KR102051423B1 - 식중독 병원균 동시성장용 선택농축배지 및 이를 이용한 식중독 병원균의 동시성장 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 트립틱 소이 브로쓰(TSB) 배지에, 아크리플라빈, 싸이클로헥시미드, 날리딕산, 리튬 클로라이드, 폴리믹신 B와 퍼태슘 텔루라이트로 이루어진 생장 저해제, 및 페릭암모늄 사이트레이트, 마그네슘 설페이트, 만니톨, 소디움 피루베이트과 효모 추출물로 이루어진 생장 촉진제를 더 포함하는, 식중독 병원균 동시성장용 선택농축배지, 및 이를 이용하여 식중독 병원균을 동시성장시키는 방법에 관한 것이다.

Description

식중독 병원균 동시성장용 선택농축배지 및 이를 이용한 식중독 병원균의 동시성장 방법{Selective enrichment medium for simultaneous growth of foodborne pathogens and method of simultaneous growth of foodborne pathogens using the same}

본 발명은 식중독 병원균 동시성장용 선택농축배지 및 이를 이용한 식중독 병원균의 동시성장 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 트립틱 소이 브로쓰(TSB) 배지에, 아크리플라빈, 싸이클로헥시미드, 날리딕산, 리튬 클로라이드, 폴리믹신 B와 퍼태슘 텔루라이트로 이루어진 생장 저해제, 및 페릭암모늄 사이트레이트, 마그네슘 설페이트, 만니톨, 소디움 피루베이트와 효모 추출물로 이루어진 생장 촉진제를 더 포함하는, 식중독 병원균 동시성장용 선택농축배지, 및 이를 이용하여 식중독 병원균을 동시성장시키는 방법에 관한 것이다.

식중독(foodborne disease)은 전 세계적으로 발생하며 현재 공중보건 문제로서, 2014년 미국에서만 19,542건의 감염, 4,445건의 입원, 10만명당 71건의 사망이 음식을 통해 전염된 병원균에 의해 발생하였다.

특히 글로벌화된 세계에서 경제의 큰 손실을 초래하는데, 실제로 공중 보건과 경제에 대한 식중독의 부담은 과소 보고와 식량 오염과 이로 인한 질병이나 사망간의 인과 관계를 수립하기가 어렵기 때문에, 여전히 과소 평가되고 있다.

식중독 발생의 원인 박테리아들에는 병원성 대장균(E. coli), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 살모넬라(Salmonella sp.), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 캠피로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 등이 알려져 있는데, 이 중에서 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes) 및 황색포도상구균은 세 가지 주요 식중독 병원균이라 할 수 있다.

상기 바실러스 세레우스(B. cereus)는 선진국에서 식중독의 증가에 책임이 있으며, 설사 및 구토 식중독을 일으킨다. 상기 리스테리아 모노사이토제네스(L. monocytogenes)는 전 세계에서 수많은 리스테리아 증세를 일으켰으며, 이는 미국에서 주요 사망원인 중의 하나이기도 하다. 또한, 황색포도상구균(S. aureus)은 포도상구균 성장 독소를 생성하여 가장 흔한 식인성 질환 중의 하나인 포도상구균 식중독을 일으킬 수 있다.

한편, 상기 식중독 병원균의 전통적인 검출 방법은 농축 과정을 포함하여 배양 의존성 어세이(culture dependent assays)에 기반을 두고 있고, 분자 기반 PCR과 같은 많은 신속한 검출 방법이 개발되어 검출에 적용되고 있다(비특허문헌 1).

또한, 이들 식중독 박테리아를 검출하기 위한 표준 방법은 각 특정 박테리아에 특이적인 선택배지 및 분별배지 등을 이용하는 배양에 기초한 방법으로, BP 아가 배지의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 탄소원과 항생제를 포함하는 황색포도상구균 분별용 미생물 생육용 배지(특허문헌 1), 바실러스 세레우스 검출용 배지인 MYP 배지에, 항생제로 트리메토프림(trimethoprim)을 첨가한 세레우스 검출용 배지 조성물(특허문헌 2), 리스테리아 모노사이토제네스 선택 배양용 배지 조성물(특허문헌 3) 등이 알려져 있다.

그러나, 일부 가공식품 시료에는 적은 수의 쇠약한 생존세포(debilitated viable cells)를 포함하고 있어, 검출 한계를 충족시키지 못할 수 있고, 또한 경쟁하는 미생물 수가 더 많이 존재하여 표적 박테리아의 성장을 억제할 수 있기 때문에, 1회의 어세이에서 병원균의 동시 검출을 수행하기 위해서는 적절한 농축 배지가 필요하며, 이는 식품 시료의 병원균 농도를 높이고 스트레스 받은 세포 또는 손상된 세포의 회복을 촉진한다.

