KR20230030909A - 비브리오 미미쿠스 검출용 선택배지 조성물 및 이를 이용한 비브리오 미미쿠스 검출방법 - Google Patents
비브리오 미미쿠스 검출용 선택배지 조성물 및 이를 이용한 비브리오 미미쿠스 검출방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 미생물을 배양하는 배지에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 식중독균의 하나로 알려진 비브리오속(Vibrio spp.) 균 중 비브리오 미미쿠스(Vibrio mimicus)만을 선별하여 검출할 수 있는 선택배지 조성물; 상기 선택배지 조성물을 포함하는 비브리오 미미쿠스 검출용 키트; 및 상기 선택배지 조성물을 이용한 비브리오 미미쿠스 검출방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 비브리오 미미쿠스 검출용 선택배지 조성물은 수크로스(sucrose), 아라비노스(arabinose) 및 셀로비오스(cellobiose)로 이루어진 3가지 탄소원을 유효성분으로 포함함으로써, 유전자 증폭 장치와 같은 분석 장비 없이도 신속하게 비브리오 미미쿠스만을 특이적으로 검출할 수 있으며, 특히, 본 발명의 선택배지 조성물은 집락 성상이 유사한 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus)와 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus)는 검출하지 않으면서, 비브리오 미미쿠스만을 특이적으로 검출할 수 있는 이점을 가진다. 또한, 본 발명의 선택배지 조성물은 유효성분으로 황산칼슘(calcium sulfate) 및 황산마그네슘(magnesium sulfate)을 추가로 포함함으로써, 우수한 균 회복력를 가짐과 동시에 균의 낮은 초기 농도(2 log CFU/mL 미만)에서도 비브리오 미미쿠스를 검출할 수 있는바, 비브리오 미미쿠스에 대한 민감성을 개선한 배지 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 미생물을 배양하는 배지에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 식중독균의 하나로 알려진 비브리오속(Vibrio spp.) 균 중 비브리오 미미쿠스(Vibrio mimicus)만을 선별하여 검출할 수 있는 선택배지 조성물; 상기 선택배지 조성물을 포함하는 비브리오 미미쿠스 검출용 키트; 및 상기 선택배지 조성물을 이용한 비브리오 미미쿠스 검출방법에 관한 것이다.
비브리오속에는 100가지가 넘는 종이 있으나 이 중 12종만이 인간에게 감염증을 일으킨다. 특히, 국립수산과학원에서는 5가지 병원성 비브리오인 장염 비브리오(Vibrio parahaemolyticucs), 비브리오 패혈증균(Vibrio vulnificus), 비브리오 콜레라균(Vibrio cholerae), 비브리오 미미쿠스(Vibrio mimicus), 비브리오 플루비알리스(Vibrio fluvialis)를 수산물 생물학적 위해요소로 지정하였다.
이 중 1981년 Davis 등에 의하여 제안된 비브리오 미미쿠스는 제 1군 법정 전염병으로 분류된 비브리오 콜레라균과 생태, 병원성이 유사한 그람음성간균으로, 쌀뜨물 같은 형태의 변이 지속적으로 발생하는 수양성 설사와 구토 증상이 나타난다.
그간 비브리오 미미쿠스의 병원성은 다른 병원성 비브리오 종들에 비해 비교적 많이 부각되지 않았다. 그러나 2004년 태국에서 300여명의 환자가 감염된 집단 식중독 사고가 발생하였고, 미국에서는 2010년에 1건, 2015년에 3건의 비브리오 미미쿠스 식중독 사건이 있었으며 2021년 발표된 논문(Nilavan, 2021)에 따르면 인도 남서부 해안 환경 및 어류, 수산물에서 250개의 샘플 중 5.6%에서 비브리오 미미쿠스가 검출되었다.
이처럼 비브리오 미미쿠스의 식품 검출 사례 및 식중독 사례가 지속적으로 발생하고 있지만, 비브리오 미미쿠스를 선별적으로 검출할 수 있는 선택배지는 부재한 실정이다. 비브리오의 검출을 위해 사용되고 있는 대표적인 선택배지는 TCBS (Thiosulfate-Citrate-Bile salts-Sucrose) 배지이다. 황소 담즙(Ox gall) 등의 성분을 통하여 그람양성균의 생장을 억제하고, 세균이 자당(sucrose)을 분해하여 산을 형성하면 배지 내의 지시약에 의하여 초록색에서 노란색으로 변하는 생화학적 특성을 이용한다. 현재 국내에서는 TCBS 배지를 장염 비브리오, 비브리오 패혈증균, 그리고 비브리오 콜레라균의 검출을 위한 선택배지로 지정하고 있다.
