KR101973403B1 - 황색포도상구균 검출용 선택농축배지 및 이를 이용하여 황색포도상구균을 검출하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 트립틱 소이 브로쓰(TSB) 배지에, 아크리플라빈, 날리딕산, 퍼태슘 텔루라이트와 소디움 클로라이드로 이루어진 저해제, 및 소디움 피루베이트, 만니톨과 효모 추출물로 이루어진 생장 촉진제를 더 포함하는 황색포도상구균 검출용 선택농축배지 및 이를 이용하여 황색포도상구균을 검출하는 방법에 관한 것으로, 본 발명에 의한 황색포도상구균 검출용 선택농축배지는 높은 초기 증균 속도, 높은 최대 군체 밀도, 빠른 스트레스 회복, 및 비-황색포도상구균의 생장억제 등의 효과가 우수하여, 황색포도상구균의 신속진단 및 검출 방법에 적용할 수 있다.

Description

황색포도상구균 검출용 선택농축배지 및 이를 이용하여 황색포도상구균을 검출하는 방법{Selective enrichment medium for detecting Staphylococcus aureus and method of detecting Staphylococcus aureus using the same}

본 발명은 황색포도상구균 검출용 선택농축배지 및 이를 이용하여 황색포도상구균을 검출하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 트립틱 소이 브로쓰(TSB) 배지에, 아크리플라빈, 날리딕산, 퍼태슘 텔루라이트와 소디움 클로라이드로 이루어진 저해제, 및 소디움 피루베이트, 만니톨과 효모 추출물로 이루어진 생장 촉진제를 더 포함하는 황색포도상구균 검출용 선택농축배지, 및 이를 이용하여 황색포도상구균을 검출하는 방법에 관한 것이다.

식중독은 지속적으로 발생하고 있는 세계적 공중 보건 문제이며, 농·식품의 위생 및 안정성과 관련되어 있다. 특히 세균성 식중독 사고는 계속해서 국민 보건, 사회 및 경제적 손실 등을 발생시키므로 사후 처리도 중요하나, 가장 효율적인 방법은 사전에 식중독 세균들을 검출하여 예방하는 것이다.

식중독 발생의 원인 세균들에는 병원성 대장균(E. coli), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 살모넬라(Salmonella sp.), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 캠피로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 등이 알려져 있다.

식중독 병원균의 하나인 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)은 그람양성균으로 육류 및 그 가공품, 유제품, 밥, 김밥, 채소 및 과일 등에서 검출되고, 이 병원균이 증식하는 식품을 섭취하면 황색포도상구균이 생산하는 포도상구균 장독소에 의한 독소형 식중독이 발생하며, 구토, 설사 및 복통 등의 증상을 일으킨다.

이들 식중독 세균을 검출하기 위한 표준 방법은 각 특정 세균에 특이적인 선택배지 및 분별배지 등을 이용하는 배양에 기초한 방법으로, BP 아가 배지의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 탄소원과 항생제를 포함하는 황색포도상구균 분별용 미생물 생육용 배지 (등록특허공보 제10-1485947호), 바실러스 세레우스 검출용 배지인 MYP 배지에, 항생제로 트리메토프림(trimethoprim)을 첨가한 세레우스 검출용 배지 조성물 (공개특허공보 제10-2012-0048862호) 등이 알려져 있다.

그러나, 상기 종래기술들은 검출 및 확인까지 긴 시간과 많은 노동력과 전문 인력이 필요하기 때문에, 보다 신속하고, 간단하고, 정확하고 경제적인 검출 방법의 개발이 시도되고 있다.

최근의 신속진단법인 PCR 기반 검출 방법 등은 이러한 문제점을 부분적으로 해결 가능하지만 (Korean J. Food Sci. Ani. Resour. Vol. 30, No. 3, pp. 410~418 (2010)), 현재의 진단 방법들은 검출한계가 있으므로, 신속 진단/검사법을 적용하기 위한 과정에서 전 배양 및 농축배양 단계에서 가장 긴 시간이 필요하므로, 가장 극복하여야 할 단계이다.

따라서, 오염된 시료에서 표적 세균을 신속하게 증균/농축(enrichment)시키면서 다른 박테리아의 생장을 억제시킬 수 있는 선택적 증균배지의 개발이 절실히 요구되고 있다.