따라서, 복합 식품 매트릭스에서 표적 박테리아의 성장을 개선하기 위해, 천연 미생물에서 비표적 박테리아의 성장을 억제하지만, 표적 병원균의 성장을 지원하고 검출 효율을 증가시킬 수 있는 선택농축배지의 개발이 시급히 요구되고 있는 실정이다.

대한민국 등록특허공보 제10-1485947호 대한민국 공개특허공보 제10-2012-0048862호 대한민국 공개특허공보 제10-2013-0137965호

Korean J. Food Sci. Ani. Resour. Vol. 30, No. 3, pp. 410~418 (2010)

본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 비표적 박테리아의 성장을 억제하면서, 표적 병원균의 동시성장을 촉진시켜 검출 효율을 증가시킬 수 있는 식중독 병원균 동시성장용 선택농축배지(selective enrichment medium)를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 선택농축배지를 이용하여 비표적 박테리아의 성장을 억제하면서, 표적 박테리아인 식중독 병원균을 동시성장시킬 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 트립틱 소이 브로쓰(TSB) 배지에, 아크리플라빈, 싸이클로헥시미드, 날리딕산, 리튬 클로라이드, 폴리믹신 B와 퍼태슘 텔루라이트로 이루어진 생장 저해제, 및 페릭암모늄 사이트레이트, 마그네슘 설페이트, 만니톨, 소디움 피루베이트와 효모 추출물로 이루어진 생장 촉진제를 더 포함하는 식중독 병원균 동시성장용 선택농축배지를 제공한다.

또한, 본 발명은 시료를 상기 선택농축배지에 접종 및 배양하는 단계를 포함하는 식중독 병원균의 동시성장 방법을 제공한다.

본 발명에 의한 식중독 병원균 동시성장용 선택농축배지 및 이를 이용한 식중독 병원균의 동시성장 방법은 비표적 박테리아의 성장을 억제하면서, 표적 병원균인 식중독 병원균의 동시성장을 촉진시킬 수 있기 때문에, 바실러스 세레우스, 리스테리아 모노사이토게네스 및 황색포도상구균과 같은 식중독 병원균의 검출 효율을 증가시킬 수 있는 장점이 있다.

또한, 본 발명에 의한 식중독 병원균 동시성장용 선택농축배지 및 이를 이용한 식중독 병원균의 동시성장 방법의 상기와 같은 장점을 이용하여 농수산물 식품안전관리, 공중 보건 등에서 바실러스 세레우스, 리스테리아 모노사이토게네스 및 황색포도상구균과 같은 식중독균의 선택적 배양 및 검출방법에 기여할 수 있다.

도 1은 두 가지 접종 수준(10 CFU/mL 및 1000 CFU/mL)과 BLS 브로쓰 및 각 선택농축 브로쓰에서 24시간 동안 배양한 후, 바실러스 세레우스(a), 리스테리아 모노사이토게네스(b) 및 황색포도상구균(c)의 성장곡선을 나타낸 것이다.
도 2는 24시간 동안 BLS 브로쓰에서 4 가지의 다른 비율로 혼합된 바실러스 세레우스, 리스테리아 모노사이토게네스 및 황색포도상구균의 성장곡선을 나타낸 것으로서, (a)는 1:1:1(각 병원균에 대해 10-100 CFU/mL), (b)는 1:100:10(1-10 CFU/mL, 100-1000 CFU/mL 및 10-100 CFU/mL), (c)는 10:1:100(10-100 CFU/mL, 1-10 CFU/mL, 100-1000 CFU/mL), (d)는 100:10:1(100-1000 CFU/mL, 10-100 CFU/mL, 1-10 CFU/mL)을 나타낸 것이다.

본 발명의 일 구현예는 트립틱 소이 브로쓰(TSB) 배지에, 아크리플라빈, 싸이클로헥시미드, 날리딕산, 리튬 클로라이드, 폴리믹신 B와 퍼태슘 텔루라이트로 이루어진 생장 저해제, 및 페릭암모늄 사이트레이트, 마그네슘 설페이트, 만니톨, 소디움 피루베이트와 효모 추출물로 이루어진 생장 촉진제를 더 포함하는, 식중독 병원균 동시성장용 선택농축배지에 관한 것이다.

