KR20120048862A - 바실러스 세레우스 검출을 위한 선택배지 및 그 검출방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 바실러스 세레우스 검출을 위한 선택배지 및 그 배지를 이용한 바실러스 세레우스 검출방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 바실러스 세레우스 검출을 위한 선택배지 및 그 배지를 이용한 바실러스 세레우스 검출방법에 관한 것이다.
선택배지는 특정미생물의 생화학적 특성을 이용하여 대상으로 하는 미생물을 다른 미생물과 구별을 두면서 선택적으로 검출하고자 할 때 사용된다. 선택배지는 1) 검출대상으로 하는 균의 선택적 증균, 2) 검출대상으로 하지 않는 균들의 성장 억제, 3) 검출대상으로 하는 균을 그 이외의 균과 구별할 수 있는 선택성 부여를 목적으로 하므로 위의 세 가지 기능을 할 수 있는 성분을 포함하고 있어야 한다. 선택배지는 특정 미생물의 검출에서 가장 기본적으로 요구되는 도구이기 때문에 효과적인 선택배지를 개발하고, 배지의 효율을 증진시키고자하는 노력은 계속되어왔다.
한편, 바실러스 세레우스는 상재균으로서 쌀을 비롯한 곡류, 야채, 육류 등에 다양한 식품에 널리 분포한다. 바실러스의 감염량은 환자의 면역상태에 따라 다르나 다른 식중독균에 비해 매우 높기 때문에 정성보다는 정량이 우선시 되어 세계 각국은 바실러스에 대한 정량 기준을 가지고 있다. 한국에서도 바실러스의 정량기준이 있어서 분유나 유아용식품 등에서는 100 CFU/g이하, 무순이나 샐러드 등에서는 1000 CFU/g 이하, 된장, 고춧가루 등의 조미식품에서는 10000 CFU/g 이하의 바실러스 세레우스 기준을 가지고 있다. 이러한 바실러스 세레우스의 정량 검출은 주로 선택배지를 사용하여 검출하는데, 바실러스 세레우스 선택배지로 가장 널리 사용되는 것은 MYP (Mannitol-Yolk-PolymyxinB Agar)와 PEMBA (polymixinB-pyruvate-egg yolk-mannitol bromothymol blue agar) 등인데 이러한 배지들은 기본적으로 polymyxin B, 만니톨 시스템, lecithinase의 원리를 이용한다. 이러한 시스템은 바실러스 검출에 매우 효율적인 시스템으로 알려져 있으며 배지를 사용한 여전히 신뢰도 높은 표준화된 방법이다. 그러나 정상세균총이 높은 수준으로 존재하는 야채나 장류, 조미료 등에서는 정상세균총이 목적균의 검출을 저해시켜 적절한 검출이 이루어지지 못하게 한다. 바실러스 세레우스에서도 마찬가지인데, 콩이나 쌀 등과 같이 정상세균총이 비교적 적은 식품에서는 정량이 어렵지 않으나, 채소, 발효 식품과 같이 정상세균총이 높은 수준의 식품에서는 목적균의 정상적인 검출이 어렵다. 특히 국내에 정량기준이 설정된 된장, 고추장, 무순등은 정상세균총이 높아 바실러스의 선택적인 검출을 저해한다. 일반적으로 바실러스 세레우스 검출에 있어서는 다른 균을 억제하기 위해 lithum chloride, alcohol, polymyxinB등이 사용되어 왔으며 이중 polymyxinB는 바실러스의 높은 내성으로 인해 가장 널리 사용하는 항생제이다. 그러나 최근 신선편의 식품 등에서의 바실러스 검출이 증가하면서 polymyxinB 외에 다른 항생제 사용의 필요성이 대두되었다. 이는 polymyxinB는 그람음성만을 저해하므로 정상세균총이 높은 식품에서는 그람양성의 균총 역시 저해할 수 있는 항생제의 첨가가 필요하기 때문이다.
