NO317169B1 - Blanding og framgangsmåte for merking av fisk - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår bruk av en eller flere kjemiske forbindelser for kommersiell, sporbar merking av fisk, i samsvar med den innledende delen av patentkrav 1.

Bakgrunn

I den marine oppdrettsnæringen har til dags dato ikke enkeltindivider blitt merket, men ønsker og behov for dokumentasjon av miljø overfor forbrukere og ulike ledd i produksjonskjeden, har aktualisert behovet for innføring av et identifikasjonssystem som muliggjør identifikasjon av individer i den enkelte bedrift, sjøanlegg eller merd. Miljø-forvaltningen har uttrykt ønske om merking for å skille vill fisk fra oppdrettsfisk, og for å kunne iverksette tiltak for å begrense rømningen av oppdrettsfisk. De samme hensyn ligger til grunn når amerikanske og europeiske myndighetene nå søker fortgang i denne utviklingen og ønsker å innføre merking av oppdrettsfisk på merd-nivå. De fremtidige kravene/behovene for å ta hensyn til miljøet (sykdomsspredning, rømning mv.) vil være avgjørende for hvilke krav til identifikasjon som vedtas. Identifikasjon vil i mange sammenhenger bety at enkeltindivid kan spores tilbake til hvilket selskap som var produsent, samt hvilken årsklasse, region, lokalitet og/eller merd individet har gått i.

Flere ulike kommersielle merkemetoder er i dag tilgjengelig på markedet. De fleste baserer seg på indre og ytre fysisk merking og individuell håndtering ved merking. Blant disse kan nevnes CWT-snutemerke, PIT-tag, VIT-merke, Carlin-merke og Floy-merke. Metodene er imidlertid i stor grad utviklet for identifikasjon av et begrenset antall individer og primært tilpasset forskningens behov.

Det er også kjent kjemisk merking ved badbehandling med bruk av merkestoffet alizarin complexone og identifikasjon ved visuell deteksjon av "strekkoder" i otolitt gjennomført og benyttet i forbindelse med utprøving og forskning (Iglesisas & Rodriguez-ojea 1997; Moen 1996,2000). Identifikasjon av merke betinger at fisken avlives og at otolittene taes ut for avlesning. Det samme gjelder for merking som beskrevet i britisk patent 2320960 og publikasjoner av Campana, S.E. 1999; og Blom G. 1994.

Det er imidlertid fremdeles et behov for rask og effektiv merking av et større eller mindre antall individer tilhørende en gruppe fisk. Det er også ønskelig med muligheter for gjentatt identifikasjon av enkeltindivid tilhørende en gruppe, ved gjentatte prøvetak enten i produksjonskjeden eller senere. Dette vil i de fleste tilfeller kreve to typer deteksjon, både en rask grovdeteksjon i felt (skille all merket fisk fra umerket fisk) og en findeteksjon (for å bestemme merkekoden gitt et enkeltindivid). I dag finnes det ingen merkemetoder som har de nevnte egenskapene og som dekker behovet for merking ved kommersiell produksjon av laksefisk. For å skille merkene fra hverandre vil det være behov for å produsere og detektere et stort antall stabile merkekoder. Dagens metoder for kjemisk merking har også i denne sammenhengen klare begrensninger.

Formål

Formålet med foreliggende oppfinnelse er å benytte en eller flere forbindelser for merking av fisk i en gruppe, idet hver gruppe har et unikt merke. Merket som oppnås skal både være lett tilgjengelig slik at det enkelt skal kunne avgjøres hvorvidt fisken er merket, det skal følge fisken fra merking til forbruk, og dersom fisken er merket skal det kunne bestemmes hvor den kom fra, uten at fisken må avlives. Det skal videre kunne oppnås et høyt antall stabile merkekoder, og kodene skal kunne detekteres kvalitativt og kvantitativt uten at fisken må avlives. Det er dessuten et formål at framgangsmåten ikke skal være arbeidskrevende, forstyrre fisken som organisme eller gjøre den uegnet som mat.

Oppfinnelsen

Formålet med oppfinnelsen oppnås ved bruk i samsvar med de karakteriserende delen av

patentkrav 1. Ytterligere fordelaktige trekk er gitt i de uselvstendige patentkrav.