본 발명의 상기 식중독 병원균 동시성장용 선택농축배지는 상기 트립틱 소이 브로쓰(TSB) 배지 100 중량부에 대하여, 상기 아크리플라빈 0.008~0.0085 중량부, 상기 싸이클로헥시미드 0.066~0.068 중량부, 상기 날리딕산 0.066~0.068 중량부, 상기 리튬 클로라이드 1.6~1.7 중량부, 상기 퍼태슘 텔루라이트 0.000006~0.000008 중량부, 상기 페릭암모늄 사이트레이트 1.6~1.7 중량부, 상기 마그네슘 설페이트 3.2~3.4 중량부, 상기 만니톨 3.2~3.4 중량부, 상기 소디움 피루베이트 32~34 중량부, 및 상기 효모 추출물 6.4~6.8 중량부를 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 식중독 병원균 동시성장용 선택농축배지는 바람직하게는 상기 트립틱 소이 브로쓰(TSB) 배지 30 g/L, 상기 아크리플라빈 2.5 mg/L, 상기 싸이클로헥시미드 20 mg/L, 상기 날리딕산 20 mg/L, 상기 리튬 클로라이드 0.5 g/L, 상기 폴리믹신 B 55000 U/L, 상기 퍼태슘 텔루라이트 0.02 mg/L, 상기 페릭암모늄 사이트레이트 0.5 g/L, 상기 마그네슘 설페이트 1.0 g/L, 상기 만니톨 1.0 g/L, 상기 소디움 클로라이드 10 g/L 및 상기 효모 추출물 2.0 g/L를 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 식중독 병원균 동시성장용 선택농축배지에서, 상기 식중독 병원균의 예로는 병원성 대장균(E. coli), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 살모넬라(Salmonella sp.), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 캠피로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 등을 들 수 있다.

본 발명의 상기 식중독 병원균 동시성장용 선택농축배지에서, 상기 식중독 병원균은 바람직하게는 바실러스 세레우스, 리스테리아 모노사이토게네스 및 황색포도상구균 중에서 선택된 2종 이상, 보다 바람직하게는 바실러스 세레우스, 리스테리아 모노사이토게네스 및 황색포도상구균일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예는 시료를 상기 선택농축배지에 접종 및 배양하는 단계를 포함하는 식중독 병원균의 동시성장 방법에 관한 것이다.

본 발명의 상기 식중독 병원균의 동시성장 방법에서, 상기 시료는 식품 및 농수산물로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 식중독 병원균의 동시성장 방법에서, 상기 식품은 소고기, 돼지고기, 양고기 등과 같은 육류, 햄(스팸), 소시지, 베이컨 등과 같은 육가공품, 우유, 버터, 치즈 등과 같은 유가공품, 샐러드, 김밥 및 샌드위치 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 식중독 병원균의 동시성장 방법에서, 상기 접종 및 배양은 시료 0.1~5 ㎖. 바람직하게는 0.1~1 ㎖을 선택농축배지에 접종하고, 33~37℃, 바람직하게는 34~36℃에서, 18~36시간, 바람직하게는 18~24시간 동안 배양할 수 있다.

본 발명의 상기 식중독 병원균의 동시성장 방법에서, 상기 식중독 병원균의 예로는 병원성 대장균(E. coli), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 살모넬라(Salmonella sp.), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 캠피로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 등을 들 수 있다.

본 발명의 상기 식중독 병원균의 동시성장 방법에서, 상기 식중독 병원균은 바람직하게는 바실러스 세레우스, 리스테리아 모노사이토게네스 및 황색포도상구균 중에서 선택된 2종 이상, 보다 바람직하게는 바실러스 세레우스, 리스테리아 모노사이토게네스 및 황색포도상구균일 수 있다.

이하, 본 발명을 실시 예를 통하여 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시 예는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위는 이들 실시 예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예>

1. 재료 및 방법

(1). 박테리아 균주 및 배양 배지

본 실시예에서는 21개의 표적 균주 및 19개의 비표적 균주를 포함한 총 40개의 균주를 사용하였다. 모든 균주는 American Type Culture Collection(ATCC), Korean Collection for Type Culture(KCTC), Korean Culture Center of Microorganisms(KCCM) 및 National Culture Collection for Pathogens(NCCP)에서 구입하였다.

모든 균주는 20% 글리세롤을 포함하는 트립틱 소이 브로쓰(Bacto Tryptic Soy Broth; TSB, Becton Dickinson, Sparks, MD, USA)에서 -80℃에서 보관한 보존 배양(stock culture)으로부터 실온에서 해동시켰다. 각 균주를 TSB에서 35℃, 18~24 시간 동안 150 rpm으로 진탕 배양하였다.

멸균된 0.1 %(w/v) 펩톤수(PW; Difco)에서 배양액의 10배 희석액을 준비하고, 트립틱 소이 아가(TSA; Becton Dickenson and company, Sparks, MD, USA)에 도말하였다. 35℃에서 24시간 동안 인큐베이션한 후, 아가 플레이트상의 콜로니를 계수하였다.

(2). 성장 억제제 및 촉진제의 선택

널리 사용되고 있는 농축배지 TSB(Tryptic soy broth)를 기초배지로 사용하였는데, 상기 TSB 배지의 조성은 물 1 리터당 트립톤 17 g, 파이톤(Phytone) 3 g, NaCl 5 g, 다이퍼태슘 포스페이트(K₂HPO₄) 2.5 g, 글루코오스 2.5 g으로 이루어져 있다.

각 병원균의 성장은 다른 농도의 각 시약으로 시험하였다(표 1 참조). 리튬 클로라이드, 페릭암모늄 사이트레이트(ferric ammonium citrate), 마그네슘 설페이트, 만니톨(덕산제약(주), 안산시, 경기도), 소디움 피루베이트, 효모 추출물, 소디움 클로라이드를 별도로 증류수에 넣고 오토클레이브하였다.

