KR101642658B1 - 세포테탄을 포함하는 캠필로박터에 대한 민감성 및 선택성을 개선한 볼튼 배지 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents
세포테탄을 포함하는 캠필로박터에 대한 민감성 및 선택성을 개선한 볼튼 배지 조성물 및 그 제조방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR101642658B1 KR101642658B1 KR1020150081979A KR20150081979A KR101642658B1 KR 101642658 B1 KR101642658 B1 KR 101642658B1 KR 1020150081979 A KR1020150081979 A KR 1020150081979A KR 20150081979 A KR20150081979 A KR 20150081979A KR 101642658 B1 KR101642658 B1 KR 101642658B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- campylobacter
- weight
- coli
- culture medium
- sodium
- Prior art date
Links
- 241000589876 Campylobacter Species 0.000 title claims abstract description 57
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 title claims abstract description 23
- SRZNHPXWXCNNDU-RHBCBLIFSA-N cefotetan Chemical compound N([C@]1(OC)C(N2C(=C(CSC=3N(N=NN=3)C)CS[C@@H]21)C(O)=O)=O)C(=O)C1SC(=C(C(N)=O)C(O)=O)S1 SRZNHPXWXCNNDU-RHBCBLIFSA-N 0.000 title claims abstract description 18
- 229960005495 cefotetan Drugs 0.000 title claims abstract description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 title claims abstract description 9
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 18
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 18
- KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 2-oxoglutaric acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)C(O)=O KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 16
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 16
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims abstract description 9
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 108010059993 Vancomycin Proteins 0.000 claims abstract description 9
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 claims abstract description 9
- BTIJJDXEELBZFS-UHFFFAOYSA-K hemin Chemical compound [Cl-].[Fe+3].[N-]1C(C=C2C(=C(C)C(C=C3C(=C(C)C(=C4)[N-]3)C=C)=N2)C=C)=C(C)C(CCC(O)=O)=C1C=C1C(CCC(O)=O)=C(C)C4=N1 BTIJJDXEELBZFS-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims abstract description 9
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims abstract description 9
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 claims abstract description 9
- HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L sodium disulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S(=O)S([O-])(=O)=O HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 9
- 239000004296 sodium metabisulphite Substances 0.000 claims abstract description 9
- 235000010262 sodium metabisulphite Nutrition 0.000 claims abstract description 9
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 claims abstract description 9
- 229960003165 vancomycin Drugs 0.000 claims abstract description 9
- MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N vancomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=C2C=C3C=C1OC1=CC=C(C=C1Cl)[C@@H](O)[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H]3C(=O)N[C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](C3=CC(O)=CC(O)=C3C=3C(O)=CC=C1C=3)C(O)=O)=O)[C@H](O)C1=CC=C(C(=C1)Cl)O2)=O)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC)[C@H]1C[C@](C)(N)[C@H](O)[C@H](C)O1 MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N 0.000 claims abstract description 9
- MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N vancomycin Natural products O1C(C(=C2)Cl)=CC=C2C(O)C(C(NC(C2=CC(O)=CC(O)=C2C=2C(O)=CC=C3C=2)C(O)=O)=O)NC(=O)C3NC(=O)C2NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CC(C)C)NC)C(O)C(C=C3Cl)=CC=C3OC3=CC2=CC1=C3OC1OC(CO)C(O)C(O)C1OC1CC(C)(N)C(O)C(C)O1 MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 102000004407 Lactalbumin Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 108090000942 Lactalbumin Proteins 0.000 claims abstract description 8
- HWXBTNAVRSUOJR-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxyglutaric acid Natural products OC(=O)C(O)CCC(O)=O HWXBTNAVRSUOJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 229940009533 alpha-ketoglutaric acid Drugs 0.000 claims abstract description 8
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims abstract description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims abstract description 8
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 claims abstract description 7
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 claims abstract description 7
- IEDVJHCEMCRBQM-UHFFFAOYSA-N trimethoprim Chemical compound COC1=C(OC)C(OC)=CC(CC=2C(=NC(N)=NC=2)N)=C1 IEDVJHCEMCRBQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 229960001082 trimethoprim Drugs 0.000 claims abstract description 6
- 229960002668 sodium chloride Drugs 0.000 claims abstract 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 23
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 22
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 19
