KR101306957B1 - 캠필로박터에 대한 민감성 및 선택성을 개선한 배지 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents
캠필로박터에 대한 민감성 및 선택성을 개선한 배지 조성물 및 그 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 캠필로박터에 대한 민감성 및 선택성을 개선한 배지 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 캠필로박터에 대한 민감성 및 선택성을 개선한 배지 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
일반적으로, Campylobacter spp.로 인한 식중독 사고는 전세계적으로 발생되고 있으며, 특히 북미와 유럽 등의 선진국에서는 Salmonella에 의한 감염증보다 발생빈도가 많을 정도로 문제가 되고 있다. 식품 내 Campylobacter 검출 시, 국내외 공인검출법에서는 선택증균을 하여 균을 안정화 시키고, 균수를 늘린 후, 검출을 실시하고 있다. 일반적으로 선택증균에 사용하는 액체배지는 ISO, FDA BAM, USDA FSIS 등 국제적인 검출기관에서는 대부분 Bolton broth를 사용하고 있는데 이 배지는 산소에 대한 독소분해력이 좋고 Campylobacter 의 회복력이 뛰어나기 때문이다. Bolton broth에는 다양한 첨가물질과 항생제가 들어가지만 균의 검출이 어려운 식품샘플에서는 부분적인 한계점이 있는 것으로 알려져 있다.
관련 선행특허로 대한민국 특허공개번호 제1020090085202호는 캠필로박터균의 배양 또는 수송용 배지에 관한 것으로, (a) 캠필로박터(Campylobacter)균 성장 유지에 유효한 에너지원(energy source)을 포함하는 영양 배지(nutrient medium); (b) 혈액(blood) 또는 혈청(serum); 및 (c) 젤라틴(gelatin) 성분을 포함하는 캠필로박터(Campylobacter) 균의 배양(culture) 또는 수송(transport)용 배지 조성물이 기재되어 있으며,
또 다른 선행특허로 대한민국 특허공개번호 제 1020080082561호는 식품 위해 미생물 검출용 프라이머 및 이를 이용한 식품 위해 미생물 검출방법에 관한 것으로, 해당 특허의 서열번호 19의 염기서열로 이루어지는 프라이머 및 서열번호 20의 염기서열로 이루어지는 프라이머로 이루어지고 Tm 값이 80.7℃인 303 bp의 캠필로박터 제주니 특이적 유전자 산물을 증폭시키는 것을 특징으로 하는 캠필로박터 제주니(Camphylobacter jejuni) 검출용 프라이머가 기재되어 있다.
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 개선된 민감도를 가지는 새로운 캠필로박터균 배지를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 개선된 선택성을 가지는 새로운 캠필로박터균 배지를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 개선된 민감도를 가지는 새로운 캠필로박터균 배지 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 개선된 선택성을 가지는 새로운 캠필로박터균 배지 제조방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 옥소이드(OXOID) 사의 뉴트리언트 브로쓰 넘버 2, 세균 활성탄(Bacteriological charcoal), 카제인 가수분해물(Casein hydrolysate) , 디옥신콜린산 나트륨(Sodium desoxycholate),황산제일철(Ferrous sulphate), 피루브산 나트륨(Sodium pyruvate), 암포테리신 B, 세포페라존(Cefoperazone),및 폴리믹신(polymyxin) B를 포함하는 캠필로박터(Campylobacter)에 대한 민감성을 개선한 배지 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물의 조성은 뉴트리언트 브로쓰 넘버 2 100 중량부, 세균 활성탄(Bacteriological charcoal) 16 중량부, 카제인 가수분해물(Casein hydrolysate) 12 중량부, 디옥신콜린산 나트륨(Sodium desoxycholate) 4 중량부,황산제일철(Ferrous sulphate) 1 중량부, 및 피루브산 나트륨(Sodium pyruvate) 1 중량부 비율인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또한 본 발명은 옥소이드(OXOID) 사의 뉴트리언트 브로쓰 넘버 2, 세균 활성탄(Bacteriological charcoal), 카제인 가수분해물(Casein hydrolysate) , 디옥신콜린산 나트륨(Sodium desoxycholate),황산제일철(Ferrous sulphate), 및 피루브산 나트륨(Sodium pyruvate)에 암포테리신 B, 세포페라존(Cefoperazone),및 폴리믹신(polymyxin) B를 첨가하는 단계를 포함하는 캠필로박터(Campylobacter)에 대한 민감성을 개선한 배지 조성물의 제조방법을 제공한다.