아크리플라빈(Acriflavine), 싸이클로헥시미드(cycloheximide), 날리딕산(nalidixic acid), 퍼태슘 텔루라이트(potassium tellurite) 및 폴리믹신 B(polymyxin B)는 시그마(Sigma)에서 구입하여 별도로 고압증기 멸균된 증류수에 용해시킨 후, 0.2μm 막으로 여과하였다.

리튬 클로라이드, 페릭암모늄 사이트레이트 및 마그네슘 설페이트는 Sigma사로부터 구입하였으며, 소디움 피루베이트, 효모 추출물 및 소디움 클로라이드는 대정화학공업(경기도 시흥시)에서 구입하였다.

바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes) 및 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)의 접종 수준으로 50~100 CFU/mL를 준비하고, 각 시약과 함께 TSB에 접종하였다.

TSB에서 각 병원균의 성장은 대조군으로 사용되었다. 대한랩테크(경기도 남양주시)의 진탕 배양기(80 rpm)로 35℃에서 24시간 동안 배양한 후, OD₆₀₀을 SpectraMax i3 Platform(Molecular Devices, LLC Wals, Austria)로 OD₆₀₀을 기록하였다. 각 시약의 저해 수준은 OD₆₀₀ 값에 기초하여 계산되었다.

(3). 다중 병원균 농축 브로쓰(multi-pathogen enrichment broth) BLS의 제제

하나의 배지에서 3 가지 병원균의 성장을 위한 최상의 조합 조건을 얻기 위해, 반응표면 분석법(response surface methodology; RSM)에 의해 설계된 실험을 수행하여 싸이클로헥시미드, 폴리믹신 B 및 퍼태슘 텔루라이트의 조합 농도를 최적화하였다.

Design Expert Software(Version 8.0.6, Stat-Ease, Inc., Minneapolis, MN, USA)의 반응표면 중심합성설계법(central composite design of response surface)에 따라 20 세트의 작업이 수행되었다. 14 가지의 요인 실험과 6 가지의 중심점(central points)으로 구성되었다.

B. cereus , L. monocytogenes 및 S. aureus의 신선한 오버나잇 배양물을 102 CFU/mL 수준으로 각 시험에 별도로 접종하였다. 진탕 배양기(80 rpm)로 35℃에서 24시간 동안 인큐베이션한 후, 각 병원균에 대한 OD₆₀₀의 반응을 측정하였다.

(4). BLS 배지에서 세 가지 병원균의 성장 반응속도(growth kinetics)

개발된 선택농축배지 BLS와, 각 선택농축배지인 B. cereus용 폴리믹신 B(TP), L. monocytogenes용 fraser broth(FB) 및 7.5% 소디움 클로라이드(TNaCl)에 의한 TSB의 3 가지 병원균의 성장을 비교하였다. 0.1 mL의 S. aureus, B. cereus , L. monocytogenes 및 S. aureus 분액(aliquot)을 각각의 선택농축 배양액 9.9 mL에 접종하였다.

BLS와 각 선택농축배지에서 B. cereus , L. monocytogenes 및 S. aureus의 성장 반응속도를 비교하기 위하여, 두 가지 접종 수준(10 및 1000 CFU/mL)을 사용하였다.

시료를 0, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 및 24시간 동안 증균시킨 후, 0.1% 완충 펩톤수(BPW)로 적절히 희석시킨 다음, TSA로 처리하고 35℃에서 24시간 동안 배양하였다.

BLS 배지에서 성장 반응속도를 측정하기 위하여, 3 가지 병원균의 4가지 상이한 접종원 조합을 준비하였다. 실험 Ⅰ에서는 B. cereus , L. monocytogenes 및 S. aureus(각 병원균에 대해 10-100 CFU/mL)의 농도를 준비하고 BLS 브로쓰에 접종하였다. 실험 Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ에서 3개의 박테리아배양물의 접종비는 1:10:100(1-10 CFU/mL, 10-100 CFU/mL, 100-1000 CFU/mL)으로 설정하였다.

접종된 BLS 브로쓰를 진탕 배양기(150 rpm)로 35℃에서 24시간 동안 배양하고, 0, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 및 24시간 동안 증균시킨 후 시료를 취하였다. 각 박테리아 0.1mL의 분액(aliquot)을 각 선택아가 플레이트, 즉 B. cereus에 대한 살아있는 콜로니수를 결정하기 위한 Mannitol-Egg Yolk-Polymyxin agar(MYP agar, Difco), L. monocytogenes용 수정된 Listeria supplement(MOX 한천, 영국 Oxiod, 영국), 및 달걀 노른자(egg yolk)와 텔루라이트 에멀젼을 함유하는 S. aureus용 Baird Parker Agar(BP agar, Oxiod, England))에 플레이팅하였다.

