ES2428076T3 - Procedimiento de identificación de bacterias del grupo Bacillus cereus - Google Patents
Procedimiento de identificación de bacterias del grupo Bacillus cereus Download PDFInfo
- Publication number
- ES2428076T3 ES2428076T3 ES10770572T ES10770572T ES2428076T3 ES 2428076 T3 ES2428076 T3 ES 2428076T3 ES 10770572 T ES10770572 T ES 10770572T ES 10770572 T ES10770572 T ES 10770572T ES 2428076 T3 ES2428076 T3 ES 2428076T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- bacillus
- substrate
- bacteria
- plc
- bacillus cereus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000006378 Bacillus cereus group Species 0.000 title claims abstract description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 36
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 54
- 108010073128 phosphatidylcholine-specific phospholipase C Proteins 0.000 claims abstract description 36
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 29
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 26
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 claims abstract description 26
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims abstract description 21
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 16
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims abstract description 12
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 claims abstract description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 31
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 claims description 27
- 241000194106 Bacillus mycoides Species 0.000 claims description 13
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 11
- 229950004354 phosphorylcholine Drugs 0.000 claims description 11
- 101710139410 1-phosphatidylinositol phosphodiesterase Proteins 0.000 claims description 9
- 102100037097 Protein disulfide-isomerase A3 Human genes 0.000 claims description 9
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 claims description 8
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 8
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 claims description 7
- 229940065181 bacillus anthracis Drugs 0.000 claims description 7
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 claims description 7
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 5
- 241000906059 Bacillus pseudomycoides Species 0.000 claims description 4
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims description 4
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims description 4
- 241000186780 Listeria ivanovii Species 0.000 claims description 4
- 241000186779 Listeria monocytogenes Species 0.000 claims description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 4
- 241000193752 Bacillus circulans Species 0.000 claims description 3
- 241000193422 Bacillus lentus Species 0.000 claims description 3
- 241000193386 Lysinibacillus sphaericus Species 0.000 claims description 3
- 241000194105 Paenibacillus polymyxa Species 0.000 claims description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 3
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 claims description 2
- 241000194103 Bacillus pumilus Species 0.000 claims description 2
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 claims description 2
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 claims 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 15
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 8
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 6
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 5
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 4
- 235000001130 magnesium glycerophosphate Nutrition 0.000 description 4
- 239000011742 magnesium glycerophosphate Substances 0.000 description 4
- BHJKUVVFSKEBEX-UHFFFAOYSA-L magnesium;2,3-dihydroxypropyl phosphate Chemical compound [Mg+2].OCC(O)COP([O-])([O-])=O BHJKUVVFSKEBEX-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- HSHNITRMYYLLCV-UHFFFAOYSA-N 4-methylumbelliferone Chemical compound C1=C(O)C=CC2=C1OC(=O)C=C2C HSHNITRMYYLLCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- -1 for example Substances 0.000 description 3
- 239000003349 gelling agent Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 3
- GDOPTJXRTPNYNR-UHFFFAOYSA-N methyl-cyclopentane Natural products CC1CCCC1 GDOPTJXRTPNYNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 3
- MJKVTPMWOKAVMS-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxy-1-benzopyran-2-one Chemical compound C1=CC=C2OC(=O)C(O)=CC2=C1 MJKVTPMWOKAVMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000005577 Gastroenteritis Diseases 0.000 description 2
- 108010093965 Polymyxin B Proteins 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000007793 ph indicator Substances 0.000 description 2
- 229920000024 polymyxin B Polymers 0.000 description 2
- 229960005266 polymyxin b Drugs 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 235000015067 sauces Nutrition 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 2
- IEDVJHCEMCRBQM-UHFFFAOYSA-N trimethoprim Chemical compound COC1=C(OC)C(OC)=CC(CC=2C(=NC(N)=NC=2)N)=C1 IEDVJHCEMCRBQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001082 trimethoprim Drugs 0.000 description 2
- IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 2,2'-piperazine-1,4-diylbisethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241001079698 Bacillus cereus ATCC 10876 Species 0.000 description 1
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 description 1
- 241000504943 Bacillus megaterium NBRC 15308 = ATCC 14581 Species 0.000 description 1
- 241001451492 Bacillus pumilus ATCC 7061 Species 0.000 description 1
- FRPHFZCDPYBUAU-UHFFFAOYSA-N Bromocresolgreen Chemical compound CC1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C(=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 FRPHFZCDPYBUAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001660259 Cereus <cactus> Species 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 241001649081 Dina Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 229920002148 Gellan gum Polymers 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 1
- 240000002129 Malva sylvestris Species 0.000 description 1
- 235000006770 Malva sylvestris Nutrition 0.000 description 1
- SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N N-Methylmorpholine Chemical class CN1CCOCC1 SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 239000007990 PIPES buffer Substances 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 102000006486 Phosphoinositide Phospholipase C Human genes 0.000 description 1
- 108010044302 Phosphoinositide phospholipase C Proteins 0.000 description 1
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010079194 Type C Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- 102000014384 Type C Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000004464 cereal grain Substances 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 229940125507 complex inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical class CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 235000015203 fruit juice Nutrition 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 235000021374 legumes Nutrition 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N n-[(2s,3r,4r,5s,6r)-2-[(2r,3s,4r,5r,6s)-5-acetamido-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-(4-methyl-2-oxochromen-7-yl)oxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]acetamide Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](NC(C)=O)[C@H](OC=2C=C3OC(=O)C=C(C)C3=CC=2)O[C@@H]1CO UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N 0.000 description 1
