KR100574069B1 - 리스테리아 속 균종을 검출하는 방법 및 검출키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 리스테리아 속(Listeria spp.)의 균종을 검출하는 방법 및 검출키트에 관한 것으로, ⒜ 시료에 서브클레스 Ⅱa에 속하는 박테리오신을 첨가하여 반응시키는 단계; ⒝ 단계 ⒜의 반응물을 PCR 주형으로 하고, 리스테리아 속 균종의 DNA를 증폭시킬 수 있는 특이적인 프라이머 쌍으로 PCR 주형을 증폭하여 PCR 산물을 수득하는 단계; 및 ⒞ 단계 ⒝에서 수득한 PCR 산물을 전기영동으로 시각화함을 특징으로 하여 리스테리아 속 균종을 검출하는 방법 및 리스테리아 속 균종의 DNA를 증폭시킬 수 있는 특이적인 프라이머 쌍, DNA 중합효소, dNTP 혼합물 및 PCR 반응 완충액으로 구성되는 리스테리아 속 균종 검출키트에 관한 것이다.
본 발명의 검출방법 및 검출키트는 시료에 존재하는 리스테리아 속 균종의 검출 민감성을 향상시켜 식중독을 일으키는 미량의 리스테리아 속 균종을 검출할 수 있다.
박테리오신, 서브클레스 Ⅱa에 속하는 박테리오신, 천연 페디오신 PA-1, PCR, 리스테리아 속
Description
도 1은 천연 페디오신 PA-1의 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 균주에 대한 항균 활성을 나타내는 사진이다(화살표 : 생육 저지환).
도 2는 순수배양한 리스테리아 모노사이토제네스 균주로부터 PCR 주형(template)을 제조하고, 이를 PCR 증폭한 것을 전기영동하여 나타낸 사진이다(A: 재부유 세포; B: 가열하여 수득한 세포 용해액; C: 정제된 게놈 DNA; 레인 1: 세포수 104CFU/reaction; 레인 2: 세포수 103CFU/reaction; 레인 3: 세포수 102CFU/reaction, M: 마커, 100bp 레더(biolabs, U.K.)).
도 3은 순수배양한 리스테리아 모노사이토제네스 균주으로부터 제조한 재부유 세포에 천연 페디오신 PA-1을 처리한 후, 이를 열처리하여 PCR 주형을 제조하고, 이를 PCR 증폭한 것을 전기영동하여 나타낸 사진이다 (A: 천연 페디오신 PA-1 비처리; B: 80AU 처리; C: 160AU 처리, D: 240AU 처리; 레인 1: 세포수 103CFU/reaction; 레인 2: 세포수 102CFU/reaction; 레인 3: 세포수 10 CFU/reaction; M: 마커, 100bp 레더).
도 4는 순수배양한 리스테리아 모노사이토제네스 균주 및 음식물에 리스테리아 모노사이토제네스 균주을 접종한 시료를 열처리 전과 후로 나누어 각각 천연 페디오신 PA-1을 처리하여 PCR 주형을 제조하고, 이를 PCR 증폭한 것을 전기영동하여 나타낸 사진이다 (A: 순수배양; B: 전지우유; C: 생돼지고기; a: 열처리; b: 천연 페디오신 PA-1 처리 후 열처리; c: 열처리 후 천연 페디오신 PA-1 처리; 레인 1: 세포수 103CFU/reaction; 레인 2: 세포수 102CFU/reaction; 레인 3: 세포수 10 CFU/reaction; M: 마커, 100bp 레더).
본 발명은 리스테리아 속(Listeria spp.)의 균종을 검출하는 방법 및 검출키트에 관한 것이다. 보다 자세하게는, ⒜ 시료에 서브클레스 Ⅱa에 속하는 박테리오신을 첨가하여 반응시키는 단계; ⒝ 단계 ⒜의 반응물을 PCR 주형으로 하고, 리스테리아 속 균종의 DNA를 증폭시킬 수 있는 특이적인 프라이머 쌍으로 PCR 주형을 증폭하여 PCR 산물을 수득하는 단계; 및 ⒞ 단계 ⒝에서 수득한 PCR 산물을 전기영동으로 시각화함을 특징으로 하여 리스테리아 속 균종을 검출하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 리스테리아 속 균종의 DNA를 증폭시킬 수 있는 특이적인 프라이머 쌍, DNA 중합효소, dNTP 혼합물 및 PCR 반응 완충액으로 구성되는 리스테리아 속 균종 검출키트에 관한 것이다.
