KR101217671B1

KR101217671B1 - 바실러스 세레우스 검출을 위한 선택배지 및 그 검출방법

Info

Publication number: KR101217671B1
Application number: KR1020100110277A
Authority: KR
Inventors: 서건호; 천정환
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2010-11-08
Filing date: 2010-11-08
Publication date: 2013-01-02
Also published as: KR20120048860A

Abstract

본 발명은 바실러스 세레우스 검출을 위한 선택배지 및 그 배지를 이용한 바실러스 세레우스 검출방법에 관한 것이다.

Description

바실러스 세레우스 검출을 위한 선택배지 및 그 검출방법{A selective medium for detecting B. cereus and a detection method using the same}

바실러스 세레우스는 상재균으로서 쌀을 비롯한 곡류, 야채, 육류 등에 다양한 식품에 널리 분포한다. 바실러스의 감염량은 환자의 면역상태에 따라 다르나 다른 식중독균에 비해 매우 높기 때문에 정성보다는 정량이 우선시 되어 세계 각국은 바실러스에 대한 정량 기준을 가지고 있다. 한국에서도 바실러스의 정량기준이 있어서 분유나 유아용식품 등에서는 100 CFU/g이하, 무순이나 샐러드 등에서는 1000 CFU/g 이하, 된장, 고춧가루 등의 조미식품에서는 10000 CFU/g 이하의 바실러스 세레우스 기준을 가지고 있다.

한편, 선택배지는 특정미생물의 생화학적 특성을 이용하여 대상으로 하는 미생물을 다른 미생물과 구별을 두면서 선택적으로 검출하고자 할 때 사용된다. 선택배지는 1) 검출대상으로 하는 균의 선택적 증균, 2) 검출대상으로 하지 않는 균들의 성장 억제, 3) 검출대상으로 하는 균을 그 이외의 균과 구별할 수 있는 선택성 부여를 목적으로 하므로 위의 세 가지 기능을 할 수 있는 성분을 포함하고 있어야 한다. 선택배지는 특정 미생물의 검출에서 가장 기본적으로 요구되는 도구이기 때문에 효과적인 선택배지를 개발하고, 배지의 효율을 증진시키고자하는 노력은 계속되어왔다.

바실러스 세레우스의 정량 검출은 배지를 사용한 표준화된 방법이 널리 사용되고 있다. 바실러스 세레우스 선택배지는 MYP (Mannitol-Yolk-PolymyxinB Agar)와 PEMBA (polymixinB-pyruvate-egg yolk-mannitol bromothymol blue agar), KG agar 등이 있다. 바실러스 세레우스는 lecithinase반응을 통해 egg yolk와 반응하여 불투명한 환을 형성하며, 만니톨을 분해하지 못하는 것이 특징이다. 또한 혈액에 대해 베타-용혈반응이 있기 때문에 경우에 따라 혈액배지에 항생제만 첨가하여 선택배지로 사용하는 경우도 있다. 첨가되는 항생제는 그람음성을 억제하는 polymyxinB를 주로 쓰는데 대부분의 바실러스 세레우스는 이 항생제에 대하여 상당한 내성을 보이고 있다. 기존에 가장 널리 사용되는 배지는 MYP 배지이며 보통 만니톨 분해, egg yolk를 통한 환을 통하여, 집락을 구분하고 균을 검출한다. 국내 식품공전에서는 바실러스 검출시, MYP 배지를 이용하여 분홍색의 불투명한 환을 보이는 균을 검출한 후, 다시 균을 계대하여 혈액배지를 사용하여 베타 용혈성을 테스트한다.

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 바실러스 세레우스 검출을 위한 선택배지를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 식품 중에 존재하는 바실러스 세레우스를 선택적으로 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 증류수 900m1 중에 혈액 아가 베이스 20～50 g, 폴리믹신B 5만～20만 IU, 트리메토프림 2～6 mg, 소듐 파이루 베이트 5~20 g, 난황 에멀젼(Egg yolk emulsion) 30~50 mL, 양 혈액 20~30 mL, 우태아 혈청 20~30 mL 및 염화나트륨 1~5 g을 혼합하여 제조된 미생물 검출용 배지 조성물을 제공한다.