Oppfinnelsen angår bruk av en eller flere kjemiske forbindelser for merking av fisk. Med oppfinnelsen oppnås et merke i fisken slik at den kan spores tilbake gjennom alle prosessene, og både produsenten av smolt og slakte-fisk kan fastslås. Det kan videre være mulig å fastslå både hvilket oppdretts-anlegg fisken ble produsert ved, og hvilken merd den har gått i. Dette oppnås ved at forbindelsen(e) som benyttes bevares som et merke i strukturer med lav metabolsk aktivitet og som ikke står i likevekt med det omkringliggende vev. Kjemiske forbindelser som er naturlig forekommende og som bindes til ytre kalsiumrike strukturer på en slik måte at de kan påvises og/eller analyseres senere, vurderes som mest egnet.

Med kalsiumrike strukturer er det i denne sammenhengen ment kalsiumstrukturer

generelt, og skjell, bein, finnestråler, tenner og otolitt på fisk spesielt.

Alizarin, calcein og relaterte forbindelser er eksempler på egnete substanser til bruk ved kjemisk merking av fisk i samsvar med foreliggende oppfinnelse. I følge SNT (Statens

Næringsmiddel Tilsyn) er det ingen helsefare forbundet med inntak av fisk merket med alizarin og/eller calcein. Alizarin er et veldokumentert farvestoff og finnes naturlig i roten av planten Rubia tincturum L. Alizarin har en spesiell affinitet overfor kalsium i bein og har derfor blitt brukt diagnostisk/ eksperimentelt til studier av beinvev i vekst hos mennesker og dyr.

Fisken kan merkes én eller flere ganger i løpet av sin levetid. Ettersom fisken vokser etter merking, vil plassering og størrelse av selve merket gi informasjon om tidspunktet for merking i forhold til fiskens alder. Dersom fisken merkes flere ganger, vil det finnes et tilsvarende antall merker i de kalsiumrike strukturene hos fisken. For deteksjon/påvisning av forbindelser opptatt/avleiret i skjell, vil et merke (som for skjell og otolitter vil opptre som en sirkel) nært sentrum av skjellet tyde på at fisken ble merket på et tidlig stadium, mens andre merker som ligger nærmere kanten av skjellet (dvs. som har større radius enn det første merket), vil representere merkinger som ble gjort på et senere tidspunkt. Tidspunktet for merking av fisk, kan for eksempel være hver gang den overføres til en ny produsent eller ei ny merd, slik at fisken får merkene etter hvert som den forflyttes.

De ulike forbindelsene og/eller derivatene i hvert merke, samt antall merker og rekke-følgen av disse vil kunne gi et tilnærmet uendelig antall kombinasjoner. Hver kombinasjon tilsvarer et gitt hendelsesforløp, og dermed kan fiskens forhistorie bestemmes. Det vil si at en fisk som har tre ulike merker hvor alle bare inneholder alizarin complexone, ikke har den samme forhistorien som en fisk med tre ulike merker hvor to inneholder bare alizarin complexone, og det tredje merket inneholder en kombinasjon av alizarin complexone og calcein.

Fisken kan også merkes bare én gang, hvilket kanskje vil være det mest hensiktsmessige. I disse tilfellene tilsvarer kombinasjonen av de ulike forbindelsene og/eller derivatene i det ene merket et gitt hendelsesforløp, og dermed kan fiskens forhistorie bestemmes. Ved tidspunktet for merking angis både fiskens tidligere historie og dens framtid. Det vil derfor være tilfeller hvor fisk fra én smoltprodusent merkes med ulike kombinasjoner av forbindelser/derivater, som alle angir den samme smoltprodusenten, men ikke samme oppdrettsanlegget, fordi fisken skal overføres til et antall produksjons-anlegg. I dette tilfellet kan fisken merkes for eksempel samtidig med vaksinering.

I tillegg til kombinasjonen av antall forbindelser og derivater, samt rekkefølgen av merker i de tilfellene fisken er merket flere ganger, kan det tenkes at mengden av de ulike forbindelsene også kan benyttes for å gi et ytterligere differensiert merke.

I praksis vil hver fisk tilhøre en gruppe, og alle fiskene i gruppen har den samme historien. Hver fisk i gruppen merkes med en eller flere kjemiske forbindelser, idet både forbindelsen(e) og mengden av de ulike forbindelsene er lik for hver fisk i gruppen, og er forbeholdt den gruppen. Gruppen kan dermed identifiseres ut fra hvilke forbindelser og/eller mengden av forbindelser som er avleiret i kalsiumrike strukturer i fisken. Det forutsettes selvsagt at det finnes en oversikt over hvilke grupper som er merket med hvilke forbindelser, og hvilken historie de ulike gruppene har.