식중독은 그 원인에 기초하여 자연독(복어독, 버섯독 등)에 의한 식중독; 음식물의 부패에 의한 식중독; 및 음식물 중 세균의 혼입 내지는 번식에 의한 식중독으로 크게 나눌 수 있다. 이들 식중독 중 자연독에 의한 식중독은 원인이 되는 음식물의 섭취를 피함으로써 쉽게 예방할 수 있고, 음식물의 부패는 음식물의 외관, 냄새 등의 변화에 의해 용이하게 검출되므로 음식물의 부패에 의한 식중독을 피하는 것도 비교적 용이하다. 그러나, 이에 비해 세균에 의한 식중독, 즉 세균성 식중독의 경우는 세균의 음식물에의 혼입 또는 번식이 일반적으로 육안으로 관찰되지 않고 전문적인 방법에 의하지 않고는 검출이 매우 곤란하기 때문에 가장 예방이 어려운 식중독이라고 할 수 있다. 세균성 식중독의 원인균을 검출·확인하는 방법으로는, 채취한 검체를 선택배지를 이용하여 배양하고, 배지에 형성된 콜로니를 육안으로 관찰하거나, 기타 탐지확인 수단을 이용하여 확인하는 방법 등이 있으며, 최근에는 중합효소연쇄반응을 이용한 검사법이 개발·사용되고 있다.
중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction: 이하 "PCR" 이라 한다.)은 환경적 또는 임상적 시료로부터 병원성 미생물을 검출 및 동정하는데 널리 이용되는 방법이다(Bhaduri et al. Molecular and Cellular Probes, 2001, Vol. 15, p267; Bubert et al. J. Clin. Microbiol., 1997, Vol. 35, p179; Shin et al. J. Microbiol. Biotechnol., 1999, Vol. 9, p184; Venkateswaran et al. Appl. Environ. Microbiol., 1998, Vol. 64, p681). 예를 들면, PCR은 음식물에 존재하는 병원균을 신속하고 특이적으로 검출할 수 있고, 음식물 시료로부터 분리된 병원균의 동정에 쓰이며, DNA 주형을 제조하여 더 자세한 유전자분석을 하는데 유용하 다. 특히, 음식물로부터 병원균의 게놈 DNA를 추출하여 통상적인 키트로 분석하는 방법이 가장 각광받고 있다. 그러나 상기 키트를 적용함에 있어서, 목적하는 유기체가 미량으로 존재, 음식물중 PCR-억제제의 존재 및 고가의 분석장비 등의 제한적인 문제를 갖고 있다(Bej et al. Detection of food borne microbial pathogens, 1994, p341., Griffin et al. and A. M. Griffin (ed.), PCR technology: current innovations. CRC Press, Boca Raton, Fl.). 따라서, 일부 연구 보고서에 의하면 순수배양된 세포 및 인공적으로 음식물을 오염시켜 열처리한 세포 용해액을 PCR 검출을 위한 주형으로 사용되고 있음이 보고된 바 있다(Shin et al. J. Microbiol. Biotechnol., 1999, Vol. 9, p184; Venkateswaran et al. Appl. Environ. Microbiol., 1998, Vol. 64, p681). 한편, PCR 억제제를 제거하거나 PCR 검출의 민감성을 증가시키기 위해 원심분리, 세정제, 리소자임, 증균배지 및 항체가 코팅된-마그네틱 비드를 사용하기도 한다(Bhaduri et al. Molecular and Cellular Probes. 2001, Vol. 15, p267.).
본 발명자들도 상기 방법을 이용하여 그람 음성균인 대장균 O157:H7(E. coli O157:H7)을 효과적으로 검출하였으나, 그람 양성균인 리스테리아 모노사이토제네스 균은 세포벽이 견고하기 때문에 쉽게 검출할 수 없었다.
이에, 본 발명자들은 식중독의 원인균인 리스테리아 모노사이토제네스 균의 세포벽이 견고하기 때문에 PCR 검출시 검출 민감성이 떨어진다는 것을 발견하고, 이를 해결하기 위해 서브클레스 Ⅱa에 속하는 박테리오신 그룹 중 천연 페디오신 PA-1을 리스테리아 모노사이토제네스 균에 처리하여 PCR 검출한 결과, 검출 민감성이 증가하는 것을 알 수 있었다.
