JPH08256798A - ＲＮＡポリメレースσ因子遺伝子の塩基配列を用いた細菌の同定・検出法 - Google Patents
ＲＮＡポリメレースσ因子遺伝子の塩基配列を用いた細菌の同定・検出法Info
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- JPH08256798A JPH08256798A JP7070096A JP7009695A JPH08256798A JP H08256798 A JPH08256798 A JP H08256798A JP 7070096 A JP7070096 A JP 7070096A JP 7009695 A JP7009695 A JP 7009695A JP H08256798 A JPH08256798 A JP H08256798A
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- JP
- Japan
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- base sequence
- rna polymerase
- bacteria
- factor gene
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 ＲＮＡポリメレースσ因子遺伝子の核酸塩基
配列を指標として細菌の同定及び検出を行うことを特徴
とする細菌の同定法及び検出法。 【効果】 細菌を高い精度で分類、同定することが可能
となる。
配列を指標として細菌の同定及び検出を行うことを特徴
とする細菌の同定法及び検出法。 【効果】 細菌を高い精度で分類、同定することが可能
となる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ＲＮＡポリメレースσ
因子（σ７０）遺伝子の核酸塩基配列を指標として細菌
の同定・検出を行う方法に関する。本発明は医学・各種
産業（食品・化学等々）領域および環境保全（水処理・
汚染物質の生物分解）において重要な役割を担う細菌
を、遺伝子レベルで同定・検出することを可能とする。
因子（σ７０）遺伝子の核酸塩基配列を指標として細菌
の同定・検出を行う方法に関する。本発明は医学・各種
産業（食品・化学等々）領域および環境保全（水処理・
汚染物質の生物分解）において重要な役割を担う細菌
を、遺伝子レベルで同定・検出することを可能とする。
【０００２】
【従来の技術】従来細菌の同定には、糖の資化性等の生
化学検査が用いられてきた。しかしこれらを用いた検査
はその検査項目が非常に多く煩雑で時間がかかり、にも
かかわらず正確な結果を得ることが困難であった。近年
では16Ｓ rＲＮＡの塩基配列を用いた微生物種の遺伝子
レベルでの解析が行われている。しかし 16S rＲＮＡは
分子進化の速度が遅く、近縁の菌種間ではその差異は微
々たるものである。また、近年はＤＮＡ−ＤＮＡハイブ
リダイゼーションの結果と食い違うことなどより、種の
同定には不適当であるとする研究結果が示されている。
このように 16S rＲＮＡシークエンスを用いた同定シ
ステムでは、細菌の種や株の判定は困難である。
化学検査が用いられてきた。しかしこれらを用いた検査
はその検査項目が非常に多く煩雑で時間がかかり、にも
かかわらず正確な結果を得ることが困難であった。近年
では16Ｓ rＲＮＡの塩基配列を用いた微生物種の遺伝子
レベルでの解析が行われている。しかし 16S rＲＮＡは
分子進化の速度が遅く、近縁の菌種間ではその差異は微
々たるものである。また、近年はＤＮＡ−ＤＮＡハイブ
リダイゼーションの結果と食い違うことなどより、種の
同定には不適当であるとする研究結果が示されている。
このように 16S rＲＮＡシークエンスを用いた同定シ
ステムでは、細菌の種や株の判定は困難である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】細菌を高い精度で分類
・同定またはモニターするには遺伝子レベルでの比較・
検出を行うことが望ましいが、このためには遺伝子のシ
ークエンス情報を、任意の細菌より簡便に入手しうるこ
とが必要となる。前述の rＲＮＡ遺伝子は種間を通して
保存性の高いＤＮＡ塩基配列を有し、この配列をいわゆ
るユニバーサルプライマーとして用いることによって、