Fisk i alle størrelser kan merkes på konvensjonell måte. For små fisk (rogn, larve og yngel) kan merkestoffet for eksempel tilføres i vannbad, mens for større fisk kan merkestoffet tilføres ved intraperitoneal injeksjon. Dersom fisken merkes på øyerogn-, larve- eller tidlig yngel stadiet, vil merket bare inkoroporeres i otolitten, fordi skjellene ennå ikke er utviklet. Slike merker kan selvsagt ikke detekteres uten at fisken avlives. Merkingen av de større fiskene kan med fordel gjøres samtidig med andre injeksjoner, så som vaksinasjon. Det kan også tenkes utførelser hvorved forbindelsen(e) utgjør en bestanddel i et for, slik at fisken opptar forbindelsen(e) via mage- og tarmsystemet.

Det vil være en fordel å merke fisken på et tidlig stadium, slik at den alltid er merket, men etter at skjellene er dannet. Det vil da være mulig å skille oppdrettsfisk fra villfisk, uansett på hvilket tidspunkt oppdrettsfisken kom ut av oppdretts-, eller smoltanlegget.

Alle forbindelsene som benyttes for merking av fisk i samsvar med foreliggende oppfinnelse, må festes til eller opptas/avleires i kalsiumrike strukturer i fisken, og forbli der i det minste i vesentlige deler fiskens levetid. Forbindelsene må dessuten ikke finnes naturlig i fiskens miljø, og ikke endre/forstyrre metabolismen hos fisken vesentlig. Dersom forbindelsene finnes naturlig i fiskens miljø, vil de kunne opptas i de kalsiumrike strukturene uten kontroll, og ødelegge den kommersielle merkingen. Merkene bør selvsagt heller ikke endre metabolismen til fisken vesentlig, da fisken skal kunne produseres og benyttes på tilsvarende måte som i dag.

Minst en av forbindelsene som benyttes for merking av fisk bør være lett å påvise. Det kan for eksempel være en fluoriserende forbindelse, eller en forbindelse med farge, enten i eller utenfor det synlige området. Når det skal avgjøres hvorvidt en fisk er merket, ved såkalt grovdeteksjon, er funnet av en slik forbindelse i en kalsiumrik struktur, nok til at fisken blir klassifisert som merket. Dersom det er ønskelig med ytterligere informasjon om fisken, kan en eller flere kalsiumrike strukturer findetekteres, og eventuelt andre forbindelser i de kalsiumrike strukturene påvises. Som nevnt vil kombinasjonen av forbindelsene (samt eventuelt rekkefølge av merkene) gi den informasjon som er tilgjengelig for den aktuelle fisken.

Det kan også være mulig å benytte forbindelser som blir endret/derivatisert på kjent måte ved opptaket i de kalsiumrike strukturene. Fisken blir i slike tilfeller merket med en forbindelse, mens det er et derivat av denne forbindelsen som detekteres/påvises i et senere stadium.

I tillegg bør i det minste en av forbindelsene som benyttes være lett å derivatisere, slik at en tilstrekkelig differensiert merke-kode kan oppnås, idet både forbindelsen og dens derivater kan benyttes. Det kan dermed være aktuelt at en produsent benytter en forbindelse for merking av fisk, men at de ulike anleggene hos denne produsenten benytter ulike derivater av forbindelsen. Dermed vil forbindelsen som sådan identifisere produsenten, mens derivatet identifiserer anlegget som fisken ble produsert ved.

Ettersom forbindelsene også festes til/opptas/avleires i kalsiumrike strukturer som er lett tilgjengelige og kan fjernes uten å skade fisken, blant annet i skjellene på yttersiden, er det mulig å gjennomføre hele deteksjonen og avgjøre hvor fisken kommer fra, uten at den må avlives, og selv etter at den er oppgjort, det vil si etter at innvoller, hode og spole er skåret av. Det kan også bestemmes fra en filet, dersom skinnet ikke er fjernet.

Det finnes mange ulike forbindelser som kan benyttes i samsvar med foreliggende oppfinnelse, se f.eks. i H. J. Conn's Biological Stains, Williams & Wilkins Co, Baltimore, 9. utg. 1977, side 341. Forbindelsen kan være valgt fra gruppen omfattende Basic Fuchsin, Brilliant Blue G, Brilliant Cresyl Blue, Eosin, Eosin Yellow, Metyl Violet B, Ponceau S, Nuclear Fast Red, Hemaoxylin, Erythrocin B, Basic Blue 24, Calcein Blue, Oxytetracycline, Alizarin Red S, Rodizonic Acid, Xylenol Orange, Alizarin Violet 3R, Alizarin Yellow GG, Alizarin Cyanin Gr. G, Alizarin Yellow R, Indigo Carmine, Fluorescein, Fast Green FCF, Chlorazol Black E, Remazol Brilliant Blue, Alizarin Complexone, Calcein, og Procion Brilliant Blue, samt derivater av disse.