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 claims description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 4
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 claims description 4
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 claims description 3
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 claims description 3
- 230000006799 invasive growth in response to glucose limitation Effects 0.000 claims description 3
- 244000144977 poultry Species 0.000 claims description 3
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims 1
- 241000589877 Campylobacter coli Species 0.000 abstract description 4
- 241000589875 Campylobacter jejuni Species 0.000 abstract description 4
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 abstract 1
- 235000010633 broth Nutrition 0.000 description 30
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 16
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 13
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 5
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 5
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 5
- GCFBRXLSHGKWDP-XCGNWRKASA-N cefoperazone Chemical compound O=C1C(=O)N(CC)CCN1C(=O)N[C@H](C=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]1C(=O)N2C(C(O)=O)=C(CSC=3N(N=NN=3)C)CS[C@@H]21 GCFBRXLSHGKWDP-XCGNWRKASA-N 0.000 description 5
- 229960004682 cefoperazone Drugs 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 4
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 4
- 229930186147 Cephalosporin Natural products 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 229940124587 cephalosporin Drugs 0.000 description 3
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 description 3
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 3
- DSSYKIVIOFKYAU-XCBNKYQSSA-N (R)-camphor Chemical compound C1C[C@@]2(C)C(=O)C[C@@H]1C2(C)C DSSYKIVIOFKYAU-XCBNKYQSSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 229930183010 Amphotericin Natural products 0.000 description 2
- QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N Amphotericin A Natural products OC1C(N)C(O)C(C)OC1OC1C=CC=CC=CC=CCCC=CC=CC(C)C(O)C(C)C(C)OC(=O)CC(O)CC(O)CCC(O)C(O)CC(O)CC(O)(CC(O)C2C(O)=O)OC2C1 QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000723346 Cinnamomum camphora Species 0.000 description 2
- 206010016952 Food poisoning Diseases 0.000 description 2
- 208000019331 Foodborne disease Diseases 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 229940009444 amphotericin Drugs 0.000 description 2
- 229960000846 camphor Drugs 0.000 description 2
- 229930008380 camphor Natural products 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 229940112048 trimethoprim 20 mg Drugs 0.000 description 2
- DWPVVZZGGGCRRM-UHFFFAOYSA-N (4-methoxyphenyl)-(4-methylpiperazin-1-yl)methanone Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(=O)N1CCN(C)CC1 DWPVVZZGGGCRRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 241000366676 Justicia pectoralis Species 0.000 description 1
- 241000233870 Pneumocystis Species 0.000 description 1
- 206010039438 Salmonella Infections Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 241001148470 aerobic bacillus Species 0.000 description 1
- 230000008262 antibiotic resistance mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- CYQFCXCEBYINGO-IAGOWNOFSA-N delta1-THC Chemical class C1=C(C)CC[C@H]2C(C)(C)OC3=CC(CCCCC)=CC(O)=C3[C@@H]21 CYQFCXCEBYINGO-IAGOWNOFSA-N 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000003228 microsomal effect Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 238000001558 permutation test Methods 0.000 description 1
- 201000000317 pneumocystosis Diseases 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 206010039447 salmonellosis Diseases 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- -1 trimethprim Chemical compound 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
- C12Q1/045—Culture media therefor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/02—Food
- G01N33/025—Fruits or vegetables
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/02—Food
- G01N33/04—Dairy products
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/02—Food
- G01N33/12—Meat; Fish
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pathology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 세포테탄을 포함하는 캠필로박터에 대한 민감성 및 선택성을 개선한 볼튼 배지 조성물 및 그 제조방법 그리고 그 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 세포테탄을 포함하는 캠필로박터에 대한 민감성 및 선택성을 개선한 볼튼 배지 조성물 및 그 제조방법 그리고 그 용도에 관한 것이다.
캠필로박터는 그람 음성의 미호기성 세균으로서 인체에 감염되어 식중독을 일으키는 병원성 세균이다. 캠필로박터로 인한 식중독 사고는 전세계적으로 발생되고 있으며, 특히 북미와 유럽 등의 선진국에서는 Salmonella에 의한 감염증보다 발생빈도가 많을 정도로 문제가 되고 있다. 캠필로박터 종 중에서 가장 문제가 되는 종은 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni, C. jejuni)와 캠필로박터 콜리(Campylobacter coli, C. coli)이다. 식품 내 캠필로박터 검출 시, 국내외 공인검출법에서는 선택증균을 하여 균을 안정화 시키고, 균수를 늘린 후, 검출을 실시하고 있다.
