CN101084434A - 评价鱼产品的鲜度的方法 - Google Patents

Abstract

一种评价鱼产品的鲜度的方法，其通过从鱼产品上切下少量样品，加入包含细胞－渗透性染料和细胞－不渗透性荧光染料至少之一的染色剂到所述样品上，将所述样品温育达预定的持续时间，并且根据从样品发射的荧光来确定所述鱼产品的鲜度来进行。

Description

评价鱼产品的鲜度的方法

相关申请

该专利申请要求提交于2004年3月12日的临时专利申请号60/552,778和提交于2004年3月15日的临时专利申请号60/553,059的优先权，将其全部公开内容特此清楚地并入作为参考。

发明背景

1.发明领域

本发明涉及检测和评价基于蛋白质的产品的鲜度或降解或酸败的程度，作为基于蛋白质的产品的质量程度的指示。

2.相关领域的描述

评价鱼的鲜度或酸败程度的传统方法包括感觉评价(外观，触摸和嗅觉)。该方法是主观的并且会产生争论。

美国专利号5,744,321公开了快速评价鱼，诸如鳕鱼(codfish)、鲇鱼(catfish)和美洲拟鲽(winter flounder)的细菌降解程度的比色方法，其通过将鱼肉与细菌营养肉汤混合，并且将提取物与水溶性色素原诸如离子化的四唑染料盐反应来进行，所述离子化的四唑染料盐与鱼细菌进行还原反应来产生水不溶性的甲染料或着色的反应产物。接下来，将表面活性剂加入以辅助溶解形成的甲染料，并且产生溶菌作用和终止反应，将脂族醇溶剂加入溶解形成的甲染料或着色的反应产物，并防止随时间进一步的分解和暗色化。溶解的反应产物具有一定颜色，所述颜色根据鱼样品的细菌种群而强化并且可以通过与低、中等和高细菌种群的标准颜色图指示的视觉比较来比色地进行评价。该方法是复杂的因为其包括相当多的步骤和试剂。

因此，对于鱼供应者、饭店、招待公司和食品服务公司等，仍旧存在提供精确、方便和客观的评价鱼产品的鲜度的方法的需要。

发明概述

本发明提供评价鱼产品的鲜度的方法，其包括：

从鱼产品切割下小量样品；

加入有效量染色试剂到样品上，所述染色试剂包括细胞-渗入染料和细胞-不渗透的荧光染料的至少一种；

将与染色试剂一起加入的样品温育达预定的持续时间；和

根据下列参数的至少其中之一来确定鱼产品的鲜度：从被温育的样品发射出的第一荧光的强度，从被温育的样品中发射的第二荧光的强度，从样品的顶部开始到检测第一荧光的样品的最远点的第一距离，和从样品的顶部开始到检测第二荧光的样品的最远点的第二距离。

在存在细胞内酯酶活性的情况下，将细胞-渗透性染料转化为发生第一荧光的化合物。细胞-不渗透荧光染料不穿过活细胞的完整的膜，但是可以渗透细胞被损坏的膜并且发射第二荧光。当染色试剂包括细胞-渗透性染料和细胞-不渗透性染料两者时，第一荧光应与第二荧光区分开，即，它们发射不同的荧光颜色。细胞渗透性染料的实例包括钙荧光素AM和C12-刃天青。细胞-不渗透染料的实例包括EthD-1同型二聚体，Sytox^绿色染料，和YoYo-1染料。

此外，可以将细胞-渗透性染料诸如钙荧光素AM和C12-刃天青与锥虫蓝染料组合使用。锥虫蓝染料染色取决于死细胞的膜完整性的损失。锥虫蓝染料在正常情况下，被完整的细胞膜排除在外。通常，当细胞死亡时，它们对于锥虫蓝染料是可渗透的。因此，锥虫蓝染料可以结合细胞-渗透性染料来猝灭死细胞的荧光。加入锥虫蓝后的荧光的减少可以作为死细胞的测量。

