KR20050075454A

KR20050075454A - 비브리오 콜레라 또는 비브리오 미미쿠스 검출용 프라이머및 탐침과 이를 이용한 검출방법

Info

Publication number: KR20050075454A
Application number: KR1020057010755A
Authority: KR
Inventors: 타케시 고이즈미; 요코 니시야마; 사토시 야마모토; 마사후미 후쿠야마; 카츠노리 후루하타; 켄지 오오나카
Original assignee: 니찌레이 푸드 인코포레이티드
Priority date: 2002-12-13
Filing date: 2003-12-11
Publication date: 2005-07-20
Also published as: EP1577393A4; US20060115820A1; CN1748030A; TW200502387A; AU2003292842A1; JPWO2004055188A1; WO2004055188A1; EP1577393A1

Abstract

본 발명의 주목적은 오판정의 가능성이 낮을뿐만 아니라 실용상 충분한 증폭효율과 증폭특이성을 가지는 고성능의 비브리오 콜레라 및 비브리오 미미쿠스 검출ㆍ정량ㆍ동정용 특이유전자 증폭 프라이머의 제작이다. 본 발명자들은 비브리오 콜레라 및 비브리오 미미쿠스와 근연종의 rpoD 유전자 및 gyrB 유전자의 부분 염기서열을 정하고, 그 계통관계를 분명히 밝혀, 비브리오 콜레라 및 비브리오 미미쿠스 각각에 특징적인 염기를 동정하고 이를 포함하는 고특이성을 가지는 탐침 및 고특이성을 가질뿐만 아니라 증폭효율도 우수한 유전자 증폭용 프라이머의 설계를 가능하게 하였다.

Description

비브리오 콜레라 또는 비브리오 미미쿠스 검출용 프라이머 및 탐침과 이를 이용한 검출방법{Primer and Probe for Detecting Vibrio cholerae or Vibrio mimicus and Detection Method Using the Same}

본 발명은 식품검사, 역학적 환경검사 및 임상검사에 있어서의 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae)와 비브리오 미미쿠스(Vibrio mimicus)의 검출ㆍ동정ㆍ계수 방법에 관한 것이다.

비브리오 콜레라는 경구감염 후, 콜레라 독소를 만들어, 심한 설사와 구토를 일으키며, 때에 따라서는 극도의 탈수증상으로 인하여 사망하는 예도 있는 감염증 세균이다. 사람에 대하여 독성을 보이는 비브리오 콜레라는 항 O1항체로 인하여 응집하는 O1 콜레라만이며, 그 이외의 균은 O1 비응집(O1-non-agglutinable)의 NAG-비브리오로 분류되어, 사람에 대한 독성을 보이지 않는다고 여겨져 왔다. 그러나, 1995년 인도의 벵갈지방에서, 그때까지의 콜레라와 유사한 증상을 일으키나 O1 항원을 가지지 않은 신형의 비브리오 콜레라가 분리되어, O139라는 새로운 O 항원을 가지는 것으로 확인되었다. 전기 균주는 벵갈균주(Bengal strain)로 명명되었으며, 종래의 O1 콜레라와 유사한 콜레라 독소생산 유전자를 가지고 독소를 만들어 콜레라 증상을 야기하는 것으로 밝혀졌으며, 이에 따라, O1 콜레라 이외에도 사람에 감염하여 콜레라 증상의 원인이 될 수 있음이 시사되었다. 실제로, O1, O139 이외의 비브리오 콜레라에도 콜레라 독소 유전자를 가지는 균주가 존재하고, 사람에 대하여 콜레라 증상을 일으킨다. 그러나, O1 및 O139 이외의 비브리오 콜레라에 의한 증상은 행정상 감염증으로 취급되지 않는다.

한편, 비브리오 콜레라의 비 01 균주 중에서 백당 비분해 균주(non-saccharolytic strain)가 드물게 검출되고 있었는데, 데이비스(Davis) 등은 비브리오 콜레라의 DNA 상동성을 조사하여, 비브리오 콜레라와는 약간의 차이를 보이는 전기 균주를 비브리오 미미쿠스라고 명명하였다. 전기 비브리오 미미쿠스는 비브리오 콜레라와 매우 가까운 종이며, 생화학적 성상으로는 백당 분해능(saccharolytic ability)이 다르지만(비브리오 콜레라가 양성, 비브리오 미미쿠스가 음성), 그 외의 성상은 매우 비슷하다고 보고되고 있다(참조: J. Clin. Microbiol., 14:631-639, 1981)(비특허문헌 1). 비브리오 미미쿠스에는 비브리오 콜레라와 유사한 콜레라 독소 유전자를 가지는 균주가 존재하는 것이 알려져 있어(참조: Microbiol. Immunol., 42:823-828, 1998)(비특허문헌 2), 콜레라 증상과 유사한 증상을 일으킬 가능성이 있다.

또한, 콜레라 독소 유전자를 가지지 않은 비브리오 콜레라 중에서 장염 비브리오의 병원인자인 내열성 용혈 독소 유전자(tdh)를 가진 균주(참조: Appl. Environ. Microbiol., 52:1218-20, 1986)(비특허문헌 3)나, 대장균의 내열성 엔테로톡신을 만드는 균주(참조: J. Clin. Invest., 85:697-705, 1990)(비특허문헌 4)의 존재가 보고되어 있으며, 설사 증상 등의 원인이 될 수 있다. 더욱이, 비브리오 미미쿠스에도 유사하게 tdh 유전자를 가지는 균주가 존재한다고 알려져 있으며(참조: FEMS Microbiol., 59:319-23, 1990)(비특허문헌 5), 콜레라 독소를 만들지 않는 경우에도 설사증상 등의 원인이 될 수 있다.

상술한 바와 같이, 혈청형이 O1 및 O139(벵갈)이며, 콜레라 독소를 만드는 비브리오 콜레라가 검출된 경우에는 "감염증의 예방 및 감염증의 환자에 대한 의료에 관한 법률"이 정한 조치의 대상이 된다. 또한, O1 콜레라 및 벵갈 콜레라 이외의 비브리오 콜레라에도 콜레라 독소생산 균주가 존재하며, 콜레라 증상과 유사한 증상을 일으킨다. 더욱이, 콜레라 독소 비생산 균주라도 콜레라 증상의 원인이 되진 않지만 그것이 비병원성인 것을 의미하지는 않으며, 콜레라 독소 이외의 독소를 만들어 급성위염 이나 설사 등을 야기한다. 따라서, 비브리오 콜레라 균군의 신속하고 정확한 검출이 요구된다.

한편, 비브리오 미미쿠스에 있어서도, 콜레라 증상의 원인이 될 수 있는 콜레라 독소를 만드는 균주 및 콜레라 독소 이외의 독소를 생산하여 급성위염, 설사 등의 원인이 되는 균주가 있다. 따라서, 비브리오 미미쿠스 균군 역시 신속하고 정확한 검출이 요구된다.

생화학적 방법을 이용한 종래의 검사방법은 숙련된 기술과 많은 노력 및 시간을 요한다. 이러한 단점을 극복하고자, 정확하고 신속ㆍ간편한 비브리오 콜레라 및 비브리오 미미쿠스의 검출ㆍ동정을 목적으로 한 유전자에 의한 검사방법이 시도되고 있다.

콜레라 증상의 원인인 콜레라 독소를 암호화하는 유전자를 검출하는 프라이머가 이미 존재한다(참조: J. Biol. Chem., 258:13722-13726, 1983)(비특허문헌 6). 그러나, 상기 프라이머로는 콜레라 독소 유전자를 가지지 않고 다른 독소를 만드는 비브리오 콜레라 및 비브리오 미미쿠스를 검출하는 것은 불가능하다.

한편, 비브리오 콜레라와 비브리오 미미쿠스의 16S rRNA 유전자 염기서열을 전장의 범위에서 비교하면, 1,456 염기 중 6 염기밖에 다르지 않으므로(참조: Int. J. Syst. Bacteriol., 44:416-426, 1994)(비특허문헌 7), 명확히 구별하는 것은 불가능하기 때문에 비브리오 콜레라와 비브리오 미미쿠스의 16S-23S rRNA Intergenic Spacer Region을 비교하고, 비브리오 콜레라와 비브리오 미미쿠스가 분류가능한 지를 검토하여, 비브리오 콜레라 만을 검출가능한 프라이머를 작성한 보고(참조: Appl. Environ. Microbiol., 65:2202-2208, 1999)(비특허문헌 8)도 있지만, 전기 프라이머를 이용한 경우에 비브리오 미미쿠스가 잘 못 검출된 보고도 존재한다(참조: Appl. Environ. Microbiol., 67:2360-2364, 2001)(비특허문헌 9).

도 1은 gyrB 및 rpoD 유전자의 부분서열을 연결해 맞춘 후에 분자계통해석을 수행한 결과를 도시한 계통도이다. 전기 계통도가 근린결합법에 의한 분자계통수이며, 비브리오 콜레라 및 비브리오 미미쿠스가 다른 비브리오 속 세균과는 다른 단일의 계통에 속하고 있음을 보여주고 있다. 또한, 비브리오 콜레라 및 비브리오 미미쿠스도 각각 독립한 계통군을 형성하고 있음을 보여주고 있다.

도 2는 도 1에서 보인 비브리오 콜레라 및 비브리오 미미쿠스가 속하는 클러스터의 gyrB 유전자의 공통서열(상단)과 근연의 클러스터(도 1 중의 C1,2,3)의 gyrB 유전자의 공통서열(하단)을 결정하고 비교한 표이다. ●으로 나타낸 부위가 비브리오 콜레라 및 비브리오 미미쿠스에 특유한 염기임을 나타낸다.

도 3은 도 1에서 보인 비브리오 콜레라 및 비브리오 미미쿠스가 속하는 클러스터의 rpoD 유전자의 공통서열(상단)과 근연의 클러스터(도 1 중의 C1,2,3)의 rpoD 유전자의 공통서열(하단)을 결정하고 비교한 표이다. ●으로 나타낸 부위가 비브리오 콜레라 및 비브리오 미미쿠스에 특유한 염기임을 나타낸다.

도 4는 도 1에서 보인 비브리오 콜레라가 속하는 클러스터의 gyrB 유전자의 공통서열(상단)과 비브리오 미미쿠스가 속하는 클라스터의 gyrB 유전자의 공통서열(하단)을 결정하고 비교한 표이다. ●으로 나타낸 부위가 비브리오 콜레라에 특이적인 염기임을 나타낸다.

도 5는 도 1에서 보인 비브리오 콜레라가 속하는 클러스터의 rpoD 유전자의 공통서열(상단)과 비브리오 미미쿠스가 속하는 클라스터의 rpoD 유전자의 공통서열(하단)을 결정하고 비교한 표이다. ●으로 나타낸 부위가 비브리오 콜레라에 특이적인 염기임을 나타낸다.