일반적으로 선택증균에 사용하는 액체배지는 ISO, FDA BAM, USDA FSIS 등 국제적인 검출기관에서는 대부분 Bolton broth를 사용하고 있다. Bolton broth는 산소에 대한 독소분해력이 좋고 캠필로박터의 회복력이 뛰어나다고 알려져 있다. Bolton broth에는 다른 세균의 성장을 억제하기 위하여 다양한 항생제 supplement가 들어가게 되는데 첨가되는 항생제로는 cefoperazone, trimethprim, vancomycin, amphotericin B 등 네 가지가 있다. 이러한 조합은 식품, 환경샘플, 분변샘플 등에서 그람음성과 그람양성 경쟁세균총을 적절히 억제한다고 알려져 있으나, 실제 식품에서는 그람음성의 정상세균총을 억제하는데 한계가 있다고 밝혀져 왔다. 특히 extended-spectrum β-lactamase (ESBL)이라는 효소를 생성하는 E. coli의 경우 Bolton broth에서 억제되지 않고 살아남아, 캠필로박터의 선택적인 검출을 어렵게 하는 경우가 많다(Jasson, V., Sampers, I., Botteldoorn, N., Lopez-Galvez, F., Baert, L., Denayer, S., Rajkovic, A., Habib, I., De Zutter, L., Debevere, J., Uyttendaele, M., 2009. Characterization of Escherichia coli from raw poultry in Belgium and impact on the detection of Campylobacter jejuni using Bolton broth. International Journal of Food Microbiology 135, 248-253. Moran, L., Kelly, C., Cormican, M., McGettrick, S., Madden, R.H., 2011. Restoring the selectivity of Bolton broth during enrichment for Campylobacter spp. from raw chicken. Letters in Applied Microbiology 52, 614-618.).
ESBL 효소는 세균의 항생제 내성 기전의 하나로서 해당 효소는 cephalosporin계 항생제를 억제하는 효과를 지닌다. 세균이 이 효소를 만드는 경우 cephalosporin에 강한 내성을 보이는데, 일반적으로 캠필로박터 선택배지에는 cephalosporin계 항생제의 일종인 cefoperazone이 들어가므로, 이 효소를 생성하는 세균은 캠필로박터 선택배지에서 죽지 않고 생존이 가능하다. 이러한 경우 캠필로박터 배지에 캠필로박터 균만 보이는 것이 아니라 ESBL을 생성하는 세균도 함께 나타나게 되어 경쟁집락으로 작용하게 되고 이로 인해 캠필로박터 균의 선택적인 배양에 어려움이 있다. 특히 기존 Bolton broth에는 그람음성 균을 막는 항생제가 cefoperazone 밖에 없어서 ESBL 생성 E.coli를 막는데에 어려움이 있다. 따라서 기존 Bolton broth에는 ESBL 생성균을 억제하는 추가적인 항생제의 사용이 강력하게 요구된다.
관련 선행특허로 대한민국 특허공개번호 제1020090085202호는 캠필로박터균의 배양 또는 수송용 배지에 관한것으로, (a) 캠필로박터(Campylobacter)균 성장 유지에 유효한 에너지원(energy source)을 포함하는 영양 배지(nutrient medium); (b) 혈액(blood) 또는 혈청(serum); 및 (c) 젤라틴(gelatin) 성분을 포함하는 캠필로박터(Campylobacter) 균의 배양(culture) 또는 수송(transport)용 배지 조성물이 기재되어 있으며,
또 다른 선행특허로 대한민국 특허공개번호 제 1020080082561호는 식품 위해 미생물 검출용 프라이머 및 이를 이용한 식품 위해 미생물 검출방법에 관한 것으로, 해당 특허의 서열번호 19의 염기서열로 이루어지는 프라이머 및 서열번호 20의 염기서열로 이루어지는 프라이머로 이루어지고 Tm 값이 80.7℃인 303 bp의 캠필로박터 제주니 특이적 유전자 산물을 증폭시키는 것을 특징으로 하는 캠필로박터 제주니(Camphylobacter jejuni) 검출용 프라이머가 기재되어 있다.