ほとんどの細菌種で、ＰＣＲ断片から直接ＤＮＡ塩基配
列を決定することが可能である。しかし、構造遺伝子で
はこのような種間を通して保存されたＤＮＡ塩基配列は
存在しないため、これまでは同様の方法で塩基配列情報
を入手することは出来なかった。このため従来はシーク
エンスを行なうために１種ごとにクローニング操作を行
なわなくてはならず、分類・同定といった目的にこれら
遺伝子を応用することは事実上不可能だった。
・同定またはモニターするには遺伝子レベルでの比較・
検出を行うことが望ましいが、このためには遺伝子のシ
ークエンス情報を、任意の細菌より簡便に入手しうるこ
とが必要となる。前述の rＲＮＡ遺伝子は種間を通して
保存性の高いＤＮＡ塩基配列を有し、この配列をいわゆ
るユニバーサルプライマーとして用いることによって、
ほとんどの細菌種で、ＰＣＲ断片から直接ＤＮＡ塩基配
列を決定することが可能である。しかし、構造遺伝子で
はこのような種間を通して保存されたＤＮＡ塩基配列は
存在しないため、これまでは同様の方法で塩基配列情報
を入手することは出来なかった。このため従来はシーク
エンスを行なうために１種ごとにクローニング操作を行
なわなくてはならず、分類・同定といった目的にこれら
遺伝子を応用することは事実上不可能だった。
【０００４】本発明は、上述したような問題を解決する
ことをその目的とするものであり、具体的には、任意の
細菌からＲＮＡポリメレースσ因子遺伝子のシークエン
ス情報を容易に入手する方法を確立し、簡便でかつ精度
の高い細菌の同定・検出方法を提供することを目的とす
る。
ことをその目的とするものであり、具体的には、任意の
細菌からＲＮＡポリメレースσ因子遺伝子のシークエン
ス情報を容易に入手する方法を確立し、簡便でかつ精度
の高い細菌の同定・検出方法を提供することを目的とす
る。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記目的
を達成すべく研究を重ねた結果、ＲＮＡポリメレースσ
因子遺伝子の核酸塩基配列が、同属種間あるいは株間で
顕著な相違がみられることを見出し、本発明を完成し
た。即ち、本発明は、ＲＮＡポリメレースσ因子遺伝子
の核酸塩基配列を指標として細菌の同定を行うことを特
徴とする細菌の同定法である。
を達成すべく研究を重ねた結果、ＲＮＡポリメレースσ
因子遺伝子の核酸塩基配列が、同属種間あるいは株間で
顕著な相違がみられることを見出し、本発明を完成し
た。即ち、本発明は、ＲＮＡポリメレースσ因子遺伝子
の核酸塩基配列を指標として細菌の同定を行うことを特
徴とする細菌の同定法である。
【０００６】また、本発明は、ＲＮＡポリメレースσ因
子遺伝子の核酸塩基配列を指標として細菌の検出を行う
ことを特徴とする細菌の検出法である。以下、本発明を
詳細に説明する。本発明は、細菌のＲＮＡポリメレース
σ因子遺伝子の塩基配列を指標として当該細菌の同定・
検出を行うものである。具体的には、ＲＮＡポリメレー
スσ因子遺伝子上の特定の塩基配列を含むＤＮＡ断片を
ＰＣＲ法により増幅し、ついでジデオキシ法等によりそ
のＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、この塩基配列に基づ
き細菌の同定・検出を行うものである。
子遺伝子の核酸塩基配列を指標として細菌の検出を行う
ことを特徴とする細菌の検出法である。以下、本発明を
詳細に説明する。本発明は、細菌のＲＮＡポリメレース
σ因子遺伝子の塩基配列を指標として当該細菌の同定・
検出を行うものである。具体的には、ＲＮＡポリメレー
スσ因子遺伝子上の特定の塩基配列を含むＤＮＡ断片を
ＰＣＲ法により増幅し、ついでジデオキシ法等によりそ
のＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、この塩基配列に基づ
き細菌の同定・検出を行うものである。
【０００７】ＰＣＲ法に用いるプライマーとしては、M
Y M R E M G T V で表されるアミノ酸配列をコードする
塩基配列を含むセンスプライマーとK K E M V E A N で
表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むアン
チセンスプライマーの２種類のプライマーを用いる。図
１にこれらのプライマーの塩基配列を示す。それぞれの
プライマーの鋳型ＤＮＡ結合部位は大腸菌Ｋ12株のσ70
