JPH10136996A - 微生物の染色組成物、微生物の染色方法ならびに微生物の染色組成物の保存方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 微生物数を迅速かつ簡便に測定し得るのみな
らず、着色度が時間とともに変化しにくい、微生物の染
色組成物及び微生物の染色方法を提供する。また、保存
安定性に優れた、微生物の染色組成物ならびに保存方法
を提供する。 【解決手段】 色素及び界面活性剤を含有する組成物で
あって、ｐＨを４〜６に調整した組成物を用いるか、色
素及び界面活性剤を含有する組成物を用いてｐＨを４〜
６に調整した状態で染色する。色素及び界面活性剤を含
有する組成物を、ｐＨが４〜６に調整された状態で保存
するか、色素を含有する組成物をｐＨが４〜６に調整さ
れた状態で保存し、使用前に界面活性剤を添加する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、微生物の染色組成
物、微生物の染色組成物の保存方法ならびに微生物の染
色方法に関するもので、例えば、細菌数測定用の染色液
や、染色手法を用いた細菌数の測定方法に利用できる。
本発明の微生物の染色組成物ならびに染色方法は、尿中
の細菌が問題となる診断分野をはじめ、金属加工油分
野、腐敗が問題となる染料分野，食品分野、温泉水など
の環境分野など、広汎な分野において有効に利用するこ
とができる。

【０００２】

【従来の技術】従来より、尿検査分野などでは、炎症の
発見や病状を推定するために、尿等の試料中の細菌数等
の測定が行なわれている。例えば、尿中の細菌が増殖し
た場合、細菌尿と診断され、尿路感染症が暗示される。
従って、早期治療や薬投与のため、細菌数の測定を行な
っている。このような場合、細菌数の測定は、平板培養
法により行われる場合が多く、その場合には検査結果の
判明は尿採取の翌日となる。このため、迅速かつ適切な
緊急処置ができないという問題があった。

【０００３】また、食品分野などでは、食品が腐敗して
いないかどうかを判断するために食品中の細菌数等の測
定が行なわれており、さらに発酵乳や乳酸菌飲料などで
は食品中の乳酸菌数管理のために食品中の乳酸菌数の測
定が行なわれている。このような場合の細菌数の測定
も、寒天平板培養法により行なわれるのが主流であり、
結果が出るのに２４〜４８時間を要する。

【０００４】細菌を迅速に検出する方法として、細菌を
染色してその数を測定する手法が開発されている。例え
ば、特公昭５６−３８１９６号公報には、キレート剤と
染料からなる組成物を用いて、約７．０以上のｐＨで細
菌を染色する技術が開示されている。また、特開平１−
１２４７６７号公報には、ｐＨが８から１２において緩
衝液に可溶であるとともにこのｐＨ域において機能する
色素を用いる細菌の染色方法が開示されている。そし
て、この両公報とも、染色後の過剰色素除去のため、酸
性溶液を採用している。また、染色後の着色度の変化に
ついては言及されていない。

【０００５】本出願人においても、測定結果の判明まで
に長時間かかるという従来の欠点を解消するものとし
て、特開平６−２０９７９０号公報において、フクシン
とともにモノエタノールアミンを用いて微生物を染色し
た後に疎水性フィルターに捕集し、次いで過剰のフクシ
ンを除去し、微生物の着色度から試料中の微生物菌数を
測定する方法を開示している。この手法により、迅速か
つ簡便に微生物菌数が測定できる。しかしながら、この
方法においては、着色度が時間とともに変化する場合が
あり、更なる改良が望まれていた。

【０００６】また、微生物の染色組成物は、保存中に退
色したりすると、着色度から試料中の微生物菌数を測定
する場合、正確な結果が得られなくなる。このため、調
製後、長期間（例えば、２カ月以上）同一の染色性が保
持される組成物が望まれていた。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記従来技
術の問題点を解決し、試料中の微生物の存在あるいは存
在数を迅速、かつ簡便に測定し得るのみならず、染色後
着色度が時間とともに変化しにくい、微生物の染色組成
物及び微生物の染色方法を提供することを目的とするも
のである。

【０００８】本発明は、また、長期間同一の染色性が保
持される、微生物の染色組成物の保存方法の提供を目的
とするものである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意研究を重ねた結果、色素と界面活
性剤を含有するとともに特定のｐＨに調整された組成物
を用いることにより、あるいは色素と界面活性剤を含有
する組成物を特定のｐＨで用いることにより、上記の課
題が解決されることを見出した。特に、従来細菌の染色
性のみに着目し、中性〜塩基性領域で着色する技術に代
えて、弱酸性領域で機能する組成物を用いることによ
り、染色性のみならず、着色度の保持性が改良されたこ
とは、予測外の知見であった。本発明は、かかる知見に
基づいて完成させたものである。