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 개선된 민감도를 가지는 새로운 캠필로박터균 배지를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 개선된 선택성을 가지는 새로운 캠필로박터균 배지를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 개선된 민감도를 가지는 새로운 캠필로박터균 배지 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 개선된 선택성을 가지는 새로운 캠필로박터균 배지 제조방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 옥소이드(OXOID) 사의 미트 펩톤(Meat peptone), 락토알부민 가수분해물(Lactalbumin hydrolysate), 효모 추출물(Yeast Extract), 염화 나트륨(Sodium chloride), 알파-케토글루타르산(Alpha-ketoglutaric acid), 피루브산 나트륨(Sodium pyruvate), 메타중아황산 나트륨(Sodium metabisulphite),탄산 나트륨(Sodium carbonate), 해민(Haemin),트리메소프림(trimethoprim), 세포테탄(cefotetan), 반코마이신(vancomycin), 및 앰포테리신 B(Amphotericin B)를 포함하는 캠필로박터(Campylobacter)에 대한 민감성을 개선한 배지 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 배지 조성물의 조성은 전체 배지 조성물 1리터당 상기 세포테탄(cefotetan)을 4mg 내지 64mg 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 배지 조성물의 조성은 옥소이드(OXOID) 사의 미트 펩톤(Meat peptone) 10.0 중량부, 락토알부민 가수분해물(Lactalbumin hydrolysate) 5.0 중량부, 효모 추출물(Yeast Extract) 5.0 중량부, 염화 나트륨(Sodium chloride) 5.0 중량부, 알파-케토글루타르산(Alpha-ketoglutaric acid) 1.0 중량부, 피루브산 나트륨(Sodium pyruvate) 0.5 중량부,메타중아황산 나트륨(Sodium metabisulphite) 0.5 중량부,탄산 나트륨(Sodium carbonate) 0.6 중량부, 및 해민(Haemin) 0.01 중량부 비율로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 상기 배지 조성물은 캠필로박터(Campylobacter)에 대한 선택성을 개선하는 것이 바람직하고,
상기 캠필로박터(Campylobacter)는 Campylobacter.jejuni 또는 Campylobacter.coli인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 옥소이드(OXOID) 사의 미트 펩톤(Meat peptone), 락토알부민 가수분해물(Lactalbumin hydrolysate), 효모 추출물(Yeast Extract), 염화 나트륨(Sodium chloride), 알파-케토글루타르산(Alpha-ketoglutaric acid), 피루브산 나트륨(Sodium pyruvate), 메타중아황산 나트륨(Sodium metabisulphite),탄산 나트륨(Sodium carbonate), 해민(Haemin),트리메소프림(trimethoprim), 세포테탄(cefotetan), 반코마이신(vancomycin), 및 앰포테리신 B(Amphotericin B)를 물에 첨가하는 단계를 포함하는 캠필로박터(Campylobacter)에 대한 민감성을 개선한 배지 조성물의 제조방법을 제공한다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 배지 조성물을 유효성분으로 포함하는, 식품 시료에서의 캠필로박터 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 식품은 가금류, 육류, 유제품, 어류, 또는 채소인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 식품 샘플을 상기 본 발명의 배지 조성물에 배양한 후, 집락 형태 또는 호기 미호기 테스트를 통하여 Campylobacter에 대한 확인 및 동정을 실시하는 단계를 포함하는, 식품 시료에서 캠필로박터를 검출하는 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명에서는 기존 Bolton broth에 ESBL을 억제가능한 Cefotetan 이라는 물질을 넣어주어 그 효과와 효능을 테스트하였다. 새롭게 개선된 배지를 기존의 배지와 비교하여 Cefotetan의 함유로 인해 실제 식품샘플에서 Bolton broth의 민감도가 어느 정도 상승하는지 테스트하였다.
Bolton broth는 식품으로부터 Campylobacter 종에 대한 선택적인 enrichment broth이다(J.M. Hunt,Campylobacter, F.D.A Bacteriological Analytical Manual, 8th Editino, (Revision A) 7.01-7.27, AOAC,Arlington V A (1998) ;F.J. Bolton, Personal communication (1995)).