Eksempel

Foreliggende oppfinnelse vil i det følgende beskrives med henvisning til forsøk med merking av fisk. Resultatene av forsøkene er vist i vedlagte figurer, hvor

figur 1 viser fluorescerende merker i skjell, tatt ved ulike tidspunkt under forsøkene, og figur 2 viser resultater av findekteksjon av skjell, tatt ved ulike tidspunkt under forsøkene.

Det ble utført to forsøk for merking av fisk, hvor det første var et korttids-forsøk med prøveuttak og vurdering av endringer over tid. Forsøket hadde en varighet på 14 dager, og det ble benyttet seks grupper av fisk hvorav fem ble merket med ulike konsentrasjoner av alizarin complexone, og en gruppe forble umerket for kontroll. Det ble kun registrert dødelighet ved den høyeste konsentrasjonen (150 mg/kg) etter en dag, da én fisk, tilsvarende 20 %, døde.

I korttidsforsøket ble det også foretatt en makroskopisk undersøkelse av pankreas for å kartlegge eventuelle histologiske forandringer grunnet merkingen, fra alle grupper etter 14 dager i korttidsforsøket. Tre fisk fra hver gruppe ble undersøkt. Resultatene viste ingen celleforandringer i noen av prøvene uansett konsentrasjon.

Det andre forsøket var et langtidsforsøk som varte i 6 måneder, hvor det ble benyttet to konsentrasjoner av alizarin complexone; 100 mg/kg som en relativt høy dose og 30 mg/kg som en relativt lav dose, for merking av fisken. Nødvendig prøvemateriale for kvalitative og kvantitative undersøkelse i ytre strukturer ble tatt ut og opparbeidet fortløpende i prosjektperioden.

Som det aktive merkestoffet ble det benyttet alizarin complexone (ALZ) [Sigma A3882; C19H15N08; FW 385,3; Lot 117H0509; 3952-78-1] i begge forsøkene, da alizarin complexone er å anse som en modell-forbindelse for de forbindelsene som er aktuelle i samsvar med foreliggende oppfinnelse. Merkestoffet ble løst i fysiologisk saltvann, tilsatt NaCl og bufret ved tilsetning av tris-buffer til pH nær 7. Det ble tilsatt 300 mg NaCl pr 100 ml fysiologisk saltvann. Tabell 1 gir en oversikt over utveid mengde alizarin complexone og målte pH-verdier i løsningene.

Fisken ble merket ved stikkmerking i buk. Fiskematerialet benyttet i korttidsforsøket var presmolt laks med jevn størrelse og snittvekt på 22,5 g. I langtidsforsøket ble det benyttet laks med en snittvekt på 30 g. Det ble injisert et standard væskevolum på 0,2 ml i all fisk i henhold til S-1007. Kontrollgruppen (0 mg/kg) ble injisert 0,2 ml fysiologisk saltvann. Fisken ble finne/ kjeveklipt på samme tidspunkt i henhold til S-1011.

Grovdeteksjon - kvalitativ deteksjon i ytre strukturer

For å avgjøre hvorvidt fisken var merket, ble det benyttet grovdeteksjon av skjell. Skjell har ei relativt rein og jevn overflate hvor veksten hovedsakelig er to-dimensjonal, hvilket gjør skjell egnet for fluorescens/farge måling. Det er allerede etablert rutiner for uttak av skjellprøver blant sportsfiskere og andre som håndterer fisk, og dette gjør skjell enda mer attraktivt som måleobjekt.

I et konvensjonelt fluorimeter kan det enkelt konstanteres hvorvidt fisken er merket med en fluoriserende forbindelse. Det kan også benyttes forbindelser som ikke er fluoriserende, men som har farge enten i, eller utenfor det synlig området. I de tilfeller det benyttes en forbindelse med farge, kan det for eksempel benyttes et spektrometer for påvisning av forbindelsen som beviser at fisken er merket. Intraperitoneal merking viste god innfarging i både tenner, finnestråler og skjell, og emisjonen/fluorescensen var imidlertid tilnærmet lik fra alle kalsiumrike strukturer.

