KR20130137965A - 리스테리아 모노사이토제니스 선택 배양용 배지 조성물 - Google Patents

리스테리아 모노사이토제니스 선택 배양용 배지 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes) 선택 배양용 배지 조성물 및 이를 이용하여 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes)를 리스테리아 이노큐아(Listeria innocua)균 또는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)로부터 선택 분리하는 방법에 관한 것으로, 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes)와 리스테리아 이노큐아(L. innocua)가 분별되지 않았던 문제점을 해결함으로써, 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes)의 분별 선택성을 높이는 효과를 발휘한다.

Description

리스테리아 모노사이토제니스 선택 배양용 배지 조성물{Medium composition for screening of Listeria monocytogenes}
본 발명은 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes) 선택 배양용 배지 조성물 및 이를 이용하여 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes)를 리스테리아 이노큐아(Listeria innocua)균 또는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)로부터 선택 분리하는 방법에 관한 것이다.
리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes)는 주된 식중독균 중 하나로 해외에서는 이 균과 관련된 식중독 사고가 빈번하게 발생하고 있다. 따라서, 식품 안전성을 위해 식품으로부터 리스테리아 모노사이토제니스를 분리해 내는 일은 매우 중요하다고 할 수 있다.
리스테리아 모노사이토제니스의 분리를 위한 다양한 방법 중 선택 분별 배지의 사용은 가장 널리 사용되는 방법인데, 현재까지 다양한 종류의 선택 분별 배지가 개발되었다. 그 중에서 변형된 옥스포드 아가(modified oxford agar, MOX) 배지는 가장 널리 사용되고 있는 배지 중 하나이다 (Hegde, V., C. G. Leon-Velarde, C. M. Stam, L. A. Jaykus, and J. A. Odumeru. 2007. Evaluation of BBL CHROMagar Listeria agar for the isolation and identification of Listeria monocytogenes from food and environmental samples. Journal of Microbiological Methods. 68: 82-87; Gasanov, U., D. Hughes, and P, M. Philip. 2005. Methods for the isolation and identification of Listeria spp. and Listeria monocytogenes: a review. FEMS Microbiology Reviews. 29: 851-875)
MOX (modified oxford agar) 배지는 리스테리아 모노사이토제니스가 가지는 에스쿨리나아제(esculinase) 효소 활성을 이용하여 다른 미생물들로부터 리스테리아 모노사이토제니스를 분별해 내는 것이다. 리스테리아 모노사이토제니스는 MOX 배지 중에 존재하는 에스쿨린(esculin)을 분해하고, 분해된 생성물이 MOX 배지 상에 존재하는 규연산 철 암모늄(ferric ammonium citrate)과 반응하여 콜로니를 검은색으로 변화시키는데, 이러한 특성으로 인해 리스테리아 모노사이토제니스는 MOX 배지 상에서 검은색 콜로니로 자라게 되어, 다른 미생물로부터 용이하게 구별되는 것이다.
하지만, 상기와 같은 특성은 같은 종에 속하며 식품 중에 빈번히 존재하는 리스테리아 이노큐아 균에서도 동일하게 나타나기 때문에 식품 중에 이들 두 균주가 함께 존재하는 경우, 비병원성인 리스테리아 이노큐아 균이 병원성인 리스테리아 모노사이토제니스 균으로 판단되는 허위양성(false positive) 결과를 야기할 수 있다. 이와 같은 허위양성(false positive) 결과는 리스테리아 모노사이토제니스를 정확히 분별하기 위한 추가적인 테스트의 필요성을 의미하는 것인데, 이로 인해 추가적 비용과 노동력이 소요되고 있는 실정이다.
한편, 최근 들어 형광물질을 이용한 리스테리아 모노사이토제니스 검출용 색소 생산성(chromogenic) 선택 배지가 많이 나오고 있다. 기존 배지에 비해 분별능이 높기는 하나, 기존 배지에 비해 고가격이기 때문에 식품 산업 현장에서의 사용이 제한될 수밖에 없는 장애가 있다.
따라서, 리스테리아 모노사이토제니스를 비병원성 균인 리스테리아 이노큐아로부터 분별하는 동시에, 가격 경쟁력 또한 가진 새로운 선택분별배지를 개발하는 것은 대단히 중요하다.
대한민국 특허출원번호 제10-2003-0022492호에는 "리스테리아 모노사이토게네스를 선별적으로 인지하는 단클론 항체, 이를 생산하는 하이브리도마, 이를 포함하는 시험 키트 및 이를 사용한 검출 방법"이 기재되어 있고, 대한민국 특허출원번호 제10-2004-0011088호에는 "PCR을 통해 리스테리아 속 균종을 검출하는 방법 및 검출키트"가 기재되어 있다.