본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 황색포도상구균을 보다 신속하고 선택적으로 증균할 수 있는 선택농축배지(selective enrichment medium)를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 선택농축배지를 이용하여 신속하고, 정확하게 황색포도상구균을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 트립틱 소이 브로쓰(tryptic soy broth; TSB) 배지에, 아크리플라빈, 날리딕산, 퍼태슘 텔루라이트와 소디움 클로라이드로 이루어진 저해제, 및 소디움 피루베이트, 만니톨과 효모 추출물로 이루어진 생장 촉진제를 더 포함하는 황색포도상구균 검출용 선택농축배지를 제공한다.

또한, 본 발명은 시료를 상기 선택농축배지에 접종 및 배양하여, 상기 배지상에 형성된 황색포도상구균을 확인하는 단계를 포함하는 황색포도상구균을 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명에 의한 황색포도상구균 검출용 선택농축배지는 높은 초기 증균속도, 높은 최대 군체밀도, 빠른 스트레스 회복, 및 비-황색포도상구균의 생장억제 등의 효과가 우수하기 때문에, 황색포도상구균의 신속진단 및 검출 방법에 적용할 수 있다.

또한, 본 발명에 의한 황색포도상구균 검출용 선택농축배지의 상기와 같은 장점을 이용하여 농수산물 식품안전관리, 공중 보건 등에서 식중독균의 신속배양 및 검출방법에 기여할 수 있다.

도 1은 본 발명의 선택증균배지(OSA) 배지와 대조군 TSB 배지에서 배양한 황색포도상구균의 생장 곡선을 나타낸 것이다.
도 2a는 황색포도상구균으로 인위 접종하여 오염된 스팸(spam) 시료를 대상으로 선택증균배지(OSA) 배지와 TNaCl(TSB+7.5%) 배지에서의 생장곡선을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 2b는 황색포도상구균으로 인위 접종하여 오염된 김밥 시료를 대상으로 선택증균배지(OSA) 배지와 TNaCl(TSB+7.5%) 배지에서의 생장곡선을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 2c는 황색포도상구균으로 인위 접종하여 오염된 우유 시료를 대상으로 선택증균배지(OSA) 배지와 TNaCl(TSB+7.5%) 배지에서의 생장곡선을 비교한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 트립틱 소이 브로쓰(TSB) 배지에, 아크리플라빈(acriflavine), 날리딕산(nalidixic acid), 퍼태슘 텔루라이트(potassium tellurite)와 소디움 클로라이드(sodium chloride)로 이루어진 저해제, 및 소디움 피루베이트(sodium pyruvate), 만니톨(mannitol)과 효모 추출물(yeast extract)로 이루어진 생장 촉진제를 더 포함하는 황색포도상구균 검출용 선택농축배지에 관한 것이다.

본 발명의 상기 황색포도상구균 검출용 선택농축배지는 상기 트립틱 소이 브로쓰(TSB) 배지 100 중량부에 대하여, 상기 아크리플라빈 0.016~0.017 중량부, 상기 날리딕산 0.033~0.034 중량부, 상기 퍼태슘 텔루라이트 0.00003~0.00004 중량부, 상기 소디움 클로라이드 66~67 중량부, 상기 소디움 피루베이트 49.5~50.5 중량부, 상기 만니톨 19.5~20.5 중량부 및 상기 효모 추출물 1.6~1.7 중량부를 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 황색포도상구균 검출용 선택농축배지는 바람직하게는, 상기 트립틱 소이 브로쓰(TSB) 배지 30 g/L, 상기 아크리플라빈 5 mg/L, 상기 날리딕산 10 mg/L, 상기 퍼태슘 텔루라이트 0.1 mg/L, 상기 소디움 클로라이드 20 g/L, 상기 소디움 피루베이트 15 g/L, 상기 만니톨 6 g/L 및 상기 효모 추출물 0.5 g/L를 포함한다.