따라서, 본 발명은 ⒜ 시료에 서브클레스 Ⅱa에 속하는 박테리오신을 첨가하여 반응시키는 단계; ⒝ 단계 ⒜의 반응물을 PCR 주형으로 하고, 리스테리아 속 균종의 DNA를 증폭시킬 수 있는 특이적인 프라이머 쌍으로 PCR 주형을 증폭하여 PCR 산물을 수득하는 단계; 및 ⒞ 단계 ⒝에서 수득한 PCR 산물을 전기영동으로 시각화함을 특징으로 하여 리스테리아 속 균종을 검출하는 방법을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 리스테리아 속 균종의 DNA를 증폭시킬 수 있는 특이적인 프라이머 쌍, DNA 중합효소, dNTP 혼합물 및 PCR 반응 완충액으로 구성됨을 특징으로 하는 리스테리아 속 균종 검출키트를 제공하고자 한다.
본 발명은 ⒜ 시료에 서브클레스 Ⅱa에 속하는 박테리오신을 첨가하여 반응시키는 단계; ⒝ 단계 ⒜의 반응물을 PCR 주형으로 하고, 리스테리아 속 균종의 DNA를 증폭시킬 수 있는 특이적인 프라이머 쌍으로 PCR 주형을 증폭하여 PCR 산물을 수득하는 단계; 및 ⒞ 단계 ⒝에서 수득한 PCR 산물을 전기영동으로 시각화함을 특징으로 하여 리스테리아 속 균종을 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 시료는 리스테리아 속 균종에 의해 오염되었거나 오염될 수 있는 우유, 유가공품, 육류 및 육가공품 등의 음식물을 균질화하고 현탁시켜 사용할 수 있다.
본 발명에서 검출하고자 하는 리스테리아 속 균종들은 그람 양성, 비아포성 의 통성혐기성 간균이며, 냉온성의 미생물로서 자연계에 널리 분포하고 있는 균종이다. 여러 환경적 여건에서 생존할 수 있으며, pH 5.0 내지 9.0에서 증식이 가능하고 냉장온도에서도 오랫동안 생존 및 증식할 수 있다. 또한, 리스테리아 속 균종들은 식중독의 원인체로서, 리스테리아 모노사이토제네스, 리스테리아 이바노비(Listeria ivanovii), 리스테리아 인노쿠아(Listeria
innocua), 리스테리아 세에리게리(Listeria
seeligeri), 리스테리아 웰쉬메리(Listeria welshimeri), 리스테리아 그레이(Listeria
grayi) 및 리스테리아 머레이(Listeria
murrayi) 등이 알려져 있으나, 이중 리스테리아 모노사이토제네스 균에 의한 감염이 주로 식중독을 일으킨다. 또한, 상기 리스테리아 속의 균종들은 그람 양성으로서 세포벽이 견고하므로 종래의 PCR 방법으로 검출하게 되면 세포수 103 CFU/reaction 이상에서 검출이 된다고 한다. 즉, 리스테리아 속 균종의 견고한 세포벽으로 인해 DNA 방출이 용이하지 않으므로 종래의 PCR 방법으로는 리스테리아 속 균종의 검출 민감성이 낮다.
이에, 본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위해 서브클레스 Ⅱa에 속하는 박테리오신(Bacteriocin)을 시료에 처리하여 리스테리아 속 균종의 세포벽 구성성분인 세포막을 효과적으로 파괴시켜 PCR 검출시 검출 민감성을 향상시킬 수 있다.
용어 "박테리오신"이란 여러 종의 미생물이 생산하는 천연의 항균성 단백질(antimicrobial peptide) 또는 단백질계의 물질을 의미한다. 박테리오신의 항균성은 자신이 가지고 있는 아미노산 서열에 의해 다양하게 변화하지만 일반적으 로는 분자량이 작고 열에 안정적이며 양이온성이고 소수성인 성질을 나타낸다(Oscariz et al. Int. Microbiol., 2001, Vol. 4, p13.).
박테리오신의 분류는 클레스 I(class I), Ⅱ 및 Ⅲ로 구분할 수 있고, 이 중 클레스 Ⅱ는 서브클레스 Ⅱa(subclass Ⅱa), Ⅱb 및 Ⅱc로 구분할 수 있으며, 특히, 서브클레스 Ⅱa를 페디오신-유사 박테리오신(pediocin-like bacteriocins)라고 부르며 이 그룹의 대표적인 특징은 리스테리아 속에 대한 항균 활성이 강하다.
따라서, 본 발명에서 사용할 수 있는 서브클레스 Ⅱa에 속하는 박테리오신은 천연 페디오신 PA-1; 엔테로신 A(entrocin A); 디버기신 DV41(divergicin DV41); 메센테로신 Y105(mesenterocin); 사카신 P(sakacin P); 쿠어바신 A(curvacin A); 류코신 UAL-187(leucocin UAL-187); 및 카노박테리오신 B2(carnobacteriocin B2)으로 이루어진 그룹중에서 선택된 어느 하나를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 항균 스펙트럼이 넓은 천연 페디오신 PA-1을 사용할 수 있다.