그러나 비브리오 미미쿠스의 경우, 검출을 위해 TCBS 배지를 사용할 수는 있으나 그 집락 성상이 장염 비브리오나 비브리오 패혈증균과 동일하여 Vitek이나 PCR 등을 통한 추가적인 확인실험이 반드시 필요하다. 이와 같은 추가적인 동정 과정은 Vitek 기기, 유전자 증폭 장치 등의 설비를 필요로 하기 때문에 검출을 위한 접근성이 떨어지며, 모든 의심집락에 대한 동정을 진행하는데 시간과 비용이 추가적으로 소요된다.
따라서, 비브리오 미미쿠스만을 선별 가능한 새로운 배지 조성물의 개발을 통해 유전자 증폭 장치 등 기타 분석 장비 없이도 수행 가능하며 시간과 비용을 절감할 수 있는 비브리오 미미쿠스에 대한 선택적 검출법의 개발이 시급한 실정이다.
비브리오 미미쿠스는 앞서 언급했듯이 해수, 담수 및 수산물에 상재하고 있다. 따라서 비브리오 미미쿠스 검출이 가능한 선택배지 개발을 통해서 빠른 검출과 정확성을 높여 국민 보건에 이바지할 수 있을 것으로 기대된다.
이러한 배경 하에, 본 발명자는 유전자 증폭 장치와 같은 기타 분석 장비 없이도 신속하게 비브리오 미미쿠스만을 특이적으로 검출할 수 있는 선택배지를 발굴하고자 노력하였으며, 그 결과 수크로스(sucrose), 아라비노스(arabinose) 및 셀로비오스(cellobiose)로 이루어진 3가지 탄소원을 유효성분으로 포함하는 배지 조성물의 경우 집락 성상이 유사한 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus)와 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus)를 함께 검출하지 않고, 비브리오 미미쿠스만을 특이적으로 검출할 수 있음을 확인하였다. 또한, 배지 조성물에 황산칼슘(calcium sulfate) 및 황산마그네슘(magnesium sulfate)을 더 포함하는 경우 비브리오 미미쿠스에 대한 민감도를 개선시킬 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 비브리오 미미쿠스(Vibrio mimicus)만을 특이적으로 검출할 수 있는 선택배지 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 선택배지 조성물을 포함하는 비브리오 미미쿠스(Vibrio mimicus) 특이적 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 선택배지 조성물을 이용하여 비브리오 미미쿠스(Vibrio mimicus)를 효과적으로 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 수크로스(sucrose), 아라비노스(arabinose) 및 셀로비오스(cellobiose)를 유효성분으로 포함하는 비브리오 미미쿠스(Vibrio mimicus) 검출용 선택배지 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 비브리오 미미쿠스에 대한 민감도를 개선시키기 위하여 황산칼슘(calcium sulfate) 및 황산마그네슘(magnesium sulfate)을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 수크로스(sucrose), 아라비노스(arabinose) 및 셀로비오스(cellobiose)는 조성물 100중량부를 기준으로 각각 0.1 내지 3중량부로 포함될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 황산칼슘(calcium sulfate) 및 황산마그네슘(magnesium sulfate)은 조성물 100중량부를 기준으로 각각 0.005 내지 0.5중량부 및 0.05 내지 0.5중량부를 포함될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 증류수, 효모 추출물, 펩톤, 티오황산 나트륨, 시트르산 나트륨, 황소 답즙, 염화나트륨, 시트르산 제2철 암모늄, 브로모티몰 블루, 티몰 블루 및 한천으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 선택배지 조성물을 포함하는 비브리오 미미쿠스(Vibrio mimicus) 검출용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 a) 상기 선택배지 조성물에 시료를 접종하여 배양하는 단계; 및 b) 상기 배지 상에 형성된 콜로니의 성상을 확인하는 단계를 포함하는, 비브리오 미미쿠스(Vibrio mimicus)를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 시료는 식품 또는 농수산물일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 식품은 육류, 어류, 육가공품, 어류가공품, 유제품 및 채소로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 a) 단계는 본 발명의 비브리오 미미쿠스(Vibrio mimicus) 검출용 선택배지 조성물에 시료를 접종하고 33℃ 내지 37℃에서 18시간 내지 36시간 동안 배양하는 단계일 수 있다.