(5). 비표적 박테리아와 스트레스 받은 세포에 대한 다중 병원균 BLS의 평가

표적 박테리아의 성장을 지원하고 비표적 병원균의 성장을 억제하기 위한 BLS 브로쓰의 능력을 평가하기 위하여, 6개의 표적 박테리아와 5개의 비표적 박테리아의 신선한 배양액을 TSB로 준비하였다.

적절한 희석 후, 각각의 병원균을 BLS 브로쓰와 TSB에 개별적으로 10³ CFU/mL의 접종 농도로 접종하였다. 시료를 35℃에서 배양하는 동안 12, 16, 20 및 24시간 동안 증균시킨 후 채취하여 OD₆₀₀ 값을 측정하였다.

BLS 브로쓰의 회복 성능(recovery performance)을 시험하기 위하여, 산(pH 4.5, pH 5.5, 3시간), 냉(4℃, 3시간) 및 열(55℃, 10분) 조건 하에서 3 가지 병원균의 스트레스 받은 세포를 준비하였다. 3 가지 병원균의 순수한 신선한 배양물을 준비하고 각 배양액 5mL를 원심분리하고, 인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.4; Gibco, Invitrogen, Grand Island, NY, USA)에 재현탁시켰다.

세포 펠렛을 5 mL의 BLS로 재현탁시키고, 다음 조건으로 3시간 동안 유지 하였다. (ⅰ) 산성 조건 BLS는 1M 구연산(경기도 시흥시 대청화학공업(주))을 이용하여 pH 4.5, 5.5로 조정하였다. (ⅱ) 냉 조건 BLS를 4℃에서 예냉하였다. (ⅲ) 열 조건 BLS를 수조(비전과학 유한공사, 대전광역시)에서 55℃로 예열한 후 55℃의 수조에서 10 분간 유지하였다. 이어서 배양물을 즉시 워터 배쓰에서 제거하고, 상온(25℃)에서 열 스트레스를 멈추게 하였다.

(ⅳ) 대조군 BLS는 37℃에서 예열하였다. 0.1 mL의 스트레스 받은 세포를 9.9 mL의 BLS, 0.6%의 효모 추출물을 함유한 TSB(TSBYE), 각각의 선택농축배지(B. cereus용 TP, L. monocytogenes용 FB 및 S. aureus용 TNaCl)에 접종하였다.

35℃에서 3시간 및 6시간 동안 회복시킨 후, 각 박테리아의 적절한 희석액을 TSA에 스프레드하고, 35℃에서 24시간 동안 배양하였다.

2. 결과

(1). 성장 억제제 및 촉진제의 선택

6개의 성장 억제제와 5개의 촉진제를 따로 따로 준비하여 TSB에 첨가하고 각 첨가 시약의 농도를 다르게 한 후, 세 가지 병원균의 OD₆₀₀ 값을 측정한 결과를 하기 표 1(B. cereus , L. monocytogenes 및 S. aureus의 성장에 첨가된 각 시약의 영향)에 나타내었다.

상기 표 1에서, 저해 수준(inhibitionlevel)은 다음 방정식 [(OD_TSB-OD_{TSB with each reagent})/ODT_SB * 100]으로 측정된다. 억제 수준값은 평균±표준편차(n=3)이다. 서로 다른 글자를 갖는 동일한 박테리아에 대해 동일한 시약의 동일한 컬럼 내에서의 의미는 유의적인 차이를 나타낸다(p<0.05).

상기 표 1에서 보는 바와 같이, B. cereus , L. monocytogenes 및 S. aureus의 성장은 L. monocytogenes의 성장을 제외하고 모든 시험 농도에서 리튬 클로라이드 0.5 g/L 수준의 첨가와 함께, 아크리플라빈(acriflavine), 싸이클로헥시미드(cycloheximide), 날리딕산(nalidixic acid), 리튬 클로라이드(lithium chloride), 폴리믹신 B(polymyxin B)와 퍼태슘 텔루라이트(potassium tellurite)를 첨가했을 때 억제되었다.

3가지 병원균의 저해 수준은 아크리플라빈, 폴리믹신 B 및 퍼태슘 텔루라이트의 농도가 다른 경우 유의한 차이를 보였다(p <0.05). 아크리플라빈, 폴리믹신 B 및 퍼태슘 텔루라이트의 농도가 높을수록 저농도에 비해 세 병원균에 대한 억제효과가 더 좋았다.

아크리플라빈의 첨가는 TSB에서 2.5 mg/L의 농도로 3개의 병원균의 성장을 약간 억제했다. 3 가지 첨가 농도의 날리딕산의 경우 B. cereus의 성장에서 유의한 차이는 발견되지 않았다. 20 mg/L의 날리딕산을 첨가하였을 때, L. monocytogenes 및 S. aureus의 높은 수준의 성장(40-60 mg/L)에 비해 덜 억제되었다. 0.5 g/L의 리튬 클로라이드를 첨가한 경우, 세 가지 병원균에 대한 저해 수준(4 % 미만)이 발견되었다.