按照本发明的一个实施方案，测定的步骤可以通过将至少一个参数与在鲜度和至少一个参数之间的预先建立的相关性进行比较来进行。

第一荧光和第二荧光的强度可以由数字装置进行量化，并且预先建立的相关性可以根据第一荧光和第二荧光的量化的强度来建立。

按照本发明的另一个实施方案，第一荧光和第二荧光可以由光学装置记录在图像中，并且在鲜度和第一荧光和第二荧光的至少一个的强度之间的预先建立的相关性可以在标准颜色图中进行描述。

优选地，染色试剂包括有效量的钙荧光素AM和有效量的EthD-1同型二聚体。接着，第一产物的鲜度可以根据从样品中发射的红色(EthD-1同型二聚体)荧光和绿色(钙荧光素)荧光来进行测定。

按照本发明的又一个实施方案，在染色试剂中包含的细胞一不渗透性荧光染料是锥虫蓝染料。接着，第一产物的鲜度可以根据在样品中出现的蓝色来确定。优选地，鲜度根据锥虫蓝染料透入样品的距离来进行确定，其中更新鲜的鱼对应更短的渗透距离。

通过所考虑的随后的详细描述结合附图，本发明的其它目的和特点将变得显而易见。然而，要理解的是，图仅出于举例说明的目的进行设计，而不被视为对本发明的限制，本发明的限制应该参考后附的权利要求。还应该理解的是，图不一定按规定比例来绘出，除非另外指出，它们仅倾向于概念性地举例说明本文所述的结构和方法。

附图简述

在附图中：

图1显示在样品中所用的取样管。

图2显示通过使用活着的/死亡的荧光测定，于1℃并且在不同的贮存日收集的鲑鱼(salmon)样品的荧光图像。

图3显示通过使用活着的/死亡的荧光测定，在1℃贮存并且在第1天和第8天收集的鲑鱼样品的荧光图像。

图4举例说明这样的相关性，所述相关性为鲑鱼样品的鲜度和从样品的顶部开始到检测绿色荧光的样品中的最远点的距离与从样品的顶部开始到检测红色荧光的样品中的最远点的距离的比率之间的相关性。

图5显示从活的虹鳟鱼(raibow trout)收集的样品的荧光图像。

图6显示从虹鳟鱼产品收集的样品的荧光图像，所述虹鳟鱼产品在4℃贮存了达7天。

图7举例说明这样的相关性，所述相关性为虹鳟鱼样品的鲜度和从样品的顶部开始到检测绿色荧光的样品中的最远点的距离与从样品的顶部开始到检测红色荧光的样品中的最远点的距离的比率之间的相关性。

图8举例说明这样的相关性，所述相关性为多佛鳎鱼(Dover sole)样品的鲜度和从样品的顶部开始到检测绿色荧光的样品中的最远点的距离与从样品的顶部开始到检测红色荧光的样品中的最远点的距离的比率之间的相关性。

图9显示通过使用活着的/死亡的荧光测定，多佛鳎鱼样品从染料添加到16分钟的时间-推移图像，所述多佛鳎鱼样品在1℃贮存了达5天。

图10显示鲑鱼样品的荧光图像，所述鲑鱼样品在1℃贮存并且在贮存的第1天和第5天收集。

图11举例说明通过使用锥虫蓝测定，锥虫蓝染色染料渗透到鲑鱼样品中的渗透深度，所述鲑鱼样品贮存于1℃，并且在贮存的第1天，第4天，和第7天进行收集。

图12举例说明锥虫蓝染料渗透到鲑鱼样品中的距离，所述鲑鱼样品在1℃从贮存的第1天到第8天进行收。

本发明优选实施方案的详述

实验材料和方法

鲑鱼片

将两个包装的在良好状态下的冷冻鲑鱼片切成8个部分。当仍在冷冻状态时，每个部分是约60克。将四个部分置于持续温度为1℃(+/-0.5℃)的冷室中，将其它的四个部分置于维持在4℃的标准实验室电冰箱中。将所有的这些部分贮存在可再密封的袋中以防止当不取样时氧化和脱水。