상기 천연 페디오신 PA-1은 페디오코커스 에시디락시티 K10(Pediococcus acidilactici) 균으로부터 추출할 수 있다.
본 발명에서 상기 서브클레스 Ⅱa에 속하는 박테리오신을 시료에 첨가하여 최적의 검출조건을 유도해낼 수 있는 농도는 80 내지 240AU/reaction이다.
일 실시예로서, 서브클레스 Ⅱa에 속하는 박테리오신 중 천연 페디오신 PA-1을 시료에 첨가하여 반응시킨 후, 이를 주형으로 하여 PCR 검출하였을 때 최소 세포수 10CFU/reaction일 때 리스테리아 속의 균종을 검출할 수 있었다 (참조: 실시 예 8). 이는 천연 페디오신 PA-1을 처리하지 않은 시료로부터 리스테리아 속의 균종을 검출할 때 최소 세포수가 103 CFU/reaction인 것과 비교하여 볼 때 (참조: 실시예 6) 검출 민감성이 향상되었음을 알 수 있다.
본 발명에서 PCR 주형의 제조는 시료에 서브클레스 Ⅱa에 속하는 박테리오신을 첨가하여 반응시킨 것을 직접 PCR 주형으로 사용할 수 있다. 이는 서브클레스 Ⅱa에 속하는 박테리오신으로 먼저 리스테리아 속 균종의 세포벽 구성성분인 세포막을 파괴시키기 위함이다. 상기 서브클레스 Ⅱa에 속하는 박테리오신을 첨가하여 시료와 반응시키는 시간은 20 내지 40분이 바람직하다.
추가적으로, 본 발명은 서브클레스 Ⅱa에 속하는 박테리오신으로 반응시킨 시료를 열처리하여 검출하고자 하는 병원균의 세포내에 존재하는 DNA를 쉽게 방출되도록 할 수 있다. 열처리 온도 및 시간은 90 내지 100℃에서 5 내지 15분으로 수행하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 PCR 주형의 증폭을 위해 사용되는 프라이머(primer)는 리스테리아 속 균종의 DNA를 증폭시킬 수 있는 특이적인 프라이머 쌍을 사용할 수 있다.
예를 들면, 리스테리아 모노사이토제네스 균의 DNA를 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍은 hly A 유전자(Mengaud et al. Infec. Immun., 1988, Vol. 56, p76; Mengaud et al. Infec. Immun., 1989, Vol. 57, p3695)의 다운스트림(down stream) 영역을 기초로 하여 제작할 수 있으며, 이를 프라이머 1(서열번호 1) 및 프라이머 2(서열번호 2)로 나타내었다 (표 1 참조).
한편, 상기 리스테리아 모노사이토제네스 균을 포함한 리스테리아 속에 속하는 특정균의 DNA를 증폭시키기 위해 사용되는 프라이머 쌍은 하기 문헌에 기재된 것을 사용할 수 있다 (Andreas Bubert et al. Applied and envrionmental microbiology, 1999, 65(10), p4688.).
최종적으로, 상기 PCR 증폭한 산물은 당업계에서 통상적으로 사용하는 전기영동을 이용하여 시각화할 수 있다.
본 발명은 리스테리아 속 균종의 DNA를 증폭시킬 수 있는 특이적인 프라이머 쌍, DNA 중합효소, dNTP 혼합물 및 PCR 반응 완충액으로 구성됨을 특징으로 하는 리스테리아 속 균종 검출키트를 제공한다.
본 발명의 검출키트에는 리스테리아 속 균종의 DNA를 특이적으로 증폭시킬 수 있는 프라이머 및 일반적인 구성성분인 PCR 반응 완충액, DNA 중합효소 등을 포함한다. 예를 들면, 리스테리아 모노사이토제네스 균의 검출을 위한 키트는 리스테리아 모노사이토제네스 균의 DNA를 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍(서열번호 1 및 2), 내열성 DNA 중합효소(Taq polymerase), dNTP 혼합물 및 PCR 반응 완충액의 구성성분인 트리스-염산, 염화칼슘 및 염화마그네슘 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 검출키트를 이용하여 리스테리아 속 균종을 검출하는 방법은 다음과 같다.