싸이클로헥시미드, 폴리믹신 B 및 퍼태슘 텔루라이트 첨가농도 사이의 유의 수준의 차이 때문에, 이 세 가지 시약의 수준이 더욱 최적화되었다.

페릭암모늄 사이트레이트, 마그네슘 설페이트, 만니톨, 소디움 피루베이트 및 효모 추출물을 B. cereus , L. monocytogenes 및 S. aureus의 성장 촉진제로 시험하였다.

페릭암모늄 사이트레이트(0.5g/L), 마그네슘 설페이트(1 g/L) 및 소디움 피루베이트(10 g/L)의 농도가 높을수록 세 병원균의 성장이 더 잘 뒷받침되었다. 2 g/L의 첨가량이 적은 효모 추출물은 L. monocytogenes와 S. aureus의 성장을 유의하게 촉진시켰다(p <0.05). 만니톨은 시험한 농도의 L. monocytogenes(30% 이상)의 성장을 잘 뒷받침한다. 그리고 만니톨의 첨가량이 1 g/L일 때, 3 가지 병원균의 전반적인 성장이 더 좋았다.

(2). 선택농축 브로쓰 BLS의 제제

RSM은 싸이클로헥시미드, 폴리믹신 B 및 퍼태슘 텔루라이트의 최적 농도를 최적화하도록 설계되었다. B. cereus , L. monocytogenes 및 S. aureus의 20회 수행에 대한 반응 OD₆₀₀ 값을 사용하여 다양한 조합을 평가한 결과를 하기의 표 2(B. cereus , L. monocytogenes 및 S. aureus의 성장을 위한 cycloheximide, polymyxin B 및 potassium tellurite의 최적화)에 나타내었다.

상기 표 2에서 보는 바와 같이, B. cereus의 경우, 1, 5, 20 번의 OD₆₀₀ 값이 가장 높았다(>0.80). L. monocytogenes의 OD₆₀₀ 값은 2, 3, 11, 19로 유의하게 높았다(p<0.05). S. aureus의 OD₆₀₀ 값은 3, 5, 14, 15, 16(>1.0)으로 다른 군보다 유의하게 높았다(p<0.05).

싸이클로헥시미드, 폴리믹신 B 및 퍼태슘 텔루라이트의 필요한 양은 RSM으로 세 병원균의 성장을 최대화하기 위해 최적화되었다. BLS 배지에서 B. cereus , L. monocytogenes 및 S. aureus의 OD₆₀₀ 값은 각각 0.78, 0.70 및 1.11이었고, 3 가지 시약의 최적 조합으로 99% 예측 간격(PI)의 범위에 있었다(싸이클로헥시미드 20 mg/L, 폴리믹신 B 55000 U/L 및 퍼태슘 텔루라이트 0.02 mg/L).

아크리플라빈은 종종 농축 프로토콜에서 싸이클로헥시미드, 날리딕산, 폴리믹신 B 및 퍼태슘 텔루라이트 티오시아네이트(potassium thiocyanate)와 결합되어 아크리플라빈 자체가 RNA 합성을 억제할 수 있다. 아크리플라빈은 다른 포도상구균에 비해 S. aureus를 억제하였다.

날리딕산은 S. enteritidis와 Shigella dysenteriae와 같은 그람 음성 박테리아가 5 mg/L의 농도로 성장하는 것을 저해하였다. 마그네슘 설페이트는 B. cereus의 성장을 촉진시켰다. 소디움 피루베이트는 손상된 세포의 회복을 촉진할 수 있다. Fe^{3 +}는 L. monocytogenes의 성장을 자극하는 것으로 보고되었다.

그러므로 상기와 같은 결과를 바탕으로 저해제(inhibitors)와 촉진제(promoters)들을 조합하여 하기 표 3과 같은 공식화된 식중독 병원균 동시성장용 선택농축배지(BLS)를 개발하였다.

(3). BLS 배지에서 3 가지 병원균의 개별 및 동시 성장

B. cereus , L. monocytogenes 및 S. aureus의 BLS 배지 및 각 선택농축 배양액에서의 성장곡선을 도 1에 나타내었는데, 3 가지 병원균에 대한 각각의 선택농축배지는 B. cereus용 폴리믹신 B(TP), L. monocytogenes용 frazer broth(FB) 및 S. aureus용 7.5% 소디움 클로라이드(TNaCl)에 의한 TSB로 나타내었다. 두 접종 수준(10 및 1000 CFU/mL)을 시험하였다.

BLS 브로쓰와 TP 브로쓰에서 B. cereus의 성장 반응속도는 두 가지 수준과 유사하였다. BLS 배지에서의 L. monocytogenes 및 S. aureus의 성장은 각각의 선택농축배지 FB 및 TNaCl에서 보다 2배(two levels)나 양호하였다.

도 1의 곡선으로부터 추론된 성장 반응속도 값을 하기 표 4에 나타내었다.