본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 바실러스 세레우스 검출을 위한 선택배지를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 식품 중에 존재하는 바실러스 세레우스를 선택적으로 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 바실러스 세레우스 검출용 배지에, 항생제로 트리메토프림을 첨가하는 것을 특징으로 바실러스 세레우스 검출용 배지 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 트리메토프림은 배지에 4?256mg/L 첨가하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 배지 조성물은 아가 베이스, 난황 에멀젼 및 항생제로 폴리믹신 B를 추가적으로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또한 본 발명은 어떤 시료 내 바실러스 세레우스를 확인 또는 분리하기 위한 방법으로서, 시료를 상기 본 발명의 배지에 접종한 후 16~48 시간 바람직하게는 24시간 동안 배양하고, 배지상에 형성된 군집체의 발색 형태를 관찰함으로써 시료 내 바실러스 세레우스를 검출하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 발효 식품 중에 존재하는 바실러스 세레우스를 확인 또는 분리하기 위한 방법으로서, 발효 식품을 상기 본 발명의 배지에 접종한 후 16~48 시간,바람직하게는 24시간 동안 배양하고, 배지 상에 형성된 군집체의 발색 형태를 관찰함으로써 발효 식품 중에 존재하는 바실러스 세레우스를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 발효식품은 된장 또는 고추장인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또한 본 발명은 야채에 존재하는 바실러스 세레우스를 확인 또는 분리하기 위한 방법으로서, 야채를 제 1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 배지에 접종한 후 16~48 시간, 바람직하게는 24시간 동안 배양하고, 배지상에 형성된 군집체의 발색 형태를 관찰함으로써 야채에 존재하는 바실러스 세레우스를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 야채는 무순인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명에서는 국내 식품공전에서 사용되는 MYP배지에 tirmethorpim을 첨가하였을 때 전통장류, 조미식품, 신선편의 식품 등 정량기준이 존재하나 정상세균총이 높아 검출이 어려운 식품에서 어느 정도의 검출력을 갖는지 평가하고자 한다. 식품에서 정량기준 수준의 식품을 접종하였을 때 기존의 MYP배지와 tirmethorpim을 첨가한 MYP 배지간 능력차이를 정량적으로 비교하였다.
본 발명을 통해서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에서 개발된 개량 MYP 배지(mMYP)에서는 표 4에서 알 수 있는 바와 같이, 집락구분이 쉽고 picking이 가능하여 확인동정 후 균수의 정량이 가능하였으며, 또한 도 2의 사진에서 알 수 있는 바와 같이 고춧가루 및 된장에서는 trimethoprim이 4mg/L만 되어도 선택성이 좋고 균의 집락구분이 매우 용이하였으나, 일반 MYP에서는 집락이 모두 노란색으로 변하여 분홍색 의심집락을 찾기 어려웠으며, 특히 그림과 같이 (그림 A, C) 정상세균총이 너무 빽빽하여 원하는 바실러스 세레우스 만을 picking하기 힘들어 확인동정이 어려웠다.
따라서 본 발명의 배지는 기존의 MYP 배지에 비하여 매우 우수한 선택성을 가지고 있어서 효과적인 바실러스 세레우스 선택 배지로 사용될 수 있는 효과가 있다.
도 1은 일반적인 MYP에서 성장한 바실러스 세레우스 사진을 나타낸다. 도 1의 사진과 같이, 실러스 세레우스가 일반적인 MYP에서 자라게 되면 집락이 형성된다. 분홍색 집락과 더불어 불투명한 환을 보이는 것이 특징이다.
도 2는 바실러스 세레우스가 인위접종된 조미료와 야채샘플에서 두 종류 배지의 회수율 비교한 사진이다.
도 2a의 A 사진: 고춧가루샘플, 일반 MYP에서의 바실러스 세레우스이고, B 사진: 고춧가루샘플, mMYP-4에서의 바실러스 세레우스이며,
도 2b의 C 사진: 된장샘플, 일반 MYP에서의 바실러스 세레우스이고, D 사진: 된장샘플, mMYP-4에서의 바실러스 세레우스이고,
도 2c의 E 사진: 무순샘플, 일반 MYP에서의 바실러스 세레우스이고, F 사진: 무순샘플, mMYP-64에서의 바실러스 세레우스이고,
도 2d의 G 사진: 야채샐러드 샘플, 일반 MYP에서의 바실러스 세레우스이며, H 사진: 야채샐러드 샘플, mMYP-64에서의 바실러스 세레우스를 나타낸다.
도 2는 바실러스 세레우스가 인위접종된 조미료와 야채샘플에서 두 종류 배지의 회수율 비교한 사진이다.