본 발명에서는 상기 "발명의 배경이 되는 기술"에서 서술한 문제점을 극복할 수 있는 새로운 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes) 선택 분별용 배지를 개발하여 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 개발된 선택 분별용 배지를 이용하여 리스테리아 모노사이토제니스 (Listeria monocytogenes)를 허위 양성균으로부터 분리하는 방법을 개발하여 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명은 레시틴(lecithin)을 포함하는 것을 특징으로 하는 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes) 선택 배양용 배지 조성물을 제공한다. 이때, 상기 레시틴은 일 예로, 대두 유래인 것을 사용할 수 있다. 레시틴(lecithin)은 글리세린 인산을 포함하고 있는 인지질의 하나로서, 생체막을 구성하는 주요 성분인데, 난황·콩기름·간·뇌 등에 많이 존재한다.
본 발명의 레시틴을 첨가한 배지를 사용할 경우, 레시틴은 레시티나아제 효소의 기질로 사용될 수 있는데, 이 효소를 가지고 있는 리스테리아 모노사이토제니스는 효소 활성을 나타낼 수 있기 때문에, 효소 활성을 나타내지 못하는 다른 균주들과 구별될 수 있다. 특히, 리스테리아 모노사이토제니스에 대해 허위 양성을 불러일으키는 리스테리아 이노큐아 균주는 레시티나아제 효소를 가지고 있지 않기 때문에, 배지 상에서 리스테리아 모노사이토제니스를 리스테리아 이노큐아로부터 구별할 수 있다.
한편, 본 발명의 배지 조성물은, 일 예로 에스쿨린(esculin)을 포함하지 않는 것일 수 있다. 또한, 본 발명의 배지 조성물은 다른 예로 레보플록사신(levofloxacin)을 더 포함하는 것일 수 있다. 또한, 본 발명의 배지 조성물은 상기와 다른 또 다른 예로 레보플록사신을 포함하고, 에스쿨린을 포함하지 않는 것일 수 있다.
에스쿨린(esculin)은 기존의 MOX 배지 상에서 유효성분으로 첨가된 물질인데, 에스쿨리나아제(esculinase)라는 효소에 분해된다. 분해되어 생성된 생성물은 MOX 배지 상에 존재하는 규연산 철 암모늄(ferric ammonium citrate)과 반응하여 콜로니를 검은색으로 변화시킨다. 이러한 특성에 의해 리스테리아 모노사이토제니스는 MOX 배지 상에서 검은 색 콜로니로 자라게 되어, 다른 미생물로부터 용이하게 구별되는 것이었다. 그런데, 에스쿨린은 리스테리아 모노사이토제니스의 에스쿨리나아제에 의해 분해될 경우, 검은색의 퍼지는 형상의 콜로니를 형성한다. 이는 레시티나아제에 의해 콜로니 주변에 형성되는 환을 명확하지 않게 할 수 있으므로, 바람직하게는 본 발명의 배지에서 제외하는 것이 좋다.
레보플록사신(levofloxacin)은 항생제의 일종으로 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)를 선택적으로 사멸시키는 특징이 있다. 식품 중에 빈번히 존재할 수 있는 바실러스 세레우스는 리스테리아 모노사이토제니스와 동일하게 레시티나아제 활성을 가지고 있는데, 배지 상에서 리스테리아 모노사이토제니스로 판별되는 허위양성 결과를 야기할 수 있다. 하지만, 이와 같은 문제가 본 발명에서와 같이 레보플록사신을 배지 중에 첨가함으로써 해결될 수 있다.
한편, 본 발명의 배지 조성물은, 에스쿨린을 포함하지 않는 경우, 바람직하게 규연산 철 암모늄(ferric ammonium citrate)을 더 포함하지 않을 수 있다. 에스쿨린이 배지 중에 존재하지 않으므로, 그 존재를 전제로 하여 색깔을 형성시키기 위해 첨가되는 규연산 철 암모늄의 배지 중 첨가가 더 이상 불필요하기 때문이다.
한편, 본 발명은 레시틴(lecithin)을 포함하고, 에스쿨린을 포함하지 않는 배지를 이용하여, 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes)를 리스테리아 이노큐아(Listeria innocua)균으로부터 분리하는 방법을 제공한다. 이와 같은 배지 조성에 의해 리스테리아 모노사이토제니스 균주를 허위 양성을 일으키는 리스테리아 이노큐아로부터 명확히 분리할 수 있다.
한편, 본 발명은 레시틴(lecithin) 및 레보플록사신을 포함하고, 에스쿨린을 포함하지 않는 배지를 이용하여 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes)를 리스테리아 이노큐아(Listeria innocua)균 및 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)로부터 분리하는 방법을 제공한다. 이와 같은 배지 조성에 의해 리스테리아 모노사이토제니스 균주를 허위 양성을 일으키는 리스테리아 이노큐아 및 바실러스 세레우스로부터 명확히 분리할 수 있다.