또 본 발명은 옥소이드(OXOID) 사의 뉴트리언트 브로쓰 넘버 2, 세균 활성탄(Bacteriological charcoal), 카제인 가수분해물(Casein hydrolysate) , 디옥신콜린산 나트륨(Sodium desoxycholate),황산제일철(Ferrous sulphate), 피루브산 나트륨(Sodium pyruvate), 암포테리신 B, 세포페라존(Cefoperazone),및 폴리믹신(polymyxin) B를 포함하는 캠필로박터(Campylobacter)에 대한 선택성을 개선한 배지 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 식품 샘플을 상기 본 발명의 배지 조성물에서 배양하고, 배양 후 캠필로박터를 확인 동정하는 단계를 포함하는 식품 샘플에서 캠필로박터를 확인 동정하는 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명에서는 현재 agar의 형태로 사용되는 Modified Cefoperazone-Charcoal-Deoxycholate Agar (mCCDA)를 액체배지인 broth의 형태로 제조하고, 추가적인 항생제를 첨가하여 새로운 배지를 개발하였으며, 그 성능을 현재 세계적으로 가장 널리 사용되는 Bolton broth와 비교해 보았다. 개발된 배지의 명칭은 P-mCCD broth (polymyxin B supplemented mCCD broth)로 본 명세서에서 명명한다.
Bolton broth는 식품으로부터 Campylobacter 종에 대한 선택적인 enrichment broth이다(J.M. Hunt, Campylobacter, F.D.A Bacteriological Analytical Manual, 8th Editino, (Revision A) 7.01-7.27, AOAC, Arlington V A (1998) ;F.J. Bolton, Personal communication (1995)). 이 배지는 Campylobacter의 recovery를 개량하기 위하여 특별하게 개발되었다(배지 제조방법 등 기타 사항은 OXOID 사 제품설명서 참조). 이 배지의 조성의 성분 및 용량(gm/litre)은 다음과 같다;Meat peptone 10.0, Lactalbumin hydrolysate 5.0, Yeast Extract 5.0, Sodium chloride 5.0, Alpha-ketoglutaric acid 1.0, Sodium pyruvate 0.5,Sodium metabisulphite 0.5,Sodium carbonate 0.6,Haemin 0.01, pH는 7.4 ±0.2이었다.
mCCDA에 대한 항생물질 보충물(OXOID)에 포함된 하기 열거된 항생물질들은 Campylobacter spp에 대한 선택성을 최적화한다.Cefoperazone는 주로 Gram-negatives에 활성을 가지며, Amphotericin B는 방사균 Streptomyces nodosus가 생산하는 폴리엔계 항생물질의 일종으로, 진균이나 동물세포의 세포막에 존재하는 스테롤과 결합하여 특이적인 상호작용으로 형태적, 기능적으로 막에 변화를 일으켜 막에 소공(4Å)을 형성할 수 있도록 폴리엔이 형성한다. 세균의 막에서는 스테롤이 결여하기 때문에 작용하지 않으나 항진균제로서 칸디다증, 피부사상균증 등에 유효성을 나타내며 국소적으로 사용한다.
본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 배지 조성물은 민감도 및 선택성 면에서 기존의 배지에 비해 뛰어난 효과를 나타낸다.
도 1은 실험과정 flow chart를 나타낸 그림이다.