도 2a의 A 사진: 고춧가루샘플, 일반 MYP에서의 바실러스 세레우스이고, B 사진: 고춧가루샘플, mMYP-4에서의 바실러스 세레우스이며,
도 2b의 C 사진: 된장샘플, 일반 MYP에서의 바실러스 세레우스이고, D 사진: 된장샘플, mMYP-4에서의 바실러스 세레우스이고,
도 2c의 E 사진: 무순샘플, 일반 MYP에서의 바실러스 세레우스이고, F 사진: 무순샘플, mMYP-64에서의 바실러스 세레우스이고,
도 2d의 G 사진: 야채샐러드 샘플, 일반 MYP에서의 바실러스 세레우스이며, H 사진: 야채샐러드 샘플, mMYP-64에서의 바실러스 세레우스를 나타낸다.
이하, 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
비교예
:
MYP
배지의 제조
MYP배지는 900mL의 1차 증류수에 37g의 MYP 아가 베이스를 첨가하고 고압멸균을 실시한다. 고압멸균이 끝난 후 배지를 50~55℃로 식히고, 난황 에멀젼(100mL)과 polymyxinB (100,000IU)를 첨가해 준다. 첨가해 준 후, 페트리 디쉬에 20-25ml 가량 분주하고 냉장온도에 보관하여 사용한다.
실시예
:
MYP
배지와
mMYP
배지의 제조
총 27개의 균주(27 종의 바실러스 세레우스 균주)를 실험에 사용하였다. 표준균주인 ATCC 14579와 식품분리주 21주, 임상분리주 5주를 사용하였다. MYP배지와 supplement는 Oxoid 제품을 사용하였고 trimethoprim은 sigma제품을 사용하였다. Autoclave된 MYP배지를 50-55°C로 식힌 후, polymyxinB supplement와 egg yolk를 넣어 trimethoprime이 첨가되지 않은 일반적인 MYP배지를 제조하였다. Trimethoprim첨가 MYP 배지는 정상적인 MYP 배지에 50 trimethoprim을 4~256mg/L의 농도로 첨가하여 제조하였다. 그 배합을 요약하면 다음과 같다 (이하, 본 발명에서 trimethoprim 첨가 MYP의 경우 mMYP(modified MYP)로 칭하며, 농도에 따라 mMYP4, mMYP8,...,mMYP256로 명명하기로 함).
| 일반 MYP | mMYP | |
| 1차 증류수 | 900mL | 900mL |
| 아가 베이스 | MYP 아가 베이스 | MYP 아가 베이스 |
| 난황 에멀젼 | 100mL | 100mL |
| 항생제 | PolymyxinB : 100,000 IU | PolymyxinB : 100,000 IU Trimethoprim : 4 ~ 256 mg |
표 1은 일반 MYP 배지와 mMYPA 배지의 배합비교를 나타낸다.
실험예
1:다양한 균주를 다양한 농도의
mMYP
에서 배양하였을 때의 성장 여부
특정 바실러스 세레우스 균주가 trimethoprim에 대해 내성이 있다고 할지라도 모든 바실러스 세레우스가 그런지에 대해서는 알 수 없다. 따라서 본 발명에서는 27개의 균주를 사용하여 실제로 다양한 균주가 trimethoprim에 내성을 보여 mMYP에서 자라는지, 또 trimethoprim이 선택배지에 어느 정도 농도까지 있어도 잘 자라는지를 검증하였다. 27개의 균주를 계대 배양한 후, 식염수에 풀어서 탁도를 0.5MacFarland로 맞춘 후, mMYP4~mMYP256까지 접종하고 30℃에서 하루 배양한 후 성장을 확인하였다. 그 결과는 다음과 같다.
표 2는 다양한 균주를 다양한 농도의 mMYPA에 접종했을때의 성장여부를 나타낸 표이다.
표 2에서 제시된 바와 같이, 27개 중 22개의 대부분의 균주가 mMYP256의 높은 농도에서도 성장이 가능했다. 또한 5개의 균주 역시 32~128로 높은 수준이므로 mMYP에서는 trimethoprim이 비교적 높게 함유되어 있어도 여러가지 다양한 균주가 잘 자랄 수 있을 것으로 판단된다.