【００１０】すなわち、本発明の要旨は以下のとおりで
ある。 （１）．色素及び界面活性剤を含有する組成物であっ
て、ｐＨを４〜６の範囲に調整したことを特徴とする微
生物の染色組成物。 （２）．色素、界面活性剤及び塩を含有する組成物であ
って、ｐＨを４〜６の範囲に調整したことを特徴とする
微生物の染色組成物。 （３）．塩を０．５〜３．０％（ｗ／ｖ）含有する請求
項２記載の微生物を染色する組成物。 （４）．色素及び界面活性剤を含有する組成物をｐＨが
４〜６の範囲内で微生物と接触させる微生物の染色方
法。 （５）．色素、界面活性剤及び塩を含有する組成物をｐ
Ｈが４〜６の範囲内で微生物と接触させる微生物の染色
方法。 （６）．色素を含有する組成物をｐＨ４〜６の範囲に調
整した状態で保存することを特徴とする微生物の染色組
成物の保存方法。 （７）．色素及び界面活性剤を含有する組成物をｐＨ４
〜６の範囲に調整した状態で保存することを特徴とする
微生物の染色組成物の保存方法。 （８）．色素及び塩を含有する組成物をｐＨ４〜６の範
囲に調整した状態で保存することを特徴とする微生物の
染色組成物の保存方法。 （９）．色素、界面活性剤及び塩を含有する組成物をｐ
Ｈ４〜６の範囲に調整した状態で保存することを特徴と
する微生物の染色組成物の保存方法。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明の微生物の染色組成物（以
下、染色組成物と略記する。）は、色素及び界面活性剤
を必須成分とし、ｐＨが４〜６に調整されていることが
必要である。本発明の染色組成物に使用される色素は、
微生物が染色されるものであればよい。また、本発明の
染色組成物は通常、水溶液として使用されるため、上記
の色素は水溶性であることが好ましい。このような色素
として、例えば、フクシン、サフラニン−Ｏ、メチレン
ブルー、メチルグリーン、クリスタルバイオレット、ゲ
ンチアナバイオレット、ビクトリアブルーＢなどが挙げ
られるが、微生物濃度による着色の程度に差が出やす
く、微生物の有無や微生物数の判定がし易い、フクシン
やサフラニン−Ｏが好ましい。

【００１２】色素の濃度は、微生物への着色が十分であ
るとともに、過剰な色素が除去される濃度であればよ
く、このような濃度を色素により適宜採用すればよい。
例えば、フクシンやサフラニン−Ｏの場合、通常、０．
０００１〜０．００１％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０
００２〜０．０００５％（ｗ／ｖ）である。ここで色素
の濃度が０．０００１％未満であると着色が不十分とな
る場合があり、０．００１％を超えると過剰の色素の除
去のための洗浄操作が煩雑となる場合がある。

【００１３】本発明においては、染色時に付着した過剰
の色素を洗浄して除去するために界面活性剤が必要であ
る。界面活性剤を含有しない染色組成物を使用すると過
剰色素の除去が困難になり、微生物数の正確な測定が困
難となる場合がある。本発明に使用される界面活性剤
は、染色組成物あるいは染色時における系内のｐＨを変
化させにくい特性を有することが望ましい。このような
界面活性剤として、非イオン性界面活性剤を挙げること
ができる。中でも、非イオン性界面活性剤の一種であ
る、ツイーン２０が前記したｐＨ変化が少ない点で好ま
しい。

【００１４】また、界面活性剤を添加量は、０．００１
〜１．０％（ｗ／ｖ）とするのが好ましく、０．１〜
０．５％とするのが特に好ましい。それは、界面活性剤
の含量が０．００１％未満では、過剰色素の除去が困難
となる場合があり、１．０％より多く使用した場合に
は、微生物に付着した色素までも除去されてしまう場合
があるからである。

【００１５】また、必要に応じて、エタノールなどの防
腐剤等を添加することもできる。なお、エタノールなど
の防腐剤を添加する場合には１〜１５％（ｖ／ｖ）添加
すればよい。

【００１６】本発明の染色組成物においては、ｐＨを４
〜６に調整する必要がある。それは、ｐＨが３以下の場
合、微生物に対する着色の程度が弱過ぎ、またｐＨが８
以上の場合には、微生物に対する着色の程度が強過ぎる
ためである。また、ｐＨが７程度の場合には、着色の程
度に問題はないが、着色後の色の安定性に劣る。また、
ｐＨを４〜６に調整しない場合には、染色組成物の貯蔵
安定性が低下し、２〜３週間で微生物に対する染色性が
変化する場合がある。

