CCD o CMOS.
Entre dichos dispositivos se incluyen un sistema UVP BioDoclt con cámara digital, una cámara digital Nikon CoolPix 995 con lente telescópica, un fotomicroscopio Nikon Eclipse E800 dotado de iluminación de campo brillante, DIC, y óptica de fases y fluorescencia, luces LED azules y verdes, y sistema de detección CCD.
En el presente estudio, las muestras se visionaron utilizando un objetivo 4X Plan Fluor 0,13 n.a. Las imágenes digitales se recogieron utilizando una cámara CoolCam CCD/color de tres chips enfriada con líquido (Cool Camera Company, Decatur, GA 30033) y se capturaron en un ordenador personal Pentium IV 3,0 GHz utilizando software Image Pro Plus versión 4.5 (Media Cybernetics, Silver Springs, MD 20910). Las imágenes digitales se almacenaron para su futura impresión y análisis utilizando ImageJ o ImagePro Plus. Para la presentación se utilizaron los programas Adobe PhotoShop y Microsoft PowerPoint.
Se recogieron imágenes digitales de manera que pudiesen derivarse procedimientos cuantitativos para comparar el color de la muestra teñida como función de la viabilidad celular o "frescura". El color de la muestra teñida y la profundidad de penetración de las tinciones en la muestra son criterios importantes para evaluar la frescura de la muestra.
Resultados Ensayo fluorescente Live/Dead
La solución de tinción contenía calceína-AM 5,0 \muM y homodímero de EtD-1 10,0 \muM. Se preparó a partir de los reactivos del kit de viabilidad/citotoxicidad LIVE/DEAD de Molecular Probes (L3224). Se añadieron aproximadamente 10 a 30 \mul de la solución de tinción sobre las muestras (2,1 mm x \sim2 a 10 mm). La frescura de la muestra puede determinarse basándose en la proporción entre los cambios de color rojo y verde en la emisión fluorescente tras la incubación durante aproximadamente 5 a 10 minutos. La imagen fluorescente se obtuvo mediante excitación de la muestra a una longitud de onda de 490 \pm 40 nm y se recogió a 525 \pm 20 nm.
Las figuras 2 a 3 muestran los resultados de ensayo de muestras de salmón almacenadas durante un número diferente de días a la misma temperatura (1ºC) La imagen representada en la figura 2 se obtuvo 5 minutos después de la adición de la tinción. El color verde indica actividad de esterasa (en fresco). El color rojo indica núcleos de células con membranas comprometidas. La distancia que recorre la tinción desde la parte superior a la inferior aparentemente se relacionada con el número de días de almacenamiento. La imagen representada en la figura 3 se obtuvo 30 minutos después de la tinción de las muestras.
La tabla siguiente muestra un sumario de los datos del ensayo Live/Dead fluorescente de frescura (calceína-AM 5,0 \muM y homodímero -1 de EtD-1 10,0 \muM) en una muestra de salmón congelada almacenada a 1ºC y muestreada a intervalos de 24 horas. La figura 4 muestra la correlación entre la frescura del producto de pescado y la proporción entre las distancias recorridas de la fluorescencia verde y de la fluorescencia roja.
TABLA 1 Sumario de datos del ensayo de fluorescencia Live/Dead
1
Las figuras 5 a 8 muestran los resultados del ensayo de fluorescencia de otras especies de peces almacenadas durante un número diferente de días a la misma temperatura. La figura 5 muestra el resultado de fluorescencia de la muestra de trucha arcoiris (Oncorhynchus mykiss) fresca. La figura 6 muestra el resultado de fluorescencia de la muestra de trucha arco iris almacenada a 4ºC durante siete días. En la figura 6, la imagen superior refleja información tanto verde como roja de las muestras; la imagen intermedia es una imagen en escala de grises procedente de la información verde; la imagen inferior es una imagen en escala de grises de la información roja. Ambas imágenes, de las figuras 5 y 6, se obtuvieron 30 minutos después de la adición de tinción a la muestra de trucha arco iris. Se añadió tinción a la abertura en la parte superior (parte izquierda de la imagen) del tubo.
El gráfico de la figura 7 se basa en los resultados del ensayo de muestras de trucha arcoiris procedentes de 3 peces (12 muestras en total) recogidas diariamente de pescado almacenado durante 7 días a 4ºC. Se obtuvieron imágenes de las muestras 30 minutos después de la adición de tinción. Este gráfico ilustra la proporción media entre la distancia recorrida por la fluorescencia verde y la fluorescencia roja para muestras obtenidas el mismo día.