또한, 본 발명은 시료를 상기 선택농축배지에 접종 및 배양하여, 상기 배지 상에 형성된 황색포도상구균을 확인하는 단계를 포함하는 황색포도상구균을 검출하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 상기 황색포도상구균을 검출하는 방법에서, 상기 시료는 식품, 및 농수산물로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 황색포도상구균을 검출하는 방법에서, 상기 식품은 소고기, 돼지고기, 양고기 등과 같은 육류, 햄(스팸), 소시지, 베이컨 등과 같은 육가공품, 우유, 버터, 치즈 등과 같은 유·가공품, 샐러드, 김밥 및 샌드위치 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 황색포도상구균을 검출하는 방법에서, 상기 접종 및 배양은 시료 0.1~5 ㎖. 바람직하게는 0.1~1 ㎖을 선택농축배지에 접종하고, 33~37℃, 바람직하게는 34~36℃에서, 18~36시간, 바람직하게는 18~24시간 동안 배양할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시 예를 통하여 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시 예는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위는 이들 실시 예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 균주의 선정 및 배양

세균 균주들로 Staphylococcus aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27664, 그리고 non-S. aureus 균주로 Bacillus cereus ATCC 14579, Bacillus thuringiensis ATCC 10792, Escherichia coli ATCC 43894, Listeria monocytogenes ATCC 19114, Micrococcus luteus ATCC 11211, Proteus mirabilis KCCM 11327, almonella enterica ATCC 13076 및 Yersinia enterocolitica ATCC 9610 등을 사용하였다.

황색포도상구균의 일반적 배양은 트립틱 소이 브로쓰 배지를 사용하였으며, 선택배지 Baird-Parker(BP) 한천배지에 도말하고, 35℃에서 24시간 배양 후 확인하였으며, 단일 콜로니를 10 ㎖ TSB 배지에 접종하여 35℃에서 18~20 시간 동안 배양하여 사용하였다.

각 배양액의 세균 수는 플레이트 카운팅(plate counting) 방법으로 트립틱 소이 아가 플레이트(TSA, Difco)에 0.1 ㎖ 희석 배양액을 도말하여 플레이트를 35℃에서 24 시간 동안 배양하여 확인하였다.

세균 농도는 배양된 각 균주의 세포를 Buffer Peptone Water(BPW)에 희석하여, 최종 농도가 10^7-8 CFU/mL이 되도록 준비하였다.

< 실시예 2> 저해제 및 성장 촉진제 선택

널리 사용되고 있는 농축배지 TSB(Tryptic soy broth)를 기초배지로 사용하였는데, 상기 TSB 배지의 조성은 물 1 리터당 트립톤 17 g, 파이톤(Phytone) 3 g, NaCl 5 g, 다이퍼태슘 포스페이트(K₂HPO₄) 2.5 g, 글루코오스 2.5 g으로 이루어져 있다.

각 시약을 상기 TSB 배지에 별도로 첨가하여 박테리아의 생장 영향을 확인하였는데, 생장촉진제로는 소디움 피루베이트, 만니톨, 효모 추출물을 각각 증류수에 용해시켜 멸균 후, 4℃ 냉각시킨 다음 보관 후 사용하였다.

또한, 저해제로는 아크리플라빈, 날리딕산, 퍼태슘 텔루라이트, 소디움 클로라이드를 멸균하여 사용하였으며, 상기 시약의 일부(아크리플라빈, 날리딕산, 퍼태슘 텔루라이트, 만니톨)는 0.2μm 막을 이용하여 여과하여 사용하였다.

표적 병원체를 총 50~100 CFU/㎖를 첨가제를 농도별로 넣은 배지에 접종하였고, 각 시약의 농도는 하기 표 1에 나타낸 바와 같으며, 대조군으로는 기초 배지(TSB)를 사용하였다.

이들은 접종 후 35℃에서 24시간 동안 80 rpm으로 진탕배양기(Shaking incubator)에서 배양한 후, 분광광도계(SpectraMax i3 플랫폼)를 사용하여 파장 600 nm에서의 광학 밀도(OD₆₀₀)를 측정하였고, 이 실험은 3번 반복하였다.

상기 저해제와 생장 촉진제의 OD₆₀₀ 측정값을 하기의 표 1에 나타내었다.

상기 표 1에서 보는 바와 같이, 퍼태슘 텔루라이트가 낮은 농도에서도 S. aureus 균의 성장을 많이 억제하였고, 소디움 클로라이드는 농도가 증가함에 따라 S. aureus 증식의 억제 값도 비례하여 증가하였음을 알 수 있다.

아크리플라빈은 농도가 증가함에 따라 억제력도 증가하지만, 증가 비율에 비해 차이가 나지 않았고, 날리딕산은 농도 5 mg/L에서 10 mg/L으로 될 때 억제도가 크게 증가하지만, 농도를 20 mg/L으로 높였을 때는 농도 10일 때와 많은 차이가 나지 않았음을 알 수 있다.