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 1
- PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N neutral red Chemical compound Cl.C1=C(C)C(N)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 231100000255 pathogenic effect Toxicity 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 229940066779 peptones Drugs 0.000 description 1
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000000275 quality assurance Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000001223 reverse osmosis Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- MWEMXEWFLIDTSJ-UHFFFAOYSA-M sodium;3-morpholin-4-ylpropane-1-sulfonate Chemical compound [Na+].[O-]S(=O)(=O)CCCN1CCOCC1 MWEMXEWFLIDTSJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000014347 soups Nutrition 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 235000013599 spices Nutrition 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 229960005404 sulfamethoxazole Drugs 0.000 description 1
- JLKIGFTWXXRPMT-UHFFFAOYSA-N sulphamethoxazole Chemical compound O1C(C)=CC(NS(=O)(=O)C=2C=CC(N)=CC=2)=N1 JLKIGFTWXXRPMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
- XOSXWYQMOYSSKB-LDKJGXKFSA-L water blue Chemical compound CC1=CC(/C(\C(C=C2)=CC=C2NC(C=C2)=CC=C2S([O-])(=O)=O)=C(\C=C2)/C=C/C\2=N\C(C=C2)=CC=C2S([O-])(=O)=O)=CC(S(O)(=O)=O)=C1N.[Na+].[Na+] XOSXWYQMOYSSKB-LDKJGXKFSA-L 0.000 description 1
- 235000013618 yogurt Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
- C12Q1/045—Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Procedimiento de identificación de bacterias del grupo Bacillus cereus, que comprende las etapas que consistenen: - poner en contacto, en un recipiente, una muestra susceptible de contener bacterias del grupo Bacillus cereus,un medio de reacción que comprende al menos un sustrato fluorescente de PC-PLC y un inhibidor debacterias Gram negativas; - incubar el conjunto; - identificar las bacterias del grupo Bacillus cereus por detección de la reacción de hidrólisis del sustrato de PCPLC;caracterizado porque el pH del medio de reacción y el tiempo necesario para la detección de la reacción de hidrólisisdel sustrato de PC-PLC utilizado, están adaptados de tal modo que dicha reacción de hidrólisis por las bacterias delgrupo Bacillus cereus es detectada antes de que la hidrólisis del sustrato de PC-PLC por las bacterias Grampositivas distintas de las que pertenecen al grupo Bacillus cereus y potencialmente presentes en la muestra, nopueda detectarse.
Description
Procedimiento de identificación de bacterias del grupo Bacillus cereus
La presente invención se refiere al campo del control microbiológico alimentario. Más particularmente, se basa en un método de discriminación de bacterias del grupo Bacillus cereus con respecto a otras bacterias, por hidrólisis de un sustrato fluorescente de lecitinasa o fosfatidilcolina fosfolipasa C, que se denomina en lo sucesivo PC-PLC.
El control microbiológico en el campo agroalimentario requiere la utilización de técnicas que permitan la detección y/o la identificación y/o la enumeración de microorganismos,. y que la obtención de resultados con ellas sea lo más rápido posible. Dichos microorganismos pueden ser no patógenos, por ejemplo bacterias de interés tecnológico tales como los fermentos o tales como los indicadores de calidad; estos últimos permiten validar el proceso de producción, materias primas o productos crudos, llegando hasta productos terminados. Sin embargo, dichos microorganismos son con frecuencia patógenos y la detección rápida y precisa de contaminaciones supuestas exige llevar a cabo acciones correctivas. Alternativamente, las toxinas producidas por dichos microorganismos y que son responsables de los efectos patógenos, pueden ser investigadas.
El diagnóstico clínico utiliza las mismas técnicas : o bien la detección y/o la enumeración de las propias bacterias. o bien la detección de las toxinas. En todos los casos, los factores importantes para los ensayos diagnósticos son la sensibilidad, la selectividad y el tiempo de obtención de los resultados.
El género Bacillus comprende bacterias Gram positivas presentes en la naturaleza en todas partes:: en la tierra, en el agua y en el aire, así como en los productos alimentarios, granos de cereales, leches en polvo, productos harinosos, especias etc. La capacidad de formar esporas las confiere una resistencia muy grande en el medio exterior. Las esporas de Bacillus cereus (B. cereus), en particular, pueden contaminar los alimentos, materias primas y productos manufacturados. La supervivencia de dichas esporas se mantiene a todo lo largo de la cadena alimentaria. En circunstancias normales, el B. cereus está presente en una cantidad inferior a 103 células por gramo de alimento y carece de incidencia patógena, El nivel mínimo patógeno es superior a 105 células por gramo de alimento. La contaminación de un individuo a partir de un alimento puede ser responsable, por tanto, de una gastroenteritis. Las gastroenteritis asociadas con B. cereus se traducen o bien en vómitos, o bien en diarreas. Diversos alimentos pueden estar involucrados; carnes, arroz, platos deshidratados, salsas, sopas, etc. También pueden observarse infecciones oportunistas por B. cereus en pacientes debilitados tales como sujetos alcohólicos, inmunodeprimidos, o como consecuencia de heridas tales como quemaduras.
La detección y determinación cuantitativa de las bacterias del grupo Bacillus cereus es, por tanto, fundamental para los laboratorios de garantía de calidad de la industria agroalimentaria, así como para los laboratorios de diagnóstico clínico. Normalmente, el aislamiento se lleva a cabo en medios de cultivo selectivos, convencionales, en placa, por ejemplo las normas de tipo ISO (International Organization for Standardization) o los métodos BAM-FDA (Bacteriological Analytical Manual of the Food and Drug Administrarion) que recomiendan medios tales como el Agar-azul de bromotimol-manitol-yema de huevo-polimixina (PEMBA) o el Agar-polimixina-yema de huevo-manitol (MYP) según sus denominaciones anglosajonas. La identificación se lleva a cabo según las características morfológicas y las de los cultivos, o características metabólicos..
Estos medios PEMBA o MYP pueden dar lugar a falsos positivos potenciales asociados a un sistema inhibidor poco eficaz, o a falsos negativos, asociados con la ausencia posible de las características citadas, morfológicas o metabólicas, de ciertas cepas. Finalmente, ciertas cepas presentan reacciones ambiguas, tales como ha sido descrito por Fricker et al., International Journal of Food Microbiology; 121 (2008) : 27-34. Han sido desarrollados medios cromógenos en placa para paliar los falsos negativos. Estos medios contienen sustratos naturales o sustratos sintéticos cromógenos. De este modo son detectadas actividades enzimáticas especificas de ciertas cepas mediante la selección de estos sustratos. La especificidad de la detección puede mejorarse mediante la adición al medio de cultivo de sistemas inhibidores, mezclas de compuestos antimicrobianos y/o antifúngicos destinadas a limitar el crecimiento de otros microorganismos. No obstante, las mezclas de inhibidores retardan igualmente el crecimiento de microorganismos considerados dianas, en la medida en que están destinados a limitar el crecimiento de microorganismos del mismo género que dichos microorganismos considerados dianas .