La figura 8 representa la correlación entre la frescura de lenguado (Microstomus pacificus) con la proporción entre la distancia recorrida por la fluorescencia verde y la fluorescencia roja. El procedimiento en la figura 8 es el mismo que en la figura 7, excepto en que las muestras de trucha arco iris de la figura 7 se sustituyeron por lenguado (Microstomus pacificus).
Las imágenes obtenidas en lapsos de tiempo tal como se muestran en la figura 9 demuestran que la incorporación del colorante cambia en el tiempo. La muestra utilizada es una muestra de lenguado (Microstomus pacificus) almacenada durante 5 días a 1ºC.
La figura 10 representa las imágenes de fluorescencia de muestras de salmón en platos.
Mediciones de azul tripán
Se añadieron aproximadamente 10 a 30 \mul de reactivo de tinción azul tripán (al 0,5% p/v) sobre la parte superior de las muestras (2,1 mm x 2\sim10 mm). Se midió la profundidad de penetración del colorante azul tripán en la muestra. El tiempo de incubación era de 10 minutos. Las muestras se habían almacenado a 1ºC y marcado a temperatura ambiente. Se utilizó la luz transmitida/reflejada para visionar las muestras.
Las figuras 11 y 12 representaban la correlación entre la frescura de las muestras de salmón y la distancia a la que había penetrado el colorante azul tripán en la muestra. Tal como se muestra en la figura 12, el día 1 es único, los días 2 y 3 son similares, los días 4 a 8 son similares en la proporción de distancia de penetración del colorante respecto a la longitud total de la muestra. El día 1 fue significativamente diferente del resto, y los días 2 y 3 fueron significativamente diferentes de los días 4 a 8.
La tabla siguiente representa el sumario de datos del ensayo de azul tripán
TABLA 2 Sumario de datos del ensayo de azul tripán
2

Claims (28)

1. Procedimiento para evaluar la frescura de un producto de pescado, que comprende:
cortar una cantidad pequeña de muestra del producto de pescado;
añadir sobre la muestra una cantidad efectiva de un reactivo de tinción que comprende por lo menos un colorante que permea la célula y un colorante fluorescente que no permea la célula; en el que el colorante que permea la célula se convierte en un compuesto que emite una primera fluorescencia en presencia de actividad de esterasa intracelular; en el que el colorante fluorescente que no permea la célula puede penetrar en membranas comprometidas de células y emitir una segunda fluorescencia; y en el que la primera fluorescencia y la segunda fluorescencia pueden distinguirse entre sí cuando el reactivo indicador comprende tanto el colorante que permea la célula como el colorante que no permea la célula;
incubar la muestra a la que se ha añadido el reactivo de tinción durante un periodo predeterminado; y
determinar la frescura del producto de pescado basándose en por lo menos un parámetro seleccionado de entre el grupo constituido por: intensidad de la primera fluorescencia emitida a partir de la muestra incubada, la intensidad de una segunda fluorescencia emitida a partir de la muestra incubada, una primera distancia a partir de la parte superior de la muestra hasta el punto más distante en la muestra en el que se detecta la primera fluorescencia; una segunda distancia a partir de la parte superior de la muestra al punto más distante de la muestra en el que se detecta la segunda fluorescencia.
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2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la etapa de determinación se lleva a cabo mediante la comparación de por lo menos un parámetro con una correlación preestablecida entre la frescura y dicho por lo menos un parámetro.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que las intensidades de la primera fluorescencia y la segunda fluorescencia se cuantifican mediante un dispositivo digital, y la correlación preestablecida se establece basándose en las intensidades cuantificadas de la primera fluorescencia y la segunda fluorescencia.
4. Procedimiento según la reivindicación 2 ó 3, en el que las intensidades de la primera fluorescencia y la segunda fluorescencia se registran en una imagen mediante un dispositivo óptico, y la correlación preestablecida entre la frescura y la intensidad de por lo menos una de entre la primera fluorescencia y la segunda fluorescencia se ilustra en un gráfico de color estándar.
5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el reactivo de tinción comprende tanto el colorante que permea la célula como el colorante que no permea la célula.
6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la determinación de la frescura del producto de pescado se basa en la proporción de las intensidades de la primera fluorescencia y de la segunda fluorescencia.
7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la determinación de la frescura del producto de pescado se basa en la proporción de la primera distancia y la segunda distancia.
8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el colorante que permea la célula es calceína-AM (calceína-acetoximetil éster o 3',6'-di(O-acetil-2',7'-bis[N,N-bis(carboximetil)-aminometil]fluoresceíntetraacetoximetil éster), y el colorante que no permea la célula es homodímero de EtD-1 (homodímero de etidio-1), siendo la primera fluorescencia verde y la segunda fluorescencia roja.