이하, 비한정적인 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
실시예
1; 배지의 제조
함께 비교할 Bolton broth는 제조자의 매뉴얼대로 준비되었으며, P-mCCD broth는 기존 mCCDA 배지의 성분에 아가(agar)를 제외하고, polymyxin B를 첨가하여 만들었다. 그 조성은 아래의 표 1에 기재되어 있다.
| Bolton broth | P- mCCD broth | |
| 용매 | 멸균 증류수 1L | 멸균 증류수 1L |
|
베이스 성분 |
-Bolton broth agar base, 27.6g (OXOID) |
-Nutrient broth No. 2, 25g (OXOID) -Bacteriological charcoal 4g (Sigma) -Casein hydrolysate 3g (Sigma) -Sodium desoxycholate 1g (Sigma) -Ferrous sulphate 0.25g (Sigma) -Sodium pyruvate 0.25g (Sigma) |
|
선택첨가제 |
Bolton broth 용 항생제 첨가제 2 바이알 (OXOID) |
mCCDA 용 항생제 첨가제 2 바이알 (OXOID) -PolymyxinB 5,000~400,000 IU |
표 1은 실험에 사용된 두 가지 선택증균배지의 조성을 나타낸 표이다.
표에서 선택 첨가제 1 바이알(vial)은 배지 500ml에 충분함.
실시예
2:
닭에서의
선택증균배지의
검증실험
개발된 배지를 이용하여 실제 계육샘플에서 그 검출감도를 확인해 보았다. Campylobacter 가 제일 문제가 되는 식품은 닭, 칠면조 등의 가금육으로서, 본 실험에서는 시중에 유통되는 닭을 20마리 사서 Bolton broth와 개발된 broth로 해당 균을 검출하였다. 닭의 린스(rinse) 방법 및 증균방법은 미국 농림부의 식품안전기관인 USDA FSIS의 프로토콜을 그대로 사용하였으며, 검출용 선택배지는 미국 FDA에서 공인 검출배지로 사용중인 mCCDA 배지를 사용하였다. 샘플의 준비 및 검출 프로토콜은 아래와 같다.
계육(전육)을 400ml의 Buffered peptone water과 섞은 후, 1분간 shaking한다. Shaking이 끝난 rinse액중 25ml을 Bolton broth (2X 농도) 및 새로 개발된 배지(2X 농도) 25ml과 섞어준 후, 42℃에서 48시간 배양한다. 배양이 끝난후, 한 백금이를 mCCDA 배지에 획선도말한 후, 미호기적 환경에서 42℃에서 48시간 배양한 후, 둥글고 편평한 반투명의 집락을 골라서 성상확인 및 colony PCR을 통하여, Campylobacter 에 대한 확인동정을 실시한다. colony PCR은 유전학적으로 Campylobacter의 확인동정을 실시하는 방법으로 방법은 다음과 같다. 계대된 집락을 0.2ml의 멸균증류수에 풀고, 10분간 끓인 후 원심분리하고 상층액을 분리하여 template DNA로 사용한다. DNA는 PCR mix kit인 MaximeTM PCR PreMix (iNtRON biotechnology, Sungnam, Korea)와 섞어주고, forward/reverse primer를 첨가해 준 후, PCR을 돌리고 밴드사이즈를 통해 Campylobacter spp. 양성임을 최종 확인한다. 반응조건, primer의 사용농도, primer의 시퀀스 등은 Denis et al. (Denis et al. Development of a m-PCR assay for simultaneous identification of Campylobacter jejuni and C. coli. Letters in Applied Microbiology 1999, 29, 406-410)에 나온 것과 동일하게 사용하였다. 본 실험의 전반적인 과정은 도 1에 도식화되어 있다.
실시예
3:비교 및 통계처리
Chon et al. (Comparison of three selective media and validation of the VIDAS Campylobacter assay for the detection of Campylobacter jejuni in ground beef and fresh-cut vegetables. J Food Prot. 2011. 74:456-60)에 제시된 방법을 이용하여 양성검출수를 비교함으로서 민감도를 비교 측정하였다. 또한 캠필로박터가 아닌 다른 경쟁균(competing flora)이 발견된 배지의 수를 비교하여 선택성을 비교하였다 (경쟁균이 적다는 것은 불필요한 균을 배재하는 능력이 뛰어난 것을 의미하므로, 경쟁균이 발견된 배지가 적을수록 선택성은 높음). 총 20개의 샘플 중 해당되는 수를 측정하고, GraphPad Instat software (GraphPad Software, Inc. San Diego, CA, USA)를 사용해 Fisher's exact test로 각 배지의 민감도를 비교하였다. P value를 측정하여 값이 0.05보다 적으면 유의차가 있는 것으로 판단하였다.