におけるアミノ酸ポジション94から108および376から39
1に相当する。
Y M R E M G T V で表されるアミノ酸配列をコードする
塩基配列を含むセンスプライマーとK K E M V E A N で
表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むアン
チセンスプライマーの２種類のプライマーを用いる。図
１にこれらのプライマーの塩基配列を示す。それぞれの
プライマーの鋳型ＤＮＡ結合部位は大腸菌Ｋ12株のσ70
におけるアミノ酸ポジション94から108および376から39
1に相当する。
【０００８】このようなミックスプライマーによる増幅
断片は、その塩基配列全体が未知で塩基配列決定用のプ
ライマー配列が得られないため、増幅断片より直接シー
クエンス反応（ジデオキシ法など）を行うことが出来な
い。そこで本発明では図１に示したようにあらかじめプ
ライマー５' 末端に既知の配列を付加しておき、この塩
基配列をシークエンスプライマーとして用いることによ
って増幅断片より直接塩基配列を求めることを可能とし
ている。本法によりＲＮＡポリメレースσ因子遺伝子
の、約800塩基対を決定することができる。この方法で
決定されるＤＮＡ塩基配列はアミノ酸の保存性が比較的
低い高変異領域で、進化速度が速く、細菌の同定・検出
への利用に適している。
断片は、その塩基配列全体が未知で塩基配列決定用のプ
ライマー配列が得られないため、増幅断片より直接シー
クエンス反応（ジデオキシ法など）を行うことが出来な
い。そこで本発明では図１に示したようにあらかじめプ
ライマー５' 末端に既知の配列を付加しておき、この塩
基配列をシークエンスプライマーとして用いることによ
って増幅断片より直接塩基配列を求めることを可能とし
ている。本法によりＲＮＡポリメレースσ因子遺伝子
の、約800塩基対を決定することができる。この方法で
決定されるＤＮＡ塩基配列はアミノ酸の保存性が比較的
低い高変異領域で、進化速度が速く、細菌の同定・検出
への利用に適している。
【０００９】このようにして得られる塩基配列は、実施
例に示すように同属種間あるいは株間で異なっている。
また同一種間で比較を行った場合、 16S rＲＮＡの塩基
配列に較べ顕著に相違度が高い。このため得られたＲＮ
Ａポリメレースσ因子遺伝子の配列情報を用いることに
より、複雑な生化学検査を行うことなしに簡便かつ高精
度に菌の同定を行うことが出来る。さらに近縁菌種の塩
基配列を同様に求めて多重比較を行うことにより、種あ
るいは株レベルでの高い特異性を有するプローブやＰＣ
Ｒプライマーの作成が可能である。これら特殊配列に基
づくＰＣＲプライマーを使用して増幅された、ＰＣＲ断
片の制限酵素消化パターンを解析することにより、塩基
配列の決定を行わなくとも種や株の同定が可能である。
例に示すように同属種間あるいは株間で異なっている。
また同一種間で比較を行った場合、 16S rＲＮＡの塩基
配列に較べ顕著に相違度が高い。このため得られたＲＮ
Ａポリメレースσ因子遺伝子の配列情報を用いることに
より、複雑な生化学検査を行うことなしに簡便かつ高精
度に菌の同定を行うことが出来る。さらに近縁菌種の塩
基配列を同様に求めて多重比較を行うことにより、種あ
るいは株レベルでの高い特異性を有するプローブやＰＣ
Ｒプライマーの作成が可能である。これら特殊配列に基
づくＰＣＲプライマーを使用して増幅された、ＰＣＲ断
片の制限酵素消化パターンを解析することにより、塩基
配列の決定を行わなくとも種や株の同定が可能である。
【００１０】以上のように、ＲＮＡポリメレースσ因子
遺伝子を用いた検出システムは、未知の菌を多数含む天
然菌叢中でも目的とする菌を特異的に検出できると期待
される。また容易に菌を遺伝子レベルで表現できるた
め、未同定の新種の記述に用いることが可能である。本
発明に用いたプライマーはグラム陰性菌に適用できる。
グラム陽性菌については、これらの遺伝子特異的なミッ
クスプライマーによってＰＣＲ増幅および塩基配列の決
定が可能である。また本発明はＲＮＡポリメレースσ因
子遺伝子のみならず広く構造遺伝子に応用することも可
能である。
遺伝子を用いた検出システムは、未知の菌を多数含む天
然菌叢中でも目的とする菌を特異的に検出できると期待
される。また容易に菌を遺伝子レベルで表現できるた
め、未同定の新種の記述に用いることが可能である。本