한편, 바람직하게 본 발명의 리스테리아 모노사이토제니스 선택 분별용 배지 조성물은, 추가적으로 판크레아틱 다이제스트 오브 카제인(pancreatic digest of casein), 프로테아제 펩톤(protease peptone), 효모 추출물(yeast extract), 비프 하트 인퓨젼(beef heart infusion), 염화나트륨(sodium chloride), 염화리튬(lithium chloride), 아가(agar)를 포함할 수 있다.
또한, 더욱 바람직하게 본 발명의 리스테리아 모노사이토제니스 선택 분별용 배지 조성물은 배지 1L 당 8.9 g의 판크레아틱 다이제스트 오브 카제인(pancreatic digest of casein), 4.4 g의 프로테아제 펩톤(protease peptone), 4.4 g의 효모 추출물(yeast extract), 2.7 g의 비프 하트 인퓨젼(beef heart infusion), 4.4 g의 염화나트륨(sodium chloride), 15.0 g의 염화리튬(lithium chloride), 15.0 g의 아가(agar), 5 g의 대두 레시틴(soy lecithin), 0.2 g의 레보플록사신(levofloxacin)으로 조성되는 것이 좋다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에서 개발한 배지 조성물은 기존의 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes) 선택 분별 배지에서 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes)와 리스테리아 이노큐아(L. innocua)가 분별되지 않았던 문제점을 해결함으로써 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes)의 분별 선택성을 높이는 효과를 발휘한다. 이와 같은 효과는 리스테리아 이노큐아(L. innocua)의 허위양성(false positive) 결과를 감소시켜, 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes)의 확인을 위한 추가적인 테스트시, 테스트 해야 하는 콜로니(colony)의 수를 현저히 감소시킨다. 결국 본 발명의 배지는 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes)의 검출에 소비되는 막대한 비용과 시간을 절감할 수 있는 것이다.
도 1은 기존 MOX 배지(A)와 본 발명에서 개발한 배지(B)에서 배양된 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes)와 리스테리아 이노큐아(L. innocua)의 콜로니(colony) 모습을 각각 나타낸 도이다.
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[ 실시예 1: 본 발명의 리스테리아 모노사이토제니스 ( Listeria monocytogenes ) 선택 분별용 배지 조성물 제조]
배지 1L를 기준으로 8.9 g의 판크레아틱 다이제스트 오브 카제인(pancreatic digest of casein), 4.4 g의 프로테아제 펩톤(protease peptone), 4.4 g의 효모 추출물(yeast extract), 2.7 g의 비프 하트 인퓨젼(beef heart infusion), 4.4 g의 염화나트륨(sodium chloride), 15.0 g의 염화리튬(lithium chloride), 15.0 g의 아가(agar), 5g의 대두 레시틴(soy lecithin), 0.2g의 레보플록사신(levofloxacin)을 첨가하여, 리스테리아 모노사이토제니스 선택 분별용 배지를 제조하였다. 이 조성은 기존에 사용되어 오던 MOX 배지의 조성을 변형한 것으로, 대두 레시틴과 레보플록사신(levofloxacin)을 첨가하고, 에스쿨린(esculin)을 제거한 특징이 있다.
[ 실험예 1: 새로운 배지의 리스테리아 모노사이토제니스( Listeria monocytogenes )와 리스테리아 이노큐아 ( L. innocua ) 분별능 측정 실험]
리스테이아 모노사이토제니스와 리스테리아 이노큐아를 트립틱 소이 브로스(tryptic soy broth)에서 18시간 동안 배양한 후, 기존의 MOX 배지와 본 발명의 새로운 배지에 분주, 도말하여 배양하였다. 그 결과, 도 1과 같이 본 발명에서 개발한 새로운 배지에서는 리스테리아 모노사이토제니스와 리스테리아 이노큐아가 서로 구분되는 콜로니를 형성하는 것을 확인하였다. 도 1은 기존 MOX 배지(A)와 본 발명의 배지(B)에서, 각각 배양된 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes)와 리스테리아 이노큐아(L. innocua)의 콜로니(colony) 모습을 나타낸 도이다. 기존 MOX 배지에서는 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes)와 리스테리아 이노큐아(L. innocua)의 콜로니 모두 검은 색을 나타내어 분별이 불가능한 반면, 실시예 1 배지에서는 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes)는 환으로 둘러싸인 하얀색 콜로니로 자라고, 리스테리아 이노큐아(L. innocua)는 환이 없는 하얀색 콜로니로 자람으로써 서로 분별이 가능한 것을 확인할 수 있다.