도 6은 도 1에서 보인 비브리오 미미쿠스가 속하는 클러스터의 gyrB 유전자의 공통서열(상단)과 비브리오 콜레라가 속하는 클라스터의 gyrB 유전자의 공통서열(하단)을 결정하고 비교한 표이다. ●으로 나타낸 부위가 비브리오 미미쿠스에 특이적인 염기임을 나타낸다.

도 7은 도 1에서 보인 비브리오 미미쿠스가 속하는 클러스터의 rpoD 유전자의 공통서열(상단)과 비브리오 콜레라가 속하는 클라스터의 rpoD 유전자의 공통서열(하단)을 결정하고 비교한 표이다. ●으로 나타낸 부위가 비브리오 미미쿠스에 특이적인 염기임을 나타낸다.

발명의 개시

이상과 같이, 기존의 유전자 검출방법으로는 비브리오 콜레라 및 비브리오 미미쿠스를 우수한 정확도로 검출할 수가 없다.

종래의 유전자 검사방법의 공통점은 세균의 "종"(種)이 유전적인 다양성을 내포하는 집단이라는 사실을 무시하고 있다는 점이다. 어떤 세균집단의 일원으로 추측되는 한 균주의 염기서열을 그 집단 공통의 또는 대표하는 서열로 이용하는 것은 중립적 변이(neutral mutation)를 빨리 축적하는 유전자의 분자진화 성질상 매우 위험하다. 즉, 원래 검출될 균주가 프라이머 영역에서의 약간의 변이로 인하여 증폭이 저해되어 검출되지 않는다거나 프라이머의 특이성이 충분하지 않아 검출되지 않아야 할 근연주가 검출되는 것과 같은 오판정의 원인이 될 우려가 있다. 따라서, 특이성의 배경이 증명되고, 오판정의 가능성이 낮으며, 실용상 충분한 증폭효율과 증폭 특이성을 가지는 고성능의 비브리오 콜레라 및 비브리오 미미쿠스의 검출ㆍ동정ㆍ정량용 특이 유전자 증폭 프라이머, 게다가, 비브리오 콜레라, 비브리오 미미쿠스를 각각 특이적으로 검출ㆍ동정ㆍ정량하는 유전자 증폭 프라이머의 작성이 필요하게 되었다.

세균의 어느 계통군의 유전자를 특이적으로 검출하는 방법을 작성하기 위해서는 검출하려고 하는 생물군 및 그 계통적으로 근연한 생물군의 염기서열을 되도록 많이 수집할 필요가 있다. 또한, 특이검출의 목적이 되는 유전자는 가장 근연의 생물과도 판별가능하도록 충분히 다른 염기서열을 가질 필요가 있다. 이를 위해서는, 충분히 빠른 진화속도를 가져야 한다. 또한, 고빈도로 수평전파하는 유전자(예를 들어, 장염 비브리오의 독소 유전자)의 경우와 같이, 계통과는 무관하게 존재하는 유전자는 이용할 수 없다. 본 발명에서 목적으로 이용한 gyrB 유전자 및 rpoD 유전자가 암호화하는 단백질은 생존에 필수적인 단백질이다. 이 때문에, 수평전파가 어려우며, 또한, 적당한 진화속도를 가지고 있기 때문에, 세균의 계통해석에 적합하다(참조: Int. J. Syst. Bacteriol., 48:813-819, 1998; Int. J. Syst. Bacteriol., 49:87-95, 1999). 본 발명자들은 이미 gyrB 유전자 및 rpoD 유전자의 PCR 다이렉트 시퀀싱법에 의한 간편한 염기서열의 결정방법을 개발하고 있다(참조: 특개평 제 07-213229호, 특개평 제 08-256798호). 게다가, 본 발명자들은 이미 다수의 비브리오 콜레라를 단리하고, 또한, 공지의 비브리오 미미쿠스 보존균주 및 16S rRNA 서열에 기초한 해석에 따라 본균에 근연하다고 보고되어 있는 Listonella anguillarum, V.ordalii, V.diazotrophicus, V.vulnificus, V.navarrensis, V.metschnikovii, V.cincinnatiensis(참조: International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 51,1449-1456(2001)) 에 대하여, 표 1에 표시된 균주의 gyrB 및 rpoD 유전자의 부분염기서열을 해석하고, 그 서열에 기초한 분자계통해석을 수행하여 그 계통관계를 명확하게 하였다.

표 1: 사용한 균주

구체적으로, 시험균주(test strain)를 2% NaCl 첨가 brain heart infusion 배지에서 증균배양한 후에, PUREGENE DNA Isolation Kit(Gentra SYSTEMS)를 이용하여 염색체 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA를 주형으로 하여, gyrB 증폭 유니버설 프라이머 UP-1E 및 AprU를 이용하여 약 900bp(대장균 K-12주 상의 염기서열 위치 331-1212; 아미노산 서열은 111-404에 해당하는 영역)의 gyrB 유전자 단편을 PCR 증폭하였다. 또한, 동일하게 rpoD 증폭 유니버설 프라이머 70F-M13 및 70R-M13을 이용하여 약 800bp(대장균 K-12주 상의 염기서열 위치 334-1125; 아미노산 서열은 위치 112-375에 해당하는 영역)의 rpoD 유전자 단편을 PCR 증폭하였다. 수득한 PCR 산물은 1% 아가로스젤로 전기영동한 후, 브롬화에티듐으로 염색하고, 자외선 조사 하에서 증폭산물의 존재를 확인한 후에, Wizard PCR Preps DNA Purification System(Promega사 제품)을 이용하여 정제하고, 시퀀스 반응의 주형으로 하였다. 시퀀스 반응은 유니버설 프라이머에 미리 준비되어 있는 M13R, M13-21 서열을 프라이머로 하고, ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit(PE Applied Biosystems사 제품)을 이용하였으며, ABI PRISM 310 Genetic Analyzer(PE Applied Biosystems사 제품)로 서열을 해석하였다. 결정한 염기서열을 이용하여 분자계통 해석을 수행함에 있어서, 비브리오 콜레라 및 비브리오 미미쿠스의 근연종을 보다 정확하게 파악하는 것을 목적으로 하여 gyrB 및 rpoD 유전자 부분 서열을 결합시킨 후에 해석을 실시하였다. 수득한 염기서열을 Clustal W 컴퓨터 프로그램을 이용하여 다중 얼라인먼트 해석을 수행한 후, PHYLIP 컴퓨터 프로그램 패키지를 이용하고, 기무라의 2 변수 모델로 계산한 유전적 거리에 기초하여 근린결합법(neighbor-joining method)에 의하여 분자계통수(phylogenetic tree)를 제작하였다. 이 결과, 비브리오 콜레라 및 비브리오 미미쿠스가 다른 비브리오 속(genus) 세균과는 상이한 단일계통(mono phylem)임이 밝혀졌다. 또한, 비브리오 콜레라 및 비브리오 미미쿠스도 각각이 독립한 계통군을 형성하고 있음을 알 수 있었다(참조: 도 1). 따라서, 비브리오 콜레라 및 비브리오 미미쿠스 균주만을 검출가능한 유전자 검사법을 확립하기 위해, 우선, 근연종 간의 염기서열의 차이를 명확하게 밝혔다. 즉, 비브리오 콜레라 및 비브리오 미미쿠스 군 내에서는 보존되고, 타 비브리오 속 세균과는 다른 염기의 위치를 동정하였다. 구체적으로는, 비브리오 콜레라 및 비브리오 미미쿠스가 속하는 계통군의 공통서열(consensus sequence)을 찾아내고, 분자계통해석의 결과로부터 본 계통에 근연하다고 판명된 도 1 중 C1 내지 C3의 계통의 공통서열을 비교하고, 계통 특이적 정보도를 작성하였다(도 2, 3). 도 2에 의한, gyrB 유전자에 있어서는 서열번호 1의 위치번호(이하, 염기번호라고도 명명) 21, 96, 107, 126, 153, 190, 258, 270, 279, 285, 357, 543, 552, 557, 600, 690, 702, 714, 729, 733, 734, 759, 771, 782, 786, 792, 795 또는 885의 위치, 도 3에 의한, rpoD 유전자에 있어서는 서열번호 2의 위치번호 3, 27, 66, 67, 75, 90, 117, 123, 141, 144, 177, 178, 180, 186, 223, 227, 228, 231, 250, 251, 255, 257, 259, 264, 300, 301, 302, 303, 305, 313, 314, 350, 351, 362, 369, 373, 374, 380, 390, 400, 402, 409, 410, 415, 416, 423, 427, 433, 444, 447, 504, 510, 513, 543, 556, 558, 618, 638, 649, 663, 685, 711, 747, 757, 762, 763 또는 789의 위치가 비브리오 콜레라 및 비브리오 미미쿠스가 속하는 계통에 특이적이라는 것이 밝혀지게 되었다. 이들 특징적인 염기를 포함하는 전기 계통에 특이적인 서열을 이용함으로써, 고특이성을 가지는 탐침 및 고특이성을 가지면서 증폭효율이 우수한 유전자 증폭 프라이머를 설계하는 것이 가능하게 된다. 예를 들어, 근연종과 염기가 다른 위치를 반드시 포함하도록, 전기 근연종과 다른 염기를 포함하면서 연속하는 15 염기 이상의 gyrB 및 rpoD 유전자의 염기서열, 바람직하게는 20 염기 이상, 좀 더 바람직하게는 20 염기 이상 40 염기 이하의 연속하는 gyrB 및 rpoD 유전자의 염기서열을 포함하는 프라이머를 설계하는 것이 가능하게 된다. 마찬가지로, 근연종과 염기가 다른 위치를 반드시 포함하도록, 전기 근연종과 다른 염기를 포함하면서 연속하는 15 염기 이상의 gyrB 및 rpoD 유전자의 염기서열, 바람직하게는 20 염기 이상, 좀 더 바람직하게는 20 염기 이상 100 염기 이하의 연속하는 gyrB 및 rpoD 유전자의 염기서열을 포함하는 탐침을 설계하는 것이 가능하게 된다. 또한, 전기 프라이머 및 탐침을 작성하는데는 상기 서로 다른 염기를 2개 이상의 고빈도로 포함하는 영역, 예를 들어, gyrB 유전자에 있어서는 96, 107을 포함하는 영역, 258, 270, 279, 285 중 어느 하나의 위치를 2개 이상 포함하는 영역, 543, 552, 557 중 어느 하나의 위치를 2개 이상 포함하는 영역, 690, 702, 714 중 어느 하나의 위치를 2개 이상 포함하는 영역, 729, 733, 734 중 어느 하나의 위치를 2개 이상 포함하는 영역, 759, 771을 포함하는 영역, 782, 786, 792, 795 중 어느 하나의 위치를 2개 이상 포함하는 영역, rpoD 유전자에 있어서는 66, 67, 75, 90 중 어느 하나의 위치를 2개 이상 포함하는 영역, 177, 178, 180, 186 중 어느 하나의 위치를 2개 이상 포함하는 영역, 223, 227, 228, 231 중 어느 하나의 위치를 2개 이상 포함하는 영역, 250, 251, 255, 257, 259, 264 중 어느 하나의 위치를 2개 이상 포함하는 영역, 300, 301, 302, 303, 305, 313, 314 중 어느 하나의 위치를 2개 이상 포함하는 영역, 362, 369, 373, 374, 380 중 어느 하나의 위치를 2개 이상 포함하는 영역, 400, 402, 409, 410, 415, 416 중 어느 하나의 위치를 2개 이상 포함하는 영역, 423, 427, 433, 444, 447 중 어느 하나의 위치를 2개 이상 포함하는 영역, 504, 510, 513 중 어느 하나의 위치를 2개 이상 포함하는 영역, 543, 556, 558 중 어느 하나의 위치를 2개 이상 포함하는 영역, 747, 757, 762, 763 중 어느 하나의 위치를 2개 이상 포함하는 영역을 적절하게 사용할 수 있다. 또한, 프라이머의 경우, 3' 말단이 비브리오 콜레라 및 비브리오 미미쿠스 균군에 특이적인 염기인 것이 바람직하다. 본 발명은 이들 프라이머 및 탐침을 다른 시약과 함께 조합하여 사용하는 비브리오 콜레라 및 비브리오 미미쿠스의 검출, 정량 또는 동정용 키트를 포함하는 것이다.