Medios cromógenos o fluorescentes basados en la detección de la actividad de la fosfolipasa C específica del fosfatidilinositol (en lo sucesivo denominada PI-PLC), han sido descritos en las patentes US 6.284.517 B, EP 1 219 628 B y US 6.558.917 B, así como en la publicación de Fricker et al., 2008 (referencia bibliográfica anterior). Estos medios presentan el inconveniente de dar lugar a falsos negativos, en particular con ciertas cepas del grupo Bacillus cereus que no presentan actividad PI-PLC (B. cereus, B. mycoides, B. weihenstephanensis) o que presentan pequeña actividad PI-PLC (B. anthracis), o a falsos positivos. Además, el sustrato fluorescente 4MU-MIP (4-metilumbeliferil-mioinositol-1 fosfato) presenta una estabilidad reducida en medio acuoso lo que impone condiciones excesivamente rigurosas para su utilización, en particular una medida discontinua de la fluorescencia llevada a cabo en condiciones precisas de pH según indica la patente US 6.558.917. Más propiamente,. es necesario realizar el cultivo a pH ácido y después alcalinizar el medio para aumentar la fluorescencia., leída en el punto final. La patente US 7.309.580 B2 describe un medio en placa de cultivo que combina un sustrato cromógeno de PC-PLC y un sustrato cromógeno de PI-PLC. Los colores respectivos, del medio, del primer sustrato y del segundo sustrato, son diferentes y pueden igualmente diferenciarse del tercer color que resulte de la mezcla posible de los productos procedentes de reacciones enzimáticas.
El medio BCM, suministrado por Biosynth® (Suiza) utiliza un sustrato cromógeno de PI-PLC y un sistema inhibidor de la flora bacteriana no considerada diana, que comprende polimixina B, trimetoprima, sulfametoxazol y cicloheximida. Los comportamientos del ensayo están mejorados con respecto a los medios estándar, pero ciertas cepas atípicas pueden quedar mal identificadas (Fricker et al., 2008, referencia anterior).
Existen medios cromógenos que se basan en la hidrólisis de sustratos de 1-glucosidasa tales como el Brilliance ™ Bacillus cereus Agar suministrado por Oxoid™. No obstante, este medio genera falsos positivos Gram positivos a pesar de la presencia de un sistema inhibidor anti-Gram positivos que comprende polimixina B y trimetoprima, así como también falsos negativos (Fricker et al., 2008).
Finalmente, existe un medio cromógeno en placa, que se basa en la hidrólisis de un sustrato cromógeno de PC-PLC: R&F® Anthracis Chromogenic Agar. Este medio proporciona una indicación de resultado negativo para el Bacillus anthracis en 24 horas y un resultado potencialmente positivo en 48 horas. El tiempo de obtención del resultado es largo y la especificidad necesita la presencia de varios antibióticos. (Juergensmeyer et al., Journal of food protection; vol. 69, No. 8 (2006): 2002-2006, así como la patente US 2004/005652, describen igualmente la utilización de tales medios cromógenos.)
Resulta de este estado de la técnica que hasta la fecha no existe un procedimiento que permita detectar y/o enumerar bacterias del grupo de Bacillus cereus con ayuda de un medio de reacción que comprende un inhibidor de bacterias Gram negativas y un sustrato fluorescente de PC-PLC, cuyo medio de reacción permita obtener un resultado en 6 a 30 horas. Un procedimiento tal presenta un valor real añadido para el diagnóstico clínico o industrial, en particular en el campo de la industria agroalimentaria.
Teniendo en cuenta los inconvenientes manifestados en el estado de la técnica considerado anteriormente, los objetivos esenciales de la presente invención son:
• obtener un resultado positivo más rápidamente que con los ensayos existentes;
- •
- reducir el número de falsos positivos;
- •
- mejorar la sensibilidad, en particular para niveles pequeños de contaminación de la muestra, gracias a la utilización de un sistema inhibidor reducido;
- •
- presentar gran facilidad de lectura e interpretación gracias a la utilización de un solo sustrato específico, pudiendo, además, automatizarse dicha lectura;
- •
- presentar condiciones de reacción y/o de cultivo simplificadas, en particular para la preparación del medio y la estabilidad del sustrato.
Según un primer modo de realización. la invención se basa en un procedimiento de identificación de bacterias del grupo Bacillus cereus, que comprende las etapas que consisten en:
- •
- poner en contacto en un recipiente, una muestra capaz de contener bacterias del grupo Bacillus cereus, un medio de reacción que comprende al menos un sustrato fluorescente de PC-PLC y un inhibidor de bacterias Gram negativas:
- •
- incubar el conjunto;
- •
- identificar las bacterias del grupo Bacillus cereus mediante la detección de la reacción de hidrólisis del sustrato de PC-PLC
en el que el pH del medio de reacción y el tiempo necesario para detectar la reacción de hidrólisis del sustrato de PC-PLC empleado, están adaptados de tal modo que dicha reacción de hidrólisis por las bacterias del grupo Bacillus cereus es detectada antes de que la hidrólisis del sustrato de PC-PLC por las bacterias Gram positivas distintas de las que pertenecen al grupo Bacillus cereus y potencialmente presentes en la muestra, no pueda detectarse.