이 배지는 Campylobacter의 recovery를 개량하기 위하여 특별하게 개발되었다(배지 제조방법 등 기타 사항은 OXOID 사 제품설명서 참조). 이 배지의 조성의 성분 및 용량(gm/litre)은 다음과 같다;Meat peptone 10.0, Lactalbumin hydrolysate 5.0, Yeast Extract 5.0, Sodium chloride 5.0, Alpha-ketoglutaric acid 1.0, Sodium pyruvate 0.5,Sodium metabisulphite 0.5,Sodium carbonate 0.6,Haemin 0.01, pH는 7.4 ±0.2이었다.
또 BOLTON BROTH SELECTIVE SUPPLEMENT는 CODE: SR0208으로 리터 당 Cefoperazone 20.0mg, Vancomycin 20.0mg, Trimethoprim. 20.0mg 및 Amphotericin B 10.0mg를 포함한다.
본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 배지 조성물은 민감도 및 선택성 면에서 기존의 배지에 비해 뛰어난 효과를 나타낸다.
도 1은 본 발명의 실험의 모식도
이하, 비한정적인 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
실시예
1: 개선된 배지의 제조
본 발명의 개선된 Bolton broth는 기존의 배지에 일정량의 cefotetan을 넣어 제조하였으며 그 조성은 아래의 표에 기재되어 있다. 즉 본 발명에서는 기존 배지에 사용하는 cefoperazone을 cefotetan으로 대체한 것이고, 기타 다른 다른 항생제는 기존 볼튼 브로스와 동일하게 들어간다
| Bolton broth | 개선된 Bolton broth | |
| 용매 | 멸균 증류수 1L | 멸균 증류수 1L |
| 아가베이스 | Bolton broth agar base, 27.6g (OXOID) | Bolton broth agar base, 27.6g (OXOID) |
| 선택첨가제 |
Antibiotic supplement for Bolton broth 2 vials (OXOID)
(Cefoperozone 20mg Amphotericin 10mg trimethoprim 20mg vancomycin 20mg) |
Cefotetan 4-64 mg
Amphotericin 10mg trimethoprim 20mg vancomycin 20mg |
표 1은 본 발명의 실험에 사용된 두 가지 선택증균배지 조성
실시예
2:
닭에서의
선택증균배지의
검증실험
상기 본 발명에서 개발된 배지를 이용하여 실제 계육샘플에서 그 검출감도를 확인해 보았다. 캠필로박터 가 제일 문제가 되는 식품은 닭이나 칠면조 등의 가금육으로서, 본 실험에서는 시중에 유통되는 닭을 80마리 사서 Bolton broth와 개선된 Bolton broth로 해당 균을 검출하였다. 검출에 사용된 프로토콜은 미국 농림부의 식품안전기관인 USDA FSIS의 프로토콜을 그대로 사용하였으며 아래와 같다.
계육(전육)을 400ml의 Buffered peptone water과 섞은 후, 1분간 shaking한다. Shaking이 끝난 rinse액 중 25ml을 Bolton broth와 개선된 Bolton broth (혈액 비첨가, 각 2X농도로 사용) 25ml과 섞어준 후, 42℃에서 48시간 배양한다. 배양이 끝난후, 집락형태 및 호기/미호기 배양을 통하여 양성 의심집락을 확인한다.
실시예
3:
배지비교
및 통계처리
계육에서의 배지검증 실험의 경우, Chon et al. (Comparison of three selective media and validation of the VIDAS Campylobacter assay for the detection of Campylobacter jejuni in ground beef and fresh-cut vegetables. J Food Prot. 2011. 74:456-60)에 제시된 방법을 이용하여 양성 검출수를 비교함으로서 민감도를 비교 측정하였다. 또한 캠필로박터가 아닌 다른 경쟁균(competing flora)이 발견된 배지의 수를 비교하여 선택성을 비교하였다 (경쟁균이 적다는 것은 불필요한 균을 배제하는 능력이 뛰어난 것을 의미하므로, 경쟁균이 발견된 배지가 적을수록 선택성은 높음). 총 80개의 샘플 중 해당되는 수를 측정하고, GraphPad Instat software (GraphPad Software, Inc. San Diego, CA, USA)를 사용해 Fisher? exact test로 각 배지의 민감도를 비교하였다. P value를 측정하여 값이 0.05보다 적으면 유의차가 있는 것으로 판단하였다.
상기 실시예의 결과는 하기와 같다.
