KR101649604B1 - B. cereus의 특이적 검출을 위한 새로운 배지 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 배지 조성물에 크로모젠으로 5-브로모(Bromo)-4-클로로(chloro)-3-인돌일 인산(indolyl phosphate)을 첨가하는 것을 특징으로 하는 바실러스 세레우스를 특이적으로 검출하기 위한 배지 조성물 및 그 용도에 관한 것이다.

Description

B. cereus의 특이적 검출을 위한 새로운 배지{A novel media for specifically detecting Bacillus.cereus}
본 발명은 배지 조성물에 크로모젠으로 5-브로모(Bromo)-4-클로로(chloro)-3-인돌일 인산(indolyl phosphate)을 첨가하는 것을 특징으로 하는 바실러스 세레우스를 특이적으로 검출하기 위한 배지 조성물 및 그 용도에 관한 것이다.
바실러스 세레우스는 상재균으로서 쌀을 비롯한 곡류, 야채, 육류 등에 다양한 식품에 널리 분포한다. 바실러스 세레우스의 감염량(infection dose)은 환자의 면역상태에 따라 다르나 다른 식중독균에 비해 매우 높기 때문에 정성보다는 정량이 우선시 되어 세계 각국은 바실러스에 대한 정량 기준을 가지고 있다. 한국에서도 바실러스 세레우스의 정량기준이 있어서 분유나 유아용식품 등에서는 100 CFU/g이하, 무순이나 샐러드 등에서는 1000 CFU/g 이하, 된장, 고춧가루 등의 조미식품에서는 10000 CFU/g 이하의 바실러스 세레우스 기준을 가지고 있다. 이러한 바실러스 세레우스의 정량 검출은 배지를 사용한 표준화된 방법이 널리 사용되고 있다.
대표적으로 사용되는 바실러스 세레우스 선택배지는 MYP (Mannitol-Yolk-PolymyxinB Agar)와 PEMBA (polymixinB-pyruvate-egg yolk-mannitol bromothymol blue agar), KG agar 등이 있다. 이러한 배지는 바실러스 세레우스의 lecithinase반응을 통해 egg yolk와 반응하여 불투명한 환을 형성하며, 만니톨을 분해하지 못하는 균의 성질을 이용하는 것이 특징이다.
그러나 최근에는 바실러스 세레우스 크로모제닉 배지가 많이 개발되고 있다. 크롬배지(chromogenic media)라 함은 기질-효소 반응을 사용하여 검출하고자 하는 목적균만 특이적인 색깔로 나오게 하여 쉽게 균 집락구분이 가능하도록 개발된 배지로서 생화학적 성질을 주로 사용하는 일반배지(conventional agar)와는 다른 개념이다. 이때 사용되는 배지내의 특이기질을 크로모젠(chromogen)이라고 하며, 이 크로모젠이 균 내의 특이효소와 결합하여 특정 반응을 하게 된다. 해당 반응으로 인하여 균의 집락은 특이한 색깔을 띄게 된다.
현재 바실러스 세레우스 크롬배지로는 옥소이드사의 Brillance 크롬배지, R&F 사의 크롬배지, 비오메리으사의 바카라 배지 등이 있다. 이러한 배지에 크로모젠으로 사용되는 것은, 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-베타-D-glucopyranoside (beta-D-glucosidase 반응유도), 5-Bromo-4-chloro-3- myo-inositol 1-phosphate (phosphatidylinositol-specific phospholipase C (PI-PLC) 반응유도) 등이 대표적이며, 몇몇 크로모젠은 공개되지 않고 있다.