실험예
2: 다양한 식품의
정상세균총
측정
본 발명에서는 정상세균총이 높은 고춧가루, 된장, 야채샐러드, 무순을 사용하여 실제로 이러한 식품에서 정상세균총이 어느 정도 수준인지 측정하였다. 측정 결과는 다음과 같다.
| 식품샘플 | 전통조미료샘플 | 야채샘플 | ||
| 된장 | 고춧가루 | 무순 | 야채샐러드 | |
| 정상세균총 수준 (Log CFU/g) |
6.13 | 5.76 | 7.27 | 6.11 |
표 3은 고춧가루, 된장, 야채샐러드, 무순에서의 정상세균총 수준을 나타낸 표이다.
표 3에서 알 수 있는 바와 같이 g 당 5~7log CFU/g으로 정상세균총의 수준이 매우 높으며, 특히 무순이 가장 높았다.
실험예
3: 식품 내 인위접종을 통한
배지평가
실험
실제로 식품 내에 바실러스 세레우스를 인위적으로 접종하여 그 회수율(recovery rate-몇 개를 접종하여 몇 개가 나오는지)과 선택성(원하는 집락인 바실러스만 구분하기 용이한지)을 일반 MYP배지와 mMYP배지에서 비교해 보았다.
mMYP는 4~64mg/L의 농도로 사용하였으며 표준균주인 ATCC 14579를 접종하였다.
25g의 식품 내에 일정량의 균수를 접종하였으며(장류: 4~5 log CFU/g, 야채류: 3-4 log CFU/g), 식품공전의 방법에 따라 접종된 식품 25g과 희석액 225ml을 섞어준 후 균질화하여 그 중 0.1mL을 일반 MYP배지와 mMYP 4~64에 spreading하고 30℃에서 24시간 배양하였다. 다음날 집락을 확인하고 균수를 세었다. 그리고 각 배지에서 5개씩의 집락을 골라 실제로 접종해준 바실러스 세레우스가 맞는지 PCR을 통해 확인동정하였다. 그 결과는 다음과 같다.
| 샘플 | 전통조미료 샘플 | 야채샘플 | ||
| 된장1 ) | 고춧가루1 ) | 무순1 ) | 야채샐러드1 ) | |
| 접종량 | 4.19±0.15a | 4.19±0.15a | 3.40±0.27a | 3.50±0.16a |
| MYPA에서의 균수 | NC 2) | NC 2) | 3.33±0.31a | 3.30±0.21a |
| mMYPA-4에서의 균수 | 3.11±0.52b | 3.30±0.27c | 3.42±0.34a | 3.53±0.14a |
| mMYPA-8에서의 균수 | 3.15±0.40b | 3.33±0.31c | 3.37±0.31a | 3.37±0.27a |
| mMYPA-16에서의 균수 | 3.20±0.41b | 3.24±0.23bc | 3.28±0.46a | 3.52±0.20a |
| mMYPA-32에서의 균수 | 3.16±0.39b | 3.29±0.27c | 3.32±0.39a | 3.49±0.24a |
| mMYPA-64에서의 균수 | 3.11±0.53b | 3.29±0.25c | 3.32±0.39a | 3.46±0.26a |
표 4는 바실러스 세레우스가 인위접종된 조미료와 야채샘플에서 두 종류 배지의 회수율 비교 표이다.
표 4에서 1) 각 열에서 알파벳이 다를 경우 통계학적 유의차가 있음을 의미 (p <0.05)
2) NC; Not countable, 집락을 선택하여 확인동정을 해야하는데 정상세균총이 두껍게 깔려있어 집락의 picking이 불가능했음을 나타낸다.
표 4에서 알 수 있는 바와 같이, 야채에서는 모든 배지들이 접종량과 비교하여 통계학적 유의차를 보이지 않았다. 그러나 된장 및 고춧가루에서는 MYP배지의 경우 정상세균총의 집락이 밀집되어 있어 목적하는 바실러스 세레우스 집락을 picking하기 어려웠다. 그러나 mMYP에서는 집락구분이 쉽고 picking이 가능하여 확인동정 후 균수의 정량이 가능하였으며 mMYP에서는 농도와 관련없이 회수된 균수는 통계학적 유의차를 보이지 않았다. 그러나 접종량에 비해서는 통계학적 유의차를 보이며 낮은 경향을 보였다.
또한 도 2의 사진에서 알 수 있는 바와 같이 고춧가루 및 된장에서는 trimethoprim이 4mg/L만 되어도 선택성이 좋고 균의 집락구분이 매우 쉬웠다(그림 B, D).