【００１７】ｐＨ調整試薬としては、微生物により簡単
に分解されないものであればよい。このようなものとし
て、無機酸や無機アルカリを挙げることができる。中で
も、入手の容易さ、コスト及び操作性より、希塩酸や希
水酸化ナトリウムが好ましい。

【００１８】本発明の染色組成物においては、染色され
た微生物の捕集を容易にするため、塩を加えることが好
ましい。特に、染色された微生物をろ過により捕集する
場合、微生物の濃度が高いサンプルでは、ろ過が困難に
なる場合があり、このような場合には、ろ過性を向上さ
せるため塩を加える必要がある。使用する塩は、染色組
成物が通常、水溶液として使用されるため、水溶性のも
のが好ましく、特にアルカリ金属の無機塩が溶解性の点
で好ましい。中でも、塩化ナトリウムや塩化カリウムが
入手容易性、コスト及び操作性の点で好ましい。染色組
成物中の塩の含量は、０．５〜３．０％（ｗ／ｖ）とす
るのが好ましく、０．５〜２．０％（ｗ／ｖ）とするの
が特に好ましい。それは、この範囲外では、着色微生物
の捕集が困難となる場合があるからである。

【００１９】本発明の染色組成物は、通常、水を希釈液
として用い、色素や界面活性剤の含量が所定量となるよ
うに調整される。

【００２０】本発明の染色組成物は、色素、界面活性
剤、希釈液及び必要な場合にはｐＨ調整試薬や塩を用い
て調製される。通常、これらの成分を単に混合すること
により、染色組成物は調製されるが混合の順序は特に限
定されない。好ましくは、希釈液中に色素、界面活性剤
及び所望により塩を投入し、ｐＨが外れている場合に
は、ｐＨ調整試薬を用いてｐＨ調整をする。

【００２１】また、本発明の染色組成物を保存する場合
には、ｐＨを４〜６の範囲に調整した濃厚溶液として保
存してもよく、ｐＨが調整されていれば、貯蔵安定性が
保持される。本発明の染色組成物を保存する場合には、
界面活性剤を添加しない状態で保存するのが、更に好ま
しく、この場合には、７カ月以上安定して保存すること
ができる。

【００２２】ここで本発明の染色組成物ならびに染色方
法を適用することができる試料は、特に制限はなく、例
えば尿を初めとして、切削油，圧延油，熱処理油などの
水溶性金属加工油、液体調味料（醤油，ソースなど），
液体飲食品（例えば発酵乳・乳酸菌飲料など），酒類
（例えばワイン，清酒など）などの液状食品、粉末や固
形食品（例えば野菜，魚肉など）の場合には洗浄した試
料、水溶性塗料等、さらには河川水，池水，温泉水，水
槽水，生活廃水などの水等にも幅広く適用することがで
きる。なお、試料は必要に応じて、適宜、希釈したり、
或いは例えば固形食品などの場合には破砕した後に、希
釈したりするなどして測定用試料とするとよい。

【００２３】また、前記試料中に含まれる微生物の濃度
としては、１×１０⁴ 〜１×１０⁷個／ミリリットル程
度が好適である。それは、１×１０⁴ 未満では、着色が
生じない場合があり、１×１０⁷ を超えると、ろ過工程
を有する測定方法を採用した場合に、ろ過が困難となる
場合があるからである。本発明の染色組成物は、前記の
ような試料中に存在する微生物を染色することで、その
存在が確認できるとともにその数を測定することができ
る。

【００２４】次に、本発明の染色方法について説明す
る。本発明の染色方法は、色素及び界面活性剤を含有す
る組成物をｐＨが４〜６の範囲内で微生物と接触させる
ことを特徴としている。染色方法としては、試料中に色
素と界面活性剤を添加後、ｐＨを調整する方法、試料中
に、色素と界面活性剤を含有する組成物を添加後、ｐＨ
を調整する方法、試料中に、本発明の染料組成物を添加
する方法等が考えられる。

【００２５】この場合において、前記組成物のｐＨが４
〜６の範囲に調整された組成物（即ち、本発明の染料組
成物）を用いるのが好ましい。それは、本発明の染料組
成物は貯蔵安定性に優れるため、使用時あるいはその直
前に調整する必要がないためである。