[ 실험예 2: 항생제 첨가에 따른 기존 배지와의 선별성 검증 실험]
실시예 1의 배지에 새롭게 첨가된 항생제가 리스테리아 모노사이토제니스 (Listeria monocytogenes)의 생장을 억제하는 정도를 확인하기 위해 기존의 MOX 배지와 비교 검증하는 실험을 수행하였다.
10 ml의 트립틱 소이 브로스(tryptic soy broth)에 15개 균주의 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes)를 접종하고 37℃에서 18 시간 동안 배양하였다. 그 후, 단계적으로 10배 희석하여 MOX 배지와 실시예 1의 배지에 분주, 도말하였다. 그리고 37℃에서 48 시간 동안 배양한 후 콜로니 수를 비교하였다.
종 균주a 콜로니 수(log CFU/ml)
MOX 실시예 1의 배지
Listeria monocytogenes ATCC 19114 5.48±0.43 5.20±0.13
L. monocytogenes ATCC 19115 5.32±0.28 5.11±0.14
L. monocytogenes ATCC 15313 5.40±0.33 5.22±0.06
L. monocytogenes NCCP 10810 5.82±0.35 5.61±0.33
L. monocytogenes NCCP 10811 5.68±0.42 5.45±0.55
L. monocytogenes NCCP 10943 5.04±0.46 4.81±0.58
L. monocytogenes SNCC 1 5.34±0.04 5.28±0.11
L. monocytogenes SNCC 2 5.24±0.66 5.14±0.76
L. monocytogenes SNCC 3 4.79±0.52 4.73±0.61
L. monocytogenes SNCC 4 5.59±0.55 5.36±0.23
L. monocytogenes SNCC 5 5.66±0.30 5.52±0.48
L. monocytogenes SNCC 6 5.06±0.14 5.05±0.03
L. monocytogenes SNCC 7 5.68±0.55 5.61±0.37
L. monocytogenes SNCC 8 6.09±0.55 6.02±0.53
L. monocytogenes SNCC 9 4.61±0.25 4.51±0.21
실험 결과(표 1), 15개 균주의 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes)가 기존의 MOX 배지와 실시예 1 배지에서 유의적으로 차이가 없는 성장 정도를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
[ 실험예 3: 식품 적용 실험을 통한 리스테리아 모노사이토제니스( Listeria monocytogenes )의 선택적 분별 검출 실험]
향상된 기능의 균주 선택성을 검증하기 위해 기존에 사용되어 오던 MOX (Modified oxford agar) 배지와 상기 실시예 1에서 제조된 본 발명 배지에 대해 식품 적용 실험을 실시하였다.
소고기, 돼지고기, 감자, 양상추, 당근, 소세지, 시금치, 고구마, 무, 새우 샘플(25 g)을 225 ml의 버퍼된 리스테리아 풍부 배지(buffered Listeria enrichment broth)에서 48시간 동안 증균한 후, 기존의 MOX 배지와 실시예 1에서 제조한 본 발명 배지에 희석하여 도말하였다.
도말 후, 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes)로 의심되는 콜로니를 취하여 'API Listeria system'을 이용하여 균을 동정하였다.
식품 형태 샘플 수 허위 양성을 나태는 샘플 수
MOX 실시예1의 배지
소고기 14 4 0
돼지고기 19 3 0
감자 14 6 1
양상추 13 5 2
당근 17 6 0
소세지 3 0 0
시금치 4 2 0
고구마 4 1 0
무 5 2 0
새우 4 2 0
실험 결과(표 2), 총 97개의 식품 샘플 중 MOX 배지에서는 31개의 허위양성 결과가 나타났지만, 본 발명의 새로운 배지에서는 3개의 허위양성 결과가 나왔다. 이는 실시예 1 배지의 선택성이 기존의 MOX 배지에 비해 월등히 뛰어난 것을 의미한다.

Claims (8)

  1. 레시틴(lecithin)을 포함하는 것을 특징으로 하는 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes) 선택 배양용 배지 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 레시틴은,
    대두 유래인 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 배지 조성물은,
    에스쿨린(esculin)을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 배지 조성물은,
    레보플록사신(levofloxacin)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 배지 조성물은,
    에스쿨린(esculin)을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
  6. 제3항 또는 5항에 있어서,
    상기 배지 조성물은,
    규연산 철 암모늄(ferric ammonium citrate)을 더 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
  7. 제3항의 배지를 이용하여, 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes)를 리스테리아 이노큐아 (Listeria innocua)균으로부터 분리하는 방법.
  8. 제5항의 배지를 이용하여, 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes)를 리스테리아 이노큐아 (Listeria innocua)균 및 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)로부터 분리하는 방법.
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