⑴ 리스테리아 속 균종으로부터 오염되거나 오염될 수 있는 음식물 시료에 서브클레스 Ⅱa에 속하는 박테리오신을 첨가하여 반응시켜 PCR 주형을 제조하는 단계;
⑵ 검출하고자 리스테리아 속 균종의 특이적인 프라이머 쌍, DNA 중합효소, dNTP 혼합물 및 PCR 반응 완충액으로 구성된 본 발명의 검출키트에 단계 ⑴의 PCR 주형을 첨가하여 목적하는 리스테리아 속 균종의 DNA를 증폭시켜 PCR 산물을 수득하는 단계; 및
⑶ 단계 ⑵의 PCR 산물을 전기영동으로 시각화하여, 리스테리아 속의 균종을 검출할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예>
실시예 1
균주의 배양
리스테리아 모노사이토제네스(ATCC 19111) 균을 BHI 브로스(brain heart infusion Broth; BHI Broth, Merck KGaA, Darmstadt, Germany)에 접종한 후 37℃에 서 18시간 동안 호기성 배양하여 배양액을 수득하였다. 상기 배양액을 단계적으로 희석한 후, BHI 아가 플레이트(BHI agar plate, Merck KGaA, Darmstadt, Germany)에 도말하여 균수(단위: CFU/㎖)를 측정하였다.
한편, 서브클레스 Ⅱa에 속하는 박테리오신 중 항균 스펙트럼이 넓은 천연 페디오신 PA-1을 추출하기 위하여 페디오코커스 에시디락티시 K10 균을 김치로부터 분리하였다. 상기 균을 MRS 브로스(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)에 접종한 후 37℃에서 18시간 동안 배양하였다.
실시예 2
천연 페디오신 PA-1의 추출 및 박테리오신 활성 측정
실시예 1에서 배양한 페디오코커스 에시디락티시 K10을 10,000×g로 15분 동안 원심분리하여 상청액을 수득한 후, 이를 구경 0.22㎛ 멤브레인 필터에 통과시켰다. 통과된 배양액 중 100㎖을 취하여 4℃로 유지시키면서 암모니움 설페이트(ammonium sulfate) 결정을 첨가하면서 잘 혼합하여 50% 포화상태가 되도록 하였다. 상기 시료를 4℃에서 4시간 동안 혼합하고 15,000×g로 15분 동안 원심분리하였다. 원심분리하여 펠렛(pellet)상태가 된 시료를 증류수 및 탈이온수를 첨가하여 용해시켰다. 염을 제거하기 위해 상기 시료를 Spectra/Por CE 멤브레인[MWCO(분획분자량): 1,000; Spectrum Medical Industries, Inc., Houston, Texas, U.S.A.)]를 이용하여 4℃에서 12시간동안 증류수 및 탈이온수로 투석하였고 이를 동결건조하여 냉동보관하면서 필요시 증류 및 탈이온수로 녹여 천연 페디오신 PA-1 조제액으로 사용하였다 (Moon et al. J. Microbiol. Biotechnol., 2000, Vol. 10, p507; Moon et al. J. Microbiol. Biotechnol., 2002, Vol. 12, p936.).
한편, 상기 추출한 천연 페디오신 PA-1의 박테리오신 활성은 스팟-온-로운 검정(spot-on-lawn test)을 이용하여 측정하였다. 즉, 상기 실시예 1에서 순수 배양한 리스테리아 모노사이토제네스 균이 107CFU/㎖가 되도록 5㎖의 BHI 소프트 아가(0.7% W/V)와 혼합하여 BHI 아가 플레이트에 골고루 붓고 그 위에 천연 페디오신 PA-1 조제액 2㎕를 점적하여 37℃에서 하룻밤 동안 배양한 후, 생육 저지환(inhibition zone)을 관찰하여 활성의 유무를 파악하였다. 이의 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 천연 페디오신 PA-1의 박테리오신 활성을 측정한 결과, BHI 아가 플레이트에 뚜렷하게 생육 저지환이 나타났다. 이는 페디오코커스 에시락티시 K10으로부터 추출한 페디오신 PA-1이 리스테리아 모노사이코제네스 균에 대해 항균 활성을 가지고 있음을 의미한다. 임의 단위(단위: AU(arbitrary unit)/㎖)로 나타내는 박테리오신의 활성은 천연 페디오신 PA-1 조제액을 2배로 단계적 희석하여 스팟-온-로운 검정의 결과 지시균에 대해 생육 저지환을 나타내는 최고 희석배수의 역에 전환계수(conversion factor, 2㎕의 천연 페디오신 PA-1을 사용한다면 전환계수는 500이 된다.)를 곱한 값이다 (Daeschel, M. A. Procedures to detect antimicrobial activities of microorganisms, 1992. p57. - Ray et al. Food Biopreservatives of Microbial Origin, CRC Press, Ann Arbor, U.S.A.).