9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el colorante que permea la célula se selecciona de entre el grupo constituido por calceína-AM y resazurina-C12, y el colorante que no permea la célula se selecciona de entre el grupo constituido por homodímero de EtD-1 y YoYo-1.
10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el reactivo de tinción comprende además colorante azul tripán cuando el reactivo de tinción comprende el colorante que permea la célula.
\vskip1.000000\baselineskip
11. Procedimiento para evaluar la frescura de un producto de pescado, que comprende:
cortar una cantidad pequeña de muestra del producto de pescado;
añadir un reactivo de tinción que comprende una cantidad efectiva de calceína-AM y una cantidad efectiva de homodímero de EtD-1 sobre la muestra;
incubar la muestra a la que se ha añadido el reactivo de tinción durante un periodo predeterminado;
determinar la frescura del producto de pescado basándose en por lo menos una de entre la intensidad de una fluorescencia verde y una primera distancia a partir de la parte superior de la muestra incubada y el punto más distante en la muestra incubada en el que se detecta la fluorescencia verde, y por lo menos uno de entre la intensidad de una fluorescencia roja y una segunda distancia a partir de la parte superior de la muestra incubada y el punto más distante en la muestra incubada en el que se detecta la fluorescencia roja.
\vskip1.000000\baselineskip
12. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que la determinación de la frescura se basa en la proporción de las intensidades de la fluorescencia verde y de la fluorescencia roja.
13. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que la determinación de la frescura se basa en la proporción de la primera distancia y la segunda distancia.
14. Procedimiento según la reivindicación 11 ó 12, en el que la determinación de la frescura se lleva a cabo mediante la comparación de las intensidades de la fluorescencia verde y la fluorescencia roja con una correlación preestablecida entre la frescura y las intensidades de la fluorescencia verde y la fluorescencia roja.
15. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que las intensidades de la fluorescencia verde y la fluorescencia roja se cuantifican utilizando un dispositivo digital, y se establece la correlación preestablecida basándose en las intensidades cuantificadas de la fluorescencia verde y la fluorescencia roja.
16. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que las intensidades de la fluorescencia verde y la fluorescencia roja se registran en una imagen utilizando un dispositivo óptico, y la correlación preestablecida entre la frescura y las intensidades de la fluorescencia verde y la fluorescencia roja se ilustra en un gráfico de color estándar.
17. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, en el que el reactivo de tinción comprende calceína-AM de 0,1 a 50 \muM.
18. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, en el que el reactivo de tinción comprende homodímero de EtD-1 de 0,1 a 100 \muM.
19. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 18, en el que la cantidad del reactivo de tinción de 1 \mul a 1 ml.
20. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 19, en el que la duración predeterminada de la etapa de incubación es de 1 a 45 minutos.
21. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 20, en el que la duración predeterminada de la etapa de incubación es de 5 a 10 minutos, y la etapa de incubación se lleva a cabo a temperatura ambiente.
22. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en el que el producto de pescado se selecciona de entre el grupo constituido por salmón, trucha arco iris, lenguado y fletán.
\vskip1.000000\baselineskip
23. Procedimiento para evaluar la frescura de un producto de pescado, que comprende:
cortar una cantidad pequeña de muestra del producto de pescado;
añadir un reactivo de tinción que comprende una cantidad efectiva de colorante azul tripán sobre la muestra;
incubar la muestra a la que se ha añadido el reactivo de tinción durante un periodo predeterminado;
determinar la frescura del producto de pescado basándose en una distancia de penetración a partir de la parte superior de la muestra incubada hasta el punto más distante en la muestra incubada en el que se detecta la fluorescencia azul.
\vskip1.000000\baselineskip
24. Procedimiento según la reivindicación 23, en el que la determinación de la frescura se lleva a cabo mediante la comparación de la distancia de penetración y una correlación preestablecida entre la frescura y la distancia de penetración.
25. Procedimiento según la reivindicación 23 ó 24, en el que el reactivo de tinción comprende colorante azul tripán 0,1 a 10 mM.
26. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25, en el que la cantidad del agente de tinción se encuentra comprendida entre 1 \mul y 1 ml.
\newpage
27. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26, en el que el periodo de tiempo predeterminado de la etapa de incubación es de 2 minutos a 45 minutos.
28. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 27, en el que el periodo de tiempo predeterminado de la etapa de incubación es de 10-30 minutos, y la incubación se lleva a cabo a temperatura ambiente.
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