(1)계육에서의 배지검증 실험- 민감도 비교
| 캠필로박터가 양성으로 나온 plate의 수 (양성 검출수) | ||
| 기존 Bolton broth | 새로운 증균배지 | |
| 캠필로박터 검출 a | 21 / 80 A | 34 / 80 B |
표 2는 두 가지 증균배지의 민감도 비교
a 동일열에 있는 다른 알파벳(A, B, C)은 통계학적 유의차(p < 0.05)가 난다는 것을 의미함
상기 표2에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 개선된 Bolton broth를 사용하였을 때에는 34개가 검출되고 일반 Bolton broth 사용시에는 21개의 양성을 보여 두 배지간에는 큰 통계적 유의차를 보였다(p< 0.05). 따라서 개선된 증균배지가 일반 증균배지에 비해 유의적으로 높은 민감도를 가지고 있는 것을 확인하였다. 결론적으로 개선된 Bolton broth는 검출능력에서 기존의 배지에 비해 뛰어난 것으로 보인다. 이것은 새로이 첨가된 cefotetan이 ESBL 생성 E. coli를 억제하여 선택성이 높아지고, 이에 따라 민감도도 높아졌기 때문으로 사료된다.
또한 닭에서는 캠필로박터가 억제되지 않고 매우 잘 자라 캠필로박터 균이 cefotetan에 대해 높은 내성을 가지고 있는 것으로 확인되었다. 이는 결국 cefotetan을 캠필로박터 증균배지에 추가적인 항생제로서 활용할 수 있음을 의미한다.
(2)계육에서의 배지검증 실험- 선택성 비교
| 기존 Bolton broth | 개선된 Bolton broth | |
| 경쟁균이 자란 선택배지의 갯수 a |
55 / 80 A | 15 / 80 B |
표 3은 두 가지 증균배지의 선택성 비교: 경쟁균이 자란 선택배지의 개수 비교
a 동일열에 있는 다른 알파벳(A, B)은 통계학적 유의차(p < 0.05)가 난다는 것을 의미함
상기 표 3에서 알 수 있는 바와 같이, 증균액을 선택배지로 옮겼을 때, 기존 Bolton broth에 비해 개선된 Bolton broth에서 훨씬 적은 수의 샘플이 경쟁집락에 오염되었다. 따라서 개발된 증균배지의 선택성이 더 좋은 것을 확인하였다.
Claims (15)
- 펩톤(peptone), 락토알부민 가수분해물(Lactalbumin hydrolysate), 효모 추출물(Yeast Extract), 염화 나트륨(Sodium chloride), 알파-케토글루타르산(Alpha-ketoglutaric acid), 피루브산 나트륨(Sodium pyruvate), 메타중아황산 나트륨(Sodium metabisulphite), 탄산 나트륨(Sodium carbonate), 해민(Haemin), 트리메소프림(trimethoprim), 세포테탄(cefotetan), 반코마이신(vancomycin), 및 앰포테리신 B(Amphotericin B)를 포함하는 Campylobacter.jejuni 또는 Campylobacter.coli에 대한 민감성을 개선한 배지 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 배지 조성물의 조성은 전체 배지 조성물 1리터당 상기 세포테탄(cefotetan)을 4mg 내지 64mg 포함하는 것을 특징으로 하는 Campylobacter.jejuni 또는 Campylobacter.coli에 대한 민감성을 개선한 배지 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 배지 조성물의 조성은 펩톤(peptone) 10.0 중량부, 락토알부민 가수분해물(Lactalbumin hydrolysate) 5.0 중량부, 효모 추출물(Yeast Extract) 5.0 중량부, 염화 나트륨(Sodium chloride) 5.0 중량부, 알파-케토글루타르산(Alpha-ketoglutaric acid) 1.0 중량부, 피루브산 나트륨(Sodium pyruvate) 0.5 중량부, 메타중아황산 나트륨(Sodium metabisulphite) 0.5 중량부, 탄산 나트륨(Sodium carbonate) 0.6 중량부, 및 해민(Haemin) 0.01 중량부 비율로 포함하는 것을 특징으로 하는 Campylobacter.jejuni 또는 Campylobacter.coli에 대한 민감성을 개선한 배지 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 배지 조성물은 Campylobacter.jejuni 또는 Campylobacter.coli에 대한 선택성을 개선하는 것을 특징으로 하는 Campylobacter.jejuni 또는 Campylobacter.coli에 대한 민감성을 개선한 배지 조성물.