본 발명에 따른 비브리오 미미쿠스(Vibrio mimicus) 검출용 선택배지 조성물은 수크로스(sucrose), 아라비노스(arabinose) 및 셀로비오스(cellobiose)로 이루어진 3가지 탄소원을 유효성분으로 포함함으로써, 유전자 증폭 장치와 같은 분석 장비 없이도 신속하게 비브리오 미미쿠스만을 특이적으로 검출할 수 있으며, 특히, 본 발명의 선택배지 조성물은 집락 성상이 유사한 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus)와 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus)는 검출하지 않으면서, 비브리오 미미쿠스만을 특이적으로 검출할 수 있는 이점을 가진다. 또한, 본 발명의 선택배지 조성물은 유효성분으로 황산칼슘(calcium sulfate) 및 황산마그네슘(magnesium sulfate)을 추가로 포함함으로써, 우수한 균 회복력를 가짐과 동시에 균의 낮은 초기 농도(2 log CFU/mL 미만)에서도 비브리오 미미쿠스를 검출할 수 있는바, 비브리오 미미쿠스에 대한 민감성을 개선한 배지 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 비브리오 미미쿠스 검출용 배지 조성물에서 비브리오 미미쿠스, 비브리오 파라헤몰리티쿠스 및 비브리오 불니피쿠스 각각의 접종 배양에 따른 콜로니 성상을 나타낸 것이다(1a: Vibrio mimicus, 1b: Vibrio parahaemolyticus, 1c: Vibrio vulnificus).
도 2는 기존 TCBS 배지 조성물에서 비브리오 미미쿠스, 비브리오 파라헤몰리티쿠스 및 비브리오 불니피쿠스 각각의 접종 배양에 따른 콜로니 성상을 나타낸 것이다(2a: Vibrio mimicus, 2b: Vibrio parahaemolyticus, 2c: Vibrio vulnificus).
도 2는 기존 TCBS 배지 조성물에서 비브리오 미미쿠스, 비브리오 파라헤몰리티쿠스 및 비브리오 불니피쿠스 각각의 접종 배양에 따른 콜로니 성상을 나타낸 것이다(2a: Vibrio mimicus, 2b: Vibrio parahaemolyticus, 2c: Vibrio vulnificus).
본 발명은 수크로스(sucrose), 아라비노스(arabinose) 및 셀로비오스(cellobiose)를 유효성분으로 포함하는 비브리오 미미쿠스(Vibrio mimicus) 검출용 선택배지 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 ‘수크로스(sucrose)’는 아노머 탄소를 통해 연결된 포도당과 과당으로 구성되어진 비환원 이당류로서, 사탕 수수, 사탕무(BETA VULGARIS) 및 다른 식물에서 상업적으로 얻어지며 음식과 감미료로 광범위하게 사용되고 있다.
본 명세서에서 ‘아라비노스(arabinose)’는 아라비아고무나 기타 식물에 존재하는 고무질의 가수분해에서 얻어지는 펜토오스, 곧 오탄당의 일종이다.
본 명세서에서 ‘셀로비오스(cellobiose)’는 D-글루코오스 2분자가 베타-형 글리코시드 결합을 하여 생성된 이당류로서, C12H22O11 화학식을 가지며, 셀룰로오스의 기본 구성단위를 형성한다.
본 발명의 비브리오 미미쿠스(Vibrio mimicus) 검출용 선택배지 조성물에 유효성분으로 포함되는 수크로스(sucrose), 아라비노스(arabinose) 및 셀로비오스(cellobiose)는 조성물 100중량부를 기준으로 각각 0.1 내지 3중량부로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 조성물 100중량부를 기준으로 각각 0.5 내지 2.5중량부로 포함될 수 있다.
본 발명의 배지 조성물에서 수크로스(sucrose), 아라비노스(arabinose) 및 셀로비오스(cellobiose)는 비브리오속(Vibrio spp.) 균주의 생장에 있어서 탄소원 역할을 할 수 있다. 다만, 비브리오 미미쿠스는 상기 3종의 탄소원을 분해하지 못하는 특성을 나타내는바, 상기 3종의 탄소원을 포함시킨 본 발명의 배지 조성물에 병원성 비브리오균을 분주하여 배양함으로써, 상기 3종의 탄소원 중에서 어느 하나라도 분해하는 균주(Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, Vibiro cholerae, Vibrio fluvialis)로부터 상기 3종의 탄소원을 모두 분해하지 못하는 비브리오 미미쿠스 균주를 구분할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 비브리오 미미쿠스 검출용 선택배지 조성물의 경우 황산칼슘(calcium sulfate) 및 황산마그네슘(magnesium sulfate)을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 비브리오 미미쿠스 검출용 선택배지 조성물에 유효성분으로 포함되는 황산칼슘(calcium sulfate)은 조성물 100중량부를 기준으로 0.005 내지 0.5중량부로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 조성물 100중량부를 기준으로 0.01 내지 0.3중량부로 포함될 수 있다. 또한, 황산마그네슘(magnesium sulfate)은 조성물 100중량부를 기준으로 0.05 내지 0.5중량부로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 조성물 100중량부를 기준으로 0.01 내지 0.3중량부로 포함될 수 있다.