発明に用いたプライマーはグラム陰性菌に適用できる。
グラム陽性菌については、これらの遺伝子特異的なミッ
クスプライマーによってＰＣＲ増幅および塩基配列の決
定が可能である。また本発明はＲＮＡポリメレースσ因
子遺伝子のみならず広く構造遺伝子に応用することも可
能である。
【００１１】
〔石油分解菌同定への応用〕図１に示したＰＣＲプライ
マーを用いて、 Pseudpmonas putida 13株と新規海洋性
炭化水素分解菌ＰＢ4とＫ23-1株のＲＮＡポリメレース
σ因子遺伝子のＰＣＲ増幅を試みた。この結果、全ての
株でほぼ単一の増幅産物を得ることができた。この増幅
産物より図１に示したシークエンスプライマーを用い
て、ジデオキシ法によりＤＮＡ塩基配列を求めた。この
結果を図２に示す。またこれらの塩基配列は、ＲＮＡポ
リメレースσ因子遺伝子であることがアミノ酸配列の解
析結果から確認された。ＰＢ4とＫ23-1株の塩基配列を
他の P.putida 塩基配列と比較した結果、本株は P.put
ida に属し、既存の株では JCM6156株およびPpG7株に最
も近い、新しいタイプであることが確認された。このよ
うに P.putida 内でもＲＮＡポリメレースσ因子遺伝子
の塩基配列は異なっており、菌株を判別することが可能
であった。
マーを用いて、 Pseudpmonas putida 13株と新規海洋性
炭化水素分解菌ＰＢ4とＫ23-1株のＲＮＡポリメレース
σ因子遺伝子のＰＣＲ増幅を試みた。この結果、全ての
株でほぼ単一の増幅産物を得ることができた。この増幅
産物より図１に示したシークエンスプライマーを用い
て、ジデオキシ法によりＤＮＡ塩基配列を求めた。この
結果を図２に示す。またこれらの塩基配列は、ＲＮＡポ
リメレースσ因子遺伝子であることがアミノ酸配列の解
析結果から確認された。ＰＢ4とＫ23-1株の塩基配列を
他の P.putida 塩基配列と比較した結果、本株は P.put
ida に属し、既存の株では JCM6156株およびPpG7株に最
も近い、新しいタイプであることが確認された。このよ
うに P.putida 内でもＲＮＡポリメレースσ因子遺伝子
の塩基配列は異なっており、菌株を判別することが可能
であった。
【００１２】
【発明の効果】本発明により、細菌を高い精度で分類、
同定することが可能となる。これは、例えば、感染症の
診断などに利用することができ、また、複雑な菌叢から
特定の細菌の消長を追うことが可能となり、微生物環境
浄化システムの開発、食品製造工程の管理等にも利用す
ることができる。
同定することが可能となる。これは、例えば、感染症の
診断などに利用することができ、また、複雑な菌叢から
特定の細菌の消長を追うことが可能となり、微生物環境
浄化システムの開発、食品製造工程の管理等にも利用す
ることができる。
【図１】ＲＮＡポリメレースσ因子遺伝子のＰＣＲ増幅
用のプライマーを示す図である。
用のプライマーを示す図である。
【図２】本発明により求められたシュードモナス・プチ
ダのＲＮＡポリメレースσ因子遺伝子の部分塩基配列を
示す図である。
ダのＲＮＡポリメレースσ因子遺伝子の部分塩基配列を
示す図である。
Claims (2)
- 【請求項１】 ＲＮＡポリメレースσ因子遺伝子の核酸
塩基配列を指標として細菌の同定を行うことを特徴とす
る細菌の同定法。 - 【請求項２】 ＲＮＡポリメレースσ因子遺伝子の核酸
塩基配列を指標として細菌の検出を行うことを特徴とす
る細菌の検出法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7070096A JPH08256798A (ja) | 1995-03-28 | 1995-03-28 | ＲＮＡポリメレースσ因子遺伝子の塩基配列を用いた細菌の同定・検出法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7070096A JPH08256798A (ja) | 1995-03-28 | 1995-03-28 | ＲＮＡポリメレースσ因子遺伝子の塩基配列を用いた細菌の同定・検出法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08256798A true JPH08256798A (ja) | 1996-10-08 |
Family
ID=13421666