실시예 3
프라이머의 제작
PCR을 이용하여 리스테리아 모노사이토제네스 균을 특이적으로 검출하기 위해, hly A 유전자(Mengaud et al. Infec. Immun., 1988. Vol. 56, p76; Mengaud et al. Infec. Immun., 1989, Vol. 57, p3695.)의 다운스트림(down stream) 영역을 기초로 올리고뉴클레오타이드 프라이머 세트를 (주) 바이오니아(대한민국, 청원)에 의뢰하여 합성하였다. 이를 하기 표 1에 나타내었다.
| 프라이머 | 염기 서열 | 서열번호 | PCR 증폭산물의 크기 |
| 정방향 프라이머 | 5'- TTACGAATTAAAAAGGAGCG -3' | 1 | 161bp |
| 역방향 프라이머 | 5'- TTAAATCAGCAGGGGTCTTT -3' | 2 |
실시예 4
순수배양한 리스테리아 모노사이토제네스 균주 및 음식물 시료로부터 PCR 주형의 제조
리스테리아 모노사이토제네스 균주의 여러 PCR 주형으로부터 증폭된 PCR 산 물을 비교하기 위해, 재부유 세포, 가열하여 수득한 세포 용해액 및 DNA 정제 키트(Bio-Rad Laboratories Inc., U. S. A.)로부터 수득한 게놈 DNA의 3가지 PCR 주형 타입을 제조하였다.
상기 PCR 주형의 제조는 다음과 같다. 실시예 1에서 순수배양한 세포수 104, 105 및 106CFU/㎖의 리스테리아 모노사이토제네스 균주를 각각 4℃에서 5분 동안 10,000ㅧg로 원심분리하고, 이로부터 상청액을 제거하여 세포 펠렛을 수득하였다. 상기 세포 펠렛을 증류수 및 탈이온수 1㎖로 두 번 세척하고, 이를 다시 증류수 및 탈이온수 0.1㎖을 첨가하여 재부유시킨 것을 PCR 주형으로 사용하였으며(재부유 세포), 상기 재부유 세포를 98℃에서 10분간 가열하여 세포를 용해시킨 것을 PCR 주형으로 사용하였다 (세포 용해액).
한편, 음식물 시료로부터 리스테리아 모노사이토제네스 균주의 PCR 주형을 제조하기 위해, 리스테리아 모노사이토제네스 균주를 전지우유 및 생돼지고기에 접종하여 이로부터 PCR 주형을 수득하였다. 상기 음식물 시료는 일반 시중(대한민국, 분당)에서 판매하는 전지우유 및 4℃에서 냉장보관된 생돼지고기를 사용하였다. 상기 음식물 시료에 리스테리아 모노사이토제네스 균주를 인위적으로 오염시키는 방법은 하기와 같다. 전지우유 9㎖를 멸균된 시험관에 주입하였다. 또한 생돼지고기 10g을 절단하여 스토마커 필터 백(stomacher filter bag, Seward Ltd., U.K.)에 0.1% 펩톤용액 90㎖과 함께 주입한 후, 스토마커 400 순환기(stomacher 400 circulator, Seward Ltd., U.K.)를 이용하여 200rpm으로 1분 동안 균질화시킨 다음, 균질화된 여과액 9㎖를 멸균된 시험관에 주입하였다. 상기 전지우유와 균질화된 돼지고기 시료가 주입된 시험관에 상기 실시예 1에서 배양한 리스테리아 모노사이토제네스 균주를 접종하여 균의 최종 농도를 103 104 및 105
CFU/㎖가 되도록 각각 희석하였다. 상기 희석액으로부터 PCR 주형을 제조하는 방법은 상기 순수배양한 균주로부터 PCR 주형을 제조하는 방법과 동일하게 수행하였다.
실시예 5
천연 페디오신 PA-1을 처리한 PCR 주형의 제조
실시예 4에서 제조한 재부유 세포 및 음식물 시료로부터 수득한 PCR 주형에 세포막 파괴인자인 천연 페디오신 PA-1을 처리하여 PCR 주형을 제조하였다. 즉, 상기 실시예 2에서 수득한 천연 페디오신 PA-1을 실시예 4의 재부유 세포 및 음식물 시료로부터 수득한 PCR 주형에 처리하고, 이를 30분 동안 실온에서 배양하였다. 상기 배양한 각각의 시료를 98℃에서 10분 동안 열처리하여 PCR 주형으로 사용하였다.
실시예 6
순수배양한 리스테리아 모노사이토제네스 균주로부터 제조한 PCR 주형의 PCR 분석
순수배양한 리스테리아 모노사이토제네스 균주의 검출 민감성을 비교하기 위해, 상기 실시예 4에서 제조한 3가지 타입의 PCR 주형을 이용하였다.