생장 촉진제로 사용된 소디움 피루베이트는 농도를 증가시키면 비례하여 S. aureus 균이 증가하였고, 만니톨은 농도가 낮을수록 S. aureus 세균이 증가하였음을 알 수 있다. 마찬가지로 효모 추출물도 낮은 농도에서 S. aureus 균이 가장 많이 증가하였다.

< 실시예 3> 황색포도상구균용 선택농축배지의 배합 최적화

선택적 첨가제를 3 요소 반응표면 방법론(3 Factor Response Surface Methodology)을 사용하여 Design Expert로 실험을 설계하였다.

3 요소는 소디움 클로라이드, 만니톨, 퍼태슘 텔루라이트이고, 이들은 예비 실험에서 가장 높은 결과 값을 나타낸 요소들이다.

설계한 농도 배합에 따라 배지를 제조한 후, 표적 병원체 총 약 10² CFU/㎖을 접종하고, 35℃에서 24시간 진탕배양기에서 80rpm으로 배양하였다. SpectraMax i3 플랫폼의 분광 광도계를 사용하여 600nm에서의 광학 밀도(OD₆₀₀)를 측정하였고, 이 실험은 3 번 반복 후 값을 계산하였다.

상기 설계 그룹 간의 차이는 ANOVA 테스트를 사용하여 Design Expert에 의해 비교하여 가장 최적 조건의 조합을 선택하였다.

각 변수의 효과를 연구하기 위한 반응표면 방법론의 실험 결과를 하기의 표 2에 나타내었다.

상기 표 2에서 보는 바와 같이, 소디움 클로라이드, 만니톨, 퍼태슘 텔루라이트가 높은 효과를 나타내고, 소디움 클로라이드 20 g/L, 만니톨 6.0 g/L 그리고 퍼태슘 텔루라이트 0.01 mg/L 일 때, S. aureus이 가장 많이 증가하였음을 알 수 있다.

S. aureus가 OD₆₀₀으로 측정하였을 때 흡광도 1.0을 넘는 값 중 가장 작은 증가율을 가지는 농도는 소디움 클로라이드의 경우 80 g/L, 만니톨의 경우 1.00 g/L 그리고 퍼태슘 텔루라이트는 0.20 mg/L 이었다.

그러므로 이들을 이용하여 최저값과 최대값을 이용하여 RSM을 수행하였다. S. aureus을 증가시키는 세 가지 요소들에 대한 적당한 농도 비율을 얻었다. 이를 바탕으로 하여 나머지 가장 적합한 값의 선택 시약(selective reagents)과 촉진 시약(promoting reagents)들을 조합하여 하기 표 3과 같은 공식화된 황색포도상구균용 선택농축배지(OSA)를 개발하였다.

<실시예 4> 선택농축배지(OSA)에서의 Staphylococcus aureus 의 생장 평가

S. aureus ATCC 12600을 TSB 배지에서 18-24시간, 35℃, 150rpm으로 배양하였다.

상기 실시예 3에서 제조한 OSA에 표적 박테리아를 10³ CFU/ml, 10⁴ CFU/ml, 10⁵ CFU/ml 접종하여 RSM을 사용하여 나온 예상 결과 값과 비교하였다. 대조군 배지 (TSB)에 대해서도 실험하였다.

35℃에서 24시간 진탕배양기에서 80rpm으로 배양하였다. SpectraMax i3 플랫폼의 분광 광도계를 사용하여 600nm에서의 광학 밀도(OD₆₀₀)를 측정하였다. 이 실험은 3 번 반복 후 값을 계산하였는데, 결과 값이 예상 결과 값과 비슷하면 표적 병원균의 성장도를 평가하였다.

표적 병원균(S. aureus) 100 ㎕를 OSA 9.9 ㎖과 7.5% NaCl을 함유한 TSB 배지에 접종하였다. 35℃, 150rpm으로 배양하면서 0, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 시간에서 각각 세균수를 측정하여 성장곡선을 만들어 분석하였다.

황색포도상구균 접종 균수를 3 단계로 달리하여 접종하였다(도 1에서 1, 2 및 3으로 표시함). 앞서 흡광도로 체크한 결과를 비교하기 위해, OSA와 TSB + 7.5% NaCl에 균 농도를 다르게 하여 접종 하였을 때 생균수를 측정하여 log값으로 나타낸 결과는 도 1과 같다.