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7070096A Pending JPH08256798A (ja) | 1995-03-28 | 1995-03-28 | ＲＮＡポリメレースσ因子遺伝子の塩基配列を用いた細菌の同定・検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08256798A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003014393A1 (en) * | 2001-08-03 | 2003-02-20 | Nichirei Corporation | METHOD OF DETECTING, IDENTIFYING AND COUNTING ENTERITIS VIBRIO USING GENE (rpoD) SEQUENCES ENCODING RNA POLYMERASE σ70 FACTOR |
| WO2004020671A1 (ja) * | 2002-08-30 | 2004-03-11 | Nichirei Corporation | ビブリオ ブルニフィカスの検出用プライマー及びプローブ並びにそれらを用いる検出方法 |
| WO2004055188A1 (ja) * | 2002-12-13 | 2004-07-01 | Nichirei Foods Inc. | ビブリオコレラ又はビブリオミミカスの検出用プライマー及びプローブ並びにそれらを用いる検出方法 |
-
1995
- 1995-03-28 JP JP7070096A patent/JPH08256798A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003014393A1 (en) * | 2001-08-03 | 2003-02-20 | Nichirei Corporation | METHOD OF DETECTING, IDENTIFYING AND COUNTING ENTERITIS VIBRIO USING GENE (rpoD) SEQUENCES ENCODING RNA POLYMERASE σ70 FACTOR |
| US7244838B2 (en) | 2001-08-03 | 2007-07-17 | Nichirei Corporation | Method for detecting, identifying and counting Vibrio parahaemolyticus using gene (rpoD) sequence encoding RNA polymerase σ70 factor |
| WO2004020671A1 (ja) * | 2002-08-30 | 2004-03-11 | Nichirei Corporation | ビブリオ ブルニフィカスの検出用プライマー及びプローブ並びにそれらを用いる検出方法 |
| WO2004055188A1 (ja) * | 2002-12-13 | 2004-07-01 | Nichirei Foods Inc. | ビブリオコレラ又はビブリオミミカスの検出用プライマー及びプローブ並びにそれらを用いる検出方法 |
| JPWO2004055188A1 (ja) * | 2002-12-13 | 2006-04-20 | 株式会社ニチレイフーズ | ビブリオコレラ又はビブリオミミカスの検出用プライマー及びプローブ並びにそれらを用いる検出方法 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060117 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060309 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070515 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070713 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080226 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20080701 |