Se entiende por “tiempo necesario para la detección de la hidrólisis del sustrato” el tiempo que transcurre entre la puesta en contacto, en un recipiente, de la muestra, el medio de reacción y el sustrato, y la detección de la señal. En concreto, este tiempo está fijado y puede ser asimilado al tiempo de reacción. Dicha señal puede ser considerada, por tanto, como un resultado. Por “antes que la hidrólisis del sustrato de PC-PLC por las bacterias Gram positivas distintas de las que pertenecen al grupo Bacillus cereus y potencialmente presentes en la muestra, no pueda detectarse”, se entiende: : antes de alcanzar, en ausencia de bacterias del grupo Bacillus cereus, una señal que corresponde al umbral de detección de dichas bacterias del grupo Bacillus cereus. El resultado se considera como negativo si la señal obtenida no es significativamente diferente del ruido de fondo, o dicho de otro modo, si la señal no sobrepasa el umbral de detección. Dicho resultado es positivo si la señal obtenida es significativamente diferente del ruido de fondo.
Preferentemente, el pH del medio de reacción está comprendido entre 6,8 y 8,0.
Preferentemente, el tiempo necesario para la detección de la hidrólisis del sustrato del PC-PLC está comprendido entre 6 y 30 horas.
El medio de reacción utilizado en el procedimiento según la invención está, preferentemente, en forma sólida, líquida
o de gel.
Ventajosamente, el medio de reacción utilizado en el procedimiento según la invención puede ser un medio de cultivo.
Ventajosamente, es asimismo posible una enumeración de las bacterias del grupo Bacillus cereus presentes en la muestra.
Según un modo particular de realización, el procedimiento según la invención puede ser llevado a cabo en microplacas, microcúpulas, microtubos, capilares o placas de muchos pocillos tales como las VITEK® o TEMPO® desarrolladas y comercializadas por el Solicitante. Ventajosamente, el procedimiento según la invención puede asociarse a un dispositivo automático de control microbiológico del tipo TEMPO®, tal como el desarrollado y comercializado por el Solicitante.
Según otro modo de realización, el procedimiento según la invención comprende, además, una etapa preliminar de pre-enriquecimiento..
Ventajosamente, el medio de reacción utilizado en el procedimiento según la invención, comprende, además, al menos un segundo sustrato, cromógeno o fluorescente. Según un modo de realización particular, dicho sustrato es un sustrato de PI-PLC, que permite discriminar Bacillus anthracis de Bacillus cereus y de Bacillus thuringiensis.
Preferentemente, el sustrato fluorescente de PC-PLC corresponde a 4 MU-CP (4-metil-umbeliferil-colina fosfato).
Según un modo particular de realización del procedimiento según la invención, las bacterias del grupo Bacillus cereus están escogidas entre Bacillus cereus, Bacillus anthracis, Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides, Bacillus, pseudomycoides y Bacillus weihenstephanensis , y las otras bacterias están escogidas entre Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii, Staphylococcus u otras especies del genero Bacillus spp. tales como Bacillus subtilis, Bacillus sphaericus, Bacillus circulans, Bacillus lentus, Bacillus pumilus, Bacillus megaterium o Paenibacillus polymyxa.
El procedimiento objeto de la invención puede ser llevado a cabo con ayuda de un kit que comprende: un medio de reacción que contiene, al menos, un inhibidor de bacterias Gram negativas, y un sustrato fluorescente específico de PC-PLC. Dicho medio se pone de nuevo en suspensión por una parte alícuota de la muestra a analizar. Ventajosamente, el kit que permite poner en práctica en procedimiento según la invención puede contener también un recipiente sólido de tipo microplaca, microtubo, microcúpula, capilar, o placa de muchos pocillos tal como la VITEK® o la TEMPO®. Preferentemente, el sustrato fluorescente de PC-PLC utilizado en el kit corresponde al 4-metil-umbeliferil-colina fosfato (4 MU-CP). Ventajosamente, el kit que permite la puesta en práctica del procedimiento según la invención, comprende, además, al menos un sustrato suplementario, cromógeno o fluorescente. Preferentemente, dicho sustrato es un sustrato de PI-PLC que permite discriminar Bacillus anthracis de Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus weihenstephanensis, Bacillus mycoides y Bacillus pseudomycoides.
La especificidad de un ensayo se define por la combinación de la sensibilidad y la selectividad. La sensibilidad se define como el poder de poner de manifiesto la especie buscada, cuando ésta se encuentra presente en una cantidad pequeña en la muestra a ensayar. Una sensibilidad pequeña se traducirá en resultados falsamente negativos. La selectividad, se define como el poder de detectar la especie investigada en la muestra que contiene, igualmente, otras especies. La utilización de sustratos específicos del metabolismo de la especie investigada mejora la selectividad. Pero cepas que expresan poco la actividad enzimática investigada, pueden no ser detectadas y dar lugar a resultados falsamente negativos. Igualmente, la utilización de mezclas de inhibidores, o dicho de otro modo, de compuestos capaces de lentificar, limitar o bloquear el crecimiento de especies potencialmente presentes pero cuya detección no se desea, mejora la selectividad. Un sistema inhibidor de escaso comportamiento puede dar lugar a resultados falsamente positivos..
Por muestra se entiende una parte pequeña o una cantidad pequeña aislada de una entidad para su análisis. La muestra puede ser de origen industrial, o bien, según una lista no exhaustiva, tomada de aire, una toma de agua, una toma realizada sobre una superficie, una pieza o un producto manufacturado, o un producto de origen alimentario. Entre las muestras de origen alimentario se puede citar de modo no exhaustivo, una muestra de productos lácteos (yogures, quesos....), de carne, de pescado, de huevos, de frutas, de legumbres, de agua, o de bebidas (leche, jugos de frutas, soda, etc.). Estas muestras de origen alimentario pueden proceder, asimismo, de salsas o de platos elaborados. Una muestra alimentaria puede provenir, finalmente, de un alimento destinada a los animales, tal como en especial harinas animales. La muestra puede ser de origen biológico, tanto de origen animal, como vegetal o humano. Por consiguiente, puede corresponder a una toma de un fluido biológico (sangre total, suero, plasma, orina, líquido cefalorraquídeo, o secreción orgánica),o una muestra obtenida de un tejido o de células aisladas. Esta toma puede ser utilizada tal cual, o con anterioridad al análisis, ser sometida a una preparación de tipo enriquecimiento, extracción, concentración o purificación, según métodos conocidos por los expertos en la técnica.