한편, 비브리오 콜레라 및 비브리오 미미쿠스 균군은 또한, 비브리오 콜레라 균군과 비브리오 미미쿠스 균군이 독립한 계통을 형성하였기 때문에(참조: 도 1), 비브리오 콜레라 및 비브리오 미미쿠스 균군을 각각 검출가능한 유전자 검사법을 확립하기 위하여 상술한 바와 동일하게, 비브리오 콜레라 및 비브리오 미미쿠스 균군에서 각각 보존된 영역 및 서로 다른 염기의 위치를 동정하였다. 구체적으로는, 비브리오 콜레라 및 비브리오 미미쿠스가 속하는 계통군의 공통서열을 서로 비교함으로써 계통 특이적 정보도를 작성하였다(도 4, 5, 6 및 7). 비브리오 콜레라가 속하는 계통에 있어서는 gyrB 유전자의 경우, 도 4에 의한 서열번호 3의 위치번호 15, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 90, 111, 133, 226, 285, 291, 306, 330, 384, 390, 399, 507, 708, 756, 837, 867, 873, 879, 882 또는 885의 위치, rpoD 유전자에 있어서는 도 5에 의한 서열번호 4의 위치번호 12, 93, 96, 105, 114, 115, 116, 117, 126, 132, 141, 156, 198, 201, 216, 222, 231, 240, 252, 254, 255, 260, 261, 264, 276, 285, 291, 327, 333, 342, 345, 424, 426, 432, 441, 445, 446, 448, 450, 453, 468, 489, 495, 501, 519, 522, 525, 540, 549, 570, 585, 591, 600, 603, 606, 639, 645, 654, 657, 666, 675, 679, 680, 681, 687, 702, 705, 708, 714, 720, 723, 729, 732, 741, 750, 765, 768, 795 또는 804의 위치가 특이적이라는 것이 밝혀지게 되었다. 또한, 비브리오 미미쿠스가 속하는 계통에 있어서는 gyrB 유전자의 경우, 도 6에 의한 서열번호 5의 위치번호 15, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 90, 111, 133, 226, 285, 291, 306, 330, 384, 390, 399, 507, 708, 756, 837, 867, 873, 879, 882 또는 885의 위치, rpoD 유전자에 있어서는 도 7에 의한 서열번호 6의 위치번호 12, 93, 96, 105, 114, 115, 116, 117, 126, 132, 141, 156, 198, 201, 216, 222, 231, 240, 252, 254, 255, 260, 261, 264, 276, 285, 291, 327, 333, 342, 345, 424, 426, 432, 441, 445, 446, 448, 450, 453, 468, 489, 495, 501, 519, 522, 525, 540, 549, 570, 585, 591, 600, 603, 606, 639, 645, 654, 657, 666, 675, 679, 680, 681, 687, 702, 705, 708, 714, 720, 723, 729, 732, 741, 750, 765, 768, 795 또는 804의 위치가 특이적이라는 것이 밝혀지게 되었다. 이들 특징적인 염기를 포함하는 비브리오 콜레라 또는 비브리오 미미쿠스가 속하는 계통에 특이적인 서열을 이용함으로써, 고특이성을 가지는 탐침 및 고특이성을 가지면서 증폭효율이 우수한 유전자 증폭 프라이머를 설계하는 것이 가능하게 된다. 예를 들어, 비브리오 콜레라와 비브리오 미미쿠스의 염기가 다른 위치를 반드시 포함하도록, 전기 2균종이 다른 염기를 포함하면서 연속하는 15 염기 이상의 gyrB 및 rpoD 유전자의 염기서열, 바람직하게는 20 염기 이상, 좀 더 바람직하게는 20 염기 이상 40 염기 이하의 연속하는 gyrB 및 rpoD 유전자의 염기서열을 포함하는 프라이머를 설계하는 것이 가능하게 된다. 마찬가지로, 비브리오 미미쿠스와 비브리오 콜레라의 염기가 다른 위치를 반드시 포함하도록, 전기 2균종이 다른 염기를 포함하면서 연속하는 15 염기 이상의 gyrB 및 rpoD 유전자의 염기서열, 바람직하게는 20 염기 이상, 좀 더 바람직하게는 20 염기 이상 100 염기 이하의 연속하는 gyrB 및 rpoD 유전자의 염기서열을 포함하는 탐침을 설계하는 것이 가능하게 된다. 또한, 전기 프라이머 및 탐침을 작성하는데는 상기 서로 다른 염기를 2개 이상의 고빈도로 포함하는 영역, 예를 들어, gyrB 유전자에 있어서는 36, 39, 42, 45, 48, 51 중 어느 하나의 위치를 2개 이상 포함하는 영역, 285, 291, 306 중 어느 하나의 위치를 2개 이상 포함하는 영역, 384, 390, 399 중 어느 하나의 위치를 2개 이상 포함하는 영역, 867, 873, 879, 882, 885 중 어느 하나의 위치를 2개 이상 포함하는 영역, rpoD 유전자에 있어서는 93, 96, 105, 114, 115, 116, 117 중 어느 하나의 위치를 2개 이상 포함하는 영역, 126, 132, 141 중 어느 하나의 위치를 2개 이상 포함하는 영역, 216, 222, 231, 240 중 어느 하나의 위치를 2개 이상 포함하는 영역, 252, 254, 255, 260, 261, 264 중 어느 하나의 위치를 2개 이상 포함하는 영역, 276, 285, 291 중 어느 하나의 위치를 2개 이상 포함하는 영역, 327, 333, 342, 345 중 어느 하나의 위치를 2개 이상 포함하는 영역, 424, 426, 432, 441, 445, 446 중 어느 하나의 위치를 2개 이상 포함하는 영역, 448, 450, 453, 468 중 어느 하나의 위치를 2개 이상 포함하는 영역, 489, 495, 501 중 어느 하나의 위치를 2개 이상 포함하는 영역, 519, 522, 525, 540 중 어느 하나의 위치를 2개 이상 포함하는 영역, 585, 591, 600, 603, 606 중 어느 하나의 위치를 2개 이상 포함하는 영역, 639, 645, 654, 657 중 어느 하나의 위치를 2개 이상 포함하는 영역, 666, 675, 679, 680, 681, 687 중 어느 하나의 위치를 2개 이상 포함하는 영역, 702, 705, 708, 714, 720, 723 중 어느 하나의 위치를 2개 이상 포함하는 영역, 729, 732, 741, 750 중 어느 하나의 위치를 2개 이상 포함하는 영역을 적절하게 사용할 수 있다. 또한, 프라이머의 경우, 3' 말단이 비브리오 콜레라 또는 비브리오 미미쿠스에 특이적인 염기인 것이 바람직하다.

구체적으로, 비브리오 콜레라 및 비브리오 미미쿠스 균군을 검출, 정량 또는 동정하는 용도의 프라이머로서는,

(1) gyrB 유전자에 있어서는 서열번호 1의 위치번호 96, 107의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상의 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머, 서열번호 1의 위치번호 258, 270, 279, 285 중 어느 2개 이상의 위치의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상의 사슬 또는 그의 상보사슬로 구성되는 유전자 증폭 프라이머, 서열번호 1의 위치번호 543, 552, 557 중 어느 2개 이상의 위치의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상의 사슬 또는 그의 상보사슬로 구성되는 유전자 증폭 프라이머, 서열번호 1의 위치번호 690, 702, 714 중 어느 2개 이상의 위치의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상의 사슬 또는 그의 상보사슬로 구성되는 유전자 증폭 프라이머, 서열번호 1의 위치번호 729, 733, 734 중 어느 2개 이상의 위치의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상의 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머, 서열번호 1의 위치번호 759, 771 위치의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상의 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머, 서열번호 1의 위치번호 782, 786, 792, 795 중 어느 2개 이상의 위치의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상의 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머를 들 수 있다. 보다 구체적으로는 5'-tycaywcscaaacttacca-3' 또는 대응하는 상보사슬, 5'-gaaytctggcgtgtcgatcaag-3' 또는 대응하는 상보사슬, 5'-catrtagttgttcaaagtacgg-3' 또는 대응하는 상보사슬, 5'-ggatttyacytccgaagaaacyagc-3' 또는 대응하는 상보사슬, 5'-ygccagcttctcattcatr-3' 또는 대응하는 상보사슬, 5'-cgcttcgcttgggttttcc-3' 또는 대응하는 상보사슬 및 5'-caataatcttcgaacaaacgt-3' 또는 대응하는 상보사슬 중 어느 하나인 유전자 증폭 프라이머 및 상기 서열로 구성되는 사슬 또는 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머를 들 수 있다.