PCR 분석은 실시예 4에서 수득한 3가지 타입의 리스테리아 모노사이토제네스 균주의 PCR 주형을 각각 1㎕씩 20㎕ PCR PreMix ((주) 바이오니아, 대한민국)에 첨가하여 수행하였다. 상기 PCR 혼합물은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 각각 10pmole, 내열성 DNA 중합효소(Taq polymerase) 1U, dNTP 250μM, 트리스-염산 50mM(pH 8.3), 염화칼슘 40mM 및 염화마그네슘 1.5mM로 구성되어 있었다.
상기 PCR은 BIO-Rad Gene Cycler(모델번호. 10167, Japan)를 이용하여 수행하였다. 즉, 94℃에서 2분간 예열 단계를 거친 후, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 1분을 1주기로 하여 총 35회 반복 수행한 후, 72℃에서 5분간 최종 신장반응을 수행하여 종결하였다. 상기 PCR 산물은 1.5% 아가로스 겔 전기영동을 이용하여 분석하였고, 염색은 에티디움 브로마이드(ethidium bromide) 용액으로 하였다. 상기 겔은 자외선 촬영하여 시각화였으며, 이를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 리스테리아 모노사이토제네스 균주으로부터 제조된 재부유 세포, 가열하여 수득한 세포 용해액 및 정제된 게놈 DNA의 3가지 타입의 PCR 주형을 이용하여 PCR 산물을 검출한 결과, 각각 세포수 104, 103 및 103 CFU/reaction의 리스테리아 모노사이토제네스 균주에 해당되는 PCR 산물이 검출되었다. 이는 일반적으로 대장균 O157:H7이 세포수 10CFU/reaction일 때 검출되는 경우와 비교하여 볼 때, 그람 양성균의 세포벽을 구성하는 두꺼운 펩티도글리칸 층으로 인해 리스테리아 모노사이토제네스 균은 대장균 O157:H7보다 검출 민감성이 제한되어 있음을 알 수 있었다.
실시예 7
천연 페디오신 PA-1을 처리한 PCR 주형의 PCR 분석
천연 페디오신 PA-1의 세포막 파괴효과로 인한 리스테리아 모노사이토제네스 균주의 검출 민감성을 측정하기 위해, 상기 실시예 5에서 제조한 PCR 주형을 이용하였다. 즉, 천연 페디오신 PA-1을 실시예 4의 재부유 세포에 80, 160 및 240 AU로 각각 처리하고 이를 열처리하여 제조된 PCR 주형을 사용하였다. PCR 분석은 상기 PCR 주형을 1㎕로 하여 상기 실시예 6과 동일하게 수행하였다. 이의 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 리스테리아 모노사이토제네스 균주으로부터 제조한 재부유 세포에 천연 페디오신 PA-1을 80, 160 및 240 AU로 각각 처리하고 이를 열처리하여 제조된 PCR 주형을 이용하여 PCR 산물을 검출한 결과, 80AU의 천연 페디오신 PA-1을 처리하였을 때 세포수 102CFU/reaction의 리스테리아 모노사이토제네스 균주에 해당되는 PCR 산물이 검출되었다. 이는 천연 페디오신 PA-1을 비처리하였을 때 세포수 103CFU/reaction의 리스테리아 모노사이토제네스 균주에 해당되는 PCR 산물에서 검출된 결과에 비해 검출 민감성이 높음을 알 수 있었다.
또한, 160 및 240AU의 천연 페디오신 PA-1을 처리하였을 때 세포수 10 CFU/reaction의 리스테리아 모노사이토제네스 균주에 해당되는 PCR 산물이 검출되었다.
즉, 리스테리아 모노사이토제네스 균주의 검출 민감성은 천연 페디오신 PA-1의 첨가량이 증가할수록 높아진다는 것을 알 수 있었으며, 리스테리아 모노사이토제네스 균주 검출시 최적의 천연 페디오신 PA-1 첨가량은 160AU라는 것을 알 수 있었다(도 3의 C, D 참조).