- 삭제
- 펩톤(peptone), 락토알부민 가수분해물(Lactalbumin hydrolysate), 효모 추출물(Yeast Extract), 염화 나트륨(Sodium chloride), 알파-케토글루타르산(Alpha-ketoglutaric acid), 피루브산 나트륨(Sodium pyruvate), 메타중아황산 나트륨(Sodium metabisulphite), 탄산 나트륨(Sodium carbonate), 해민(Haemin), 트리메소프림(trimethoprim), 세포테탄(cefotetan), 반코마이신(vancomycin), 및 앰포테리신 B를 물에 첨가하는 단계를 포함하는 Campylobacter.jejuni 또는 Campylobacter.coli에 대한 민감성을 개선한 배지 조성물의 제조방법.
- 제 6항에 있어서, 상기 세포테탄(cefotetan)은 전체 배지 조성물의 1리터당 4mg 내지 64mg 첨가되는 것을 특징으로 하는 Campylobacter.jejuni 또는 Campylobacter.coli에 대한 민감성을 개선한 배지 조성물 제조방법.
- 제 6항에 있어서, 상기 제조방법은 펩톤(peptone) 10.0 중량부, 락토알부민 가수분해물(Lactalbumin hydrolysate) 5.0 중량부, 효모 추출물(Yeast Extract) 5.0 중량부, 염화 나트륨(Sodium chloride) 5.0 중량부, 알파-케토글루타르산(Alpha-ketoglutaric acid) 1.0 중량부, 피루브산 나트륨(Sodium pyruvate) 0.5 중량부, 메타중아황산 나트륨(Sodium metabisulphite) 0.5 중량부, 탄산 나트륨(Sodium carbonate) 0.6 중량부, 및 해민(Haemin) 0.01 중량부 비율로 물에 첨가하는 것을 특징으로 하는 Campylobacter.jejuni 또는 Campylobacter.coli에 대한 민감성을 개선한 배지 조성물 제조방법.
- 삭제
- 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 배지 조성물을 유효성분으로 포함하는, 식품 시료에서의 Campylobacter.jejuni 또는 Campylobacter.coli 검출용 조성물.
- 제 10항에 있어서, 상기 식품은 가금류, 육류, 유제품, 어류, 또는 채소인 것을 특징으로 하는 식품 시료에서의 Campylobacter.jejuni 또는 Campylobacter.coli 검출용 조성물.
- 삭제
- 식품 샘플을 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 배지 조성물에 배양한 후, 집락 형태 또는 호기 미호기 테스트를 통하여 Campylobacter.jejuni 또는 Campylobacter.coli에 대한 확인 및 동정을 실시하는 단계를 포함하는, 식품 시료에서 Campylobacter.jejuni 또는 Campylobacter.coli를 검출하는 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 식품은 가금류, 육류, 유제품, 어류, 또는 채소인 것을 특징으로 하는 식품 시료에서 Campylobacter.jejuni 또는 Campylobacter.coli를 검출하는 방법.
- 삭제
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020150081979A KR101642658B1 (ko) | 2015-06-10 | 2015-06-10 | 세포테탄을 포함하는 캠필로박터에 대한 민감성 및 선택성을 개선한 볼튼 배지 조성물 및 그 제조방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020150081979A KR101642658B1 (ko) | 2015-06-10 | 2015-06-10 | 세포테탄을 포함하는 캠필로박터에 대한 민감성 및 선택성을 개선한 볼튼 배지 조성물 및 그 제조방법 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR101642658B1 true KR101642658B1 (ko) | 2016-07-26 |
Family
ID=56681023
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020150081979A KR101642658B1 (ko) | 2015-06-10 | 2015-06-10 | 세포테탄을 포함하는 캠필로박터에 대한 민감성 및 선택성을 개선한 볼튼 배지 조성물 및 그 제조방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101642658B1 (ko) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013500035A (ja) * | 2009-07-27 | 2013-01-07 | ビオメリュー | β‐ラクタム抗生物質に対して耐性化しているグラム陰性菌の特異的検出のための培地 |
| KR20140004457A (ko) * | 2012-07-03 | 2014-01-13 | 건국대학교 산학협력단 | 캠필로박터에 대한 민감성 및 선택성을 개선한 배지 조성물 및 그 제조방법 |
-
2015
- 2015-06-10 KR KR1020150081979A patent/KR101642658B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013500035A (ja) * | 2009-07-27 | 2013-01-07 | ビオメリュー | β‐ラクタム抗生物質に対して耐性化しているグラム陰性菌の特異的検出のための培地 |