상기 표 4에서, Bc는 B. cereus, Lm은 L. monocytogenes, Sa는 S. aureus를 의미한다.

상기 표 4에서 보는 바와 같이, BLS 배지 중 B. cereus , L. monocytogenes 및 S. aureus의 지수기 성장속도(exponential growth rate; EGR)는 각각 0.57, 0.55 및 0.49이었고, 이는 접종 수준이 높은 TP, FB 및 TNaCl 배지에 비해 빨랐다.

신선한 배양액이 사용되었기 때문에, FBD에서 3.48 시간의 생장지체기 시간(lag phase duration; LPD)를 보인 L. monocytogens를 제외하고는 LPD를 계산할 수 없었다. TNaCl에서 S. aureus가 2.9 시간의 LPD를 나타냈다.

B. cereus , L. monocytogenes 및 S. aureus의 4 가지 접종 비율에 따라 L. monocytogenes의 성장은 B. cereus 및 S. aureus 만큼 좋지 않았으며(도 2), 4 가지 다른 비율의 LPD는 6시간 이상(표 4). B. cereus의 성장은 4 가지 다른 비율과 유사하였으며, B. cereus의 LPD는 L. monocytogenes 및 S. aureus보다 더 빨랐다.

B. cereus , L. monocytogenes , S. aureus의 접종비가 1:1:1이었을 때 세 병원균의 MPD는 각각 8.40, 7.76, 8.09 log CFU/mL이었다. 접종비가 1:100:10일 때, L. monocytogenes는 낮은 접종 수준에 비해 6.01 시간의 더 낮은 LPD를 보여 주었고, 세 병원균에 대한 유사한 MPD(>8.1 log CFU/mL)가 얻어졌다.

접종비가 10:1:100인 경우 L. monocytogenes의 낮은 접종 수준으로 인해 12.91 시간의 높은 LPD가 얻어졌고, L. monocytogenes에 대한 최대 균체밀도(maximum population density; MPD)가 6.53 log CFU/mL로 가장 낮았으며, 병원균의 비율이 100:10:1일 때, L. monocytogenes는 S. aureus(7.38 log CFU/mL)보다 높은 MPD(7.73 CFU/mL)를 보였다.

4 가지 다른 비율을 갖는 S. aureus의 EGR은 가장 낮았다. 이 결과는 BLS 브로쓰가 B. cereus , L. monocytogenes 및 S. aureus의 성장을 뒷받침할 수 있음을 나타낸다.

(3). 비표적 박테리아와 스트레스 받은 세포에 대한 다중 병원균 BLS의 평가

6개의 표적 박테리아(각 병원균에 대해 2개의 균주)와 그람 양성균과 그람 양성균을 포함한 5개의 비표적 박테리아를 사용하여 BLS 배지의 성능을 평가한 결과를 표 5에 나타내었다.

상기 표 5에서 보는 바와 같이, 표적 박테리아의 경우 OD₆₀₀ 값은 표적 박테리아를 뒷받침할 수 있는 능력을 나타내는 TSB의 OD₆₀₀ 값과 BLS 브로쓰에서 비슷하였다.

24시간 배양한 후, TSB에서 양호한 성장이 이루어졌지만, 5개의 모든 비표적 박테리아는 BLS 브로쓰에서 성장이 되지 않았다. 대조적으로, 이들은 TSB에서 양호한 성장을 나타내었는데, 이는 BLS 배지가 비표적 박테리아의 성장을 잘 억제함을 나타낸다.

저온, 산성 및 열로부터 스트레스 받은 세포의 회복 능력(recovery ability)을 위해 BLS 브로쓰에서 각 병원균의 콜로니 수를 TSBYE 및 각각의 선택농축배지와 비교한 결과를 표 6에 나타내었다.

하기 표 6에서 보는 바와 같이, 3 가지 병원균의 로그(log) 감소는 B. cereus, L. monocytogenes 및 S. aureus의 열 조건(55℃, 10분), 1.48, 2.65 및 2.94에서 가장 높았다.

B. cereus가 냉(cold), 산성 및 열로 처리되었을 때 대조구 조건(37℃)과 비교하여 0.14에서 1.48 log 감소가 얻어졌다. S. aureus가 pH 4.5와 5.5로 처리되었을 때 log 감소는 0.4 log 미만이었다.

냉 조건의 스트레스는 세포 손상을 최소화시켰다(0.14 로그 감소). L. monocytogenes의 경우 대조구 조건에 비해 0.37-2.65 log 감소가 나타났다. 냉 조건의 스트레스는 세포 손상을 일으키지 않았지만, 세포수를 증가시켰다.

S. aureus의 경우 대조구 조건에 비해 0.05에서 2.94 log 감소가 얻어졌다. 냉 조건의 스트레스는 세포 손상을 최소화시켰다(0.05 로그 감소). 스트레스 조건에서 세 병원균의 손상된 세포는 BLS 브로쓰, TSBYE 및 열 조건 하에서 L. monocytogenes 및 S. aureus를 제외한 각각의 선택농축배지에 의해 회복되었다.