본 발명의 배지 조성물에서 황산칼슘(calcium sulfate) 및 황산마그네슘(magnesium sulfate)은 비브리오 미미쿠스에 대한 민감도를 개선시키는 역할을 한다.
본 발명의 배지 조성물은 상기 유효성분 이외에 증류수, 효모 추출물, 펩톤, 티오황산 나트륨, 시트르산 나트륨, 황소 답즙, 염화나트륨, 시트르산 제2철 암모늄, 브로모티몰 블루, 티몰 블루 및 한천으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 하기 <실험예 1>에서는, 본 발명의 배지 조성물 및 종래 TCBS 배지에 다양한 비브리오속(Vibrio spp.) 균주를 접종하여 미생물 성장에 따른 콜로니 성상 확인하였다. 그 결과 본 발명의 배지 조성물에서는 비브리오 미미쿠스는 초록색을 나타내었으며, 비브리오 미미쿠스와 집락 성상이 유사한 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus)와 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus)는 노란색으로 나타남으로써, 배지의 색상 확인을 통해 비브리오 미미쿠스만 특이적으로 선별할 수 있었다(표 3 및 도 1a-1c 참조). 반면에, 종래 TCBS 배지에서는 비브리오 미미쿠스와 더불어 비브리오 파라헤몰리티쿠스 및 비브리오 불니피쿠스 모두에서 초록색을 나타내어 비브리오 미미쿠스를 특이적으로 선별하는 것이 불가능함을 확인하였다(표 4 및 도 2a-2c 참조).
또한, 본 발명의 하기 <실험예 2>에서는, 본 발명의 배지 조성물 및 종래 TCBS 배지에서 균 회복력을 평가하였으며, 그 결과 기존에 사용되고 있는 TCBS 배지 대비 본 발명의 배지 조성물에서 비브리오 미미쿠스에 대한 우수한 회복력(10% 증대)을 보이는 것을 확인하였다(표 5 참조).
또한, 본 발명의 하기 <실험예 3>에서는, 본 발명의 배지 조성물에 추가적으로 황산칼슘(calcium sulfate)과 황산마그네슘(magnesium sulfate) 첨가에 따른 비브리오 미미쿠스에 대한 민감도가 개선되는지 여부를 확인하였다. 그 결과, 황산칼슘과 황산마그네슘을 첨가하지 않은 배지와 비교하여, 이들을 첨가한 배지에서만 초기 농도 2 log CFU/mL 미만에서도 비브리오 미미쿠스의 검출이 가능함을 확인함으로써, 배지 조성물에 황산칼슘과 항산마그네슘 첨가를 통해 낮은 초기 농도에서도 비브리오 미미쿠스에 대한 검출 정확도를 높일 수 있음을 입증하였다(표 6 참조).
또한, 본 발명은 상기 선택배지 조성물을 포함하는 비브리오 미미쿠스(Vibrio mimicus) 검출용 키트 키트를 제공한다.
상기 키트는 비브리오 미미쿠스 선택적 증균용 키트 또는 비브리오 미미쿠스 검출, 동정 또는 확인용 키트일 수 있다.
상기 키트에는 비브리오 미미쿠스 선택배지 조성물을 적용하여 비브리오 미미쿠스를 적절히 배양할 수 있는 배양방법, 배양조건 등에 관한 설명이 기재된 지시서가 포함될 수 있다.
또한, 본 발명은 a) 상기 선택배지 조성물에 시료를 접종하여 배양하는 단계; 및 b) 상기 배지 상에 형성된 콜로니의 성상을 확인하는 단계를 포함하는, 비브리오 미미쿠스(Vibrio mimicus)를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 a) 단계는 본 발명의 선택배지 조성물에 시료를 접종하여 배양하는 단계로서, 자세하게는 수크로스(sucrose), 아라비노스(arabinose) 및 셀로비오스(cellobiose) 3종의 탄소원을 포함하는 선택배지 조성물에 시료를 접종(도말)하여 33℃ 내지 37℃에서 18시간 내지 36시간 동안 배양하는 단계이다.
본 발명의 일구체예에서, 상기 선택배지 조성물은 유효성분으로 수크로스(sucrose), 아라비노스(arabinose) 및 셀로비오스(cellobiose) 3종의 탄소원 이외에 비브리오 미미쿠스에 대한 민감도를 개선시키기 위하여 황산칼슘(calcium sulfate) 및 황산마그네슘(magnesium sulfate)을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 선택배지 조성물은 상기 유효성분 이외에 증류수, 효모 추출물, 펩톤, 티오황산 나트륨, 시트르산 나트륨, 황소 답즙, 염화나트륨, 시트르산 제2철 암모늄, 브로모티몰 블루, 티몰 블루 및 한천으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 시료는 식중독균 감염이 의심되는 식품 또는 농수산물일 수 있으며, 상기 식품의 종류로는 육류, 어류, 육가공품, 어류가공품, 유제품 및 채소 등을 예시할 수 있으나, 특별히 그 종류를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 상기 b) 단계는 상기 배지 상에 형성된 콜로니의 성상을 확인하는 단계로서, 자세하게는 상기 선택배지 조성물에 시료를 접종하여 배양시킨 후 형성되는 콜로니의 성상으로서 색깔(색상)을 확인하는 단계이다.