도 1에서 보는 바와 같이, TSB+7.5% NaCl과 OSA에 같은 농도로 접종하였을 때, 이미 4시간 후에서부터 OSA가 TSB보다 더 많이 생장하였다. 시간이 지날수록 그 차이는 적어지지만, 초기 생장 단계에서 TSB보다 OSA에서 황색포도상구균이 더 빠른 속도로 증식함을 알 수 있다.

또한, 하기의 표 4에 OSA와 TSB+7.5% NaCl에서 S. aureus의 생장 kinetics 값을 나타내었다.

상기 표 4에서 보는 바와 같이, 접종 농도들의 지수기 생장속도(exponential growth rate; EGR)를 보면 OSA가 TSB+7.5% NaCl보다 값이 높음을 알 수 있다.

생장 지체기 시간(lag-phase duration; LPD) 값은 제일 낮은 농도로 접종하였을 때, OSA가 TSB+7.5% NaCl보다 약 2배 이상 빨랐고, 100 CFU/mL에서도 빠름을 확인할 수 있었다. 가장 높은 농도에서는 많은 차이는 없었지만, OSA가 마찬가지로 높음을 알 수 있다.

또한, 최대 군체 밀도(maximum population density; MPD) 값도 모든 농도들의 값이 유의적인 차이는 많이 보이지는 않지만, 대체적으로 OSA에서의 값이 더 높음을 보여 주었다.

이를 통해서 본 발명에서 개발한 농축배지인 OSA가 기존의 TSB + 7.5% NaCl보다 황색포도상구균을 단시간 내에 더 빠르게 성장시킬 수 있음을 확인하였다.

또한, 황색포도상구균의 경우, OSA 배지가 TSB+7.5% NaCl과 비교하여 더 짧은 LPD를 지니고, TSB+7.5% NaCl이 9.20-9.38 log CFU/mL의 더 낮은 MPD에 도달할 동안 OSA에서 최대 군체 밀도(MPD)는 9.66-9.77 log CFU/mL에 도달하였다.

지수기 생장 속도(EGR) 값은 TSB+7.5% NaCl 사용하는 것 보다 OSA 배지를 사용하는 것이 높은 결과를 나타냄을 알 수 있다.

이상에서 얻어진 결과로부터 본 발명의 OSA 배지가 3 가지 농도의 황색포도상구균의 농축에 대해 더 우수한 성능을 지님을 확인할 수 있다.

<실시예 5> 선택농축배지(OSA)가 다른 박테리아의 증식을 억제하는 성능 평가

비-표적 병원균들을 저해하는지를 알아보기 위해, 알려진 다른 세균 및 식중독균을 선정하고, 각 세균의 선택 배지에 도말하여 24시간 35℃로 배양하였다.

비-표적 병원균들의 각 단일 콜로니를 OSA TSB+7.5% NaCl (황색포도상구균 선택배지) 그리고 TSB에 접종하여 분광 광도계를 사용하여 600 nm에서 24시간 동안 생장곡선 카이네틱(kinetic)을 확인하였다. 마찬가지로 표적 병원균도 실험하였다.

황색포도상구균과 다른 세균들을 OSA 및 TSB 배지에 접종하였을 때의 OSA가 다른 균을 억제하는지에 대해 비교 분석한 결과를 하기의 표 5에 나타내었다.

상기 표 5에서 보는 바와 같이, OSA에 접종한 S. aureus ATCC 12600와 ATCC 27664는 높은 밀도로 생장하였음에 대하여, OSA에 접종한 황색포도상구균 이외의 세균들은 대부분 거의 자라지 않았음을 알 수 있다.

24시간 후에, P. mirabilis가 OSA 배지에서는 아주 약간 자랐으며, 대조군 TSB 배지에서는 굉장히 높은 밀도로 성장하였다. 양자를 비교해 보면, OSA 배지에서는 거의 자라지 못한 것이다.

대조군 배지인 TSB에서는 비-표적 박테리아가 모두 성장함을 알 수 있다.

< 실시예 6> 열 , 온도 또는 산성 스트레스를 주었을 때 OSA 배지에서의 표적 박테리아의 회복 성능

다양한 환경 스트레스로서 산성(pH 4.5 및 5.5), 저온(cold-shock: 4℃), 및 고온(heat-shock: 55 ℃, 10분) 등의 조건 스트레스 조건을 주어 실험하였다.

S. aureus를 TSB에 접종하여 200 rpm, 35℃, 24시간 배양하였다. 배양된 표적 병원균을 5㎖ 채취하여 원심분리한 후 상층액은 버리고 인산완충 생리식염수 (pH 7.4)를 5㎖ 넣어 세척하고, 이 과정을 3회 반복하였다.