실시예 8
음식물 시료에 천연 페디오신 PA-1을 처리한 PCR 주형의 PCR 분석
천연 페디오신 PA-1이 리스테리아 모노사이토제네스 균주의 검출 민감성을 증가시킨다는 것을 이용하여 음식물 시료에서 리스테리아 모노사이토제네스 균주의 검출 민감성을 측정하기 위해, 상기 실시예 5에서 제조한 음식물 시료로부터 수득한 PCR 주형을 이용하였다. 즉, 실시예 4의 음식물 시료에 임의로 리스테리아 모노사이토제네스 균주를 접종하여 희석한 후, 천연 페디오신 PA-1을 160AU로 처리하여 이를 열처리 전과 후로 나누어 PCR 주형으로 사용하였다. PCR 분석은 상기 PCR 주형을 1㎕로 하여 상기 실시예 6과 동일하게 수행하였다. 이의 결과를 도 4에 나 타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 음식물 시료에 임의로 리스테리아 모노사이토제네스 균주를 접종하여 희석한 후, 천연 페디오신 PA-1을 160AU로 처리하여 이를 열처리 전과 후로 나눈 PCR 주형을 이용하여 PCR 산물을 검출한 결과, 오염된 전지우유로부터 수득한 세포수 102CFU/reaction의 리스테리아 모노사이토제네스 균주에 해당되는 PCR 산물이 검출되었으며, 이는 열처리 전과 후에 각각 천연 페디오신 PA-1을 처리한 경우에도 검출 민감성은 변화하지 않았다.
한편, 오염된 생돼지고기로부터 수득한 세포수 10CFU/reaction의 리스테리아 모노사이토제네스 균주에 해당되는 PCR 산물은 열처리 전에 천연 페디오신 PA-1을 처리하였을 때 검출되었다. 그러나, 오염된 생돼지고기로부터 수득한 세포수 103CFU/reaction의 리스테리아 모노사이토제네스 균주에 해당되는 PCR 산물은 열처리 후에 천연 페디오신 PA-1을 처리하였을 때 검출되었다. 이는 천연 페디오신 PA-1을 열처리 전에 처리하면 세포막을 파괴시키므로, 열처리 후 쉽게 DNA가 방출된다는 것을 알 수 있었다.
본 발명의 검출방법 및 검출키트는 시료에 존재하는 리스테리아 속 균종의 검출 민감성을 향상시켜 식중독을 일으키는 미량의 리스테리아 속 균종을 검출할 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (9)
- ⒜ 시료에 서브클레스 Ⅱa에 속하는 박테리오신을 첨가하여 반응시키는 단계;⒝ 단계 ⒜의 반응물을 PCR 주형으로 하고, 리스테리아 속 균종의 DNA를 증폭시킬 수 있는 특이적인 프라이머로 PCR 주형을 증폭하여 PCR 산물을 수득하는 단계; 및⒞ 단계 ⒝에서 수득한 PCR 산물을 전기영동으로 시각화함을 특징으로 하여 리스테리아 속 균종을 검출하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 시료가 우유, 유가공품, 육류 또는 육가공품임을 특징으로 하여 리스테리아 속 균종을 검출하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 서브클레스 Ⅱa에 속하는 박테리오신을 80 내지 240AU로 첨가함을 특징으로 하여 리스테리아 속 균종을 검출하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 단계 ⒜에서 서브클레스 Ⅱa에 속하는 박테리오신을 첨가하여 20 내지 40분동안 시료와 반응시킨 후, 추가적으로 상기 반응물을 90 내지 100℃에서 열처리함을 특징으로 하여 리스테리아 속 균종을 검출하는 방법.
- 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 서브클레스 Ⅱa에 속하는 박테리오신이 천연 페디오신 PA-1; 엔테로신 A; 디버기신 DV41; 메센테로신 Y105; 사카신 P; 쿠어바신 A; 류코신 UAL-187; 및 카노박테리오신 B2으로 이루어진 그룹중에서 선택된 어느 하나임을 특징으로 하여 리스테리아 속 균종을 검출하는 방법.
- 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 서브클레스 Ⅱa에 속하는 박테리오신이 천연 페디오신 PA-1임을 특징으로 하여 리스테리아 속 균종을 검출하는 방법.
- 제 6항에 있어서, 천연 페디오신 PA-1이 페디오코커스 에시디락티시 K10 (Pediococcus acidilactici) 균으로부터 추출한 것임을 특징으로 하여 리스테리아 속 균종을 검출하는 방법.
- 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 리스테리아 속 균종이 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes); 리스테리아 이바노비(Listeria ivanovii); 리스테리아 인노쿠아(Listeria innocua); 리스테리아 세에리게리(Listeria seeligeri); 리스테리아 웰쉬메리(Listeria welshimeri); 리스테리아 그레이(Listeria grayi); 및 리스테리아 머레이(Listeria murrayi)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 어느 하나임을 특징으로 하여 검출하는 방법.
- 리스테리아 속 균종의 DNA를 특이적으로 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍, DNA 중합효소, dNTP 혼합물 및 PCR 반응 완충액으로 구성됨을 특징으로 하는 리스테리아 속 균종 검출키트.
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