[선행 특허문헌]
대한민국 특허공개번호 제10-2014-0047776호
본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 B. cereus의 특이적 검출을 위한 새로운 Chromogenic 배지를 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 배지 조성물에 크로모젠으로 5-브로모(Bromo)-4-클로로(chloro)-3-인돌일 인산(indolyl phosphate)을 첨가하는 것을 특징으로 하는 바실러스 세레우스를 특이적으로 검출하기 위한 배지 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 배지 조성물은 아가 베이스, 항생제, 성장 인자 및 난황을 추가로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 조성물을 식품에 처리하여 해당 식품으로부터 바실러스 세레우스를 특이적으로 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 식품은 팥죽, 계란 샌드위치, 야채샐러드, 무순, 및 새싹 믹스로 구성된 군으로부터 선택된 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 배지 조성물에 크로모젠으로 5-브로모(Bromo)-4-클로로(chloro)-3-인돌일 인산(indolyl phosphate)을 첨가하는 것을 포함하는 바실러스 세레우스를 특이적으로 검출하기 위한 배지 조성물의 제조방법을 제공한다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명에서는 새로운 크로모제닉 기질로서 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate를 사용하여 크롬배지를 만들었다. 본 기질은 alkaline phosphatase 반응을 이용하여 바실러스 세레우스를 특이적으로 짙은 청록색의 중심(center)에 흰색의 가장자리형태로 보이게 함을 확인하였다.
특히 본 발명자들이 선정한 Alkaline phosphatase는 바실러스 세레우스의 크로모젠으로서는 최초로 사용되는 물질로서 가격경쟁력도 뛰어났다. 아래와 같이 시그마에서 판매되는 바실러스 세레우스 배지의 크로모젠의 가격을 비교한 결과 본 팀이 선정한 크로모젠은 기존 제품 가격의 1/15~1/7 수준이었다 (표 1). 해당 크로모젠을 사용하여 개발한 선택배지는 아래의 추가적인 실험을 통해서 성능 역시 뛰어남을 확인하였다. 개발된 배지는 아래에서 통상 B. cereus chromogenic agar (BCCA)라고 칭하였다.
관련 반응 크로모젠 이름 회사
(물품번호) 		가격 단가
( mg 당)
B-D-glucosidase 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl 베타-D-glucopyranoside Sigma
(B4527)		 $307/25mg $12.3/mg
PI-PLC reaction 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-myo-inositol 1-phosphate Sigma
(38896)		 $296/50mg $5.92/mg
Alkaline phosphatase
(본 팀 개발 크로모젠)		 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Sigma (B6149) $43.6/50mg ($0.88/mg
표 1은 바실러스 세레우스의 검출에 사용되는 주요 크로모젠의 가격비교
본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 배지는 특히 바실러스 세레우스 균을 양성으로 구분하고(민감도), 아닌 집락은 배제하는 능력이(선택성) 다른 배지에 비하여 우수하였고, 다양한 종류의 식품에서 바실러스 세레우스를 잘 회복시키고 선택성 및 우수성이 타 배지에 비하여 우수하였다.
도 1은 4가지 바실러스 세레우스 균주를 BCCA에 도말하였을 때 집락생성 모습: 청록색의 중심에 하얀 가장자리, 그리고 난황양성을 의미하는 혼탁한 환을 보임.
도 2는 도에서 빨간색 원 안에 있는 것이 의심집락이다. 개발된 BCCA 배지는 의심집락만 떠서 구분이 용이한 반면, 다른 배지는 의심집락외에 다른 집락이 구분을 방해하고 있다. MYP 배지와 PEMBA 배지는 의심집락의 구분자체가 가지 않고, CBC와 Bacara 배지는 하얗거나 청록색의 좁쌀 같은 경쟁집락이 함께 보인다. 그러나 BCCA는 의심집락만 확인된다. 이는 실제 식품 시료에서 BCCA 배지의 높은 선택성을 의미한다.
이하 본 발명을 비한정적인 실시예를 통하여 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재한 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
실시예 1: 배지 조성 및 제조
본 발명에서 개발된 배지의 조성은 아래 표 2에 기재되어 있다. 해당 배지는 크로모젠으로서 바실러스 세레우스를 특이적인 색으로 보이게 하고, 항생물질을 통하여 다른 경쟁균을 억제해주는 동시에, 난황반응을 통해서 바실러스 세레우스에만 특이적인 환까지 나타나도록 선택성을 향상시켰다.
성분 (회사) 용량 (1L 당)
Agar base Blood agar base (Oxoid) 40 g
Antibiotic agent PolymyxinB (Oxoid)
및 세파계열 항생제		 PolymyxinB 100,000 IU
세파계열 항생제 1-30mg
Growth supplement Sodium pyruvate (Sigma) 5 g
Chromogen 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (Sigma) 10-500mg
Egg yolk emusion Egg yolk emusion (Oxoid) 50ml
표 2는 본 발명의 배지의 성분배합 표이다.