그 후, 원심분리한 세포를 인산완충 생리식염수(pH 7.4)에 현탁하고, 스트레스 조건에서 3시간 동안 노출시켰다.

이때, 상기 산성 조건에 따른 실험은 1 M의 시트르산을 사용하여 pH를 4.5와 5.5로 조정한 후, 3시간 동안 스트레스를 준 다음, 9.9㎖의 OSA, TSBYE 및 TSB+7.5% NaCl 배지에 세균을 각 0.1㎖ 접종한 후 35℃, 150 rpm으로 배양하여, 0, 3, 6시간 마다 균수를 측정하였다.

또한, 상기 온도 조건에 따른 실험은 4℃ 및 37℃의 온도로 스트레스를 3시간 동안 준 세포를 9.9㎖의 OSA, TSBYE 및 TSB+7.5% NaCl 배지에 균을 각 0.1㎖ 접종한 후, 35℃, 150 rpm으로 배양하여, 0, 3, 6시간 마다 세균 수를 측정하였다.

또한, 상기 고온 조건에 따른 실험은 수조를 55℃로 맞춘 후 10분 동안 열을 가하여 스트레스를 주고, 10분 후 얼음 수조에 넣어서 열 스트레스를 멈추게 한 후, 9.9㎖의 OSA, TSBYE, 및 TSB+7.5% NaCl 배지에 세균을 각 0.1㎖ 접종한 다음35 ℃, 150 rpm으로 배양하여, 0, 3, 6시간 마다 세균수를 측정하였다.

이때, 상기 TSBYE 배지는 TSB 배지에 0.6%(w/v)의 효모 추출물이 첨가된 배지이고, 상기 TSB+7.5% NaCl 배지는 TSB 배지에 7.5%(w/v)의 NaCl이 첨가된 배지이다.

세균수는 0.1% BPW로 알맞게 희석하여 각 시간마다 100 ㎕씩 BP 배지에 도말하여 35℃, 24시간 배양하여 측정하였다.

저온, 고온, 및 산성 스트레스를 주었을 때, 황색포도상구균의 회복 시간에 대해 비교 분석한 결과를 하기의 표 6에 나타내었다.

상기 표 6에서 보는 바와 같이, 저온과 상온에서 노출시켰을 때와 산성 스트레스를 주었을 때 황색포도상구균은 정상적으로 회복하였고, 특히 온도에 대한 스트레스를 주었을 때에는 회복 초기(3시간)에서는 TSBYE에서 더 빨리 증식하였으나, 회복 후기(6시간)에서는 TSBYE와 OSA에서 비슷한 결과를 보임을 알 수 있다.

산성 스트레스에서도 비슷하게 회복 초기(3시간)에서는 TSBYE에서 가장 많이 증식하였고, 회복 후기(6시간)에서는 TSBYE와 OSA 둘 다 비슷한 증식 정도를 보임을 알 수 있다.

또한, 열 스트레스를 주었을 시에는 손상이 지속되어 회복 초기(3시간)에서 개시보다 낮은 세균수를 보이는데, 그 이유는 열 스트레스를 멈추었을 때도, 황색포도상구균이 지속적으로 손상되는 것으로 판단된다.

저온 및 산 스트레스에서와는 다르게, 열 스트레스 조건에서는 회복 초기(3시간)에 다른 배지보다 OSA 배지에서 더 빠른 회복을 보였으며, 회복 후기(6시간)에서도 OSA에서 더 높은 회복도를 보임을 알 수 있다.

또한, TSBYE 배지에서도 높게 회복하지만, S. aureus 선택농축배지에서는 여전히 열에 대한 스트레스를 받아서 균수가 오히려 감소함을 알 수 있다.

상기와 같은 결과로부터 OSA가 스트레스 받은 균이 손상 후 회복하는 데에 사용하는 TSBYE 만큼 균을 회복시킬 수 있음을 알 수 있다.

< 실시예 7> 인위적으로 접종한 식품 시료를 이용한 OSA와 TNaCl의 성능 비교 평가

황색포도상구균을 인위 접종하여 오염된 식품 시료를 대상으로 OSA와 TNaCl(TSB+7.5%)에서의 생장곡선을 비교한 결과를 도 2a 내지 도 2c에 나타내었다.