【００２６】なお、１試料当りの染色組成物量は、試料
の２〜５倍量が適当である。一方、試料の量は、通常、
５０〜１００μリットルで足りる。従って、例えば試料
の量が１００μリットルの場合、色素液組成物は２００
〜５００μリットル必要である。但し、試料の５倍を超
える量は必要ない。

【００２７】微生物数の測定の際の染色組成物の使用量
は、色の対照表や検量線を作成する際の使用量と、細菌
数未知試料への使用量とを等量にすることが、誤差を抑
える意味で好ましい。

【００２８】次に、本発明の染色組成物あるいは染色方
法の好ましい使用態様について説明する。本発明の染色
組成物あるいは染色方法を用いて微生物数を測定する場
合には、過剰の染色組成物を除去することが望ましい。
除去の手段としては、遠心分離やろ過等が適用できる
が、簡便性や確実性の面でろ過による分離が好ましく、
ろ過速度の点で吸引ろ過や加圧ろ過が特に好ましい。

【００２９】ろ過に使用するフィルターとしては、疎水
性フィルターが好ましい。それは、疎水性フィルターは
極性が弱いか、或いは極性がなく、過剰の色素の除去が
容易であるためである。疎水性フィルターとしては、例
えば、ポリテトラフルオロエチレンやポリプロピレン
が、過剰の色素の除去が容易であるため好ましい。疎水
性フィルターのろ過孔径は、微生物の捕集に通常使用さ
れる０．２〜３．０μｍ程度の範囲で良い。

【００３０】疎水性フィルターのろ過面積（着色域の面
積）の大きさは、見やすければ特に制限はない。この着
色域の形は特に問わないが、見やすさの点で円形が望ま
しく、その直径は１〜３ｍｍ程度のものが好ましい。疎
水性フィルター全体の大きさは特に制限はないが、少な
くとも着色域の大きさは最低必要である。疎水性フィル
ターの色としては、用いる色素を考慮して、判定容易な
色を定めればよい。着色の程度を容易に判定するために
は、白色の疎水性フィルターが好ましい。

【００３１】なお、本発明の染色組成物あるいは染色方
法を使用して微生物数を測定する場合に、プレフィルタ
ーを用いて染色され得る他の成分を除去する方法も採用
できる。例えば、プレフィルターの採用により、細菌試
料中に細菌より大型の動物細胞、例えば白血球などが共
存する場合に、細菌は通過させるが、そのような大型の
動物細胞を通過させずに捕集することができる。

【００３２】プレフィルターを使用する場合には、例え
ば、濾過孔径が６〜６０μｍ程度のものを用いて前処理
すればよい。このようなプレフィルターとしては、ポリ
プロピレン系のフィルターなどを使用することができ
る。染色組成物と細菌試料との混合物の吸引ろ過操作に
より、細菌検出用の疎水性フィルターへの染色された細
菌の捕集と過剰色素の除去とを同時に行ない、細菌検出
用の疎水性フィルターの着色度から試料中の細菌数を測
定する。

【００３３】このように過剰の色素が除去された試料中
の細菌の着色度から、試料中の細菌数を測定する。この
細菌数の測定は、（１）色の対照表を用いて目視により
比較するのが一番簡便であるが、（２）光学密度（Ｏ．
Ｄ．）測定による比色定量法により行なうこともでき
る。目視判定の場合には、細菌検出用の疎水性フィルタ
ーの表側の面のみならず、裏側の面の着色度より、測定
することもできる。これらの場合には、それぞれの側用
の色対照表や、吸光度と細菌数の検量線を作成すればよ
い。

【００３４】上記（１）の目視による細菌数の測定は、
具体的には、細菌捕集用の疎水性フィルター上に存在す
る細菌の着色度、即ち色の強度を、既知量の細菌数の試
料を用いて予め作成しておいた色の対照表と比較するこ
とにより行なえばよい。色の対照表は、細菌数が既知の
試料を用い、前記した測定方法で染色，洗浄した細菌検
出用の疎水性フィルターをカラー写真に撮ることによ
り、又は、この染色された細菌検出用の疎水性フィルタ
ーと同程度に濾紙等を着色したり、或いは同程度の色を
紙に印刷することにより、作成することができる。

【００３５】例えば、尿中の細菌数を測定する場合に
は、次のようにして色の対照表を作成する。すなわち、
尿中細菌は健常人の尿にも低濃度〔多い場合でも１ｍｌ
（ミリリットル）当り１万個程度〕存在するが、総数で
１ｍｌ当り１０万個以上存在した場合には細菌尿症の疑
いありと判断され、１ｍｌ当り１００万個以上の場合に
は細菌感染（細菌尿症）が確定的である。従って、この
値の前後で検出できる色対照表を作成すれば良い。通
常、１千個／ｍｌ，１万個／ｍｌ，１０万個／ｍ
ｌ，１００万個／ｍｌ，１０００万個／ｍｌの５点
の場合の標準色対照表を作成すれば充分であるが、勿
論、これに限定されるものではない。