| KR20140004457A (ko) * | 2012-07-03 | 2014-01-13 | 건국대학교 산학협력단 | 캠필로박터에 대한 민감성 및 선택성을 개선한 배지 조성물 및 그 제조방법 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Loessner et al. | A pediocin-producing Lactobacillus plantarum strain inhibits Listeria monocytogenes in a multispecies cheese surface microbial ripening consortium | |
| Johnson | Clostridium botulinum | |
| Girma et al. | Antibacterial activity of lactic acid bacteria isolated from fermented Ethiopian traditional dairy products against food spoilage and pathogenic bacterial strains | |
| Valledor et al. | Characterization and safety evaluation of two beneficial, enterocin-producing Enterococcus faecium strains isolated from kimchi, a Korean fermented cabbage | |
| KR101440460B1 (ko) | 캠필로박터에 대한 민감성 및 선택성을 개선한 배지 조성물 및 그 제조방법 | |
| Zheng et al. | Analysis and control of microbial gas production in fermented chili paste | |
| El‐Ghaish et al. | Antimicrobial impact for Lactococcus lactis subsp. lactis A15 and Enterococcus faecium A15 isolated from some traditional Egyptian dairy products on some pathogenic bacteria | |
| CN105039202A (zh) | 一种沙门氏菌、单增李斯特菌和副溶血弧菌复合增菌的选择性培养基及其制备方法 | |
| Glass et al. | Clostridium botulinum | |
| Tadesse et al. | Bad to the bone?–Genomic analysis of Enterococcus isolates from diverse environments reveals that most are safe and display potential as food fermentation microorganisms | |
| KR102247293B1 (ko) | 항균 활성을 가지는 바실러스 서브틸리스 bsc35 균주 및 이의용도 | |
| KR101642658B1 (ko) | 세포테탄을 포함하는 캠필로박터에 대한 민감성 및 선택성을 개선한 볼튼 배지 조성물 및 그 제조방법 | |
| KR101656188B1 (ko) | 세폭시틴을 포함하는 캠필로박터에 대한 민감성 및 선택성을 개선한 볼튼 배지 조성물 및 그 제조방법 | |
| KR101706063B1 (ko) | 시료에서 캠필로박터 제주니 또는 캠필로박터 콜라이 검출방법 | |
| KR101394589B1 (ko) | 캠필로박터에 대한 민감성 및 선택성을 개선한 배지 조성물 및 그 제조방법 | |
| KR101493230B1 (ko) | 트리클로산이 첨가된 개선된 배지 조성물 및 그 용도 | |
| KR20120048862A (ko) | 바실러스 세레우스 검출을 위한 선택배지 및 그 검출방법 | |
| KR101292721B1 (ko) | 캠필로박터에 대한 민감성을 개선한 배지 조성물 및 그 제조방법 | |
| Syaputri et al. | Characterization of plantaricin genes and lactic acid production by Lactiplantibacillus plantarum strains isolated from Ishizuchi-Kurocha | |
| KR101350444B1 (ko) | 캠필로박터에 대한 민감성 및 선택성을 개선한 배지 조성물 및 그 제조방법 | |
| KR101306957B1 (ko) | 캠필로박터에 대한 민감성 및 선택성을 개선한 배지 조성물 및 그 제조방법 | |
| Chon et al. | Evaluation of Ceftazidime as an Antibiotic Supplement in Mannitol–Yolk–Polymyxin B Agar Used for Enumeration of Bacillus cereus in Ready-to-Eat Vegetables | |
| KR101654473B1 (ko) | 세포테탄을 포함하는 캠필로박터에 대한 민감성 및 선택성을 개선한 배지 조성물 및 그 제조방법 | |
| KR101655034B1 (ko) | 세폭시틴을 포함하는 캠필로박터에 대한 민감성 및 선택성을 개선한 배지 조성물 및 그 제조방법 | |
| KR101654455B1 (ko) | 캠필로박터에 대한 민감성 및 선택성을 개선한 배지 조성물 및 그 제조방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20190819 Year of fee payment: 4 |