상기 실시예의 실험결과는 아래 표 2 및 3에 제시되어 있다.
|
Bolton broth 사용시 |
P- mCCD broth 사용시 |
P
value
(0.05보다 적으면 유의차 있음) |
|
| 양성 검출수 |
12/20 |
20/20 |
0.0033 |
표 2는 두 가지 선택 증균배지의 민감도 비교 표이다.
상기 표에서 알 수 있는 바와 같이, P-mCCD broth를 사용하였을 때에는 20개가 검출되고 Bolton broth 사용시에는 12개의 양성을 보여 두 배지간에는 통계적 유의차를 보였다(p< 0.05). 따라서 개발된 증균배지가 Bolton broth에 비해 유의적으로 높은 민감도를 가지고 있는 것을 확인하였다.
|
Bolton broth 사용시 |
P- mCCD broth 사용시 |
P
value
(0.05보다 적으면 유의차 있음) |
|
| 경쟁균이 발견된 배지수 |
9/20 |
2/20 |
0.0310 |
표 3은 두 가지 선택 증균배지의 선택성 비교 표이다.
상기 표에서 알 수 있는 바와 같이, P-mCCD broth를 사용하였을 때에는 20개중 2개의 배지만 경쟁균에 오염되었으나, Bolton broth를 사용했을 경우에는 9개가 오염되었다. 해당 수치는 통계학적 유의차를 보여, 개발된 증균배지가 Bolton broth에 비해 유의적으로 높은 선택성을 가지고 있는 것을 확인하였다.
결론적으로 P-mCCD broth는 민감도와 선택성 면에서 현재 세계적으로 가장 널리 사용되는 배지인 Bolton broth에 비해 뛰어난 것으로 보인다.
Claims (8)
- 옥소이드(OXOID) 사의 뉴트리언트 브로쓰 넘버 2 100 중량부, 세균 활성탄(Bacteriological charcoal) 16 중량부, 카제인 가수분해물(Casein hydrolysat
e) 12 중량부, 디옥신콜린산 나트륨(Sodium desoxycholate) 4 중량부,황산제일철(Ferrous sulphate) 1 중량부, 및 피루브산 나트륨(Sodium pyruvate) 1 중량부, 암포테리신 B, 세포페라존(Cefoperazone),및 폴리믹신(polymyxin) B 100,000IU를 포함하는 캠필로박터(Campylobacter) jejuni에 대한 민감성을 개선한 배지 조성물. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 식품 샘플을 제 1항의 배지 조성물에서 배양하고, 배양 후 캠필로박터 jejuni를 확인 동정하는 단계를 포함하는 식품 샘플에서 캠필로박터 jejuni를 확인 동정하는 방법.
- 삭제
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020110097889A KR101306957B1 (ko) | 2011-09-28 | 2011-09-28 | 캠필로박터에 대한 민감성 및 선택성을 개선한 배지 조성물 및 그 제조방법 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| KR1020110097889A KR101306957B1 (ko) | 2011-09-28 | 2011-09-28 | 캠필로박터에 대한 민감성 및 선택성을 개선한 배지 조성물 및 그 제조방법 |
Publications (2)
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|---|---|
| KR20130034069A KR20130034069A (ko) | 2013-04-05 |
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-
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- 2011-09-28 KR KR1020110097889A patent/KR101306957B1/ko not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (6)
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|---|
| Client Report, Report Prepared for Ministry of Health, pp.1-79(2003.) * |
| Client Report, Report Prepared for Ministry of Health, pp.1-79(2003.)* |
| ISO/CEN standards for Campylobacter, CRLCampy.2008.ISO(2008.) * |
| ISO/CEN standards for Campylobacter, CRLCampy.2008.ISO(2008.)* |
| 논문1:APPL ENVIRON MICROBIOL * |
| 논문2:J CLINIC MICROBIOL * |
Also Published As
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|---|---|
| KR20130034069A (ko) | 2013-04-05 |
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