또 본 발명은 증류수 900m1 중에 혈액 아가 베이스 20～50 g, 폴리믹신B 5만～20만 IU, 트리메토프림 2～6 mg, 소듐 파이루 베이트 5~20 g, 난황 에멀젼(Egg yolk emulsion) 30~50 mL, 양 혈액 20~30 mL, 우태아 혈청 20~30 mL 및 염화나트륨 1~5 g을 혼합하여 제조된 바실러스 세레우스 검출용 선택 배지 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 어떤 시료 내 바실러스 세레우스를 확인 또는 분리하기 위한 방법으로서, 시료를 본 발명의 상기 배지에 접종한 후 16~48 시간, 바람직하게는 24시간 동안 배양하고, 배지상에 형성된 군집체의 발색 형태 또는 환를 관찰함으로써 시료 내 바실러스 세레우스를 검출하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 발효 식품 중에 존재하는 바실러스 세레우스를 확인 또는 분리하기 위한 방법으로서, 시료를 제 2항의 배지에 접종한 후 16~48 시간, 바람직하게는 24시간 동안 배양하고, 배지상에 형성된 군집체의 발색 형태 또는 환를 관찰함으로써 발효 식품 중에 존재하는 바실러스 세레우스를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 발효식품은 된장 또는 고추장인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 야채에 존재하는 바실러스 세레우스를 확인 또는 분리하기 위한 방법으로서, 시료를 제 2항의 배지에 접종한 후 16~48 시간, 바람직하게는 24시간 동안 배양하고, 배지상에 형성된 군집체의 발색 형태 또는 환를 관찰함으로써 야채에 존재하는 바실러스 세레우스를 검출하는 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명에서 개발된 배지는 혈액과 난황(egg yolk)을 함께 첨가하여 용혈성과 난황에 의한 반응을 함께 관찰할 수 있으며 trimethoprim을 첨가하여 선택성을 더욱 향상시켰다.

본 발명을 통해서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에서 개발된 배지는 실험예 1의 분석결과를 통해서 통상적으로 판매되고 있는 MYP 배지 및 혈액배지와 비교했을 때 통계학적 유의차가 없는 회수율을 보였고, 이는 본 발명의 배지를 사용하여도 통계학적 유의차 없는 균의 회복율을 기대할 수 있다는 것을 의미하며, 국내에 정량기준이 있는 전통식품인 된장과 야채샐러드를 실험대상 식품으로 선정하여 균을 접종한 후 배지간의 선택성을 육안으로 비교한 결과 대조군 배지인 MYP에서는 정상세균총이 많아 집락을 picking 하기 어렵고, 집락자체도 바실러스 세레우스가 띄는 색인 분홍색을 띄지 않았으나, 본 발명의 배지에서는 집락이 뚜렷하고 모두 하얀색을 보였고, 이중의 용혈대도 관찰되어 선택성을 더욱 향상시켰다.

도 1은 본 발명의 C 배지(도 1a)와 대조군으로 사용된 MYP 배지(도 1b)에 순수배양액을 접종했을 때의 사진이다.
도 2는 된장에서의 두 가지 배지의 비교 사진이다. 도 2에서 본 발명의 C 배지(도 2a에서의 집락구분이 대조군인 MYP(도 2b)에 비해서 매우 좋은 것을 확인할 수 있다. MYP에서는 정상세균총이 많아 집락을 picking 하기 어렵고, 집락자체도 바실러스 세레우스가 띄는 색인 분홍색을 띄지 않았으나, C 배지에서는 집락이 뚜렷하고 모두 하얀색을 보였다. 이중의 용혈대는 관찰되었으나 순수배양액에 비해서는 덜 뚜렷하게 나왔다.
도 3은 야채샐러드에서의 두 가지 배지의 비교 사진이다. 도 3에서 본 발명의 C 배지(도 3a)에서의 집락구분이 대조군인 MYP(도 3b)에 비해서 매우 좋은 것을 확인 할 수 있다. 특히 MYP배지는 집락과 환이 모두 분홍색이지만 C 배지는 집락은 하얗고 환은 불투명한 회색이기 때문에 집락의 구분이 더 쉬웠다. 이중의 용혈대는 관찰되었으나 순수배양액에 비해서는 덜 뚜렷하게 나왔다.