取样方法

每天收集鲑鱼片的样品并且观察变化。对于精确的测量，一致的样品的大小是重要的。制作取样的工具来从鱼钻出样品。用在本实验中的工具是clear Lexan(聚碳酸酯树脂)管，所述管具有4.8mm的外部直径，2.1mm的内部直径，和90mm的长度。将管的一端削平以形成切割表面(见图1)。当插入鱼产品的肉中时，将部分的肉挤压到管的底部开口。接着，通过轻轻扭曲和提高，将样品移动并保持在管中。可以将具有2mm外部直径的施用器用于轻轻敲打样品并去除任何空气隙。所述管优选地被设计具有食品安全质量并且是在视觉上透明的。使用其它的丙烯酸类或聚碳酸酯材料也可以是适合的。因此，通过这样的工具获得的样品具有约2.1mm×～5到25mm的大小。

该取样方法具有一些优点，包括：

·小的，可再现的样品大小

·标准样品大小

·整洁的标记容器

·廉价、一次性的无毒工具

·牢固

·可通过管观察的样品

染色，温育

可将少量染色溶液加入所述管的顶部开口，并且温育达适当的时期，例如约10分钟。典型地，染色溶液的体积可以在1μl-1ml的范围内。温育时间可以从1分钟到1小时。

染色溶液可以是包含钙荧光素AM和溴乙非啶(ethidium)同型二聚体的溶液，例如由Molecular Probes′活着的/死亡的生存力/细胞毒性试剂盒(L3224)制作的溶液。所述L3224试剂盒包括两种探针：钙荧光素AM和溴乙非啶同型二聚体-1。钙荧光素AM是荧光酯酶底物，其被水解为绿色-荧光产物(钙荧光素)。因此，绿色荧光是具有酯酶活性以及具有完整细胞膜来维持酯酶产物的细胞的指示物。绿色荧光意为基于酯酶活性的某种水平，它们是活着的。溴乙非啶同型二聚体是高-亲和性、红色荧光核酸染色剂，其仅能够通过死细胞的受损的膜。当它们是红色时，它们是“死的”。钙荧光素AM的浓度的范围从0.1到50μM。EthD-1同型二聚体的浓度范围在0.1到100μM。

活着的/死亡的生存力/细胞毒性测定提供一些优点：

·简易性。将试剂同时加入样品中，其接着在融解过程中或紧随其后温育3-10分钟。在分析前不要求任何洗涤步骤。

·特异性和可靠性。绿色荧光细胞是活的；红色荧光细胞是死亡的。

·变化性。所述活着的/死亡的生存力/细胞毒性测定与黏附性细胞诸如星形胶质细胞，非黏附性细胞和某些组织是相容的。结果可以使用标准荧光素长通(longpass)滤色片装置通过荧光显微镜，以及通过流式细胞术或荧光测定法来进行分析。两种探针的荧光发射容易地被分辨且是可区别的。单一或多个波长的LEDs可以用于提供从360-520nm的激发光范围。其它发光源包括：荧光泡，混合的气体泡，手持UV源，投影灯，和激光器。

·简单量化。个体细胞的测量仅产生两个种群；几乎没有任何不确定染色的细胞。组织可以在“中期”阶段具有染色的混合种群。

染色溶液还可以是锥虫蓝溶液。将锥虫蓝用作测定细胞生存力的比色染料。锥虫蓝溶液的浓度可以在0.1到10mM的范围内。在细胞生物学实验中，锥虫蓝是用于区分活细胞和死细胞的最常用的染色剂。仅死细胞吸收该染料，出现蓝色，并还可以出现不对称。相反地，在未吸收蓝色染料的情况下，活的、健康细胞外观是圆形的，并且是有折射力的。然而，该染料的使用是时间-敏感性的。活细胞随时间吸收锥虫蓝，并且会影响计数和生存力结果。为了防止活细胞吸收该染料而因此呈现为死细胞，可以将用锥虫蓝染色的样品进行稀释。例如，锥虫蓝染色的样品可以通过浸入在0.1M磷酸缓冲液(pH7.4)中的2％戊二醛而进行固定并且贮存以进行后来的观察。为了使死细胞吸收最小化，取样优选地在5-30分钟内结束。此外，与细胞蛋白质相比，锥虫蓝对于血清蛋白质具有更大的亲和性。对于具有高血清条件的细胞而言，背景可能太暗。在该情形下，细胞优选地分离自组织。