(2) rpoD 유전자에 있어서는, 서열번호 2의 위치번호 66, 67, 75, 90 중 어느 2개 이상의 위치의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상의 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머, 서열번호 2의 위치번호 177, 178, 180, 186 중 어느 2개 이상의 위치의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상의 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머, 서열번호 2의 위치번호 223, 227, 228, 231 중 어느 2개 이상의 위치의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상의 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머, 서열번호 2의 위치번호 250, 251, 255, 257, 259, 264 중 어느 2개 이상의 위치의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상의 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머, 서열번호 2의 위치번호 300, 301, 302, 303, 305, 313, 314 중 어느 2개 이상의 위치의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상의 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머, 서열번호 2의 위치번호 362, 369, 373, 374, 380 중 어느 2개 이상의 위치의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상의 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머, 서열번호 2의 위치번호 400, 402, 409, 410, 415, 416 중 어느 2개 이상의 위치의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상의 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머, 서열번호 2의 위치번호 423, 427, 433, 444, 447 중 어느 2개 이상의 위치의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상의 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머, 서열번호 2의 위치번호 504, 510, 513 중 어느 2개 이상의 위치의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상의 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머, 서열번호 2의 위치번호 543, 556, 558 중 어느 2개 이상의 위치의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상의 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머 또는 서열번호 2의 위치번호 747, 757, 762, 763 중 어느 2개 이상의 위치의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상의 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머를 들 수 있다. 보다 구체적으로는 5'-gattgctgagtatcctggaaccatc-3' 또는 대응하는 상보사슬, 5'-gaycctaacgacatggaaacc-3' 또는 대응하는 상보사슬, 5'-ttcwgarctytctgaagcs-3' 또는 대응하는 상보사슬, 5'-agatgaygmkgtcgysgar-3' 또는 대응하는 상보사슬, 5'-cgacggtgaaagyagcgacag-3' 또는 대응하는 상보사슬, 5'-caatgaactgcgcggyaagtt-3' 또는 대응하는 상보사슬, 5'-gtcacgaccaaattcattaac-3' 또는 대응하는 상보사슬, 5'-gyytgamgcttcagawgcttgrtka-3' 또는 대응하는 상보사슬, 5'-ygargtrcgcagagtttcaacc-3' 또는 대응하는 상보사슬, 5'-catyaccaarcgytcttgg-3' 또는 대응하는 상보사슬 및 5'-cgytcaacagacagtgawgtc-3' 또는 대응하는 상보사슬 중 어느 하나인 유전자 증폭 프라이머 및 상기 서열로 구성되는 사슬 또는 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머를 들 수 있다.

비브리오 콜레라용 프라이머로서는,

(1) gyrB 유전자에 있어서는 서열번호 3의 위치번호 36, 39, 42, 45, 48, 51 중 어느 2개 이상의 위치의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상의 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머, 서열번호 3의 위치번호 285, 291, 306 중 어느 2개 이상의 위치의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상의 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머, 서열번호 3의 위치번호 384, 390, 399 중 어느 2개 이상의 위치의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상의 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머, 서열번호 3의 위치번호 867, 873, 879, 882, 885 중 어느 2개 이상의 위치의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상의 사슬 또는 그의 상보사슬로 구성되는 유전자 증폭 프라이머를 들 수 있다. 보다 구체적으로는 5'-ggtggttaacgcgctytct-3' 또는 대응하는 상보사슬로 구성되는 유전자 증폭 프라이머, 5'-ycgatgaacgtgaagaagataaa-3' 또는 대응하는 상보사슬로 구성되는 유전자 증폭 프라이머, 5'-tgagaaagtcttccacttt-3' 또는 대응하는 상보사슬로 구성되는 유전자 증폭 프라이머, 5'-gttaaagtggaagactttc-3' 또는 대응하는 상보사슬로 구성되는 유전자 증폭 프라이머, 5'-gggtaagccwgcaagatcc-3' 또는 대응하는 상보사슬로 구성되는 유전자 증폭 프라이머 및 상기 서열로 구성되는 사슬 또는 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머를 들 수 있다.

(2) rpoD 유전자에 있어서는, 서열번호 4의 위치번호 93, 96, 105, 114, 115, 116, 117 중 어느 2개 이상의 위치의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상의 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머, 서열번호 4의 위치번호 126, 132, 141 중 어느 2개 이상의 위치의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상의 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머, 서열번호 4의 위치번호 216, 222, 231, 240 중 어느 2개 이상의 위치의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상의 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머, 서열번호 4의 위치번호 252, 254, 255, 260, 261, 264 중 어느 2개 이상의 위치의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상의 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머, 서열번호 4의 위치번호 276, 285, 291 중 어느 2개 이상의 위치의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상의 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머, 서열번호 4의 위치번호 327, 333, 342, 345 중 어느 2개 이상의 위치의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상의 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머, 서열번호 4의 위치번호 424, 426, 432, 441, 445, 446 중 어느 2개 이상의 위치의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상의 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머, 서열번호 4의 위치번호 448, 450, 453, 468 중 어느 2개 이상의 위치의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상의 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머, 서열번호 4의 위치번호 489, 495, 501 중 어느 2개 이상의 위치의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상의 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머, 서열번호 4의 위치번호 519, 522, 525, 540 중 어느 2개 이상의 위치의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상의 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머, 서열번호 4의 위치번호 585, 591, 600, 603, 606 중 어느 2개 이상의 위치의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상의 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머, 서열번호 4의 위치번호 639, 645, 654, 657 중 어느 2개 이상의 위치의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상의 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머, 서열번호 4의 위치번호 679, 680, 681, 687, 702 중 어느 2개 이상의 위치의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상의 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머, 서열번호 4의 위치번호 705, 708, 714, 720, 723 중 어느 2개 이상의 위치의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상의 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머, 서열번호 4의 위치번호 729, 732, 741, 750 중 어느 2개 이상의 위치의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상의 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머를 들 수 있다. 보다 구체적으로는 5'-attcttgagcagtttgatcgt-3' 또는 대응하는 상보사슬로 구성되는 유전자 증폭 프라이머, 5'-caggccgaagagctacgtctc-3' 또는 대응하는 상보사슬로 구성되는 유전자 증폭 프라이머, 5'-tgagctttctgaagcggatctcgcg-3' 또는 대응하는 상보사슬로 구성되는 유전자 증폭 프라이머, 5'-gaagatgatgctgtcgtcgaa-3' 또는 대응하는 상보사슬로 구성되는 유전자 증폭 프라이머, 5'-gaagatgaagacgaagat-3' 또는 대응하는 상보사슬로 구성되는 유전자 증폭 프라이머, 5'-cggtatcgaccctgaactg-3' 또는 대응하는 상보사슬로 구성되는 유전자 증폭 프라이머, 5'-catcaagcttctgaagcgtcaga-3' 또는 대응하는 상보사슬로 구성되는 유전자 증폭 프라이머, 5'-acggaagatatccarcactaa-3' 또는 대응하는 상보사슬로 구성되는 유전자 증폭 프라이머, 5'-tcaaccaagtggtcgaattgc-3' 또는 대응하는 상보사슬로 구성되는 유전자 증폭 프라이머, 5'-gcgaacacgatccattgaagtg-3' 또는 대응하는 상보사슬로 구성되는 유전자 증폭 프라이머, 5'-gatgaacgatttcttcggcatc-3' 또는 대응하는 상보사슬로 구성되는 유전자 증폭 프라이머, 5'-aaggactttatccagccac-3' 또는 대응하는 상보사슬로 구성되는 유전자 증폭 프라이머, 5'-ttcttcttgctcacggactttcgc-3' 또는 대응하는 상보사슬로 구성되는 유전자 증폭 프라이머, 5'-ttctgaattgaacggcggatc-3' 또는 대응하는 상보사슬로 구성되는 유전자 증폭 프라이머, 5'-tgtctcttgctcgatcatttgt-3' 또는 대응하는 상보사슬로 구성되는 유전자 증폭 프라이머 및 상기 서열로 구성되는 사슬 또는 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머를 들 수 있다.

비브리오 미미쿠스용 프라이머로서는,

(1) gyrB 유전자에 있어서는 서열번호 5의 위치번호 36, 39, 42, 45, 48, 51 중 어느 2개 이상의 위치의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상의 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머, 서열번호 5의 위치번호 285, 291, 306 중 어느 2개 이상의 위치의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상의 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머, 서열번호 5의 위치번호 384, 390, 399 중 어느 2개 이상의 위치의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상의 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머, 서열번호 5의 위치번호 867, 873, 879, 882, 885 중 어느 2개 이상의 위치의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상의 사슬 또는 그의 상보사슬로 구성되는 유전자 증폭 프라이머를 들 수 있다. 보다 구체적으로는 5'-ggtagtgaatgccctgtca-3' 또는 대응하는 상보사슬로 구성되는 유전자 증폭 프라이머, 5'-cggatgagcgtgaagaagataag-3' 또는 대응하는 상보사슬로 구성되는 유전자 증폭 프라이머, 5'-tgaaaaagtattccacttc-3' 또는 대응하는 상보사슬로 구성되는 유전자 증폭 프라이머, 5'-gttgaagtggaatactttt-3' 또는 대응하는 상보사슬로 구성되는 유전자 증폭 프라이머, 5'-wggcaaaccagckarrtct-3' 또는 대응하는 상보사슬로 구성되는 유전자 증폭 프라이머 및 상기 서열로 구성되는 사슬 또는 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머를 들 수 있다.