【００３６】また、上記（２）の光学密度（Ｏ．Ｄ．）
測定による比色定量は、細菌検出用の疎水性フィルター
上に存在する細菌を着色した色素を、有機溶剤を用いて
溶出させ、溶出液の着色度を吸光度により測定し、予め
作成した光学密度（Ｏ．Ｄ．）と細菌数との検量線と照
合して定量すればよい。吸光度測定時の波長は、用いる
色素により、適宜定めればよい。ここで有機溶剤として
は、各種アルコール類を使用することができるが、特に
エタノールが好ましい。

【００３７】なお、検量線の作成は、例えば次のように
して行なえばよい。即ち、色素としてフクシンを用いた
場合には、各種の濃度に希釈した試料の着色度を、マイ
クロプレートリーダーを用いて、着色度を４９２ｎｍの
光学密度（Ｏ．Ｄ．）により測定しておき、一方、各種
の濃度に希釈した試料と同一試料の試料溶液中の細菌数
を、寒天平板培養法のコロニー数の計数により算出して
おき、両者の結果から細菌数と光学密度の検量線を作成
すればよい。

【００３８】

【実施例】次に、本発明を実施例により詳しく説明す
る。 〔参考例１〕：色素液組成物（染色組成物）Ｄ１による
尿中細菌数測定用色対照表の作成 細菌として、大腸菌（ Escherichia coli )( ATCC 11
303 ) 及び黄色ブドウ球菌（ Staphylococcus aureus
)（ IFO 3183 ) を用いて、以下の実験を行なった。

【００３９】肉汁ブイヨン培地に菌種を接種し、３７℃
で２４時間の静置培養を行ない、培養液を標準試料用菌
懸濁液とした。一方、尿路感染症に感染した男子の放出
尿を採取して、濾過孔径が０．５μｍのポリテトラフル
オロエチレン製メンブレンフィルター（アドバンテック
東洋社製）で濾過して、細菌希釈用液を調製した。

【００４０】上記標準試料用菌懸濁液に所定量のこの細
菌希釈用液を添加して、各細菌数が １千個／ｍｌ程度、１万個／ｍｌ程度、１０万個
／ｍｌ程度、１００万個／ｍｌ程度、１０００万個
／ｍｌ程度の濃度となるように、５種の標準試料を調製
した。なお、培養法による細菌数はＣＬＥＤ寒天平板培
地で、３７℃、２４時間培養した際のコロニー数により
計数した。

【００４１】図１，図２に示す細菌数測定キットを実験
に使用した。寸法及び色素液組成物は以下の通りであっ
た。 ・色素液組成物Ｄ１：フクシンを０．０００２％（ｗ／
ｖ）、食塩を０．８５％（ｗ／ｖ）、ツィーン２０（関
東化学社製）を０．１５％（ｗ／ｖ）の割合で含むｐＨ
が４．９の液 ・濾過容器Ａ：外径４．６ｍｍ、内径４ｍｍ、長さ２０
ｍｍ、ポリプロピレン製のチューブ ・試料採取用部材Ｃ：１０，５０，１００μリットルの
計量目盛り付きチップ、広口側の内径５ｍｍ（米国クオ
リティー社製） ・マイクロチューブ（色素液組成物を入れる容器Ｅ）：
１．５ミリリットル容、ポリプロピレン製（米国クオリ
ティー社製） ・細菌検出用疎水性フィルター１：ポリテトラフルオロ
エチレン製メンブレンフィルター（孔径３μｍ、着色面
積直径１．５ｍｍ） ・フィルター支持体２：シリコーンチューブ（外径４ｍ
ｍ、内径１．５ｍｍ）を長さ７ｍｍに切断したもの ・点眼ビン５：１０ミリリットル容、ポリプロピレン製 ・プレフィルター３：直径４ｍｍ、長さ４ｍｍ、ポリビ
ニルアルコール製、濾過孔径＝６０μｍ

【００４２】図２に示したように、濾過容器Ａの一端
に、３ｍｌ容の注射器Ｂを装着し、一方、濾過容器Ａの
他端（細菌検出用疎水性フィルター１を備えた側）に、
内部にプレフィルター３を装着した試料採取用部材Ｃを
取外し自在に嵌合し、この試料採取用部材Ｃの先端に設
けられている試料採取口４から、上記細菌試料１００μ
リットルを注射器Ｂの吸引操作により採取した。