El control microbiológico corresponde al análisis de una muestra con objeto de aislar y/o de identificar y/o de enumerar microorganismos potencialmente presentes, tales como bacterias o levaduras. Por medio de reacción se 5 entiende un medio que comprende todos los elementos necesarios para la supervivencia y/o para el crecimiento de los microorganismos. Este medio de reacción puede o bien servir únicamente de medio de revelación, o bien servir de medio de cultivo y de revelación. En el primer caso, el cultivo de los microorganismos puede llevarse a cabo antes de realizar la siembra, y, en el segundo caso, el medio de reacción constituye igualmente el medio de cultivo. El medio de reacción puede ser sólido, semisólido o líquido. Por medio sólido se entiende, por ejemplo, un medio 10 gelificado. Preferentemente, el medio según la invención es un medio gelificado. El agar es el agente de gelificación tradicional en microbiología para el cultivo de los microorganismos, pero es posible utilizar otros agentes gelificación tales como, por ejemplo, la gelrita, la gelatina o la agarosa. El medio de reacción según la invención puede contener otros aditivos eventuales tales como, por ejemplo, peptonas, uno o varios factores de crecimiento, hidratos de carbono, uno o más agentes selectivos, tampones, uno o varios agentes de gelificación, etc. Este medio de reacción
15 puede presentarse en forma de líquido, o de gel listo para emplear, es decir, listo para realizar la siembra en tubos, en frascos o en placas de Petri.
En general, el medio de reacción puede contener en sí mismo un sustrato que permite la detección de una actividad enzimática o metabólica de los microorganismos considerados dianas, gracias a una señal que pueda detectarse directa o indirectamente. Para una detección directa, este sustrato puede asociarse a una parte que desempeñe el 20 papel de marcador, fluorescente o cromógeno. Para una detección indirecta el medio de reacción según la invención, puede comprender en sí mismo un indicador de pH sensible a la variación de pH inducida por el consumo del sustrato y que revela el crecimiento de los microorganismos considerados dianas, Dicho indicador de pH puede ser un cromóforo o un fluoróforo. Como ejemplos de cromóforos se pueden citar el rojo neutro, el azul de anilina o el azul de bromocresol. Los fluoróforos comprenden, por ejemplo, la 4-metilumbeliferona, los derivados de la
25 hidroxicumarina o los derivados de la resorrufina. Asimismo, el sustrato fluorescente de PC-PLC utilizado preferentemente para la puesta en práctica del procedimiento según la invención, corresponde al 4-metil-umbeliferilcolina fosfato (4 MU-CP).
La comprensión del procedimiento según la invención será favorecida mediante los ejemplos que siguen, que no tienen en modo alguno carácter limitativo, en combinación con los dibujos, en los que:
30 • la Figura 1 ilustra medidas cinéticas de la actividad PC-PLC de diferentes bacterias Gram positivas;
- •
- la Figura 2 ilustra la medida cinética de la actividad PC-PLC de la cepa Bacillus cereus ATCC 7064 en función del pH del medio fijado, respectivamente, en 7,23 ó 6,8;
- •
- la Figura 3 ilustra la intensidad de coloración o de fluorescencia obtenida en 24 horas para diversas cepas de Bacillus spp en función del tipo de sustrato utilizado.
35 Ejemplo 1: Estudio de la actividad PC-PLC de Bacillus cereus frente a la observada para otras bacterias Gram positivas (Figura 1 y Tabla 1)
Diferentes cepas puras del género Bacillus así como otras bacterias Gram positivas fueron ensayadas en microplacas en presencia del medio que se indica. Seguidamente se realizó la lectura de la aparición de fluorescencia, en cinética, en cada uno de los diferentes pocillos de la microplaca durante 44 horas de incubación a
1. MEDIO
Se utilizó el medio de la siguiente composición (composición en g/l), pH 7,2:
- Compuestos
- Concentración en g/l
- Extracto de levadura
- 5
- Piruvato de sodio
- 2
- Glicerofosfato de magnesio
- 1
- Tampón HEPES básico
- 13,8
- Tampón HEPES ácido
- 11,92
- 4- Metilumbeliferil-colina fosfato1
- 0,4
14-Metilumbeliferil-colina fosfato (4-MU-PC), Biosynth®, Ref. M-5528
45 2. ENSAYOS
Los pocillos de la microplaca se inoculan con 10 Unidades que Forman Colonia (UFC) de bacterias del grupo Bacillus cereus y 1.000 UFC de las otras bacterias Bacillus no cereus y otras bacterias Gram positivas. Seguidamente la microplaca se incuba durante 44 horas a 37ºC en un lector de microplacas con la finalidad de evaluar la actividad PC-PLC de estas diversas cepas, en forma de cinética de hidrólisis del sustrato 4MU-CP, es decir, de detectar y medir la aparición de fluorescencia. El umbral de detección del aparato de medida se fija en
30.000 RFU (unidad relativa de fluorescencia)
3. RESULTADOS E INTERPRETACIÓN
5 La Figura 1 muestra una diferencia significativa entre la actividad PC-PLC observada en el Bacillus cereus (señal positiva a partir de 15 horas) y la observada en las otras bacterias Gram positivas (señal positiva que puede detectarse únicamente después de 40 horas de incubación). No es necesario añadir al medio un sistema inhibidor complejo para obtener este resultado.
Estos resultados han sido confirmados para 10 cepas pertenecientes al grupo Bacillus cereus frente a otras 15 10 cepas que no pertenecían al grupo Bacillus cereus. Estos últimos resultados están reagrupados en la Tabla 1.
La discriminación de las cepas del grupo Bacillus cereus frente a las otras bacterias Gram positivas, es posible, por tanto, sin mezcla compleja de inhibidores (presencia únicamente de un inhibidor anti Gram negativas) en un intervalo de lectura comprendido entre 6 y 30 horas.
Tabla 1. Nivel de fluorescencia generado a 24 y 40 horas por hidrólisis del 4MU-PC por diversos microorganismos.