본 실시예에서는 세파계열 항생제로 ceftazidime을 사용하였다.
실험예 1: 순수배양액의 접종실험
바실러스 세레우스 순수배양액을 일정량 접종하여 실제 바실러스 세레우스만 특이적으로 청록색의 중심에 하얀 가장자리, 그리고 난황양성을 의미하는 혼탁한 환을 보이는 집락을 형성하는지 확인하였다. 또한 바실러스 세레우스 이외의 균도 접종하여 경쟁집락은 배제되는지도 확인하였다.
표준균주인 ATCC 균주를 주로 사용하였으며, 접종은 tooth-picking 방법으로 single colony를 배지에 찍어 접종하는 방법으로 수행하였다. 특히 본 배지의 특이성을 확인하기 위하여 미국 FDA나 ISO에서 사용하는 MYP, PEMBA 등의 conventional 배지와 CBC (Oxoid), Bacara (비오메리으) 등과 같이 상용화되어 국제적으로 사용되는 크롬 배지를 함께 비교하였다.
도 1에서 보이는 것과 같이 개발된 배지는 모든 바실러스 세레우스에서 청록색의 중심에 하얀 가장자리, 그리고 난황양성을 의미하는 혼탁한 환을 보이는 집락을 형성하여 전형적인 성장(typical growth, TG)를 보임을 확인하였다(도 1 및 표 3 참조).
또한 바실러스 세레우스가 아닌 경우(다른 바실러스 종이거나 다른 속의 균일 경우)에는 자라지 않거나(NG, no growth), 전형적이지 않은 집락을 보여 (NTG, growth but non-typical shape of colony) 손쉽게 구분이 가능하였다. 특히 바실러스 세레우스 균을 양성으로 구분하고(민감도), 아닌 집락은 배제하는 능력은(선택성) MYP, PEMBA, CBC 보다 우수하였다.
Strains 배지종류
B. cereus B. cereus ATCC 21366 MYP a PEMBA CBC Bacara BCCA
Other Bacillus
strains 		B. cereus ATCC 21772 TG TG NTG TG TG
Non - Bacillus
strains 		B. cereus ATCC 14579 TG TG TG TG TG
B. cereus ATCC 10876 TG TG TG TG TG
B. cereus ATCC 21768 TG TG TG TG TG
B. cereus , 3 clinical isolates TG TG TG TG TG
B. cereus , 12 food isolates TG TG TG TG TG
B. mycoides ATCC 6462 TG TG TG TG TG
B. licheniformis ATCC 21415 TG NG NG TG TG
B. sphaericus ATCC 33203 NTG NTG NG NG NG
B. subtilis ATCC 21697 NTG NTG NG NG NG
B. subtilis ATCC 6633 NTG NTG NG NG NG
B. megaterium ATCC 10778 NTG NTG NG NG NG
B. circulans ATCC 21783 NG NG NG NG NG
B. circulans ATCC 9500 NG NG NG NG NG
E. faecalis ATCC 51299 NG NG NG NG NG
E. faecium ATCC 70021 NTG NTG NG NTG NTG
L. monocytogenes ATCC 51776 NTG NTG NTG NG NTG
S. aureus ATCC 6538 NTG NTG NG NG NG
P. mirabilis ATCC 7002 NTG NTG NG NTG NG
C. freundii ATCC 8090 NTG NTG NG NG NG
E. aerogenes ATCC 13048 NTG NG NG NG NG
E. coli ATCC 11775 NTG NG NG NG NG
E. coli ATCC 25922 NG NG NG NG NG
E. sakazakii ATCC 29544 NG NG NG NG NG
S. flexneri ATCC 12026 NG NG NG NG NG
S. Enteritidis A106 NG NG NG NG NG
표 3은 개발배지를 포함한 각종 배지의 바실러스 세레우스 및 경쟁집락의 집락형성을 나타내는 표로, 표에서 a TG, typical growth (예상하는 양성의심 집락 형태로 잘 자람); NTG, growth but non-typical shape of colony (집락이 자라긴 하였으나 바실러스 세레우스 양성의심 집락의 형태가 아님); NG, no growth (아무것도 안 자람)
실험예 2: 식품접종 실험
실제 식품에서 해당 배지의 성능이 어떠한지 확인하기 위하여 바실러스 세레우스를 인위적으로 식품에 접종한 후, 회복율을 비교하였다. 국내에 정량기준이 있는 즉석섭취식품(인스턴트 팥죽, 계란 샌드위치), 신선편의식품(야채샐러드, 무순, 새싹믹스)를 대상으로 균을 접종한 후 배지간의 균회복율과 선택성 비교하였다. 접종량은 배지 위에서 20~200개 사이의 집락이 나오도록 임의로 설정하였으며, 접종균은 5개의 균주를 cocktail mix하여 준비하였다.