【００４３】次に、上記のようにして細菌試料を注射器
Ｂの吸引操作により導入した後、３５０μリットル（７
〜８滴）の色素液組成物Ｄを入れた容器Ｅ（マイクロチ
ューブ）に一旦押し出して注入した。なお、本参考例に
おいては、注射器Ｂの吸引操作により試料を採取してい
るが、注射器に代えてスポイトを用いてもよい。この場
合、スポイトで試料を吸い上げ、２滴（約１００μリッ
トル）を前記した容器Ｅに滴下する方法を採用してもよ
い。

【００４４】注入後（あるいは、前記スポイトによる滴
下後）、直ちに注射器Ｂの先端に取付けられている試料
採取用部材Ｃの先端に設けられている試料採取口４か
ら、容器Ｅ（前記マイクロチューブ）に入れられている
色素液組成物と細菌試料との混合物を、注射器のピスト
ン６を引いて吸引濾過した。この吸引濾過操作により、
細菌検出用疎水性フィルター１への染色された細菌の捕
集が行なわれると同時に、過剰色素の除去が行なわれ
た。

【００４５】このようにして細菌検出用疎水性フィルタ
ー１への染色された細菌の捕集を行なった後、注射器Ｂ
の先端に取付けられている試料採取用部材Ｃを取外し、
濾過容器Ａの先端を露出させ、この濾過容器Ａの先端に
備えられている細菌検出用疎水性フィルター１上に存在
する細菌の着色度を目視により観察した結果、下記の第
１表の通りであった。

【００４６】〔参考例２〕：色素液組成物Ｄ２による尿
中細菌数測定用色対照表の作成 色素液組成物の組成において、フクシンの濃度を０．０
００３％（ｗ／ｖ）とした他は、参考例１と同様にし
て、尿中細菌数測定用色対照表を作成した。結果を第１
表に示す。

【００４７】

【表１】

【００４８】これらの着色したフィルターを、標準サン
プルとしてカラー写真にとり、色の対照表とした。な
お、大腸菌と黄色ブドウ球菌との間で着色の程度に大差
はなかった。また、フクシンの濃度を０．０００２％
（ｗ／ｖ）とした場合と０．０００３％（ｗ／ｖ）場合
との間で着色の程度に大差はなかった。

【００４９】〔参考例３〕：色素液組成物Ｄ３による尿
中細菌数測定用色対照表の作成 色素液組成物の組成において、フクシンに代えてサフラ
ニン−Ｏを０．０００３％（ｗ／ｖ）濃度で用い、かつ
食塩濃度を１．５０％（ｗ／ｖ）、 ツィーン２０の濃
度を０．１７％（ｗ／ｖ）とした他は、参考例１と同様
にして、尿中細菌数測定用色対照表を作成した。結果を
第２表に示す。

【００５０】〔参考例４〕：色素液組成物Ｄ４による尿
中細菌数測定用色対照表の作成 色素液組成物の組成において、サフラニン−Ｏの濃度を
０．０００４％（ｗ／ｖ）とした他は、参考例３と同様
にして、尿中細菌数測定用色対照表を作成した。結果を
第２表に示す。

【００５１】

【表２】

【００５２】これらの着色したフィルターを、標準サン
プルとしてカラー写真にとり、色の対照表とした。な
お、大腸菌と黄色ブドウ球菌との間で着色の程度に大差
はなかった。また、サフラニン−Ｏの濃度を０．０００
３％（ｗ／ｖ）とした場合と０．０００４％（ｗ／ｖ）
の場合との間で着色の程度に大差はなかった。更に、フ
クシンとサフラニン−Ｏの着色度にも大きな差はなかっ
た。

【００５３】〔実施例１〕細菌として、黄色ブドウ球菌
（ Staphylococcus aureus )（ IFO 3183 ) を用い
て、以下の実験を行なった。肉汁ブイヨン培地に菌種を
接種し、３７℃で２４時間の静置培養を行ない、培養液
を標準試料用菌懸濁液とした。

【００５４】一方、尿路感染症に感染した男子の放出尿
を採取して、濾過孔径が０．５μｍのポリテトラフルオ
ロエチレン製メンブレンフィルター（アドバンテック東
洋社製）で濾過し、細菌希釈用液として滅菌水を添加し
て細菌数が１０⁶ ／ミリリットルとなるようにして、試
料を調製した。なお、細菌数はＣＬＥＤ寒天平板培地
で、３７℃、２４時間培養した際のコロニー数より計数
した。