본 발명의 상기 b) 단계이서 상기 배지 상에 형성된 콜로니가 초록색인 경우 시료에 포함된 식중독균이 비브리오 미미쿠스임을 확인할 수 있으며, 콜로니가 초록색이 아닌 경우(노란색, 연두색, 검은색 등) 비브리오 미미쿠스가 아닌 것을 확인할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예>
재료 및 균주 준비
효모 추출물(yeast extract), 프로테오스 펩톤(proteose peptone No. 3), 티오황산나트륨(sodium thiosulfate), 시트르산 나트륨(sodium citrate), 황소 담즙(Ox gall), 자당(sucrose), 아라비노스(arabinose), 셀로비오스(D-cellobiose), 염화나트륨(sodium chloride), 시트르산 제 2철 암모늄(ferric ammonium citrate), 황산칼슘(calcium sulfate), 황산마그네슘(magnesium sulfate), 브로모티몰 블루(Bromothymol blue), 티몰 블루(thymol blue), 아가(agar) 및 TCBS 배지는 BD Difco에서 구입하였다. 영양배지(2% NaCl TSA)는 TSA(BD Difco)에 염화나트륨(JUNSEI) 첨가하여 제조하여 사용하였다.
Vibrio mimicus ATCC 33653, Vibrio parahaemolyticus ATCC 33846, Vibrio fluvialis ATCC 33809, Enterococcus faecium ATCC 19434, Enterococcus faecalis ATCC 19433, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Pseudomonas oleovorans ATCC 8062, Pseudomonas putida ATCC 21025, Pseudomonas aeruginoas ATCC 15442, Aeromonas hydrophila subsp. hydrophila ATCC 7966, Aeromonas hydrophila subsp. hydrophila ATCC 11163는 American Type Culture Collection (Manassan, VA, USA)로부터 수득하였으며; Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802 (KCCM 11965) 및 Vibrio parahaemolyticus ATCC 27969 (KCCM 41664)는 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, Seoul, Korea)로부터 수득하였고; Vibrio vulnificus ATCC 27562 (KCTC 2959) 및 Vibrio vulnificus ATCC 33815 (KCTC 2962)는 생물자원센터(Korean Collection for Type cultures, Daejeon, Korea)로부터 수득하였으며; Vibrio cholerae NCCP 13589 및 Vibrio cholerae NCCP 14552는 National Culture Collection for Pathogens로부터 수득하였다.
<실시예 1>
본 발명의 비브리오 미미쿠스 검출을 위한 고체배지 조성물 제조
증류수 1 리터에 5 g 효모 추출물(yeast extract), 10 g 프로테오스 펩톤(proteose peptone No. 3), 10 g 티오황산나트륨(sodium thiosulfate), 10 g 시트르산 나트륨(sodium citrate), 8 g 황소 담즙(Ox gall), 10 g 자당(sucrose), 20 g 아라비노스(arabinose), 10 g 셀로비오스(D-cellobiose), 10 g 염화나트륨(sodium chloride), 1 g 시트르산 제 2철 암모늄(ferric ammonium citrate), 0.04 g 브로모티몰 블루(Bromothymol blue), 0.04 g 티몰 블루(thymol blue), 15 g 아가(agar)로 조성하였으며, 상압에서 가열하여 멸균함으로써 본 발명의 고체배지를 제조하였다. 상압에서 가열하여 멸균하는 과정은 상기 배합된 배지 조성물을 거품을 내며 끊어오를 때 가열을 멈춘 후 식혀주는 작업을 3반복하여 진행하였다. 참고로, 종래 고체배지 제조 시 오토클레이브(autoclave 121℃, 15분)를 사용하는데, 이러한 경우 배지의 구성성분으로서 자당과 같은 탄소원의 변성이 발생할 수 있는바, 본 발명에서는 이러한 문제점을 극복하기 위하여 상압에서 가열하는 과정으로 제조하였다.