FB는 3시간 배양 후 L. monocytogenes의 열 스트레스 받은 세포를 회복시키지 못했고, TNaCl은 3시간 및 6시간의 회복 후에 S. aureus의 열원 세포를 회복시키지 못했다.

BLS는 TSBYE를 가진 3 가지 스트레스 받은 병원균의 회복 능력을 보였으나(p> 0.05), 열 스트레스에 의한 L. monocytogenes의 회복이 TSBYE에서 보다 BLS에서 유의하게 낮았다는 것을 제외하고는 각각의 선택적 농축에서 보다 우수한 회복 성능을 보였다(p<0.05).

선택농축배지로서, BLS 브로쓰는 TSBYE와 유사한 성능을 나타내지만, 3 가지 스트레스 받은 박테리아의 회복에 대한 각각의 선택적 농축보다 우수하였다.

상기 표 6에서, BLS에서 S. aureus의 성장에 대해 동일한 배양시간 동안 동일한 처치를 한 소문자 알파벳은 유의한 차이를 보였다(p<0.05). BLS에서 S. aureus의 성장을 위하여 6시간의 배양 동안 열처리를 한 다른 대문자 알파벳은 유의한 차이를 보였다(p<0.05).

3. 결론

결론적으로 B. cereus , L. monocytogenes 및 S. aureus의 동시 농축을 위해 새로운 선택농축배지 BLS가 개발되었다. BLS 배지는 세 가지 병원균의 성장을 촉진시켰고, 비표적 박테리아에 대해 우수한 억제 능력을 나타내었다.

또한, 스트레스 받은 세포를 회복시키는데는 TSBYE와 비슷한 성능을 나타내지만, 각각의 선택농축배지에서 보다 우수하였다.

상술한 바와 같이 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 통상의 기술자라면 하기의 청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

본 발명에 의한 식중독 병원균 동시성장용 선택농축배지 및 이를 이용한 식중독 병원균의 동시성장 방법은 비표적 박테리아의 성장을 억제하면서, 표적 병원균인 식중독 병원균의 동시성장을 촉진시킬 수 있기 때문에, 바실러스 세레우스, 리스테리아 모노사이토게네스 및 황색포도상구균과 같은 식중독 병원균의 검출 효율을 증가시킬 수 있는 장점이 있기 때문에, 본 발명이 속하는 기술 분야에 유용하게 적용될 수 있다.

Claims (9)

1. 트립틱 소이 브로쓰(TSB) 배지에, 아크리플라빈, 싸이클로헥시미드, 날리딕산, 리튬 클로라이드, 폴리믹신 B와 퍼태슘 텔루라이트로 이루어진 생장 저해제, 및 페릭암모늄 사이트레이트, 마그네슘 설페이트, 만니톨, 소디움 피루베이트와 효모 추출물로 이루어진 생장 촉진제를 더 포함하는, 식중독 병원균 동시성장용 선택농축배지로서,
   상기 트립틱 소이 브로쓰(TSB) 배지 30 g/L, 상기 아크리플라빈 2.5 mg/L, 상기 싸이클로헥시미드 20 mg/L, 상기 날리딕산 20 mg/L, 상기 리튬 클로라이드 0.5 g/L, 상기 폴리믹신 B 55000 U/L, 상기 퍼태슘 텔루라이트 0.02 mg/L, 상기 페릭암모늄 사이트레이트 0.5 g/L, 상기 마그네슘 설페이트 1.0 g/L, 상기 만니톨 1.0 g/L, 상기 소디움 클로라이드 10 g/L 및 상기 효모 추출물 2.0 g/L를 포함하고,
   상기 선택농축배지에 상기 식중독 병원균을 4℃의 저온, 55℃의 고온 또는 pH 4.5~5.5의 산성 스트레스 조건으로 배양시, 상기 식중독 병원균이 정상적으로 회복되며,
   상기 식중독 병원균은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes) 및 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 중에서 선택된 2종 이상인, 식중독 병원균 동시성장용 선택농축배지.
2. 삭제
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5. 시료를 제1항의 선택농축배지에 접종 및 배양하는 단계를 포함하는 식중독 병원균의 동시성장 방법으로서,
   상기 식중독 병원균은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes) 및 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 중에서 선택된 2종 이상인, 식중독 병원균의 동시성장 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 시료는 식품 및 농수산물로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 식중독 병원균의 동시성장 방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 식품은 육류, 육가공품, 유가공품, 샐러드, 김밥 및 샌드위치로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 식중독 병원균의 동시성장 방법.
8. 제5항에 있어서, 상기 접종 및 배양은 시료 0.1~5 ㎖을 선택농축배지에 접종하고, 33~37℃에서, 18~36시간 동안 배양하는 것을 특징으로 하는 식중독 병원균의 동시성장 방법.
9. 삭제

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