(2) rpoD 유전자에 있어서는, 서열번호 6의 위치번호 93, 96, 105, 114, 115, 116, 117 중 어느 2개 이상의 위치의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상의 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머, 서열번호 6의 위치번호 126, 132, 141 중 어느 2개 이상의 위치의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상의 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머, 서열번호 6의 위치번호 216, 222, 231, 240 중 어느 2개 이상의 위치의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상의 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머, 서열번호 6의 위치번호 252, 254, 255, 260, 261, 264 중 어느 2개 이상의 위치의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상의 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머, 서열번호 6의 위치번호 276, 285, 291 중 어느 2개 이상의 위치의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상의 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머, 서열번호 6의 위치번호 327, 333, 342, 345 중 어느 2개 이상의 위치의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상의 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머, 서열번호 6의 위치번호 424, 426, 432, 441, 445, 446 중 어느 2개 이상의 위치의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상의 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머, 서열번호 6의 위치번호 448, 450, 453, 468 중 어느 2개 이상의 위치의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상의 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머, 서열번호 6의 위치번호 489, 495, 501 중 어느 2개 이상의 위치의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상의 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머, 서열번호 6의 위치번호 519, 522, 525, 540 중 어느 2개 이상의 위치의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상의 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머, 서열번호 6의 위치번호 585, 591, 600, 603, 606 중 어느 2개 이상의 위치의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상의 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머, 서열번호 6의 위치번호 639, 645, 654, 657 중 어느 2개 이상의 위치의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상의 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머, 서열번호 6의 위치번호 679, 680, 681, 687, 702 중 어느 2개 이상의 위치의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상의 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머, 서열번호 6의 위치번호 705, 708, 714, 720, 723 중 어느 2개 이상의 위치의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상의 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머, 서열번호 6의 위치번호 729, 732, 741, 750 중 어느 2개 이상의 위치의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상의 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머를 들 수 있다. 보다 구체적으로는 5'-cattcttgaacagtttgacaag-3' 또는 대응하는 상보서열로 구성되는 유전자 증폭 프라이머, 5'-caggcagaagaactacgtctg-3' 또는 대응하는 상보서열로 구성되는 유전자 증폭 프라이머, 5'-agarctctctgaagccgatctcgct-3' 또는 대응하는 상보서열로 구성되는 유전자 증폭 프라이머, 5'-gaagatgacgaggtcgcggag-3' 또는 대응하는 상보서열로 구성되는 유전자 증폭 프라이머, 5'-gaggatgaagatgaagac-3' 또는 대응하는 상보서열로 구성되는 유전자 증폭 프라이머, 5'-gggtattgaccctgagctc-3' 또는 대응하는 상보서열로 구성되는 유전자 증폭 프라이머, 5'-taacaaagcatctgaagcttcaag-3' 또는 대응하는 상보서열로 구성되는 유전자 증폭 프라이머, 5'-gcggaaratatccagtaccag-3' 또는 대응하는 상보서열로 구성되는 유전자 증폭 프라이머, 5'-tcaaccaaatggtcaaattgt-3' 또는 대응하는 상보서열로 구성되는 유전자 증폭 프라이머, 5'-acgaacacgatccatcgaggta-3' 또는 대응하는 상보서열로 구성되는 유전자 증폭 프라이머, 5'-aataaatgatttctttggcatt-3' 또는 대응하는 상보서열로 구성되는 유전자 증폭 프라이머, 5'-gagyactttatcragccat-3' 또는 대응하는 상보서열로 구성되는 유전자 증폭 프라이머, 5'-gtcttcttgctcacgtactttttg-3' 또는 대응하는 상보서열로 구성되는 유전자 증폭 프라이머, 5'-ttggattgaagggcgaata-3' 또는 대응하는 상보서열로 구성되는 유전자 증폭 프라이머, 5'-agtctcytgttcgatcatctgm-3' 또는 대응하는 상보서열로 구성되는 유전자 증폭 프라이머 및 상기 서열로 구성되는 사슬 또는 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머를 들 수 있다.

상술한 영역, 상술한 서열로 구성되는 사슬 또는 그의 상보사슬 자체를 프라이머로 하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라서는 어댑터 서열 등의 다른 서열을 프라이머로 포함할 수도 있다.

본 발명은 이들 프라이머 및 탐침을 다른 시약과 함께 조합하여 사용하는 비브리오 콜레라 또는 비브리오 미미쿠스의 검출, 정량 또는 동정용 키트를 포함하는 것이다.

본 발명에서 이용되는 유전자 증폭방법은 PCR법에 한정되지 않는다. 프라이머의 특이성에 기초한 특이증폭방법 또는 증폭의 특이적 저해방법에서도 사용될 수 있다. 또한, 특이증폭 프라이머와 표지특이 탐침의 조합에 의한 정량증폭반응에도 사용할 수 있다. 아울러, 본 발명의 탐침 서열은 단독으로도 사용할 수 있다. 전기 사용방법은 고체상 또는 액체상에 한정되지 않는다. 사이버 그린(cyber green) 등과 같은 증폭한 이중사슬 DNA를 검출하는 시약을 사용하여 수행하는 실시간 PCR(real time PCR)이나 FRET 등을 응용한 실시간 PCR을 수행할 때의 프라이머 및 탐침으로도 이용할 수 있다.

본 발명에서 수득된 염기서열의 계통간 특이성 정보(참조: 도 2, 3 및 4)를 이용함으로써, 고특이성을 가지는 탐침 및 고특이성을 가질 뿐만 아니라 증폭효율이 우수한 유전자 증폭용 프라이머를 설계할 수 있게 되었다. 본 발명에서 수득된 비브리오 콜레라 또는 비브리오 미미쿠스 특이적 염기 정보(참조: 도 2, 3 및 4)를 기초로 작성한 PCR 프라이머의 서열을 표 2에 표시하였다.

표 2: V. cholerae, V. mimicus 특이검출용 프라이머

또한, 계통군에 관한 정보를 확보하고 있으므로, 해석한 서열상의 거의 전장에 대한 특이 프라이머 또는 탐침을 설계하는 것이 가능하다.

본 명세서는 본원의 우선권의 기초인 일본국 특허출원 제 2002-362878호의 명세서 및/또는 도면에 기재된 내용을 포함한다.

발명을 실시하기 위한 최량의 형태

이하, 본 발명을 실시예에 따라 상세하게 설명한다. 실시예는 하나의 형태이며, 본 발명은 이들의 실시예에 한정되지 않는다.

실시예 1

비브리오 콜레라 및 비브리오 미미쿠스에 특이적인 영역을 이용하여 설계함으로써, 본 발명에 따라 수득된, 표 2에 도시된 유전자 증폭용 프라이머를 사용한 실시예를 나타낸다.

또한, 청구항 5의 (2), 청구항 5의 (3), 청구항 11의 (2) 및 청구항 11의 (7)에 기재된 프라이머는 각각 표 2 중의 CMgF, CMgR, CMrF 및 CMrR에 해당된다. 시험균주로부터 추출한 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR을 수행하였다. PCR은 AmpliTaq Gold(Applied Biosystems사 제품)를 이용하였고, 최종부피 20㎕의 반응액으로 수행하였다. 반응조건은 95℃ㆍ10분의 가열 후에 94℃ㆍ1분, 어닐링(어닐링 온도는 표 5 참조) 1분, 72℃ㆍ1분의 반응을 35사이클 수행한 후에, 마지막으로 72℃ㆍ10분간의 신장반응을 수행하였다. 반응 후의 샘플은 1% 아가로스젤로 전기영동한 후, 브롬화에티듐으로 염색하고, 자외선 조사 하에서 유전자의 증폭유무를 확인하였다. gyrB 유전자를 표적으로 한 CMgF와 CMgR, rpoD 유전자를 표적으로 한 CMrF와 CMrR의 어느 것의 조합을 사용하여도, 비브리오 콜레라 및 비브리오 미미쿠스에 속한다고 확인된 균주유래의 DNA에서만 증폭산물이 발견되었다(참조: 표 6).

실시예 2

비브리오 콜레라 및 비브리오 미미쿠스에 특이적인 영역을 이용하여 설계함으로써, 본 발명에 따라 수득된, 표 3, 4에 도시된 유전자 증폭용 프라이머를 사용한 실시예를 나타낸다.

또한, 청구항 19의 (1), 청구항 19의 (3), 청구항 19의 (4), 청구항 19의 (5), 청구항 25의 (1) 및 청구항 25의 (14)에 기재된 프라이머는 비브리오 콜레라 특이적 프라이머이고, 각각 표 3 중의 CF1, CF2, CR2, CR1, CrF1 및 CrR1에 해당되며, 또한, 청구항 33의 (1), 청구항 33의 (3), 청구항 33의 (4), 청구항 33의 (5), 청구항 39의 (7) 및 청구항 39의 (13)에 기재된 프라이머는 비브리오 미미쿠스 특이적 프라이머이고 각각 표 4 중의 MF1, MF2, MR2, MR1, MrF1 및 MrR1에 해당된다.

전기 실시예 1과 같이, 시험균주로부터 추출한 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR을 수행하였다(어닐링 온도는 표 5 참조). 어느 경우에서도, 비브리오 콜레라에 특이적인 프라이머는 비브리오 콜레라에서만, 비브리오 미미쿠스에 특이적인 프라이머는 비브리오 미미쿠스에서만 증폭산물이 검출되었다(참조: 표 6).

표 3: V. cholerae 특이검출용 프라이머

표 4: V. mimicus 특이검출용 프라이머

표 5: V. cholerae, V. mimicus 특이검출용 프라이머 - PCR 조건

표 6:

본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허출원을 그대로 참고하여 본 명세서에 도입하는 것으로 한다.

본 발명의 gyrB 및 rpoD 유전자 프라이머 및 탐침은 비브리오 콜레라 및 비브리오 미미쿠스의 계통관계를 파악한 다음에 설계한 것이기 때문에, 특이성을 향상시키는 검토가 이루어져 있어서 검출 정밀도라는 점에서 우수하다. 따라서, 식품, 임상검체 등으로부터 균을 단리하지 않고, 근연세균종이 협잡하고 있는 상황에서 직접 검출하는 경우에 유리하다.