본 발명의 고체배지는 비브리오 미미쿠스가 분해하지 못하는 탄소원 3가지(자당, 아라비노스, 셀로비오스)를 첨가함으로써, 해당 탄소원 3가지 중 한 가지라도 분해하는 균주와 구분할 수 있다. 탄소원 3가지 중 한 가지라도 분해하는 균주는 노란색으로, 탄소원 3종 모두 분해하지 못하는 비브리오 미미쿠스는 초록색으로 구별 가능하다. 비브리오속의 탄소원 3종에 대한 분해 특성은 아래 표 1과 같다.
| 균주 | 자당 | 아라비노스 | D-셀로비오스 |
| Vibrio mimicus | - | - | - |
| Vibrio parahaemolyticus | - | + | V |
| Vibrio vulnificus | - | - | + |
| Vibiro cholerae | + | - | - |
| Vibrio fluvialis | + | + | + |
(+: 분해, -: 분해하지 않음, V: 균주에 따라 다름)
<실시예 2>
비브리오 미미쿠스에 대한 민감도를 개선한 고체배지 조성물 제조
비브리오 미미쿠스균은 배지에서 잘 자라지 않는 특성으로 인해 균 초기 농도가 높지 않은 경우 균 검출이 어려운 문제점이 있다. 이에, 본 실험에서는 낮은 초기 농도에서도 비브리오 미미쿠스에 대한 검출 정확도를 높이기 위하여(민감도 개선), 황산칼슘(calcium sulfate)과 황산마그네슘(magnesium sulfate)을 배지에 첨가하였다.
비브리오 미미쿠스에 대한 민감도 개선용 고체배지 조성물은 상기 <실시예 1>에서 개시하는 구성성분을 모두 포함하고, 추가적으로 1.7 g 황산칼슘(calcium sulfate), 3.24 g 황산마그네슘(magnesium sulfate)을 더 첨가하여 제조하였다. 제조방법은 상기 <실시예 1>와 동일하게 진행하였다.
<비교예>
기존 비브리오 검출을 위해 사용되는 배지 준비
종래 비브리오 검출을 위해 사용되고 있는 TCBS (Thiosulfate Citrate Bile salts Sucrose) 배지를 비교예로 사용하였다. 시중에 판매되는 TCBS 배지는 아래와 같은 구성성분을 갖는다.
| 구성성분 | 함량 |
| 효모 추출물 | 5 g |
| 펩톤 | 10 g |
| 시트르산 나트륨 | 10 g |
| 티오황산나트륨 | 10 g |
| 황소 담즙 | 8 g |
| 수크로스 | 20 g |
| 염화나트륨 | 10 g |
| 구연산철 | 1 g |
| 티몰 블루 | 0.04 g |
| 브로모티몰 블루 | 0.04 g |
| 한천 | 15 g |
| 증류수 | 1 L |
<실험예 1>
본 발명의 고체배지에서 미생물 성장에 따른 콜로니 성상 확인 및 선별력 실험
본 실험에서는 성상 확인 및 선별력 실험을 위하여 사용된 미생물은 표 3과 같다. 사용된 미생물은 병원성 비브리오로 기존 비브리오 선택배지에서 비브리오 미미쿠스와 구분이 되지 않는 비브리오 파라헤몰리티쿠스와 비브리오 불니피쿠스를 포함한다.
상기 <실시예 2>를 통해 제조된 본 발명의 고체배지에 실험균주를 분주한 후 37℃에서 24시간 동안 배양한 후 콜로니 성상을 확인하였다. 그 결과는 표 3 및 도 1에서 자세히 나타내었다.
한편, <비교예>로서 TCBS 배지에서 비브리오 미미쿠스, 장염비브리오, 비브리오 패혈증균 각각을 분주한 후 37℃에서 24시간 동안 배양한 후 콜로니 성상을 확인하였다. 그 결과는 표 4 및 도 2에서 자세히 나타내었다.