15 Umbral de detección: 30.000 RFU. Las bacterias que pertenecen al grupo Bacillus cereus están indicadas en negrita.
- Especies bacterianas
- Niveles de fluorescencia en 24 horas (RFU) Niveles de fluorescencia en 49 horas (RFU)
- Bacillus cereus ATCC 7064
- > 60000 > 60.000
- Bacillus cereus ATCC 6464
- > 60000 > 60000
- Bacillus cereus ATCC 9139
- > 60000 > 60000
- Bacillus cereus ATCC 10876
- > 60000 > 60000
- Bacillus cereus ATCC 33019
- > 60000 > 60000
- Bacillus cereus NCTC 11145
- > 60000 > 60000
- Bacillus thuringiensis 0240015
- > 60000 > 60000
- Bacillus mycoides ATCC 6463
- > 60000 > 60000
- Bacillus licheniformis 93.08.043
- 2000 2000
- Bacillus sphaericus 87.10054
- 20000 > 60000
- Bacillus circulans ATCC 4513
- 20000 20000
- Bacillus subtilis ATCC 6051
- 10000 20000
- Bacillus lentus ATCC 10840
- 5000 10000
- Bacillus pumilus ATCC 7061
- 5000 10000
- PaeniBacillus polymyxa ATCC 21551
- 5000 10000
- Bacillus megaterium ATCC 14581
- 5000 5000
- L. monocytogenes ATCC 19118
- 4000 15000
- L. monocytogenes 0301902
- 5000 10000
- L. ivanovii ATCC 49954
- 2000 10000
- L. ivanovii 0002147
- 2000 10000
- S. aureus 8407603
- 2000 2000
- S. aureus 25923
- 2000 2000
- Línea de base
- 2000 2000
20 Ejemplo 2: Estudio de la actividad PC-PLC de Bacillus cereus a pH 7,2 frente a pH 6,8 (Figura 2)
La dinámica de la actividad PC-PLC de Bacillus cereus ATCC 7064 se evaluó a pH 7,2 (medio A) frente a pH 6,8 (medio B)
1. MEDIOS
El medio A tiene la composición siguiente, pH 7,2
- Compuestos
- Concentración en g/l
- Extracto de levadura
- 5
- Piruvato de sodio
- 2
- Glicerofosfato de magnesio
- 1
- Tampón HEPES básico
- 13,8
- Tampón HEPES ácido
- 11,92
- 4-Metilumbeliferil-colina fosfato
- 0,4
El medio B tiene la composición siguiente, pH 6,8:
- Compuestos
- Concentración en g/l
- Extracto de levadura
- 5
- Piruvato de sodio
- 2
- Glicerofosfato de magnesio
- 1
- Tampón PIPES Na
- 16,22
- Tampón PIPES diNa
- 17,32
- 4- Metilumbeliferil-colina fosfato
- 0,4
- 2.
- ENSAYOS
Diez UFC de Bacillus cereus ATCC 7064 se inocularon en los pocillos de la microplaca en presencia del medio A (pH 7,2) y del medio B (pH 6,8). Después se incubó la microplaca durante 44 horas a 37ºC en un lector de microplacas con la finalidad de evaluar la actividad PC-PLC de la cepa de Bacillus cereus ATCC 7064 a los dos pH estudiados
- 3.
- RESULTADOS E INTERPRETACION
La dinámica de la actividad PC-PLC del Bacillus cereus ATCC 7064 y las señales RFU así obtenidas a pH 7,2 son superiores. En efecto, la intensidad de la emisión de fluorescencia de la 4MU aumenta con el pH del medio (pH óptimo de emisión = 10).
Considerando el crecimiento y la actividad PC-PLC de Bacillus cereus, el pH óptimo del medio es 7,2. La obtención de señales superiores permite, por tanto, .disminuir el tiempo de detección, es decir, de 10 horas en este caso preciso si se toma en consideración el umbral de detección en 30.000 RFU.
Nota: En el caso de una utilización del 4MU-MIP (4-Metilumbeliferil-mioinositol-1-fosfato, N-metil-morfolina sal, Biosynth®, Ref. M-5717) para diferenciar las bacterias del grupo Bacillus cereus, este pH de 7,2 no puede utilizarse debido a una inestabilidad del sustrato demasiado importante. Por consiguiente, se requiere un pH de 6,8 lo que arrastra un aumento del tiempo de detección
Ejemplo 3 : Estudio de los comportamientos de diferentes sustrato (cromogénicos frente a fluorogénicos) para poner de manifiesto la actividad PC-PLC de las bacterias del grupo Bacillus cereus frente a Bacillus spp. (Figura 3)
Se ensayaron diferentes cepas del género Bacillus en 10 medios diferentes. La lectura de las placas se efectuó después de 24 horas y 48 horas de incubación a 37ºC.
Los sustratos ensayados han sido el 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-colina fosfato (X-CP), cromógeno, el 5-bromo-6-cloro3-indoxil-colina fosfato (magenta-CP), cromógeno), y el 4-metilumbeliferona-colina fosfato (4MU-CP), fluorescente.
1. MEDIOS
Se utilizó el medio de la composición siguiente (composición en g/l):
- •
- extracto de levadura : 5 g/l
- •
- glicerofosfato de magnesio: 1 g/l
- •
- agar : 13 g/l
- •
- LiCl : 3 g/l
- •
- MOPS: 12,6 g/l
- •
- MOPS, sal sódica : 20,78 g/l.
Este medio se repartió en 10 frascos diferentes (T. 1. .... 9) que después fueron esterilizados mediante un ciclo de autoclave de 15 min/121ºC. El medio T sirve de testigo de crecimiento. Se prepararon soluciones madre a 30 g/l de 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-colina fosfato (X-CP), 5-bromo-6-cloro-3-indoxil-colina fosfato (magenta-CP) y 4-metilumbeliferona-colina fosfato (4MU-CP) en agua de ósmosis inversa. Luego un volumen que correspondía a una concentración final de X-CP de 100, 300 y 900 mg/l, respectivamente, se añadió a los medios en sobrefusión, denominados respectivamente 1, 2 y 3. Se repitió la misma operación para los medios 4, 5 y 6 y 7, 8 y 9 que contenían, respectivamente, 100, 300 y 900 mg/l de magenta-CP y 100, 300 y 900 mg/l de 4 MU-CP. Estos medios gelosados fueron distribuidos en placas de Petri.