도 2a는 황색포도상구균으로 인위 접종하여 오염된 스팸(spam) 시료를 대상으로 선택증균배지(OSA) 배지와 TNaCl(TSB+7.5%) 배지에서의 생장곡선을 비교한 결과를 나타낸 것이다.

도 2a에서 보는 바와 같이, 스팸에서는 8시간 후 OSA가 TNaCl보다 약 2배 정도 많이 자랐고, 시간이 경과함에도 그 차이는 OSA가 현저하게 높은 결과를 얻었으며, 24시간 후에는 점차 결과가 유의적인 차이를 갖지 않음을 알 수 있다.

도 2b는 황색포도상구균으로 인위 접종하여 오염된 김밥 시료를 대상으로 선택증균배지(OSA) 배지와 TNaCl(TSB+7.5% a S. aureus 선택농축 브로쓰) 배지에서의 생장곡선을 비교한 결과를 나타낸 것이다.

도 2b에서 보는 바와 같이, 김밥에서는 8시간 후에는 OSA가 TNaCl보다 훨씬 더 높은 결과를 얻었는데, 다른 식품 시료보다 현저하게 높은 결과를 보여주었지만, 시간이 지날수록 그 결과 값의 유의적 차이는 점차 감소함을 알 수 있다.

도 2c는 황색포도상구균으로 인위 접종하여 오염된 우유 시료를 대상으로 선택증균배지(OSA) 배지와 TNaCl(TSB+7.5%) 배지에서의 생장곡선을 비교한 결과를 나타낸 것이다.

도 2c에서 보는 바와 같이, 우유는 8시간 후에는 OSA와 TNaCl와 결과가 비슷하였는데, 우유 시료는 다른 식품 시료보다 많은 차이가 나지는 않았고, 시간이 경과함에 따라 S. aureus 균이 자라는 정도는 확실히 OSA가 TNaCl보다 높은 결과를 보임을 알 수 있다.

상술한 바와 같이 본 발명의 바람직한 실시 예를 참조하여 설명하였지만, 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 통상의 기술자라면 하기의 청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

본 발명에 의한 황색포도상구균 검출용 선택농축배지는 높은 초기 증균속도, 높은 최대 군체 밀도, 빠른 스트레스 회복, 및 비-황색포도상구균의 생장억제 등의 효과가 우수하여, 황색포도상구균의 신속진단 및 검출 방법에 적용할 수 있기 때문에, 본 발명이 속하는 기술 분야에 유용하게 적용될 수 있다.

Claims (7)

1. 트립틱 소이 브로쓰(TSB) 배지에, 아크리플라빈, 날리딕산, 퍼태슘 텔루라이트로와 소디움 클로라이드로 이루어진 저해제, 및 소디움 피루베이트, 만니톨과 효모 추출물로 이루어진 생장 촉진제를 더 포함하는, 황색포도상구균 검출용 선택농축배지로서,
   상기 선택농축배지는 상기 트립틱 소이 브로쓰(TSB) 배지 30 g/L, 상기 아크리플라빈 5 mg/L, 상기 날리딕산 10 mg/L, 상기 퍼태슘 텔루라이트 0.1 mg/L, 상기 소디움 클로라이드 20 g/L, 상기 소디움 피루베이트 15 g/L, 상기 만니톨 6 g/L 및 상기 효모 추출물 0.5 g/L를 포함하고,
   상기 선택농축배지에 황색포도상구균을 4℃의 저온, 55℃의 고온 또는 pH 4.5~5.5의 산성 스트레스 조건으로 배양시, 상기 황색포도상구균이 정상적으로 회복되는 것을 특징으로 하는 황색포도상구균 검출용 선택농축배지.
2. 삭제
3. 삭제
4. 시료를 제1항의 선택농축배지에 접종 및 배양하여, 상기 배지 상에 형성된 황색포도상구균을 확인하는 단계를 포함하는 황색포도상구균을 검출하는 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 시료는 식품 및 농수산물로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 황색포도상구균을 검출하는 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 식품은 육류, 육가공품, 유·가공품, 샐러드, 김밥 및 샌드위치로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 황색포도상구균을 검출하는 방법.
7. 제4항에 있어서, 상기 접종 및 배양은 시료 0.1~5 ㎖을 선택농축배지에 접종하고, 33~37℃에서, 18~36시간 동안 배양하는 것을 특징으로 하는 황색포도상구균을 검출하는 방법.

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