图像观察和记录

可以采用反射荧光图像来确证作为贮存时间和温度的结果，对于染色模式发生的任何变化。

为了量化和/或自动化所述方法，可以使用具有图像捕获，贮存，和/或分析功能的成像装置，诸如CCD或CMOS装置。这些装置包括具有数字照相机的UVP BioDocIt系统；具有远摄物镜的Nikon CoolPix 995数字照相机；用亮场、DIC、相和荧光透镜装备的Nikon Eclipse E800照相显微镜；蓝和绿LED光和CCD检测系统。

在本研究中，使用4X，0.13 n.a.水平荧光物镜来观察样品。使用CoolCam液冷、三芯色CCD照相机(Cool Camera Company，Decatur，GA30033)来采集数字图像，并使用Image Pro Plus 4.5版软件(MediaCybernetics，Silver Springs，MD 20910)来将其捕获到Pentium IV 3.0GHz个人电脑中。将数字图像贮存用于将来打印并且使用ImageJ或ImageProPlus来进行分析。将Adobe PhotoShop和Micorsoft PowerPoint应用用于显示。

采集数字图像从而使量化方法可以来自比较作为细胞存活力或“鲜度”的函数的染色样品的颜色。染色样品的颜色和染色剂向样品的渗透深度是评价样品的鲜度的重要标准。

结果

活着的/死亡的荧光测定

染色溶液包含5.0μM的钙荧光素AM和10.0μM的EthD-1同型二聚体。其制备自Molecular Probes′LIVE/DEAD存活力/细胞毒性试剂盒(L3224)的试剂。将约10-30μl的染色溶液加到样品的顶部上(2.1mm×～2-10mm)。样品的鲜度可以根据温育约5-10分钟后，荧光发射的红和绿色的比率的变化来确定。通过在波长490±40nm激发样品并且在525±20nm采集来获得荧光图像。

图2和3显示在相同的温度(1℃)贮存不同的天数的鲑鱼样品的测定结果。在染色剂添加后，如在图2中显示的成像需要5分钟。绿色指示酯酶活性(新鲜)。红色指示具有受损的膜的细胞的核。染色剂从顶部到底部通过的距离似乎与贮存的天数相关。在样品染色后，如在图3中显示的成像需要30分钟。

下面的表显示在贮存于1℃并且在24小时间隔取样的冷冻鲑鱼样品上的荧光鲜度活着的/死亡的测定(5.0μM的钙荧光素AM和10.0μM的EthD-1同型二聚体-1)的归纳数据。图4显示在鱼产品的鲜度和绿色荧光和红色荧光的通过的距离之间的比率之间的相关性。

表1  活着的/死亡的荧光测定的归纳数据

通过的距离与总距离的比率	第1天	第2天	第3天	第4天	第5天	第6天	第7天	第8天
									绿色/总距离	0.89	0.49	0.42	0.44	0.34	0.39	0.32	0.24
对于绿色/总距离的天数之间的SD	0.237
									红色/总距离	0.47	0.58	0.83	0.81	0.83	0.92	0.83	0.84
对于红色/总距离的天数之间的SD	0.155

图5-8显示在相同的温度上贮存不同天数的其它鱼种类的荧光测定结果。图5显示新鲜虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)样品的荧光结果。图6显示在4℃贮存达7天的虹鳟鱼样品的荧光结果。在图6中，上部图像反映样品的绿色和红色信息；中间的图像是来自绿色信息的灰度图像；下面的图像是来自红色信息的灰度图像。图5和图6的成像在将染色剂添加到虹鳟鱼样品后，都需要30分钟。将染色剂加入管的顶部(图像的左侧)的开口。

图7的图表根据虹鳟鱼样品的的测定结果，所述结果来自对于在4℃贮存了7天的鱼每日采集的3条鱼(共12个样品)。所述样品在染色剂添加后，成像30分钟。该图表举例说明对于在同一天所采样品的绿色和红色荧光通过的距离的平均比率。

图8显示多佛鳎鱼(Microstomus pacificus)的鲜度与绿色和红色荧光通过的距离的比率之间的相关性。与图8相关的方法与图7的相同，除了图7中的虹鳟鱼样品用多佛鳎鱼(Microstomus pacificus)所取代。