이하, 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

비교예 : MYP 배지의 제조

MYP배지는 900mL의 1차 증류수에 37g의 MYP 아가 베이스를 첨가하고 고압멸균을 실시한다. 고압멸균이 끝난 후 배지를 50~55℃로 식히고, 난황 에멀젼(100mL)과 polymyxinB (100,000IU)를 첨가해 준다. 첨가해 준 후, 페트리 디쉬에 20-25ml 가량 분주하고 냉장온도에 보관하여 사용한다.

실시예 : 본 발명의 선택배지의 제조

본 발명의 배지(이하, 본 발명의 명세서에서는 'C배지'라고 함)의 성분배합은 표 1과 같다.

	성분	용량
1차 증류수		900mL
아가 베이스	Blood agar base (Oxoid)	40 g
항생물질	PolymyxinB (Oxoid) Trimethoprim (Sigma)	PolymyxinB : 100,000 IU Trimethoprim : 4 mg
성장 보충제	Sodium pyruvate (Sigma)	10 g
선택적 보충제	Egg yolk emulsion	50 mL
	Sheep Blood (Union Lab)	25 mL
	Fetal Bovine Serum	20 mL
	Sodium Chloride	3.8 g
	Sodium Chloride	3.8 g

상기 표 1은 본 발명의 C배지의 성분배합을 나타낸 표이다.

혈액배지는 모든 균을 잘 자라게 하는 영양배지이므로 본 배지의 기본배지로 선택되었다. 혈액은 sheep blood를 2.5% 넣고 fetal bovine serum을 2.5% 넣어 총 4.5%를 넣었다. 일반적인 혈액배지에는 혈액만 들어가나 세럼을 같이 넣을 경우 바실러스 세레우스의 용혈환의 구분이 용이하여 본 발명에서는 두 가지를 함께 넣어 주었다. 소금을 3.8g 추가하였으며, 성장촉진과 독성분해를 위해 sodium pyruvate를 10g 넣었다. Egg yolk emulsion은 50mL 넣었다. polymyxinB 외에 추가적인 항생제를 넣어 선택성을 향상시키기 위하여 Trimethoprim은 L당 4 mg을 첨가해 주었다. 혈액배지는 autoclave한 후, 50~55℃로 식힌 후 위에서 표에 나와 있는 supplement를 추가하여 배지를 제조하였다. C 배지에서 바실러스 세레우스의 집락은 하얀색으로 형성되며 두 개의 환을 보이는데, 안쪽의 환은 용혈과 egg yolk의 반응으로 인해 생기는 불투명한 환으로 옅은 회색이며, 바깥쪽의 환은 egg yolk로 인해서만 생기는 주황색의 불투명 환이다. 바실러스 세레우스의 경우 두 개의 환을 모두 보인다.

실험예 1: 순수배양액의 접종실험

순수배양액을 일정량 희석하여 0.1mL씩을 MYP배지와 C 배지, 혈액배지에 접종하였으며, 30℃에서 하루 배양 후 플레이트 위의 균을 세었을 때, 다음과 같은 결과가 나왔다. 실험은 3 반복하여 평균을 낸 후 통계학적으로 분석하였다. 참고로 혈액배지는 비선택 배지로서 모든 균에 대하여 회복율이 높은 것으로 알려져 있다.

	일반 혈액배지	MYP 배지	C 배지
1회	53개	48개	42개
2회	21개	22개	26개
3회	57개	39개	32개
평균¹ ⁾	43.67±19.73^a개	36.33±13.21^a 개	33.33±8.08^a 개

표 2는 순수배양액의 MYP배지, 혈액배지, C 배지에서의 집락형성을 비교한 표이다.