<110> Nichirei Corporation <120> Primers and probes for detection of vibrio cholera or vibrio mimicus and method of using thereof <130> PH-1967-PCT <150> JP2002/362878 <151> 2002-12-13 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 885 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence of vibrio cholera and vibrio mimicus -gyrB <400> 1 gtmtccggyg gtctrcacgg ggtaggtgtg tcggtrgtka aygcsctbtc wgaaaaagtg 60 ctrctbacca tytatcgygg yggcaaraty caywcscaaa cttaccatca yggtgtgcca 120 caagcaccgt tgkctgtrgt rggtgakacw gagcgtaccg gtactaccgt acgtttctgg 180 ccwagygcac aracytttac caatatcgaa ttycattacg acattytggc taaacgyctg 240 cgtgagctgt cattcctgaa ytctggcgtg tcgatcaagc tgaysgatga rcgtgaagaa 300 gataaraaag accacttyat gtatgaaggk ggtattcaag cgtttgtkac ccacttgaac 360 cgyaayaaaa cgccratcca tgaraaagtm ttccacttya accaagagcg tgaagatggc 420 atcagcgtgg aagtggcrat gcagtggaay gatggtttcc aagaaaacat ctactgcttt 480 acyaacaaca tyccacagcg tgatggyggt acccayttag cyggtttccg tggtgcrttg 540 acccgtactt tgaacaacta yatggayaaa gaaggcttct cgaagaaagc scaagcrgca 600 acctcgggtg atgatgcgcg tgaaggctta acrgcdgtkg tdtcggtgaa agtrccrgat 660 cctaaattct cragccaaac caaagataag ctrgtttctt cggargtraa atccgcrgtt 720 gartcagcya tgaatgagaa gctggcrgat ttcctrgcgg aaaacccaag cgaagcgaaa 780 aacgtttgtt cgaagattat tgatgcrgcr cghgckcgtg aagcvgcgcg taaagcmcgk 840 gaaatgacyc gycgtaaagg cgcgytrgay ythgcwggyt trcch 885 <210> 2 <211> 822 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence of vibrio cholera and vibrio mimicus -rpoD <400> 2 acacgtgaag gygaaatcga tattgccaag cgcattgaag atggtattaa ccaagttcaa 60 agtgcgattg ctgagtatcc tggaaccatc ccwtayattc ttgarcagtt tgaymrkgtt 120 caggcmgaag arctacgtct sactgayctg atttcwggtt tcgttgaycc taacgacatg 180 gaaaccgaag cgccaacygc kactcacatc ggttcwgarc tytctgaagc sgatctcgck 240 gatgaagatg aygmkgtcgy sgargatgaa gacgargatg aagaygaaga yggcgacggt 300 gaaagyagcg acagcgaaga agaagtsggt atygaccctg arctsgctcg tgagaaattc 360 aatgaactgc gcggyaagtt ccaaaacctg caattagcgg ttaatgaatt tggtcgtgac 420 agtmaycaag cwtctgaagc ktcarrcytr gtrytggata tyttccgyga attccgycta 480 acaccaaarc aattygacca yttggttgaa actctgcgya cytcratgga tcgtgttcgy 540 acccaagarc gyttggtrat gaaagcvgtr gttgaagtcg cgaaratgcc raagaaatcr 600 ttyatygcyc trtttacagg caatgaatcg aatgargart ggctbgataa agtvctygct 660 tctgayaarc cttaygtasm raaagtmcgt gagcaagaag amgakatycg ccgytcaaty 720 caraaactdc aratgatcga rcargagacw tcactgtctg ttgarcgyat caaagacatc 780 agccgtcgta tgtcwatcgg tgargcraaa gctcgccgtg cg 822 <210> 3 <211> 822 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence vibrio cholera-gyrB <400> 3 acacgtgaag gygaaatcga tattgccaag cgcattgaag atggtattaa ccaagttcaa 60 agtgcgattg ctgagtatcc tggaaccatc ccwtayattc ttgarcagtt tgaymrkgtt 120 caggcmgaag arctacgtct sactgayctg atttcwggtt tcgttgaycc taacgacatg 180 gaaaccgaag cgccaacygc kactcacatc ggttcwgarc tytctgaagc sgatctcgck 240 gatgaagatg aygmkgtcgy sgargatgaa gacgargatg aagaygaaga yggcgacggt 300 gaaagyagcg acagcgaaga agaagtsggt atygaccctg arctsgctcg tgagaaattc 360 aatgaactgc gcggyaagtt ccaaaacctg caattagcgg ttaatgaatt tggtcgtgac 420 agtmaycaag cwtctgaagc ktcarrcytr gtrytggata tyttccgyga attccgycta 480 acaccaaarc aattygacca yttggttgaa actctgcgya cytcratgga tcgtgttcgy 540 acccaagarc gyttggtrat gaaagcvgtr gttgaagtcg cgaaratgcc raagaaatcr 600 ttyatygcyc trtttacagg caatgaatcg aatgargart ggctbgataa agtvctygct 660 tctgayaarc cttaygtasm raaagtmcgt gagcaagaag amgakatycg ccgytcaaty 720 caraaactdc aratgatcga rcargagacw tcactgtctg ttgarcgyat caaagacatc 780 agccgtcgta tgtcwatcgg tgargcraaa gctcgccgtg cg 822 <210> 4 <211> 822 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence of vibrio cholera -rpoD <400> 4 acacgtgaag gtgaaatcga tattgccaag cgcattgaag atggtattaa ccaagttcaa 60 agtgcgattg ctgagtatcc tggaaccatc ccttatattc ttgagcagtt tgatcgtgtt 120 caggccgaag agctacgtct cactgacctg atttcaggtt tcgttgaycc taacgacatg 180 gaaaccgaag cgccaaccgc gactcacatc ggttctgagc tttctgaagc ggatctcgcg 240 gatgaagatg atgctgtcgt cgaagatgaa gacgaagatg aagacgaaga tggcgacggt 300 gaaagcagcg acagcgaaga agaagtcggt atcgaccctg aactggctcg tgagaaattc 360 aatgaactgc gcggyaagtt ccaaaacctg caattagcgg ttaatgaatt tggtcgtgac 420 agtcatcaag cttctgaagc gtcagactta gtgytggata tcttccgtga attccgycta 480 acaccaaagc aattcgacca cttggttgaa actctgcgca cttcaatgga tcgtgttcgc 540 acccaagaac gtttggtrat gaaagcggta gttgaagtcg cgaagatgcc gaagaaatcg 600 ttcatcgccc tatttacagg caatgaatcg aatgaagagt ggctggataa agtccttgct 660 tctgacaagc cttacgtagc gaaagtccgt gagcaagaag aagagatccg ccgttcaatt 720 cagaaactac aaatgatcga gcaagagaca tcactgtctg ttgaacgcat caaagacatc 780 agccgtcgta tgtcaatcgg tgaggcraaa gctcgccgtg cg 822 <210> 5 <211> 885 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence of vibrio mimicus -gyrB <400> 5 gtctccggtg gtctacacgg ggtaggtgtg tcggtagtga atgccctgtc agaaaaagtg 60 ctgctbacca tttatcgtgg tggcaagatt cacacccaaa cttaccatca cggtgtgcca 120 caagcaccgt tgtctgtrgt gggtgagact gagcgtaccg gtactaccgt acgtttctgg 180 cctagtgcac agacttttac caatatcgaa ttccattacg acattctggc taaacgyctg 240 cgtgagctgt cattcctgaa ctctggcgtg tcgatcaagc tgacggatga gcgtgaagaa 300 gataagaaag accacttyat gtatgaaggt ggtattcaag cgtttgtkac ccacttgaac 360 cgtaayaaaa cgccgatcca tgaaaaagta ttccacttca accaagagcg tgaagatggc 420 atcagcgtgg aagtggcaat gcagtggaac gatggtttcc aagaaaacat ctactgcttt 480 accaacaaca tyccacagcg tgatggcggt acccacttag cyggtttccg tggtgcrttg 540 acccgtactt tgaacaacta catggacaaa gaaggcttct cgaagaaagc scaagcrgca 600 acctcgggtg atgatgcgcg tgaaggctta acrgcrgtkg tktcggtgaa agtrccrgat 660 cctaaattct cragccaaac caaagataag ctrgtttctt cggargtgaa atccgcggtt 720 gagtcagcca tgaatgagaa gctggcggat ttcctggcgg aaaacccaag cgaagcgaaa 780 aacgtttgtt cgaagattat tgatgcrgcr cghgctcgtg aagcvgcgcg taaagcacgt 840 gaaatgacyc gtcgtaaagg cgcgctagay ytmgctggtt tgccw 885 <210> 6 <211> 822 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence of vibrio mimicus -rpoD <400> 6 acacgtgaag gcgaaatcga tattgccaag cgcattgaag atggtattaa ccaagttcaa 60 agtgcgattg ctgagtatcc tggaaccatc ccatacattc ttgaacagtt tgacaaggtt 120 caggcagaag aactacgtct gactgayctg atttctggtt tcgttgatcc taacgacatg 180 gaaaccgaag cgccaactgc tactcacatc ggttcagarc tctctgaagc cgatctcgct 240 gatgaagatg acgaggtcgc ggaggatgaa gacgaggatg aagatgaaga cggcgacggt 300 gaaagyagcg acagcgaaga agaagtgggt attgaccctg agctcgctcg tgagaaattc 360 aatgaactgc gcggcaagtt ccaaaacctg caattagcgg ttaatgaatt tggtcgtgac 420 agtaaccaag catctgaagc ttcaagcctg gtactggata tyttccgcga attccgccta 480 acaccaaaac aatttgacca tttggttgaa actctgcgta cctcgatgga tcgtgttcgt 540 acccaagagc gyttggtgat gaaagcvgtg gttgaagtcg cgaaaatgcc aaagaaatca 600 tttattgcyc trtttacagg caatgaatcg aatgargaat ggctygataa agtrctcgct 660 tctgataarc cttatgtaca aaaagtacgt gagcaagaag acgatattcg ccgctcaatc 720 caaaaactkc agatgatcga acargagact tcactgtctg ttgagcgtat caaagacatc 780 agccgtcgta tgtctatcgg tgaagcgaaa gctcgccgtg cg 822

Claims

서열번호 1로 표시되는 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae) 및 비브리오 미미쿠스(Vibrio mimicus) 균군에 특유한 DNA 자이라제(gyrase) β 서브유닛을 암호화하는 유전자(gyrB)의 위치번호(염기번호라고도 명명) 21, 96, 107, 126, 153, 190, 258, 270, 279, 285, 357, 543, 552, 557, 600, 690, 702, 714, 729, 733, 734, 759, 771, 782, 786, 792, 795 또는 885 중 하나 이상의 염기를 포함하는 특이적인 유전자 증폭 프라이머 또는 탐침의 설계에 이용할 수 있는, 서열번호 1로 표시되는 DNA 자이라제 β 서브유닛을 암호화하는 유전자(gyrB)의 단편.
제 1항에 기재된 단편을 포함하는 서열번호 1의 DNA 자이라제(gyrase) β 서브유닛을 암호화하는 유전자(gyrB) 중에서, 비브리오 콜레라 및 비브리오 미미쿠스 균군에 특유한 다음의 위치번호 21, 96, 107, 126, 153, 190, 258, 270, 279, 285, 357, 543, 552, 557, 600, 690, 702, 714, 729, 733, 734, 759, 771, 782, 786, 792, 795 또는 885 중 하나 이상의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상을 포함하는 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머.
제 2항에 있어서,

제 1항에서 지정된 비브리오 콜레라 및 비브리오 미미쿠스 균군에 특 유한 위치를 2개 이상의 고빈도로 포함하는 영역을 이용하는 것을 특 징으로 하는

유전자 증폭 프라이머.
제 2항에 있어서,

3' 말단의 염기가 상기 비브리오 콜레라 및 비브리오 미미쿠스 균군에 특유한 제 1항에서 특정된 위치번호의 염기인 것을 특징으로 하는

유전자 증폭 프라이머.
제 2항에 있어서,

유전자 증폭 프라이머가

(1) 5'-tycaywcscaaacttacca-3' 또는 대응하는 상보사슬,

(2) 5'-gaaytctggcgtgtcgatcaag-3' 또는 대응하는 상보사슬,

(3) 5'-catrtagttgttcaaagtacgg-3' 또는 대응하는 상보사슬,

(4) 5'-ggatttyacytccgaagaaacyagc-3' 또는 대응하는 상보사슬,

(5) 5'-ygccagcttctcattcatr-3' 또는 대응하는 상보사슬,

(6) 5'-cgcttcgcttgggttttcc-3' 또는 대응하는 상보사슬,

(7) 5'-caataatcttcgaacaaacgt-3' 또는 대응하는 상보사슬 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는