如在图9中所显示的时间-推移图像证明染料吸收随时间变化。所用的样品是在1℃贮存达5天的多佛鳎鱼(Microstomus pacificus)的样品。

图10显示被置于盘中的鲑鱼样品的荧光图像。

锥虫蓝测量

将约10-30μl的锥虫蓝染色试剂(0.5％w/v)加到样品的顶部上(2.1mm×2～10mm)。测量锥虫蓝染料向样品渗透的深度。温育时间是10分钟。样品已经贮存于1℃并且在室温进行标记。将传递(Trasimitted)/反射光用于观察样品。

图11和12显示鲑鱼样品的鲜度与渗透到样品中的锥虫蓝染料的距离之间的相关性。如在图12中所显示，在染料的渗透距离与样品的总长度的比率上，第1天是独特的，第2天和第3天是相似的，第4天到第8天是相似的。第1天显著不同于其它的天数，并且第2天和第3天显著不同于第4天到第8天。

下面的表列出了锥虫蓝测定的归纳数据。

表2  锥虫蓝测定的归纳数据

锥虫蓝染色	第1天	第2天	第3天	第4天	第5天	第6天	第7天	第8天
									比率(染色剂/样品长度)	0.985	1.078	1.105	1.492	1.453	1.606	1.509	1.557
每天的标准偏差	0.084	0.107	0.112	0.294	0.296	0.484	0.316	0.377
									比率的标准偏差	0.0245
所有的置信区间(95％)	0.307
									每天的置信区间＝每天的比率平均值+和-1.96*sqrt(0.0245)/sqrt(ni)
ni	119	106	110	117	143	182	128	170
									每天的置信区间	下	上
第1天	0.957	1.013
									第2天	1.048	1.108
第3天	1.076	1.134
									第4天	1.464	1.52
第5天	1.427	1.479

第6天	1.583	1.629
									第7天	1.482	1.536
第8天	1.581	1.533

本发明并不由上述实施方案所局限，所述实施方案仅作为实施例出现，但是可以在由后附的专利权利要求所限定的范围内，以各种方式进行改进。

Claims (29)

1.一种评价鱼产品的鲜度的方法，其包括：

从鱼产品上切下少量的样品；

加入有效量的染色剂到样品上，所述染色剂包括细胞-渗透性染料和细胞-不渗透性荧光染料的至少一种；其中所述细胞-渗透性染料转化为在细胞内酯酶活性存在情况下发射第一荧光的化合物；其中所述细胞-不渗透性荧光染料可以渗透到细胞的受损的膜中并且发射第二荧光；并且其中当指示剂包括所述细胞-渗透性染料和所述细胞-不渗透性染料两者时，所述第一荧光和所述第二荧光彼此是可区分的；

将与所述染色剂一起加入的所述样品温育达预定的持续时间；和

根据选自由下列组成的组的至少一个参数来确定鱼产品的鲜度：从所述被温育的样品发射出的所述第一荧光的强度，从所述被温育的样品中发射的所述第二荧光的强度，从所述样品的顶部开始到检测所述第一荧光的所述样品的最远点的第一距离；从所述样品的顶部开始到检测所述第二荧光的所述样品的最远点的第二距离。

2.权利要求1的方法，其中确定的步骤通过将所述至少一个参数与所述鲜度和所述至少一个参数之间的预先建立的相关性进行比较来进行。

3.权利要求3的方法，其中所述第一荧光和所述第二荧光的强度通过数字化装置进行量化，并且所述预先建立的相关性根据所述第一荧光和所述第二荧光的量化的强度来建立。

4.权利要求3的方法，其中所述第一荧光和所述第二荧光的强度由光学装置记录在图像中，并且将在所述鲜度和所述第一荧光和所述第二荧光的至少其中之一的强度的预先建立的相关性在标准颜色图中进行描述。