【００５５】希塩酸水溶液及び希水酸化ナトリウム水溶
液を用いてｐＨを３．０〜９．０に調整した水溶液に、
フクシン、食塩、ツィーン２０をそれぞれ０．０００３
％（ｗ／ｖ）、０．８５％（ｗ／ｖ）、０．１５％（ｗ
／ｖ）となるように添加して色素液組成物を調製した。
次に、前記、参考例１で使用した細菌数測定キットを用
いて、同様の方法により、前記試料（細菌濃度＝１０⁶
個／ｍｌ）中の細菌数を測定した。ただし、色素液組成
物として、ｐＨを３〜９に調整した前記組成物を用い
た。着色の程度は、参考例２で作成した色対照表と比較
して決定し、細菌数を求めた。結果を第３表に示す。

【００５６】〔実施例２〕フクシンに代えて、サフラニ
ン−Ｏを０．０００４％（ｗ／ｖ）を含有するととも
に、食塩を１．５０％（ｗ／ｖ）、ツィーン２０を０．
１７％（ｗ／ｖ）含有する色素液組成物を実施例１と同
様の方法で作成し、実施例１と同様の方法で細菌数の測
定を実施した。その際、着色の程度は、参考例４で作成
した色対照表と比較して決定し、細菌数を求めた。結果
を第３表に示す。

【００５７】

【表３】

【００５８】第３表より、ｐＨを３あるいは８〜９に調
整した色素液組成物を用いた場合には、コロニー数より
計数した細菌数と判定結果が一致せず、また、測定後２
４時間で着色の程度が薄くなり、判定結果も変化するこ
とが分かった。ｐＨを７とした場合には、測定直後には
ほぼ正確な判定結果が得られ、着色の変化も少なかった
が、ｐＨを４〜６とした場合の方が、より正確な判定結
果が得られ、着色の変化もほとんどないことが確認され
た。

【００５９】〔実施例３〕実施例１と同様の方法によ
り、健常人及び尿路感染症の患者の尿検体試料を作成
し、実験に供した。一方、希塩酸水溶液を用いてｐＨを
５．０に調整した水溶液に、フクシン及びツィーン２０
をそれぞれ０．０００３％（ｗ／ｖ）、０．１５（ｗ／
ｖ）となるように添加し、更に食塩を第４表に示した濃
度となるように添加して色素液組成物を調製し、参考例
１と同様にして、細菌数を判定した。その際、参考例２
において作成した色対照表と比較して細菌数を判定し
た。また、色素液組成物と細菌試料との混合物を、注射
器のピストン６を引いて吸引ろ過する際のろ過時間を測
定した。ろ過時間の測定に際しては、ピストンを引く距
離を一定にし、前記混合物が全量注射器内に吸引される
までの秒数をろ過時間とした。また、１０分間ろ過して
全量吸引されなかった場合をろ過不可とした。結果を第
４表に示す。

【００６０】

【表４】

【００６１】第４表より、食塩を含有しない色素液組成
物を用いた場合、尿路感染症の有無の判断はできるが、
感染症の程度は判断が困難であることが分かる。また、
食塩濃度が０．５〜２．０％（ｗ／ｖ）の範囲内では、
ろ過時間が短く、かつ正確な細菌数が測定できることが
確認された。

【００６２】〔実施例４〕フクシンに代えて、サフラニ
ン−Ｏを０．０００４％となるように添加し、ツィーン
２０を０．１７％（ｗ／ｖ）となるように添加し、食塩
濃度を第５表に示した量とした他は、実施例３と同様に
してろ過時間と細菌数を判定した。細菌数は、参考例４
において作成した色対照表を使用して判定した。結果を
第５表に示す。

【００６３】

【表５】

【００６４】第４表より、サフラニン−Ｏを用いた場合
にも、食塩濃度が０．５〜２．０％（ｗ／ｖ）の範囲内
では、ろ過時間が短く、かつ正確な細菌数が測定できる
ことが確認された。

【００６５】〔実施例５〕実施例１と同様にして、細菌
濃度の異なる３種類の標準試料を作成した。また、色素
液組成物も実施例１と同様の方法により作成したが。そ
の際、ｐＨは４．９とし、界面活性剤ツィーン２０の濃
度は、第６表に示すように変化させた。

【００６６】次に、参考例１で使用した細菌数測定キッ
トを用いて、同様の方法により、前記標準試料中の細菌
数を測定した。その際、着色の程度は、参考例２で作成
した色対照表と比較して決定し、細菌数を求めた。結果
を第６表に示す。