Grovdeteksjonen ble utført ved at skjell fra de ulike fiskene ved de ulike tidspunktene ble tørket og festet til ei remse av plastfolie som deretter ble plassert diagonalt i ei kyvette, hvoretter kyvetten ble plassert i et spektrometer. Fluorescensen eller fargen ble deretter målt på kjent måte i spektrometeret.

Det ble også utført en modifisert type grovdeteksjon, hvor skjellene ble behandlet som ovenfor, men det ble satt til væske i kyvetten, i tillegg til plastfolien med skjellet. pH-verdien på ei slik væske har innvirkning på styrken av det målte signalet, idet syrer svekker signalet. Dermed kan for eksempel emisjonen fra et skjell først måles på vanlig måte uten væske eller med en base, og deretter med syre, slik at emisjonen fra sistnevnte kan benyttes til å trekke fra all uspesifikk emisjon fra skjellet. På denne måten kan selv svake signal detekteres og benyttes for påvisning av den aktuelle forbindelsen.

Det kan selvsagt også benyttes andre framgangsmåter for grovdeteksjon, for eksempel mikroskopering, hvilket vil være opplagt for en fagperson.

Merket var godt synlig i alle prøver fra korttidsforsøket, med unntak av gruppe 1(10 mg/ kg) som gav marginal verdi for sikker deteksjon. Med hensyn på fluorescensen ble optimal eksitasjon oppnådd ved eksitasjonslys omkring 530 nm, og emisjonen var maksimal rundt 620 nm.

Merking med alizarin complexone - 30 mg/kg gav et synlig merke, men synes å være for svakt til å gi en helt entydig positiv avlesing i skjell etter 3 og 6 måneder. Merking med 100 mg/kg gav derimot et merke som var detekterbart i hele forsøksperioden. Styrken på merket ble redusert i løpet av forsøksperioden, og målingene antydet en halvering av fluorescens i løpet av seks måneder. Dette kan blant annet være knyttet til vekststrukturen i skjell. Veksten hos skjell skjer i tre dimensjoner, selv om veksten i det to-dimensjonale planet dominerer. Reduksjon i emisjon kan skyldes endringer i overflatestruktur og økt tykkelse, økt absorpsjon og spredning, som derved reduserer signalstyrken tilbake til måle-instrumentet (redusert emisjon). Visuell inspeksjon av skjell i fluorescensmikroskop viste imidlertid at merker både i høy- og lav-dose gruppene var godt synlige etter seks måneder, (se figur 1. Intensiteten kan ikke sammenlignes mellom bildene på grunn av automatisk blendejustering i kameraet som ble benyttet).

Erfaringer som er gjort per i dag med fluorescerende merker i kalsiumrike strukturer hos fisk viser at merket i skjell vil holde seg gjennom hele, eller i det minste i vesentlige deler av fiskens liv. Skjell som først er dannet er metabolsk inaktivt, med unntak av mulig erosjon i ytterkant som følge av kalsiummangel under spesielt vanskelige næringsforhold. Den indre delen av skjellet som viser vekstsoner er dekt av utenpåliggende pigmenterte hudfolder og vil slik være beskyttet mot UV-stråling som kan føre til eksitasjon og svekking av merke.

Findeteksjon - kvantitativ deteksjon i ytre strukturer

Skjell kan løses opp uten at alizarin complexone blir brutt ned i vesentlig grad, og under langtidsforsøket ble mengden alizarin complexone i skjellprøver tatt ut ved ulike tidspunkt, findetektert. Prøvene ble opparbeidet og fullstendig oppløst i maursyre med 10% vann, ved 80°C i 10 timer, og deretter dampet inn til et volum på ca 100 mikroliter og overført til prøveglass med 200 mikroliter "low-volume insert". Prøvene ble deretter analysert med LCMS (Liquid Chromatograpy Mass Spectrometry) på et Agilent 1100 MSD instrument. De kunne også ha blitt analysert på GCMS (Gas Chromatography Mass Spectrometry), eller med en annen analysemetode, hvilket vil være opplagt for en fagperson. Massespektrometri som prinsipp besitter "fingerprint" egenskaper, og er et godt utgangspunkt for oppbygging av et deteksjons-system for merking, utført i samsvar med foreliggende oppfinnelse.