5.权利要求1的方法，其中所述染色剂包括细胞-渗透性染料和细胞-不渗透性染料二者。

6.权利要求5的方法，其中所述鱼产品的鲜度根据所述第一荧光和所述第二荧光的强度的比率进行确定。

7.权利要求5的方法，其中所述鱼产品的鲜度根据所述第一距离和所述第二距离的比率进行确定。

8.权利要求5的方法，其中所述细胞-渗透性染料是钙荧光素AM，并且所述细胞-不渗透性染料是EthD-1同型二聚体-1，由此所述第一荧光是绿色的，所述第二荧光是红色的。

9.权利要求5的方法，其中所述细胞渗透性染料是C12-刃天青，细胞-不渗透性染料是Sytox Green染料，由此所述第一荧光是红色的，所述第二荧光是绿色的。

10.权利要求1的方法，其中所述细胞-渗透性染料选自由钙荧光素AM和C12-刃天青组成的组，所述细胞-不渗透性染料选自由EthD-1同型二聚体、YoYo-1、和Sytox Green染料组成的组。

11.权利要求1的方法，其中当所述染色剂包括所述细胞-渗透性染料时，所述染色剂还包括锥虫蓝染料。

12.一种评价鱼产品的鲜度的方法，其包括：

从鱼产品上切下少量的样品；

加入染色剂到所述样品上，所述染色剂包括有效量的钙荧光素AM和有效量的EthD-1同型二聚体；

将与所述染色剂一起加入的所述样品温育达预定的持续时间；和

根据绿色荧光的强度和从所述被温育的样品的顶部开始到检测所述绿色荧光的所述被温育的样品的最远点的第一距离的至少其中之一，和红色荧光的强度和从所述被温育的样品的顶部开始到检测所述红色荧光的所述被温育样品的最远点的第二距离的至少其中之一来确定鱼的鲜度。

13.权利要求12的方法，其中所述鲜度的确定根据所述绿色荧光和所述红色荧光的强度的比率来确定。

14.权利要求12的方法，其中所述鲜度的确定根据所述第一距离和所述第二距离的比率来确定。

15.权利要求12的方法，其中所述鲜度通过将所述绿色荧光和所述红色荧光的强度与所述鲜度和所述绿色荧光和所述红色荧光之间的预先建立的相关性进行比较来进行确定。

16.权利要求15的方法，其中所述绿色荧光和所述红色荧光的强度由数字化装置来进行量化，所述预先建立的相关性根据所述绿色荧光和所述红色荧光的量化的强度来进行确定。

17.权利要求15的方法，其中由光学装置来将所述绿色荧光和所述红色荧光的强度记录在图像中，将在所述鲜度和所述绿色荧光和所述红色荧光的强度之间预先建立的相关性描述在标准颜色图中。

18.权利要求12的方法，其中所述染色剂包括0.1-50μM的钙荧光素AM。

19.权利要求12的方法，其中所述染色剂包括0.1-100μM的EthD-1同型二聚体。

20.权利要求12的方法，其中所述染色剂的量从约1μL到1mL。

21.权利要求12的方法，其中所述温育步骤的预定持续时间从约1到45分钟。

22.权利要求12的方法，其中所述温育步骤的预定持续时间从约5到10分钟，并且所述温育步骤在室温进行。

23.权利要求12的方法，其中所述鱼产品选自由鲑鱼(salmon)、虹鳟鱼(rainbow trout)、多佛鳎鱼(Dover sole)和大比目鱼(halibut)组成的组。

24.一种评价鱼产品的鲜度的方法，其包括：

从所述鱼产品切下少量的样品；

将包括有效量的锥虫蓝染料的染色剂加到所述样品上；

将与所述染色剂一起加入的样品温育达预定的持续时间；

根据从被温育样品的顶部开始到检测蓝色荧光的被温育样品的最远点的渗透距离来确定所述鱼产品的鲜度。

25.权利要求24的方法，其中通过将渗透距离与所述鲜度和渗透距离之间的预先建立的相关性进行比较来确定鲜度。

26.权利要求24的方法，其中所述染色剂包括0.1-10mM的锥虫蓝染料。

27.权利要求24的方法，其中所述染色剂的量从1μL到1mL。

28.权利要求24的方法，其中所述温育步骤的预定时期从约2分钟到45分钟。

29.权利要求24的方法，其中温育步骤的预定时间周期从约10-30分钟，并且在室温进行所述温育。

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