| 사용된 균주 | 콜로니 성상 |
| Vibrio mimicus ATCC 33653 | 청록색 |
| Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802 (KCCM 11965) | 노란색 |
| Vibrio parahaemolyticus ATCC 27969 (KCCM 41664) | |
| Vibrio parahaemolyticus ATCC 33846 | |
| Vibrio vulnificus ATCC 27562 (KCTC 2959) | |
| Vibrio vulnificus ATCC 33815 (KCTC 2962) | |
| Vibrio cholerae NCCP 13589 | |
| Vibrio cholerae NCCP 14552 | |
| Vibrio fluvialis ATCC 33809 | |
| Enterococcus faecium ATCC 19434 | |
| Enterococcus faecalis ATCC 19433 | |
| Enterococcus faecalis ATCC 29212 | |
| Pseudomonas oleovorans ATCC 8062 | |
| Pseudomonas putida ATCC 21025 | |
| Pseudomonas aeruginoas ATCC 15442 | |
| Aeromonas hydrophila subsp. hydrophila ATCC 7966 | 중앙: 검은색 외곽: 투명/연두색 |
| Aeromonas hydrophila subsp. hydrophila ATCC 11163 |
| 사용된 균주 | 콜로니 성상 |
| Vibrio mimicus ATCC 33653 | 청록색 |
| Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802 (KCCM 11965) | |
| Vibrio parahaemolyticus ATCC 27969 (KCCM 41664) | |
| Vibrio parahaemolyticus ATCC 33846 | |
| Vibrio vulnificus ATCC 27562 (KCTC 2959) | |
| Vibrio vulnificus ATCC 33815 (KCTC 2962) | |
| Vibrio cholerae NCCP 13589 | 노란색 |
| Vibrio cholerae NCCP 14552 | |
| Vibrio fluvialis ATCC 33809 |
도 1은 상기 <실시예 2>를 통해 제조된 본 발명의 고체배지에서 비브리오속의 콜로니 성상을 나타낸 것이다. 도 1a는 비브리오 미미쿠스의 콜로니 성상으로 청록색을 나타냈으며, 도 1b는 장염 비브리오, 도 1c는 비브리오 패혈증균의 콜로니 성상이 노란색으로 나타냈다.
도 2는 기존 TCBS 배지에서 비브리오속의 성상을 나타낸 것이다. 도 2a는 TCBS 배지에서 비브리오 미미쿠스를 분주하여 배양한 결과로서, 콜로니 성상으로 초록색을 나타냈으며, 도 2b는 장염 비브리오, 도 2c는 비브리오 패혈증균으로 콜로니 성상이 초록색으로 나타나 비브리오 미미쿠스와 선별이 불가능한 것으로 나타났다.
<실험예 2>
본 발명의 고체배지에서 비브리오 미미쿠스의 회복력 실험
식중독균 분리를 위해 사용되어지는 선택배지는 배양하고자 하는 균을 회복하는 능력을 구비해야 한다. 따라서 선택배지에서 균 회복력을 평가하는 것은 매우 중요한 일이다.
본 실험에서는 상기 <실시예 2>를 통해 제조된 본 발명의 고체배지와 영양배지로 사용되는 2% NaCl 농도의 TSA (Tryptic Soy Agar)와 회복력 비교 실험을 진행하였다. 한편, 기존 TCBS 배지를 비교예로 사용하였다.
회복력 평가를 위하여 비브리오 미미쿠스의 집락을 0.85% Saline(생리 식염수)에 현탁한 후 단계별로 희석하고, 단계별 희석액을 각각의 배지에 분주하여 평판도말하였다. 20-200개의 집락을 보이는 배지를 선별하고 집락수를 log unit으로 변환한 후, 각 배지별 집락의 수를 유의적으로 비교하였다.
그 결과 표 5에서 나타낸 바와 같이, 기존에 사용되고 있는 TCBS 배지 대비 상기 <실시예 2>를 통해 제조된 본 발명의 고체배지에서 비브리오 미미쿠스에 대한 우수한 회복력(10% 증대)을 보이는 것을 확인하였다.
| 사용된 배지 | 회복된 세포 수 (log CFU/mL) |
회복률 |
| 영양배지(2% NaCl TSA) | 7.36 ± 0.13 | 66.7% |
| <비교예> | 4.91 ± 0.20 | |
| 영양배지(2% NaCl TSA) | 5.74 ± 0.14 | 76.7% |
| <실시예 2> | 4.40 ± 0.00 |
<실험예 3>
본 발명의 고체배지에서 비브리오 미미쿠스의 민감도 개선 효과
식품 시료에서 식중독균 확인시 시료 내 포함되어 있는 균의 초기 농도가 높지 않은 경우가 많으며, 균의 초기 농도가 낮은 경우 검출 민감도가 떨어지게 되는 문제점이 있다. 이에, 낮은 농도에서도 균의 유무를 검출할 수 있도록 대상 균에 대한 민감도를 개선시키는 것이 중요하다. 본 실험에서는 상기 <실시예 1>를 통해 제조된 고체배지 대비 구성성분으로 황산칼슘과 황산마그네슘의 추가로 첨가하여 제조된 <실시예 2>에서 비브리오 미미쿠스에 대한 민감도가 개선되는지 여부를 확인하였다.