표 2에서 1)은 각 행의 알파벳이 같을 경우 통계학적 유의차가 (p<0.05) 없음을 의미한다. 통계분석은 SPSS ver 18.00을 이용하여 ANOVA로 Tukey method를 이용하여 분석하였다.

실험예 1의 분석결과 C 배지는 MYP 배지 및 혈액배지와 비교했을 때 통계학적 유의차가 없는 회수율을 보였다. 이는 C 배지를 사용하여도 통계학적 유의차 없는 균의 회복율을 기대할 수 있다는 것을 의미한다. 도 1은 순수배양액을 접종했을 때의 사진이다(도 1a 및 1b 참조).

실험예 2:실제 된장 및 야채 샐러드에서의 접종실험

국내에 정량기준이 있는 전통식품인 된장과 야채샐러드를 실험대상 식품으로 선정하여 균을 접종한 후 배지간의 선택성을 육안으로 비교하였다. 접종량은 배지 위에서 20~200개 사이의 집락이 나오도록 임의로 설정하였으며, 접종균은 ATCC 14579를 선정하였다. 그 결과를 비교한 사진은 아래와 같다 (도 2, 및 도 3 참조)

도 2는 된장에서의 두 가지 배지의 비교 사진이다. 도 2에서 본 발명의 C 배지(도 2a에서의 집락구분이 대조군인 MYP(도 2b)에 비해서 매우 좋은 것을 확인할 수 있다. MYP에서는 정상세균총이 많아 집락을 picking 하기 어렵고, 집락자체도 바실러스 세레우스가 띄는 색인 분홍색을 띄지 않았으나, C 배지에서는 집락이 뚜렷하고 모두 하얀색을 보였다. 이중의 용혈대는 관찰되었으나 순수배양액에 비해서는 덜 뚜렷하게 나왔다.

도 3은 야채샐러드에서의 두 가지 배지의 비교 사진이다. 도 3에서 본 발명의 C 배지(도 3a)에서의 집락구분이 대조군인 MYP(도 3b)에 비해서 매우 좋은 것을 확인 할 수 있다. 특히 MYP배지는 집락과 환이 모두 분홍색이지만 C 배지는 집락은 하얗고 환은 불투명한 회색이기 때문에 집락의 구분이 더 쉬웠다. 이중의 용혈대는 관찰되었으나 순수배양액에 비해서는 덜 뚜렷하게 나왔다.

Claims

삭제
증류수 900ml에 혈액 아가 베이스 20～50 g, 폴리믹신B 5만～20만 IU, 트리메토프림 2～6 mg, 소듐 파이루 베이트 5~20 g, 난황 에멀젼(Egg yolk emulsion) 30~50 mL, 양 혈액 20~30 mL, 우태아 혈청 20~30 mL 및 염화나트륨 1~5 g을 첨가하여 제조한 바실러스 세레우스 검출용 배지 조성물.
어떤 시료 내 바실러스 세레우스를 확인 또는 분리하기 위한 방법으로서, 시료를 제 2항의 배지에 접종한 후 16~48 시간 동안 배양하고, 배지상에 형성된 군집체의 발색 형태 또는 환를 관찰함으로써 시료 내 바실러스 세레우스를 검출하는 방법.
발효 식품 중에 존재하는 바실러스 세레우스를 확인 또는 분리하기 위한 방법으로서, 시료를 제 2항의 배지에 접종한 후 16~48 시간 동안 배양하고, 배지상에 형성된 군집체의 발색 형태 또는 환를 관찰함으로써 발효 식품 중에 존재하는 바실러스 세레우스를 검출하는 방법.
제 4항에 있어서, 상기 발효식품은 된장 또는 고추장인 것을 특징으로 하는 발효 식품 중에 존재하는 바실러스 세레우스를 검출하는 방법.
야채에 존재하는 바실러스 세레우스를 확인 또는 분리하기 위한 방법으로서, 시료를 제 2항의 배지에 접종한 후 16~48 시간 동안 배양하고, 배지상에 형성된 군집체의 발색 형태 또는 환를 관찰함으로써 야채에 존재하는 바실러스 세레우스를 검출하는 방법.