그러나 일반 MYP에서는 집락이 모두 노란색으로 변하여 분홍색 의심집락을 찾기 어려웠으며, 특히 그림과 같이 (그림 A, C) 정상세균총이 너무 빽빽하여 원하는 바실러스 세레우스 만을 picking하기 힘들어 확인동정이 어려웠다.
무순에서는 mMYP64정도로 trimethoprim이 높으면 정상세균총이 상당부분 억제되어 집락 구분이 쉬었다. 야채샐러드에서도 마찬가지였으며 특히 야채샐러드에서는 일반 MYP에서는 집락이 분홍색을 띄지 않았으나 mMYP64에서는 분홍색을 보여 바실러스 세레우스에 대한 선택성이 매우 좋음을 확인하였다.
Claims (8)
- 바실러스 세레우스 검출용 배지에, 항생제로 트리메토프림을 첨가하는 것을 특징으로 바실러스 세레우스 검출용 배지 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 트리메토프림은 배지에 4?256mg/L 첨가하는 것을 특징으로 바실러스 세레우스 검출용 배지 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 배지 조성물은 아가 베이스, 난황 에멀젼 및 항생제로 폴리믹신 B를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 바실러스 세레우스 검출용 배지 조성물.
- 어떤 시료 내 바실러스 세레우스를 확인 또는 분리하기 위한 방법으로서, 시료를 제 1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 배지에 접종한 후 16~48 시간 동안 배양하고, 배지상에 형성된 군집체의 발색 형태를 관찰함으로써 시료 내 바실러스 세레우스를 검출하는 방법.
- 발효 식품 중에 존재하는 바실러스 세레우스를 확인 또는 분리하기 위한 방법으로서, 발효 식품을 제 1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 배지에 접종한 후 16~48 시간 동안 배양하고, 배지 상에 형성된 군집체의 발색 형태를 관찰함으로써 발효 식품 중에 존재하는 바실러스 세레우스를 검출하는 방법.
- 제 5항에 있어서, 상기 발효식품은 된장 또는 고추장인 것을 특징으로 하는 발효 식품 중에 존재하는 바실러스 세레우스를 검출하는 방법.
- 야채에 존재하는 바실러스 세레우스를 확인 또는 분리하기 위한 방법으로서, 야채를 제 1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 배지에 접종한 후 16~48 시간 동안 배양하고, 배지상에 형성된 군집체의 발색 형태를 관찰함으로써 야채에 존재하는 바실러스 세레우스를 검출하는 방법.
- 제 7항에 있어서, 상기 야채는 무순인 것을 특징으로 하는 야채에 존재하는 바실러스 세레우스를 검출하는 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020100110280A KR20120048862A (ko) | 2010-11-08 | 2010-11-08 | 바실러스 세레우스 검출을 위한 선택배지 및 그 검출방법 |
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Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20120048862A true KR20120048862A (ko) | 2012-05-16 |
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ID=46266955
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| KR1020100110280A KR20120048862A (ko) | 2010-11-08 | 2010-11-08 | 바실러스 세레우스 검출을 위한 선택배지 및 그 검출방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20120048862A (ko) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102051423B1 (ko) | 2018-09-21 | 2020-01-08 | 강원대학교산학협력단 | 식중독 병원균 동시성장용 선택농축배지 및 이를 이용한 식중독 병원균의 동시성장 방법 |
| KR20200088782A (ko) * | 2019-01-15 | 2020-07-23 | 건국대학교 산학협력단 | 바실러스 세레우스 검출을 위한 선택배지용 조성물 및 이를 이용한 검출방법 |
| WO2021200927A1 (ja) * | 2020-03-31 | 2021-10-07 | 日水製薬株式会社 | セレウス菌グループ検出用培地 |
-
2010
- 2010-11-08 KR KR1020100110280A patent/KR20120048862A/ko active Search and Examination
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| KR20200088782A (ko) * | 2019-01-15 | 2020-07-23 | 건국대학교 산학협력단 | 바실러스 세레우스 검출을 위한 선택배지용 조성물 및 이를 이용한 검출방법 |
| WO2021200927A1 (ja) * | 2020-03-31 | 2021-10-07 | 日水製薬株式会社 | セレウス菌グループ検出用培地 |
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