본 발명의 고체배지에서 비브리오 미미쿠스의 민감도 개선 효과 평가를 위하여 비브리오 미미쿠스의 집락을 0.85% Saline(생리식염수)에 현탁한 후 단계별로 희석하고, 단계별 희석액을 각각의 배지에 분주하여 평판도말한 다음 37℃에서 24시간 동안 배양한 후 영양배지(2% NaCl TSA)에서 20-200개의 집락을 보이는 배지를 선별하고 집락수를 log unit으로 변환하여 분주한 초기 비브리오 미미쿠스의 농도 및 각 희석액의 비브리오 미미쿠스의 농도를 계산하고, <실시예 1>과 <실시예 2>의 배지에서 비브리오 미미쿠스가 검출되는 최소 농도를 확인하는 방법을 통하여 양성 집락수를 확인함으로써 비브리오 미미쿠스 검출 가능여부를 평가하였다.
그 결과 하기 표 6에서 나타낸 바와 같이, 초기 농도 2 log CFU/mL 미만에서는 본 발명의 <실시예 2>를 통해 제조된 고체배지에서만 비브리오 미미쿠스의 검출이 가능한 것으로 나타났다.
따라서, 이와 같은 결과를 통해 상기 <실시예 2>를 통해 제조된 본 발명의 고체배지의 경우 비브리오 미미쿠스에 대한 민감도가 개선됨으로써 초기 균의 농도가 낮은 경우라도 비브리오 미미쿠스균의 유무를 정확하고 효과적으로 검출할 수 있는 이점을 갖는다.
| 희석배수 | 초기농도(log CFU/mL) | 기존 특허 배지 | 본 발명 배지 |
| 1 | 7.63 | 검출 가능(○) | 검출 가능(○) |
| 3 | 5.63 | 검출 가능(○) | 검출 가능(○) |
| 5 | 3.63 | 검출 가능(○) | 검출 가능(○) |
| 7 | 1.63 | 검출 불가(×) | 검출 가능(○) |
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (10)
- 수크로스(sucrose), 아라비노스(arabinose) 및 셀로비오스(cellobiose)를 유효성분으로 포함하는 비브리오 미미쿠스(Vibrio mimicus) 검출용 선택배지 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물은 비브리오 미미쿠스에 대한 민감도를 개선시키기 위하여 황산칼슘(calcium sulfate) 및 황산마그네슘(magnesium sulfate)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 비브리오 미미쿠스(Vibrio mimicus) 검출용 선택배지 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 수크로스(sucrose), 아라비노스(arabinose) 및 셀로비오스(cellobiose)는 조성물 100중량부를 기준으로 각각 0.1 내지 3중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는, 비브리오 미미쿠스(Vibrio mimicus) 검출용 선택배지 조성물. - 제2항에 있어서,
상기 황산칼슘(calcium sulfate) 및 황산마그네슘(magnesium sulfate)은 조성물 100중량부를 기준으로 각각 0.005 내지 0.5중량부 및 0.05 내지 0.5중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는, 비브리오 미미쿠스(Vibrio mimicus) 검출용 선택배지 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 조성물은 증류수, 효모 추출물, 펩톤, 티오황산 나트륨, 시트르산 나트륨, 황소 답즙, 염화나트륨, 시트르산 제2철 암모늄, 브로모티몰 블루, 티몰 블루 및 한천으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 비브리오 미미쿠스(Vibrio mimicus) 검출용 선택배지 조성물. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 선택배지 조성물을 포함하는 비브리오 미미쿠스(Vibrio mimicus) 검출용 키트.
- a) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 선택배지 조성물에 시료를 접종하여 배양하는 단계; 및
b) 상기 배지 상에 형성된 콜로니의 성상을 확인하는 단계를 포함하는, 비브리오 미미쿠스(Vibrio mimicus)를 검출하는 방법. - 제7항에 있어서,
상기 시료는 식품 또는 농수산물인 것을 특징으로 하는, 비브리오 미미쿠스(Vibrio mimicus)를 검출하는 방법. - 제8항에 있어서,
상기 식품은 육류, 어류, 육가공품, 어류가공품, 유제품 및 채소로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 비브리오 미미쿠스(Vibrio mimicus)를 검출하는 방법. - 제7항에 있어서,
상기 a) 단계는 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 선택배지 조성물에 시료를 접종하고 33℃ 내지 37℃에서 18시간 내지 36시간 동안 배양하는 것을 특징으로 하는, 비브리오 미미쿠스(Vibrio mimicus)를 검출하는 방법.
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20050075454A (ko) * | 2002-12-13 | 2005-07-20 | 니찌레이 푸드 인코포레이티드 | 비브리오 콜레라 또는 비브리오 미미쿠스 검출용 프라이머및 탐침과 이를 이용한 검출방법 |
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| KR20170012830A (ko) * | 2015-07-24 | 2017-02-03 | 중앙대학교 산학협력단 | 비브리오균 검출용 발색배지 및 이를 이용한 비브리오균의 검출 방법 |
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-
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Patent Citations (4)
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Journal of clinical microbiology. Vol. 14, No. 6, 631-639(1981)* * |
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