【００６７】

【表６】

【００６８】第６表より、ツィーン２０を用いない場合
には、過剰の染色が除去されず、細菌濃度は濃い場合を
除いて、正確な判定ができないことが分かる。また、ツ
ィーン２０の含量が多過ぎる場合には、色素が過剰に除
去され、細菌濃度は薄い場合を除いて、正確な判定がで
きないことが分かる。

【００６９】〔実施例７〕実施例１と同様にして、細菌
濃度の異なる３種類の標準試料を作成した。また、色素
液組成物も実施例１と同様の方法により作成したが。そ
の際、ｐＨは４．９として色素液組成物の保存安定性を
検討した。なお、色素液組成物は、室温にて暗所に保存
した。

【００７０】参考例１で使用した細菌数測定キットを用
いて、同様の方法により、前記標準試料中の細菌数を測
定した。測定は、色素液組成物の調製直後（０カ月）、
２カ月後及び３カ月後に行い、０カ月の場合は同一の標
準試料を用いて、各濃度で９０回細菌数を測定し、２カ
月後及び３カ月後の場合は６０回測定した。着色の程度
は、参考例２で作成した色対照表と比較して決定し、細
菌数を求めた。結果を第７表に示す。

【００７１】

【表７】

【００７２】第７表より、本発明の染色組成物（色素液
組成物）は、２カ月間保存した後に使用した場合におい
ても、調製直後と同等の精度で判定ができることが確認
された。なお、実施例１と同様の方法により作成した色
素液組成物であって、ｐＨを７に調整した組成物を室温
にて２カ月間暗所に貯蔵したところ、脱色が起こり、実
験に供することができなかった。

【００７３】〔実施例８〕実施例７と同様にして、色素
液組成物の保存安定性を検討した。ただし、界面活性剤
無添加の色素液組成物を用いて保存を行い、染色直前に
該色素液組成物に界面活性剤を添加して使用した。結果
を第８表に示す。

【００７４】

【表８】

【００７５】第８表より、界面活性剤無添加で保存した
場合には、７カ月間保存した後に使用した場合において
も、調製直後と同等の精度で判定ができることが確認さ
れた。

【００７６】

【発明の効果】本発明の染色組成物ならびに染色方法
は、試料中の微生物の有無あるいは数を迅速、かつ簡便
に測定し得るのみならず、着色度が時間とともに変化し
にくい。本発明の染色組成物は、また、保存安定性に優
れる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、参考例及び実施例で使用した細菌数測
定キットの説明図である。

【図２】図２は、参考例及び実施例で使用した細菌数測
定キットを市販の注射器と組み合わせて、細菌数測定の
準備をした状態を示す説明図である。

【符合の説明】

Ａ 濾過容器 Ｂ 注射器 Ｃ 試料採取用部材 Ｄ 色素液組成物 Ｅ 色素液組成物を入れる容器 Ｆ 色対照表 １ 細菌検出用疎水性フィルター ２ フィルター支持体 ３ プレフィルター ４ 試料採取口 ５ 点眼ビン ６ ピストン

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 色素及び界面活性剤を含有する組成物で
   あって、ｐＨを４〜６の範囲に調整したことを特徴とす
   る微生物の染色組成物。
2. 【請求項２】 色素、界面活性剤及び塩を含有する組成
   物であって、ｐＨを４〜６の範囲に調整したことを特徴
   とする微生物の染色組成物。
3. 【請求項３】 塩を０．５〜３．０％（ｗ／ｖ）含有す
   る請求項２記載の微生物の染色組成物。
4. 【請求項４】 色素及び界面活性剤を含有する組成物を
   ｐＨが４〜６の範囲内で微生物と接触させる微生物の染
   色方法。
5. 【請求項５】 色素、界面活性剤及び塩を含有する組成
   物をｐＨが４〜６の範囲内で微生物と接触させる微生物
   の染色方法。
6. 【請求項６】 色素を含有する組成物をｐＨ４〜６の範
   囲に調整した状態で保存することを特徴とする微生物の
   染色組成物の保存方法。
7. 【請求項７】 色素及び界面活性剤を含有する組成物を
   ｐＨ４〜６の範囲に調整した状態で保存することを特徴
   とする微生物の染色組成物の保存方法。
8. 【請求項８】 色素及び塩を含有する組成物をｐＨ４〜
   ６の範囲に調整した状態で保存することを特徴とする微
   生物の染色組成物の保存方法。
9. 【請求項９】 色素、界面活性剤及び塩を含有する組成
   物をｐＨ４〜６の範囲に調整した状態で保存することを
   特徴とする微生物の染色組成物の保存方法。