위에서 언급한 5개의 배지에서 회복율을 확인하였으며 그 양상은 아래 표와 같다(표 4). 분석결과 개발된 배지는 기존 배지와 비교했을 때 팥죽, 계란샌드위치, 야채샐러드에서 균수에 있어 전혀 통계학적 유의차를 보이지 않았다. 무순, 새싹믹스에서는 MYP와 PEMBA 배지는 경쟁집락의 과도한 성장으로 인해 계수가 불가능 했으나 본 팀이 개발한 배지는 계수가 가능했으며, 비록 통계학적 유의차는 없었으나 균수도 5개의 배지중에 가장 높은 수준을 보였다. 따라서 개발된 BCCA 배지는 다양한 종류의 식품에서 바실러스 세레우스를 잘 회복시키는 것으로 나타났다.
시료
(접종량*)		 각 배지에서의 회복균수 비교*
MYP PEMBA CBC BACARA New agar
팥죽**
(3.91±0.17)		 3.88±0.15 a 3.82±0.18 a 3.90±0.22 a 3.89±0.18 a 3.85±0.25 a
계란 샌드위치**
(3.92±0.20)		 3.76±0.16 a 3.75±0.20 a 3.81±0.23 a 3.87±0.19 a 3.82±0.23 a
야채 샐러드**
(3.89±0.12)		 3.84±0.06 a 3.81±0.09 a 3.86±0.04 a 3.87±0.08 a 3.87±0.08 a
무순**
(3.86±0.12)		 계수안됨*** 계수불가 3.77±0.12 a 3.79±0.14 a 3.80±0.14 a
새싹믹스**
(3.81±0.12)		 계수불가 계수불가 3.77±0.13 a 3.78±0.11 a 3.79±0.09 a
표 4는 식품에 바실러스를 인위접종한 후 5개의 배지에서 회복균수 비교 표로,
* Mean ±SD, Log CFU/g,
** 각 행마다 다른 알파벳은 통계학적 유의차 (P < 0.05)가 있음을 의미하고,
*** 계수불가(N.C., non-countable)는 목적균의 생장을 방해하는 경쟁집락이 과하게 자라서 목적균의 수를 측정할 수 없음을 의미한다.
특히 도 2에서 확인할 수 있듯이, 본 발명자들이 개발한 배지는 다른 배지에 비해 선택성이 뛰어났다(도 2). 무순, 새싹 믹스에서 다른 식품의 경우 경쟁집락이 너무 많이 떠서 바실러스 세레우스의 정상적인 구분이 어려운 반면, 본 팀개발 배지는 경쟁집락이 뜨지 않아 바실러스 세레우스의 구분이 매우 용이하였다. 결론적으로 본 팀 개발 배지는 다른 배지에 비해 우수한 선택성을 보였다.

Claims (5)

  1. 배지 조성물에 크로모젠으로 5-브로모(Bromo)-4-클로로(chloro)-3-인돌일 인산(indolyl phosphate)을 첨가하는 것을 특징으로 하는 바실러스 세레우스를 특이적으로 검출하기 위한 배지 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 배지 조성물은 아가 베이스, 항생제, 성장 인자 및 난황을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
  3. 제 1항 또는 제2항의 조성물을 식품에 처리하여 해당 식품으로부터 바실러스 세레우스를 특이적으로 검출하는 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 식품은 팥죽, 계란 샌드위치, 야채샐러드, 무순, 및 새싹 믹스로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 배지 조성물에 크로모젠으로 5-브로모(Bromo)-4-클로로(chloro)-3-인돌일 인산(indolyl phosphate)을 첨가하는 것을 포함하는 바실러스 세레우스를 특이적으로 검출하기 위한 배지 조성물의 제조방법.

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