2. ENSAYOS
La inoculación de las diferentes cepas de Bacillus se efectuó por aislamiento en tres cuadrantes a partir de suspensiones de 0,5 McF (unidades McFarland). Las placas se incubaron después durante 48 horas a 37ºC.
Las colonias formadas se examinaron visualmente al cabo de 24 y 48 horas de incubación. La coloración o la fluorescencia (leída bajo lámpara UV a 366 nm) de estas colonias así como las intensidades, fueron anotadas.
3. RESULTADOS
Las intensidades de coloración y fluorescencia se leen en una escala relativa que va de 0 (ninguna 5 coloración/fluorescencia) a 4 (coloración/fluorescencia muy intensa).
Los resultados están ilustrados en la Figura 3 (expresión de la actividad PC-PLC al cabo de 24 horas de incubación sobre diferentes especies de Bacillus). La ausencia de barra indica que la intensidad de la coloración o de la fluorescencia medida no es significativamente diferente del ruido de fondo y, por tanto, se trata de un resultado negativo.
La utilización del sustrato fluorogénico de PC-PLC, el 4MU-CP, al contrario que los sustratos cromogénicos (X-CP y magenta-CP), permite la detección y la discriminación de las bacterias del grupo Bacillus cereus frente a Bacillus subtilis con una sensibilidad y una especificidad de detección elevadas (100%); especialmente después de 24 horas de incubación a 37ºC y sobre el conjunto de las cepas ensayadas.
Claims (17)
- REIVINDICACIONES1.-Procedimiento de identificación de bacterias del grupo Bacillus cereus, que comprende las etapas que consisten en:
- •
- poner en contacto, en un recipiente, una muestra susceptible de contener bacterias del grupo Bacillus cereus, un medio de reacción que comprende al menos un sustrato fluorescente de PC-PLC y un inhibidor de bacterias Gram negativas;
- •
- incubar el conjunto;
- •
- identificar las bacterias del grupo Bacillus cereus por detección de la reacción de hidrólisis del sustrato de PC-
PLC; caracterizado porque el pH del medio de reacción y el tiempo necesario para la detección de la reacción de hidrólisis del sustrato de PC-PLC utilizado, están adaptados de tal modo que dicha reacción de hidrólisis por las bacterias del grupo Bacillus cereus es detectada antes de que la hidrólisis del sustrato de PC-PLC por las bacterias Gram positivas distintas de las que pertenecen al grupo Bacillus cereus y potencialmente presentes en la muestra, no pueda detectarse. - 2.- Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el pH del medio de reacción está comprendido entre 6,8 y 8,0.
- 3.- Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el tiempo necesario para la detección de la hidrólisis del sustrato de PC-PLC, está comprendido entre 6 y 30 horas.
- 4.- Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que el medio de reacción está en forma líquida, de gel o sólida.
- 5.- Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que el medio de reacción es un medio de cultivo.
- 6.- Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, que comprende una etapa previa de enriquecimiento de la muestra.
- 7.- Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que el medio comprende, además, al menos un segundo sustrato, cromógeno o fluorescente.
- 8.- Procedimiento según la reivindicación precedente, en el que el segundo sustrato es un sustrato de PI-PLC que permite discriminar Bacillus anthracis de Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus weihenstephanensis, Bacillus mycoides y Bacillus pseudomycoides.
- 9.- Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque es igualmente posible una enumeración de las bacterias del grupo Bacillus cereus.
- 10.- Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que el recipiente está tomado del grupo constituido por microplacas, microcúpulas, microtubos, capilares o placas de muchos pocillos.
- 11.- Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que el sustrato fluorescente de PC-PLC corresponde al 4 MU-CP (4-metil-umbeliferil-colina fosfato)
- 12.- Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que las bacterias del grupo Bacillus cereus están escogidas entre Bacillus cereus, Bacillus anthracis, Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides, Bacillus pseudomycoides y Bacillus weihenstephanensis, y las otras bacterias están escogidas entre Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii, Staphylococcus o las otras especies del género Bacillus spp. tales como Bacillus subtilis, Bacillus sphaericus, Bacillus circulans, Bacillus lentus, Bacillus pumilus, Bacillus megaterium y Paenibacillus polymyxa.
- 13.- Kit de diagnóstico que permite la utilización del procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, y que comprende un medio de reacción selectivo o no, cuyo medio comprende al menos un inhibidor de bacterias Gram negativas y un sustrato fluorescente de PC-PLC.
- 14.- Kit de diagnóstico según la reivindicación precedente, que comprende, además, un recipiente, tomado del grupo constituido por microplacas, microcúpulas, microtubos, capilares y placas de muchos pocillos.
- 15.- Kit de diagnóstico según una de las reivindicaciones 13 ó 14, en el que el sustrato fluorescente de PC-PLC corresponde al 4 MU-CP (4-metil-umbeliferil-colina fosfato).
- 16.- Kit de diagnóstico según una de las reivindicaciones 13 a 15, en el que el medio de reacción comprende, además, al menos un segundo sustrato, cromógeno o fluorescente.