유전자 증폭 프라이머.
서열번호 1의 DNA 자이라제(gyrase) β 서브유닛을 암호화하는 유전자(gyrB) 중에서, 비브리오 콜레라 및 비브리오 미미쿠스 균군에 특유한 다음의 위치번호 21, 96, 107, 126, 153, 190, 258, 270, 279, 285, 357, 543, 552, 557, 600, 690, 702, 714, 729, 733, 734, 759, 771, 782, 786, 792, 795 또는 885 중 하나 이상의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상을 포함하는 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 비브리오 콜레라 및 비브리오 미미쿠스 검출, 정량 또는 동정용 탐침.
서열번호 2의 RNA 중합효소 σ70 인자를 암호화하는 유전자(rpoD) 중에서, 비브리오 콜레라 및 비브리오 미미쿠스 균군에 특유한 다음의 위치번호 3, 27, 66, 67, 75, 90, 117, 123, 141, 144, 177, 178, 180, 186, 223, 227, 228, 231, 250, 251, 255, 257, 259, 264, 300, 301, 302, 303, 305, 313, 314, 350, 351, 362, 369, 373, 374, 380, 390, 400, 402, 409, 410, 415, 416, 423, 427, 433, 444, 447, 504, 510, 513, 543, 556, 558, 618, 638, 649, 663, 685, 711, 747, 757, 762, 763 또는 789 중 하나 이상의 염기를 포함하는 특이적인 유전자 증폭 프라이머 또는 탐침의 설계에 이용할 수 있는 서열번호 2로 표시되는 유전자 단편.
서열번호 2의 RNA 중합효소 σ70 인자를 암호화하는 유전자(rpoD) 중에서, 비브리오 콜레라 및 비브리오 미미쿠스 균군에 특유한 다음의 위치번호 3, 27, 66, 67, 75, 90, 117, 123, 141, 144, 177, 178, 180, 186, 223, 227, 228, 231, 250, 251, 255, 257, 259, 264, 300, 301, 302, 303, 305, 313, 314, 350, 351, 362, 369, 373, 374, 380, 390, 400, 402, 409, 410, 415, 416, 423, 427, 433, 444, 447, 504, 510, 513, 543, 556, 558, 618, 638, 649, 663, 685, 711, 747, 757, 762, 763 또는 789 중 하나 이상의 염기를 포함하며 연속하는 15 염기 이상을 포함하는 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머.
제 8항에 있어서,

제 8항에서 지정된 비브리오 콜레라 및 비브리오 미미쿠스 균군에 특 유한 위치를 2개 이상의 고빈도로 포함하는 영역을 이용하는 것을 특 징으로 하는

유전자 증폭 프라이머.
제 8항에 있어서,

3' 말단의 염기가 상기 비브리오 콜레라 및 비브리오 미미쿠스 균군에 특유한 제 8항에서 특정된 위치번호의 염기인 것을 특징으로 하는

유전자 증폭 프라이머.
제 8항에 있어서,

유전자 증폭 프라이머가

(1) 5'-gattgctgagtatcctggaaccatc-3' 또는 대응하는 상보사슬,

(2) 5'-gaycctaacgacatggaaacc-3' 또는 대응하는 상보사슬,

(3) 5'-ttcwgarctytctgaagcs-3' 또는 대응하는 상보사슬,

(4) 5'-agatgaygmkgtcgysgar-3' 또는 대응하는 상보사슬,

(5) 5'-cgacggtgaaagyagcgacag-3' 또는 대응하는 상보사슬,

(6) 5'-caatgaactgcgcggyaagtt-3' 또는 대응하는 상보사슬,

(7) 5'-gtcacgaccaaattcattaac-3' 또는 대응하는 상보사슬,

(8) 5'-gyytgamgcttcagawgcttgrtka-3' 또는 대응하는 상보사슬,

(9) 5'-ygargtrcgcagagtttcaacc-3' 또는 대응하는 상보사슬,

(10) 5'-catyaccaarcgytcttgg-3' 또는 대응하는 상보사슬,

(11) 5'-cgytcaacagacagtgawgtc-3' 또는 대응하는 상보사슬 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는

유전자 증폭 프라이머.
서열번호 2의 RNA 중합효소 σ70 인자를 암호화하는 유전자(rpoD) 중에서, 비브리오 콜레라 및 비브리오 미미쿠스 균군에 특유한 다음의 위치번호 3, 27, 66, 67, 75, 90, 117, 123, 141, 144, 177, 178, 180, 186, 223, 227, 228, 231, 250, 251, 255, 257, 259, 264, 300, 301, 302, 303, 305, 313, 314, 350, 351, 362, 369, 373, 374, 380, 390, 400, 402, 409, 410, 415, 416, 423, 427, 433, 444, 447, 504, 510, 513, 543, 556, 558, 618, 638, 649, 663, 685, 711, 747, 757, 762, 763 또는 789 중 하나 이상의 염기를 포함하며 연속하는 15 염기 이상을 포함하는 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 비브리오 콜레라 및 비브리오 미미쿠스 균군의 검출, 정량 또는 동정용 탐침.
제 2항 내지 제 6항 또는 제 8항 내지 제 12항의 어느 한 항에 기재된 프라이머 또는 탐침을 이용하여 비브리오 콜레라 및 비브리오 미미쿠스 균군을 검출, 정량 또는 동정하는 방법.
제 2항 내지 제 6항 또는 제 8항 내지 제 12항의 어느 한 항에 기재된 프라이머 또는 탐침을 이용하여 비브리오 콜레라 및 비브리오 미미쿠스 균군을 검출, 정량 또는 동정하는 키트.
서열번호 3의 DNA 자이라제(gyrase) β 서브유닛을 암호화하는 유전자(gyrB) 중에서, 비브리오 콜레라 균군에 특유한 다음의 위치번호 15, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 90, 111, 133, 226, 285, 291, 306, 330, 384, 390, 399, 507, 708, 756, 837, 867, 873, 879, 882 또는 885 중 하나 이상의 염기를 포함하는 특이적인 유전자 증폭 프라이머 또는 탐침의 설계에 이용할 수 있는 서열번호 3으로 표시되는 유전자 단편.
서열번호 3의 DNA 자이라제(gyrase) β 서브유닛을 암호화하는 유전자(gyrB) 중에서, 비브리오 콜레라 균군에 특유한 다음의 위치번호 15, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 90, 111, 133, 226, 285, 291, 306, 330, 384, 390, 399, 507, 708, 756, 837, 867, 873, 879, 882 또는 885 중 하나 이상의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상을 포함하는 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머.
제 16항에 있어서,

3' 말단의 염기가 비브리오 콜레라 균군에 특유한 제 16항에서 특정된 위치번호의 염기인 것을 특징으로 하는

유전자 증폭 프라이머.
제 16항에 있어서,

제 16항에서 지정된 비브리오 콜레라 균군에 특유한 위치를 2개 이상 의 고빈도로 포함하는 영역을 이용하는 것을 특징으로 하는

유전자 증폭 프라이머.
제 16항에 있어서,

유전자 증폭 프라이머가

(1) 5'-ggtggttaacgcgctytct-3' 또는 대응하는 상보사슬,

(2) 5'-ycgatgaacgtgaagaagataaa-3' 또는 대응하는 상보사슬,

(3) 5'-tgagaaagtcttccacttt-3' 또는 대응하는 상보사슬,

(4) 5'-gttaaagtggaagactttc-3' 또는 대응하는 상보사슬,

(5) 5'-gggtaagccwgcaagatcc-3' 또는 대응하는 상보사슬 중 하나 이 상을 포함하는 것을 특징으로 하는

유전자 증폭 프라이머.
서열번호 3의 DNA 자이라제(gyrase) β 서브유닛을 암호화하는 유전자(gyrB) 중에서, 비브리오 콜레라 균군에 특유한 다음의 위치번호 15, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 90, 111, 133, 226, 285, 291, 306, 330, 384, 390, 399, 507, 708, 756, 837, 867, 873, 879, 882 또는 885 중 하나 이상의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상을 포함하는 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 비브리오 콜레라 균군의 검출, 정량 또는 동정용 탐침.
서열번호 4의 RNA 중합효소 σ70 인자를 암호화하는 유전자(rpoD) 중에서, 비브리오 콜레라 균군에 특유한 다음의 위치번호 12, 93, 96, 105, 114, 115, 116, 117, 126, 132, 141, 156, 198, 201, 216, 222, 231, 240, 252, 254, 255, 260, 261, 264, 276, 285, 291, 327, 333, 342, 345, 424, 426, 432, 441, 445, 446, 448, 450, 453, 468, 489, 495, 501, 519, 522, 525, 540, 549, 570, 585, 591, 600, 603, 606, 639, 645, 654, 657, 666, 675, 679, 680, 681, 687, 702, 705, 708, 714, 720, 723, 729, 732, 741, 750, 765, 768, 795 또는 804 중 하나 이상의 염기를 포함하는 특이적인 유전자 증폭 프라이머 또는 탐침의 설계에 이용할 수 있는 서열번호 4로 표시되는 유전자 단편.
서열번호 4의 RNA 중합효소 σ70 인자를 암호화하는 유전자(rpoD) 중에서, 비브리오 콜레라 균군에 특유한 다음의 위치번호 12, 93, 96, 105, 114, 115, 116, 117, 126, 132, 141, 156, 198, 201, 216, 222, 231, 240, 252, 254, 255, 260, 261, 264, 276, 285, 291, 327, 333, 342, 345, 424, 426, 432, 441, 445, 446, 448, 450, 453, 468, 489, 495, 501, 519, 522, 525, 540, 549, 570, 585, 591, 600, 603, 606, 639, 645, 654, 657, 666, 675, 679, 680, 681, 687, 702, 705, 708, 714, 720, 723, 729, 732, 741, 750, 765, 768, 795 또는 804 중 하나 이상의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상을 포함하는 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머.
제 22항에 있어서,