LCMS-metoden er basert på kjemisk ionisasjon i negativ modus med m/z 384 som hovedion. Prøvene ble analysert ved injeksjon av 1 ul ekstrakt ved hjelp av en autosampler, og separert på en 15 cm cyanokolonne med mobilfase 80/20 metanol/ammoniumacetat 50 mM og mobilfaseflow 1 ml/min. Alizarin complexone hadde under disse betingelser en retensjontid på 2,3 minutter og en total analysetid på 5 minutter per prøve.

Resultatene fra analysene er vist i figur 2. Måleresultatene for m/z 384 er gitt som arealenheter for en topp med retensjonstid på 2,3 min og uttrykker mengden av alizarin complexone relativt i prøvene. (M/z er et forholdstall mellom molekylets masse (molekylvekten) og det antall ladninger molekylet har (som oftest 1)). Det er også vist resultat for m/z 326 som kan være et uttrykk for et mulig nedbrytningsprodukt av alizarin complexone (Alizarin complexone etter tap av én av karboksylsyregruppene).

Alizarin complexone kunne analyseres ved alle målepunktene, og målingene av skjell fra fisk merket med 100 mg/kg viste høyere respons enn målinger fra fisk gitt 30 mg/kg (se fig.

2, m/z 384). Det ble observert en reduksjon i respons etter 6 måneder, som sannsynligvis skyldtes et måleteknisk artefakt og at uttaket av prøver ble basert på vektmengde skjellmaterial, og ikke på basis av antall skjell.

Ut fra forventningen om at det kvantum merkestoff som inkorporeres i skjell vil forbli uforandret, viser målingene en relativt stor variasjon mellom forsøksgruppene men liten variasjon innen hver gruppe (figur 2). Variasjonen mellom forsøksgruppene kan ha flere årsaker, blant annet at mengde skjell som ble benyttet i analysen ble tatt ut på grunnlag av volum og ikke antall skjell. Dette forholdet kan ha ført til at det ble benyttet færre skjell ved analysen av prøver innsamlet etter 6 mnd i forhold til de innsamlet etter 1 og 3 mnd.

Foreliggende oppfinnelse er ikke begrenset bare til det som hovedsakelig er vist og beskrevet ovenfor, hvilket vil forstås av fagpersoner. Oppfinnelsen omfatter også kombinasjoner og under-kombinasjoner av de beskrevete trekkene, samt modifiseringer og variasjoner av dette, hvilket vil være opplagte for en person som kjenner teknikkens stand, og som faller innen ramma for de følgende krav.

Claims (5)

1. Bruk av en eller flere kjemiske forbindelser og/eller derivater for kommersiell, sporbar merking av fisk i en gruppe, idet forbindelsene er karakterisert ved at - de ikke er naturlig forekommende i fiskens miljø, - de bindes vedvarende til kalsiumrike strukturer i fisken uten endre fiskens naturlige metabolisme vesentlig, og - idet minste en av dem kan påvises i kalsiumrike strukturer ved farge eller fluoresence, hver fisk merkes én gang og den benyttete forbindelsen, kombinasjonen av forbindelser og/eller mengden av forbindelsen(e) er spesifikk for gruppen av fisk, slik at gruppen fisken tilhører kan identifiseres.

2. Bruk i samsvar med krav 1, hvor den forbindelsen eller kombinasjonen av forbindelsene og/eller mengden av forbindelsen(e) som er spesifikk for en gruppe, kan identifiseres fra kalsiumrike strukturer i fisken, fortrinnsvis i skjell, ved massespektrometri.

3. Bruk i samsvar med krav 1 eller 2, hvor i det minste en av forbindelsene er derivatiserbar.

4. Bruk i samsvar med et av kravene 1-3, hvorved forbindelsen eller forbindelsene er valgt fra gruppen omfattende Basic Fuchsin, Brilliant Blue G, Brilliant Cresyl Blue, Eosin, Eosin Yellow, Metyl Violet B, Ponceau S, Nuclear Fast Red, Hemaoxylin, Erythrocin B, Basic Blue 24, Calcein Blue, Oxytetracycline, Alizarin Red S, Rodizonic Acid, Xylenol Orange, Alizarin Violet 3R, Alizarin Yellow GG, Alizarin Cyanin Gr. G, Alizarin Yellow R, Indigo Carmine, Fluorescein, Fast Green FCF, Chlorazol Black E, Remazol Brilliant Blue, Alizarin Complexone, Calcein, og Procion Brilliant Blue, samt derivater av disse.

5. Bruk i samsvar med krav 4, hvor det bare benyttes Alizarin complexone og derivater av denne.