- 17.- Kit de diagnóstico según la reivindicación 16, en el que el segundo sustrato es un sustrato de PI-PLC que permite discriminar Bacillus anthracis de Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus weihenstephanensis, Bacillus mycoides y Bacillus pseudomycoides.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR0904470A FR2950363B1 (fr) | 2009-09-18 | 2009-09-18 | Procede d'identification de bacteries du groupe bacillus cereus |
| FR0904470 | 2009-09-18 | ||
| PCT/FR2010/051925 WO2011033224A1 (fr) | 2009-09-18 | 2010-09-16 | Procede d'identification de bacteries du groupe bacillus cereus |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2428076T3 true ES2428076T3 (es) | 2013-11-05 |
Family
ID=42079005
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES10770572T Active ES2428076T3 (es) | 2009-09-18 | 2010-09-16 | Procedimiento de identificación de bacterias del grupo Bacillus cereus |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8871465B2 (es) |
| EP (1) | EP2478112B1 (es) |
| KR (1) | KR101747347B1 (es) |
| AU (1) | AU2010297125B2 (es) |
| ES (1) | ES2428076T3 (es) |
| FR (1) | FR2950363B1 (es) |
| WO (1) | WO2011033224A1 (es) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9322048B2 (en) * | 2009-09-18 | 2016-04-26 | Biomerieux, S.A. | Kit for identifying bacteria from the Bacillus cereus group |
| KR101455176B1 (ko) * | 2012-11-30 | 2014-10-27 | 한국과학기술연구원 | ｙｑｊＬ유전자 발현 산물의 형광 영상화를 통한 바실러스 서브틸리스 검출 방법 |
| CN104630174B (zh) * | 2013-11-07 | 2019-09-27 | 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 | 磷脂酶c突变体及其用途 |
| FR3015522B1 (fr) | 2013-12-24 | 2017-02-24 | Biomerieux Sa | Utilisation d'au moins un substrat de carboxylesterase et/ou de triacylglycerol-lipase pour la detection des bacteries du groupe bacillus cereus |
| KR101649604B1 (ko) * | 2014-08-08 | 2016-08-22 | (주) 센서젠 | B. cereus의 특이적 검출을 위한 새로운 배지 |
| JP6975701B2 (ja) * | 2017-12-12 | 2021-12-01 | 水ｉｎｇ株式会社 | 枯草菌の単離方法、その枯草菌、枯草菌を含む微生物製剤、枯草菌単離用培地セット |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6558917B2 (en) * | 1998-03-23 | 2003-05-06 | Biosynth Ag | Potentially fluorogenic compounds and plating media containing same |
| US6284517B1 (en) * | 1999-05-28 | 2001-09-04 | Lawrence Restaino | Plating media for the presumptive identification of Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis |
| DE60001979T2 (de) * | 2000-12-27 | 2004-08-19 | Biosynth Ag | Neue Substrate zur Detektion von mikrobiellen Metaboliten |
| US7309580B2 (en) * | 2002-07-05 | 2007-12-18 | R&F Products, Inc. | Chromogenic plating medium for the rapid presumptive identification of Bacillus anthrasis, Bacillus cereus, and Bacillus thuringiensis |
| FR2935002B1 (fr) * | 2008-08-13 | 2014-09-05 | Biomerieux Sa | Milieu de culture permettant de differencier staphylococcus aureus des staphylococcus a coagulase negative |
-
2009
- 2009-09-18 FR FR0904470A patent/FR2950363B1/fr active Active
-
2010
- 2010-09-16 US US13/496,422 patent/US8871465B2/en active Active
- 2010-09-16 KR KR1020127010006A patent/KR101747347B1/ko active Active
- 2010-09-16 ES ES10770572T patent/ES2428076T3/es active Active
- 2010-09-16 EP EP10770572.5A patent/EP2478112B1/fr active Active
- 2010-09-16 WO PCT/FR2010/051925 patent/WO2011033224A1/fr active Application Filing
- 2010-09-16 AU AU2010297125A patent/AU2010297125B2/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP2478112A1 (fr) | 2012-07-25 |
| KR20120099214A (ko) | 2012-09-07 |
| AU2010297125A1 (en) | 2012-03-29 |
| KR101747347B1 (ko) | 2017-06-14 |
| AU2010297125B2 (en) | 2015-05-21 |
| US20120171709A1 (en) | 2012-07-05 |
| FR2950363A1 (fr) | 2011-03-25 |
| EP2478112B1 (fr) | 2013-06-26 |
| FR2950363B1 (fr) | 2011-08-26 |
| US8871465B2 (en) | 2014-10-28 |
| WO2011033224A1 (fr) | 2011-03-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US12221646B2 (en) | Method for the rapid determination of susceptibility or resistance of bacteria to antibiotics | |
| US9926586B2 (en) | Rapid method for detection of Salmonella live vaccine strains | |
| ES2428076T3 (es) | Procedimiento de identificación de bacterias del grupo Bacillus cereus | |
| AU2003283484C1 (en) | Method for detecting and counting micro-organisms in a sample | |
| US9347888B2 (en) | Detection of bacteria exhibiting a resistance to carbapenems | |
| Elisseeva et al. | Performance assessment of the two oxygen sensor based respirometric platforms with complex media and in selective bacterial assays | |
| ES2663235T3 (es) | Procedimiento de detección de bacterias productoras de carbapenemasas de tipo OXA-48 | |
| ES2647451T3 (es) | Medio de reacción para las bacterias Vibrio | |
| RU2275429C2 (ru) | Питательная смесь и способ идентификации и раннего определения количества грамотрицательных микроорганизмов | |
| US20130330756A1 (en) | Detection of bacteria exhibiting enzymatic resistance to carbapenems | |
| US10351896B2 (en) | Use of at least one substrate of carboxylesterase and/or triacylglycerol lipase for detecting bacteria of the group Bacillus cereus | |
| US20100297692A1 (en) | Reaction medium for detecting and/or identtifying staphyloccous aureus | |
| US9322048B2 (en) | Kit for identifying bacteria from the Bacillus cereus group | |
| ES2666132T3 (es) | Medio de detección de microorganismos que comprende al menos un alquil(tio)glucósido | |
| WO2002020829A1 (es) | Medio de cultivo y método para la identificación de microorganismos gram-negativos | |
| JP5726410B2 (ja) | 腸管出血性大腸菌検出用培地および検出方法 | |
| JP2015504684A (ja) | アゾレダクターゼ活性による微生物のインビトロ検出 | |
| ES2529132T3 (es) | Medio de cultivo de microorganismos que comprende el ácido para-aminobenzoico como agente selectivo | |
| JP2013536680A (ja) | Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを検出および／または同定するための、β−グルコシダーゼ活性化剤の使用 | |
| Papkovsky et al. | Performance Assessment of the Two Oxygen Sensor Based Respirometric Platforms with Complex Media and in Selective Bacterial Assays | |
| JP2017079733A (ja) | カンジダ鑑別用発色培地 |