3' 말단의 염기가 상기 비브리오 콜레라 균군에 특유한 제 22항에서 특정된 위치번호의 염기인 것을 특징으로 하는

유전자 증폭 프라이머.
제 22항에 있어서,

제 22항에서 지정된 비브리오 콜레라 균군에 특유한 위치를 2개 이상 의 고빈도로 포함하는 영역을 이용하는 것을 특징으로 하는

유전자 증폭 프라이머.
제 22항에 있어서,

유전자 증폭 프라이머가

(1) 5'-attcttgagcagtttgatcgt-3' 또는 대응하는 상보사슬,

(2) 5'-caggccgaagagctacgtctc-3' 또는 대응하는 상보사슬,

(3) 5'-tgagctttctgaagcggatctcgcg-3' 또는 대응하는 상보사슬,

(4) 5'-gaagatgatgctgtcgtcgaa-3' 또는 대응하는 상보사슬,

(5) 5'-gaagatgaagacgaagat-3' 또는 대응하는 상보사슬,

(6) 5'-cggtatcgaccctgaactg-3' 또는 대응하는 상보사슬,

(7) 5'-catcaagcttctgaagcgtcaga-3' 또는 대응하는 상보사슬,

(8) 5'-acggaagatatccarcactaa-3' 또는 대응하는 상보사슬,

(9) 5'-tcaaccaagtggtcgaattgc-3' 또는 대응하는 상보사슬,

(10) 5'-gcgaacacgatccattgaagtg-3' 또는 대응하는 상보사슬,

(11) 5'-gatgaacgatttcttcggcatc-3' 또는 대응하는 상보사슬,

(12) 5'-aaggactttatccagccac-3' 또는 대응하는 상보사슬,

(13) 5'-ttcttcttgctcacggactttcgc-3' 또는 대응하는 상보사슬,

(14) 5'-ttctgaattgaacggcggatc-3' 또는 대응하는 상보사슬,

(15) 5'-tgtctcttgctcgatcatttgt-3' 또는 대응하는 상보사슬 중 하 나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는

유전자 증폭 프라이머.
서열번호 4의 RNA 중합효소 σ70 인자를 암호화하는 유전자(rpoD) 중에서, 비브리오 콜레라 균군에 특유한 다음의 위치번호 12, 93, 96, 105, 114, 115, 116, 117, 126, 132, 141, 156, 198, 201, 216, 222, 231, 240, 252, 254, 255, 260, 261, 264, 276, 285, 291, 327, 333, 342, 345, 424, 426, 432, 441, 445, 446, 448, 450, 453, 468, 489, 495, 501, 519, 522, 525, 540, 549, 570, 585, 591, 600, 603, 606, 639, 645, 654, 657, 666, 675, 679, 680, 681, 687, 702, 705, 708, 714, 720, 723, 729, 732, 741, 750, 765, 768, 795 또는 804 중 하나 이상의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상을 포함하는 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 비브리오 콜레라 균군의 검출, 정량 또는 동정용 탐침.
제 16항 내지 제 20항 또는 제 22항 내지 제 26항의 어느 한 항에 기재된 프라이머 또는 탐침을 이용하여 비브리오 콜레라 균군을 검출, 정량 또는 동정하는 방법.
제 16항 내지 제 20항 또는 제 22항 내지 제 26항의 어느 한 항에 기재된 프라이머 또는 탐침을 이용하여 비브리오 콜레라 균군을 검출, 정량 또는 동정하는 키트.
서열번호 5의 DNA 자이라제(gyrase) β 서브유닛을 암호화하는 유전자(gyrB) 중에서, 비브리오 미미쿠스 균군에 특유한 다음의 위치번호 15, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 90, 111, 133, 226, 285, 291, 306, 330, 384, 390, 399, 507, 708, 756, 837, 867, 873, 879, 882 또는 885 중 하나 이상의 염기를 포함하는 특이적인 유전자 증폭 프라이머 또는 탐침의 설계에 이용할 수 있는 서열번호 5로 표시되는 유전자 단편.
서열번호 3의 DNA 자이라제(gyrase) β 서브유닛을 암호화하는 유전자(gyrB) 중에서, 비브리오 미미쿠스 균군에 특유한 다음의 위치번호 15, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 90, 111, 133, 226, 285, 291, 306, 330, 384, 390, 399, 507, 708, 756, 837, 867, 873, 879, 882 또는 885 중 하나 이상의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상을 포함하는 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머.
제 30항에 있어서,

제 30항에서 지정된 비브리오 미미쿠스 균군에 특유한 위치를 2개 이 상의 고빈도로 포함하는 영역을 이용하는 것을 특징으로 하는

유전자 증폭 프라이머.
제 30항에 있어서,

3' 말단의 염기가 상기 비브리오 미미쿠스 균군에 특유한 제 31항에서 특정된 위치번호의 염기인 것을 특징으로 하는

유전자 증폭 프라이머.
제 30항에 있어서,

유전자 증폭 프라이머가

(1) 5'-ggtagtgaatgccctgtca-3' 또는 대응하는 상보사슬,

(2) 5'-cggatgagcgtgaagaagataag-3' 또는 대응하는 상보사슬,

(3) 5'-tgaaaaagtattccacttc-3' 또는 대응하는 상보사슬,

(4) 5'-gttgaagtggaatactttt-3' 또는 대응하는 상보사슬,

(5) 5'-wggcaaaccagckarrtct-3' 또는 대응하는 상보사슬 중 하나 이 상을 포함하는 것을 특징으로 하는

유전자 증폭 프라이머.
서열번호 5의 DNA 자이라제(gyrase) β 서브유닛을 암호화하는 유전자(gyrB) 중에서, 비브리오 미미쿠스 균군에 특유한 다음의 위치번호 15, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 90, 111, 133, 226, 285, 291, 306, 330, 384, 390, 399, 507, 708, 756, 837, 867, 873, 879, 882 또는 885 중 하나 이상의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상을 포함하는 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 비브리오 미미쿠스 균군의 검출, 정량 또는 동정용 탐침.
서열번호 6의 RNA 중합효소 σ70 인자를 암호화하는 유전자(rpoD) 중에서, 비브리오 미미쿠스 균군에 특유한 다음의 위치번호 12, 93, 96, 105, 114, 115, 116, 117, 126, 132, 141, 156, 198, 201, 216, 222, 231, 240, 252, 254, 255, 260, 261, 264, 276, 285, 291, 327, 333, 342, 345, 424, 426, 432, 441, 445, 446, 448, 450, 453, 468, 489, 495, 501, 519, 522, 525, 540, 549, 570, 585, 591, 600, 603, 606, 639, 645, 654, 657, 666, 675, 679, 680, 681, 687, 702, 705, 708, 714, 720, 723, 729, 732, 741, 750, 765, 768, 795 또는 804 중 하나 이상의 염기를 포함하는 특이적인 유전자 증폭 프라이머 또는 탐침의 설계에 이용할 수 있는 서열번호 6으로 표시되는 유전자 단편.
서열번호 6의 RNA 중합효소 σ70 인자를 암호화하는 유전자(rpoD) 중에서, 비브리오 미미쿠스 균군에 특유한 다음의 위치번호 12, 93, 96, 105, 114, 115, 116, 117, 126, 132, 141, 156, 198, 201, 216, 222, 231, 240, 252, 254, 255, 260, 261, 264, 276, 285, 291, 327, 333, 342, 345, 424, 426, 432, 441, 445, 446, 448, 450, 453, 468, 489, 495, 501, 519, 522, 525, 540, 549, 570, 585, 591, 600, 603, 606, 639, 645, 654, 657, 666, 675, 679, 680, 681, 687, 702, 705, 708, 714, 720, 723, 729, 732, 741, 750, 765, 768, 795 또는 804 중 하나 이상의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상을 포함하는 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 유전자 증폭 프라이머.
제 36항에 있어서,

제 36항에서 지정된 비브리오 미미쿠스 균군에 특유한 위치를 2개 이 상의 고빈도로 포함하는 영역을 이용하는 것을 특징으로 하는

유전자 증폭 프라이머.
제 36항에 있어서,

3' 말단의 염기가 상기 비브리오 미미쿠스 균군에 특유한 제 36항에서 특정된 위치번호의 염기인 것을 특징으로 하는

유전자 증폭 프라이머.
제 36항에 있어서,

유전자 프라이머가

(1) 5'-cattcttgaacagtttgacaag-3' 또는 대응하는 상보서열,

(2) 5'-caggcagaagaactacgtctg-3' 또는 대응하는 상보서열,

(3) 5'-agarctctctgaagccgatctcgct-3' 또는 대응하는 상보서열,

(4) 5'-gaagatgacgaggtcgcggag-3' 또는 대응하는 상보서열,

(5) 5'-gaggatgaagatgaagac-3' 또는 대응하는 상보서열,

(6) 5'-gggtattgaccctgagctc-3' 또는 대응하는 상보서열,

(7) 5'-taacaaagcatctgaagcttcaag-3' 또는 대응하는 상보서열,

(8) 5'-gcggaaratatccagtaccag-3' 또는 대응하는 상보서열,

(9) 5'-tcaaccaaatggtcaaattgt-3' 또는 대응하는 상보서열,

(10) 5'-acgaacacgatccatcgaggta-3' 또는 대응하는 상보서열,

(11) 5'-aataaatgatttctttggcatt-3' 또는 대응하는 상보서열,

(12) 5'-gagyactttatcragccat-3' 또는 대응하는 상보서열,

(13) 5'-gtcttcttgctcacgtactttttg-3' 또는 대응하는 상보서열,

(14) 5'-ttggattgaagggcgaata-3' 또는 대응하는 상보서열,

(15) 5'-agtctcytgttcgatcatctgm-3' 또는 대응하는 상보서열 중 하 나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는

유전자 증폭 프라이머.
서열번호 6의 RNA 중합효소 σ70 인자를 암호화하는 유전자(rpoD) 중에서, 비브리오 미미쿠스 균군에 특유한 다음의 위치번호 12, 93, 96, 105, 114, 115, 116, 117, 126, 132, 141, 156, 198, 201, 216, 222, 231, 240, 252, 254, 255, 260, 261, 264, 276, 285, 291, 327, 333, 342, 345, 424, 426, 432, 441, 445, 446, 448, 450, 453, 468, 489, 495, 501, 519, 522, 525, 540, 549, 570, 585, 591, 600, 603, 606, 639, 645, 654, 657, 666, 675, 679, 680, 681, 687, 702, 705, 708, 714, 720, 723, 729, 732, 741, 750, 765, 768, 795 또는 804 중 하나 이상의 염기를 포함하며 연속하는 15염기 이상을 포함하는 사슬 또는 그의 상보사슬을 포함하는 비브리오 미미쿠스 균군의 검출, 정량 또는 동정용 탐침.
제 30항 내지 제 34항 또는 제 36항 내지 제 40항 중 어느 한 항에 기재된 프라이머 또는 탐침을 이용하여 비브리오 미미쿠스 균군을 검출, 정량 또는 동정하는 방법.
제 30항 내지 제 34항 또는 제 36항 내지 제 40항 중 어느 한 항에 기재된 프라이머 또는 탐침을 이용하여 비브리오 미미쿠스 균군을 검출, 정량 또는 동정하는 키트.